Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Optagelse og graduering af Epileptiform aktivitet i gnavere hjernen skiver koblet til mikroelektrode Arrays

Published: May 15, 2018 doi: 10.3791/57548

Summary

Vi illustrere, hvordan til at udføre registrering og elektriske graduering af 4-aminopyridine-induceret epileptiform aktivitet i gnavere hjernen skiver ved hjælp af mikroelektrode arrays. En brugerdefineret indtaling kammer fastholder væv levedygtighed i hele længerevarende eksperimentelle sessioner. Live elektrode kortlægning og udvalg af stimulerende par udføres af en brugerdefineret anskuelighed brugergrænseflade.

Abstract

FLE (TLE) er den mest almindelige delvis komplekse epileptiske syndrom og den mindst lydhøre over for medicin. Deep brain stimulation (DBS) er en lovende tilgang når farmakologisk behandling fejler eller Neurokirurgi anbefales ikke. Akut hjernen skiver koblet til mikroelektrode arrays (MMA) udgør et værdifuldt redskab til at studere neuronal netværk interaktioner og deres graduering ved elektrisk stimulation. I forhold til konventionelle ekstracellulære optagelse teknikker giver de de ekstra fordele ved et større antal observationsområder og kendte Inter elektrode afstand, som giver mulighed for at studere formering sti og hastighed af elektrofysiologiske signaler. Væv iltning kan dog stærkt nedsat under MEA optagelse, der kræver en høj perfusion sats, som kommer på bekostning af nedsat signal / støj-forhold og større svingninger i den eksperimentelle temperatur. Elektrisk stimulation yderligere understreger hjernevæv, hvilket gør det vanskeligt at forfølge langvarig optagelse/stimulation epoker. Endvidere skal elektriske graduering af hjerneaktivitet skive målrette specifikke strukturer/veje i hjernen skive, der kræver, at elektroden kortlægning nemt og hurtigt udføres live under eksperimentet. Her, vi illustrere hvor hen til præstere den optagelse og elektriske graduering af 4-aminopyridine (4AP)-induceret epileptiform aktivitet i gnavere hjernen skiver ved hjælp af planar multilaterale miljøaftaler. Vi viser, at hjernevæv fremstillet af mus udkonkurrerer rotte hjernevæv og er dermed bedre egnet til MEA eksperimenter. Denne protokol garanterer generation og opretholdelsen af en stabil epileptiform mønster, der trofast gengiver den elektrofysiologiske egenskaber observeret med konventionelle felt potentielle optagelse, fortsætter i flere timer, og outlasts vedvarende elektrisk stimulation til langvarig epoker. Væv levedygtighed i hele eksperimentet er opnået takket være brugen af en små-volumen brugerdefineret indtaling afdeling giver mulighed for laminar flow og hurtig løsning exchange selv ved lav (1 mL/min.) perfusion satserne. Hurtig MEA kortlægning for real-time overvågning og udvælgelse af stimulerende elektroder er udført af en brugerdefineret grafiske brugergrænseflade (GUI).

Introduction

Epilepsi er en liv-truende progressiv lidelse forårsager ukontrollerede aktivitet af hjernen1; det bærer blandt de højeste byrde af sygdom og betydelig social stigmatisering2,3. TLE er den hyppigste syndrom (40%) og mest hyppigt (~ 30%) resistente over for anti-epileptisk medicin4. Mens kirurgisk ablation af det epileptogenic væv kan forbedre patientens tilstand, det er ikke muligt i alle patienter og kan ikke garantere en fuldstændig beslaglæggelse-frit liv5. Graduering af epileptiske limbiske netværk af elektriske DBS er en lovende tilgang når farmakologisk behandling eller Neurokirurgi ikke er egnede.

Gnaver hjernen skiver er et værdifuldt redskab til at studere hvordan neuronal netværk funktion i sundhed og sygdom6 ved hjælp af in vitro- Elektrofysiologi teknikker, som de bevare, i det mindste i en del, den oprindelige arkitektur og tilslutning af hjernen region(er) af interesse (ROI). Især vandrette kombineret hippocampus-entorhinal cortex (hippocampus-EF) skiver omfatter de væsentlige neuronal netværk involveret i TLE og er derfor rutinemæssigt ansat i in vitro- TLE forskning7.

Beslaglæggelse-lignende aktivitet kan være akut induceret i hjernen skiver ved at ændre den ioniske sammensætning af den kunstige cerebrospinalvæske (ACSF), såsom faldende magnesium samtidig øge kalium8,9,10, eller ved hjælp af farmakologiske manipulationer, som blokerer hæmmende GABAergic aktivitet (Se11 for en omfattende revision). Disse modeller er imidlertid baseret på ubalanceret ændring af excitation og hæmning; de tillader således ikke, at studere samspillet og samordnet bidrag af excitatoriske og hæmmende netværk til ictogenesis. Kontinuerlig perfusion af hjerne skiver med konvulsiv drug 4AP forbedrer både excitatoriske og hæmmende neurotransmission, således for at studere akut ictogenesis samtidig med synaptic aktivitet generelt intakt12.

MEAs tillade registrering af den elektriske aktivitet genereret af neuronal netværk fra et større antal observationsområder i forhold til konventionelle ekstracellulære felt potentielle optagelse, hvor rumlige begrænsninger begrænser antallet af elektroder, der kan være indkvarteret på hjernen skive overflade. Desuden MEA chips giver den ekstra fordel af kendte Inter elektrode afstanden, hvilket er meget nyttigt at spore formering og vurdere rejser hastigheden af indspillede signaler. Selvom oprindeligt udtænkt til optagelse fra kulturperler neuroner13,14, er multilaterale miljøaftaler nu også bruges til at karakterisere de elektrofysiologiske egenskaber af akut hjernen skiver fremstillet af gnavere15 og mennesker16. Således, i forbindelse med epilepsi forskning, MEAs repræsenterer et værdifuldt værktøj til at lokalisere neuronal netværk interaktioner kernen af ictogenesis16,17,18.

Dog bærer MEA optagelse i sagens natur tekniske udfordringer i at opnå eller fastholde en stabil epileptiform mønster hele lange (flere timer) eksperimentelle protokoller. Først, væv iltning kan ikke være tilstrækkeligt inden for de store og runde neddykket type optagelse afdeling19,20 typisk af kommercielt tilgængelige miljøaftaler, mens dårlig signal-støj-forholdet og temperatur ustabilitet kan påvirke kvaliteten af optagelsen når en høj perfusion sats (6-10 mL/min.) bruges til at forbedre ilttilførslen til hjernen Skive (Se for eksempel de tekniske bemærkninger på varme og perfusion udstyr21). Andet, tilbagevendende udledninger med høj frekvens komponenter, såsom epileptiform udledning, overholdes næppe, når du bruger neddykket type optagelse kamre19; Dette er især tilfældet, når den akutte epileptiform mønster er kemisk induceret og indebærer ephaptic mekanismer, som det er tilfældet for 4AP model22 (Se11 for en omfattende oversigt). For at overvinde disse begrænsninger, er blevet foreslået flere strategier af forskere. For eksempel, er øge perfusion sats19,20 samtidig reducere hjernen skive tykkelse (≤300 µM) og området17,18 afgørende faktorer for at opnå tilstrækkelig ilttilførslen til vævet. Derudover kan forbedrede hjernen skive levedygtighed også ske ved hjælp af perforeret multilaterale miljøaftaler (pMEAs), som giver mulighed for perfusing hjernevæv fra begge sider18.

Der henviser til, at de beskrevne tilgange har væsentligt forbedret mulighederne for MEA optagelse fra hjernen skiver, de er ikke blevet testet mod langvarig (flere timer) optagelse og elektrisk stimulation sessioner, de sidstnævnte repræsenterer en betydelig stress for hjernevæv. Langvarig indspilningerne kan være nødvendigt at undersøge udviklingen i tid til særlige epileptiform mønstre, der ikke ville være muligt at afsløre af kortvarige målinger. I forbindelse med DBS forskning, kan længerevarende eksperimentelle protokoller forpligtes til at vurdere og sammenligne effekten af flere stimulation paradigmer i det samme hjerne udsnit.

Når kun spontane elektriske aktivitet skal være registreret, kortlægning af elektroder med hensyn til Investeringsafkastet er normalt gøres a posteriori, dvs., under dataanalyse; undersøgelse af evoked svar eller elektriske Neuromodulationsbehandling paradigmer kræver i stedet, at stimulation leveres til specifikke ROI(s), dikterer behovet for hurtig og nem live elektrode kortlægning under eksperimentet.

Her viser vi en simpel forsøgsplan, der giver mulighed for induktion og vedligeholdelse af en stabil 4AP-induceret epileptiform mønster i voksen gnaver hjernen skiver. Den observerede aktivitet gengiver trofast de elektrofysiologiske egenskaber af denne model som karakteriseret ved hjælp af konventionelle ekstracellulære Elektrofysiologi teknikker. Det fortsætter i flere timer og outlasts vedvarende elektrisk stimulation for gentagne langvarig epoker. Afdelingerne bruges til at vedligeholde og Inkuber i hjernen skiver kan let samles ved hjælp af standard laboratorie forsyninger (figur 1A), der henviser til, at en brugerdefineret indtaling afdeling giver mulighed for optimal løsning valutakurs og laminar flow (figur 1B) kan indhentes fra kommercielle kilder eller ved hjælp af 3D udskrivning teknologi til en overkommelig pris. Hurtig kortlægning af ROI(s) for real-time overvågning og udvælgelse af stimulerende elektroder er muliggjort af en brugerdefineret brugervenlig GUI opkaldt mapMEA, frit tilgængelig på anmodning.

Figure 1
Figur 1: Custom udstyr anvendes til denne protokol. (A) bedriften kamre for nyttiggørelse, før opvarmning og præ-inkubation i 4AP samles ved hjælp af et bæger og en petriskål. Petriskålen bør være mindre i diameter end afbryder og holdes på plads ved hjælp af en sprøjte stemplet. Bunden af petriskålen er erstattet af en nylon mesh (fra bløde strømper) limet med Cyanocrylat på kanten af petriskålen. Ilt tilføres via en bøjet spinal nål (22 G), indsættes mellem væggene i petriskålen og bægerglasset. Bobler bør opstår fra siden af den bægerglas og aldrig nå nylon mesh til at undgå hjernen skive forskydning. Toppen af en petriskål kan bruges som låg til at undgå ACSF fordampning og vedligeholde iltmætning. (B) Custom optagelse kammer. i: inlet reservoir til at rumme den varme kanyle og referenceelektrode. ud: outlet reservoir til at rumme den suge nål. REC: optagelse kammer. (C) glas Pasteur pipette, kruset af brand-polering, bruges til at håndtere væv og justere dets position inden for optagelse kammer. (D) Custom skive hold-down anker. (E) slutmontage af optagelse kammer monteret på MEA chip. En hjerne skive hviler på bunden holdes på plads af ankeret. Den røde pil angiver PTFE slanger der dækker varme kanyle, mens den røde cirkel angiver referenceelektrode, en mættet KCl pellet oversvømmet af ACSF i fjorden reservoir. Den blå pil angiver suge nålen i outlet reservoir. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af det italienske sundhedsministerium (tilladelse n. 860/2015-PR) i overensstemmelse med EU direktiv 2010/63/EF om dyrevelfærd.

1. forberedelse af MEA/Custom kammer forsamling

Bemærk: Start 2 dage før forsøget. Bruge en MEA uden en ring (Se Materialer tabel).

  1. Ren MEA (varighed: 35-40 min).
    1. Opløses en enzymatisk renere pulver i varmt destilleret vand. Børste den varme rengøring løsning overfladen, MEA derefter suge MEA ind i den varme, rengøring løsning for mindst 3 h.
    2. Skyl MEA grundigt med destilleret vand og tør det med en fnugfri no-bunden væv.
  2. Samle MEA med optagelse kammer (varighed: 10 min + overnatning).
    1. Jævnt fordelt elastomere fugemasse på bunden overfladen af optagelse kammer. Sørg for der er ingen bobler.
    2. Montere optagelse salen på MEA med hjælp fra pincet og anvende blide tryk. Hvis der er nogen bobler, lidt flytte kammeret i en cirkel mens anvendelse blide tryk med fingrene, indtil alle bobler er forsvundet. Sprede en fugemasse lag hele vejen rundt den ydre kant af optagelse kammer.
      Bemærk: kritiske! Ikke dække MEA kontakter med fugemasse.
    3. Placere samlingen MEA/kammer inde i en 15 cm petriskål. Sted en 5 mL petriskål eller en 10 mL bægerglas fyldt med destilleret vand tæt på MEA. Dække alt for at opretholde et fugtigt miljø. Lad kur ved rumtemperatur natten over.
      Bemærk: Protokollen kan pause her.
  3. Coat MEA for at gøre det hydrofile (varighed: 5-10 min + overnatning).
    1. Placere MEA i et 15 cm petriskål. Hæld 50 µL af poly-D-lysin på MEA optagelse område. Luk petriskålen, forsegle det med forsegling film og gemme natten over ved 4 ° C.
    2. Skyl MEA grundigt med destilleret vand og gemme MEA ved 4 ° C i destilleret vand.
      Bemærk: Protokollen kan pause her. Coatede MEAs kan gemmes og genbruges for flere eksperimenter. Rutinemæssigt rengøring og ny belægning MEA hjælper med at fjerne væv snavs og forbedre signal-støj-forhold.

2. fremstilling af stamopløsninger

Bemærk: Start 1 dag før forsøget (varighed: ~ 2 h). Stamopløsninger hjælpe speed-up eksperiment på den eksperimenterende dag. De kan tilberedes i forvejen og opbevares. Se tabel 1 for koncentration faktor og sammensætning. Henvises til tabel 2 for sammensætningen af endelige løsninger.

  1. Opløse kemikalier i destilleret vand ved stuetemperatur. Filtrer stamopløsninger med et filter flaske (filter diameter: 0,22 µm).
  2. Opbevares ved 4 ° C (se tabel 1 for Anbefalet maksimal opbevaringstid).
    Bemærk: Protokollen kan pause her.

3. forberedelse af Agar

Bemærk: Start 1 dag før forsøget (varighed: ~ 1 h).

  1. Hæld 250 mL destilleret vand i et 500 mL bægerglas og begynde at røre ved 350 rpm. Tilsaettes 5 g agar og vente, indtil det er helt opløst.
  2. Varme løsning på 250-300 ° C. Lad vandet fordampe indtil løsningen er ~ 200 mL til at give en 2,5% w/v agar løsning.
    Bemærk: Temperaturen skal være høj nok til at lade vandet fordampe uden bobler.
  3. Hælde agar løsning på en 200 mL plastik Firkantet kasse med ~1.5 cm-høje vægge og lad det køle ned ved stuetemperatur indtil det bliver fast.
  4. Dække boksen og opbevares ved 4 ° C. Agar blok er god i flere uger.
    Bemærk: Protokollen kan pause her.

4. forberedelse af det frosne planet

Bemærk: Start 1 dag før forsøget.

  1. Fyld en flad bund rustfrit stål skål med destilleret vand op til 0,5 - 1 cm under kanten.
  2. Opbevares ved-20 ° C natten over.

5. forberedelse af neuroprotektive skæring ACSF

Bemærk: Start 1 dag før forsøget eller den samme dag i forsøget (Se tabel 1 og tabel 2) (varighed: 30 min).

  1. Hæld 200 mL destilleret vand i et 500 mL bægerglas og starte omrøring med en magnetomrører på 350 rpm.
  2. Tilsæt 50 mL af stock B og 50 mL af stock C (Se tabel 1).
  3. Tilsæt 3 mM pyrodruesyre syre, 208 mM saccharose, 10 mM D-glucose og 1 mM L-ascorbinsyre syre.
    Bemærk: Det faktiske antal pyrodruesyre syre afhænger af tæthed og renhed og kan variere med partiet. Altid beregne den nødvendige mængde, når du åbner et nyt parti.
  4. Dække med forsegling film og lad omrøres i 30 min.
  5. Opløsningen overføres til en 500 mL målekolbe og tilsættes destilleret vand til at fylde kolben.
  6. Forsegle den målekolbe med forsegling film og forsigtigt vendes 3 - 5 gange indtil løsningen er jævnt klar.
  7. Overføre opskæring ACSF ind i en glasflaske med hætte.
  8. Store opskæring ACSF ved-80 ° C i 20-30 min eller ved 4 ° C natten over for at køle ned til 4 ° C.
    Bemærk: Protokollen kan blive standset her hvis natten køling foretrækkes. Ellers kræves tiden for køling opskæring ACSF kan bruges til at forfølge trin 6.

6. forberedelse af bedriftens ACSF

Bemærk: Forberede løsning frisk på dagen af forsøget (varighed: 5-10 min). Bedriften ACSF vil blive brugt til at skylle hjernen skiver fra opskæring ACSF under den udskæring procedure (Se trin 8.16) og for hjernen skive langtidsopbevaring og før opvarmning. For at skylle hjernen skiver, er 100 mL holding ACSF tilstrækkelig. Holding og pre opvarmning afdelingerne bruges i denne protokol er specialfremstillet og indeholder et volumen på 300 mL og 100 mL, henholdsvis (jf. figur 1A). Med denne indstilling er 500 mL holding ACSF tilstrækkelig. Chambers fra kommercielle kilder kan indeholde en anden diskenhed, i hvilket tilfælde det samlede beløb for at holde ACSF forberedes burde justeres.

  1. Hæld 200 mL destilleret vand i en 500 mL målekolbe.
  2. Tilsæt 50 mL af stock A, 50 mL af stock B, 6,5 mL af lager M og 1 mM L-ascorbinsyre. Gnub forsigtigt ved hjælp af roterende bevægelser, indtil L-ascorbinsyre er helt opløst.
  3. Tilsæt destilleret vand for at nå det endelige rumfang, forsegle den målekolbe med forsegling film, og forsigtigt vendes 3 - 5 gange indtil løsningen er jævnt klart. Henvises til tabel 2 for bedrift ACSF sammensætning.

7. forberedelse af de eksperimentelle bænke

Bemærk: Dette kræver 15 min, plus 30 min til at opnå en stabil temperatur på det varme bad.

  1. Optagelse bænk
    1. Start det varme bad, sæt den til 32 ° C, og dække det for at fastholde sin temperatur.
      Bemærk: Det varme bad bruges i denne protokol kan være skræddersyede ved hjælp af en hård plastik kasse og et akvarium termostat pre-indstille den ønskede temperatur. Støt ønskede temperatur kan nås i ~ 30 min med udgangspunkt i stuetemperatur. Da de pre opvarmning og udrugning kamre sidder i bunden af boksen plast, bør vandstanden være lige nok til at dække termostaten for at holde kamrene fra flydende.
    2. Samle bedriften og de pre opvarmning kamre (jf. figur 1A), og hæld bedriften ACSF ind i dem. Holde bedrift kammer ved rumtemperatur og placere den pre opvarmning kammer inde i det varme bad. Start boblende løsninger med 95% O2/5% CO2 gasblandingen og fjerne enhver fanget bobler ved hjælp af en omvendt Pasteur pipette. Holde dækket.
  2. Udskæring bænk og vibratome
    1. Lim en lille agar blok på midten af objektpladen med ren lim.
    2. Læg et 250 mL bægerglas ind i en isspand og hæld skære ACSF ind i den.
    3. Tag to 100 mL bægerglas og hæld 50 mL holding ACSF i hver. Forlade bægre ved stuetemperatur. Disse er de føres bægre.
    4. Start boblende løsninger med en 95% O2/5% CO2 gasblanding.
    5. Montere pufferkarret op på vibratome og omgiver det med knust is. Hæld nogle ethanol på knust is til støtte i at bevare kolde temperaturer under proceduren udskæring. Efter øsende ethanol, tilsættes mere is efter behov.
      Bemærk: En temperatur på 2 ° C er optimal.
    6. Sted Bobleflasken inde pufferkar, derefter samle og montere vibratome klinge blok.
      Bemærk: Sørg for, at klingen er monteret på frivinkel ~ 10 °.
    7. Sætte knust is i et 500 mL bægerglas til 2/3 af volumen og fylde med destilleret vand.
    8. Tage den frosne skål ud af fryseren, placere den opadrettede-down på den udskæring bænk og dække det med et stykke køkkenrulle og et filtrerpapir disc.
  3. Anæstesi bænk
    1. Placer en lille skål i en is-fyldt bakke og hæld skære ACSF i det. Start sprudlende med en 95% O2/5% CO2 gasblanding.

8. hjerne skive forberedelse og vedligeholdelse

Bemærk: Denne protokol gør brug af voksen (4 - 6 uger gamle) mandlige CD1 mus, men andre stammer (fx, c57/bl617,18) kan bruges. Vi sammenligner også senere eksperimentelle output opnået med musen hjernen skiver med der af hjernen skiver fremstillet af mandlige Sprague-Dawley rotter i samme aldersgruppe. Følgende trin henvise til forberedelse af delvis afbrudt hjernen skiver hvor CA3-drevet hurtigt interictal-lignende aktivitet er tilbageholdende til hippocampus korrekt og kan ikke overføres til parahippocampal cortex, som beskrevet i23. Hippocampus-cortex frakobling er en forudsætning at forfølge elektriske graduering undersøgelser i ved hjælp af hippocampus-EF hjernen skive forberedelse. Vibratome brugt refererer til den model, der er opført i Materialer tabel. Andre modeller kan kræve en anden procedure.

  1. Bedøver gnaver ved hjælp af isofluran 5% i en carbogen gas blandingen leveret til en anæstesi induktion kammer ved 2 L/min.
  2. Under dyb anæstesi (ingen reflekser i svar til fod og poter knivspids), uddrag hjernen inden for 1 min efter standardprocedurer som23. Læg hjernen i den lille skål der indeholder afbalancerede iskold opskæring ACSF og lad chill i 90-120 s.
    Bemærk: Lad ikke hjernen chill for længe, ellers kan det fryse.
  3. Hæld den iskolde opskæring ACSF i pufferkarret. Sprede skære ACSF på filtrerpapir placeret på den frosne skål. Læg hjernen på filtrerpapir og isolere kræves hjernen væv blok ved at fjerne lillehjernen og skære den frontale pole ud lige.
  4. Ved hjælp af et bøjet spatel, lim den dorsale side af hjernen på objektpladen med den frontale cut side agar blok og occipital pole vender vibratome blade. Bruge et tyndt lag af ren lim. Placer objektpladen i pufferkarret straks og sikre det.
  5. Justere skæring området for at flytte vibratome blade hele vejen på tværs af væv op til agar blok. Justere modellen disk højde for at nå det klinge niveau med hjernen væv blok.
  6. Kassér væv sektioner, indtil hippocampus er klart synlig (normalt ~ 900 µm). Derefter indstille skive tykkelse 400 µm og starte udskæring at opbevare sektionerne væv. For hver sektion, hjernen opdeler de to hjernehalvdele og trim den unødvendige væv for at få to hjerne skiver. Som pufferkar er forhøjet i efterfølgende afsnit, fyld buffer bakke følge med iced destilleret vand (Se trin 7.2.7).
  7. Bruge en inverteret Pasteur pipette til forsigtigt at overføre hjernen skiver i den første føres bægerglas, tømme Pasteur pipette og overføre hjernen skiver til den anden føres bægerglas. Derefter, overføre hjernen skiver ind i bedriften kammeret og lade dem inddrive i mindst 60 min.
    Bemærk: Normalt det er muligt at få 6-8 hjernen skiver samlede. Protokollen kan blive standset her.

9. udarbejdelse af ACSF indeholdende 4-AP (4AP-ACSF)

Bemærk: Dette kræver 10 min til forberedelse, plus 20 min opvarmning. Forsigtighed! 4-AP er en konvulsiv stof og det er giftigt. Håndtere med handsker og undgå at spilde.

  1. Hæld 200 mL destilleret vand i en 500 mL målekolbe.
  2. Tilsæt 50 mL af stock A, 50 mL af stock B, 5 mL af lager M og 1 mM L-ascorbinsyre. Gnub forsigtigt ved hjælp af roterende bevægelser, indtil L-ascorbinsyre er helt opløst.
  3. Tilsættes 500 µL af 4AP lager.
  4. Tilsæt destilleret vand for at nå det endelige rumfang, forsegle den målekolbe med forsegling film, og forsigtigt vendes det 3 - 5 gange indtil løsningen er jævnt klart.
  5. Samle 4AP kvægbruget salen (jf. figur 1A) og hæld det ~ 80 mL af 4AP-ACSF. Dække salen, overføre det til den varmt bad og starte sprudlende med en 95% O2/5% CO2 gasblanding. Fjerne nogen fanget bobler ved hjælp af en omvendt Pasteur pipette. Holde dækket.
  6. Vent indtil 4AP-ACSF temperaturen er 30-32 ° C (~ 20 min).
    Bemærk: Protokollen kan blive standset her hvis hjernen skiver er stadig ved at komme.

10. før opvarmning og inkubation af skiver i 4AP (varighed: 90 min)

  1. Kontroller, at den pre opvarmning ACSF og 4AP-ACSF temperatur er 30-32 ° C.
  2. Bruge en omvendt glas Pasteur pipette til at overføre 1 hjernen skive ind i pre opvarmning kammeret og lade væv resten til 25-30 min. Derefter overføre hjernen skive ind i 4AP-ACSF kvægbruget kammeret og lad det hvile i 60 min.

11. forberedelse af MEA Set-up

Bemærk: Start 15 min før optagelse.

  1. Overføre den resterende mængde af 4AP-ACSF til en 500 mL Erlenmeyer-kolbe.
  2. Anbring Erlenmeyerkolben på en hylde over MEA forstærker og bruge slangen til at tillade løsning til løbende feed en 60 mL sprøjte. Justere højden på Erlenmeyerkolben og sprøjte til at tillade en tyngdekraft fodret sats på 1 mL/min.
    Bemærk: Den korrekte højde afhænger af slangen indre diameter (ID). For slanger af 5/32 inches ID er 30 cm tilstrækkelig.
  3. Start boblende 4AP-ACSF i Erlenmeyerkolben og i sprøjten med en 95% O2/5% CO2 gasblanding.
  4. Lad 4AP-ACSF flow gennem perfusion slangen i et bægerglas indtil der er ingen luft inde; så stop løsning flow.
  5. Tilslut varmeelement på MEA base til termostaten. Placer den tørre MEA chip inde MEA forstærker og sikre forstærker hovedet. Brug en plastik Pasteur pipette overførsel 4AP-ACSF til indløb og ydre reservoir af optagelse kammer.
  6. Sikre varme kanyle til en magnetiske indehaveren og Placer spidsen inde optagelse kammer indløbsstuds; den magnetiske indehaveren tillægge en magnetstriben på MEA forstærker hovedet; Tilslut perfusion slangen til kanyle; Tilslut kanylen til termostaten.
    Bemærk: Varme kanyle bør være omfattet af skrå polytetrafluorethylen (PTFE) slanger at nå optagelse kammer indløbsstuds og minimere støj på grund af det metalliske materiale af kanylen. Når fjorden reservoir er tilstrækkeligt fyldt med 4AP-ACSF, bør dråber falder fra perfusion system ikke være synlig.
  7. Placer suge nålen inde reservoiret og kontrollere, at der er undertryk ved nedsænkning suge nålen ind i ACSF; Tjek for en konstant lav frekvens suge støj.
    Bemærk: Suge nålen placeres således at 4AP-ACSF til at flyde lige over hjernen skive overflade. En vakuum linje eller en støjsvag vakuum pumpe kan bruges.
  8. Angiv flow regulator til at tillade en gennemstrømningshastighed på 1 mL/min og starte perfusing.
    Bemærk: Tyngdekraft fodret perfusion fjerner den støj, der kan være forårsaget af peristaltiske pumper; Hvis peristaltiske pumper er at foretrække, er støjsvage modeller obligatorisk.
  9. Når 4AP-ACSF strømmer gennem kanylen, drej på termostaten. Sæt varme kanyle til 37 ° C og MEA base til 32 ° C til at opnå en temperatur på 32-34 ° C inde optagelse kammer.
    Bemærk: forsigtighed! Aldrig kan varme kanyle uden løsning i det eller det være uigenkaldeligt beskadiget. Indstil temperaturen af kanylen højere end optagelse temperatur (dvs., 32-34 ° C) for at tage højde for de iboende temperatur forskydning mellem den indstillede værdi og faktiske værdi på spidsen af varme kanylen og inden for optagelse kammer. Strømningshastigheden, miljø temperatur og volumen af optagelsen kammer alle indflydelse temperaturen af løsningen ved optagelse. Indstillingerne for rapporteret i trin 11,9 er optimeret til de beskrevne protokol og udstyr. Altid kontrollere den faktiske optagelse temperatur ved hjælp af et termoelement og justere indstillingerne efter behov. Ikke varme MEA base over 34 ° C til at undgå overophedning hjernen skive.
  10. Placer den eksterne referenceelektrode i optagelse kammer inlet reservoir.
    Bemærk: Selvom MEA chips er udstyret med en intern referenceelektrode, dette er omfattet af brugerdefineret indtaling kammer. Således skal der anvendes en ekstern referenceelektrode. En mættet KCl pellet er den mest praktiske, da det er klar til brug uden behov for kloring.

12. MEA Live kortlægning

  1. Engang 4AP-ACSF niveau og optagelse temperaturen er stabiliseret som ønskede, drej perfusion og de suge stopcocks til den slukkede position for midlertidigt at stoppe dem.
    1. Hurtigt overføre én hjerne skive på MEA optagelse kammeret ved hjælp af en omvendt glas Pasteur pipette. Justere sin holdning på området MEA optagelse som nødvendige ved hjælp af en brand-poleret krøllet Pasteur pipette (figur 1 c) eller en blød kompakt lille børste. Placer hold-down anker (fig. 1 d) på hjernen skive. Genstarte perfusion og suge ved at dreje deres stopcocks tilbage til positionen on.
      Bemærk: kritiske! Cirkeludsnittet, der skal overføres, og perfusion genstartes inden 60 s eller væv kan dø. Skive hold-down anker bør holdes i 4AP-ACSF at forhindre, at hjernen skive flytter samtidig lægge ankeret på hjernen skive skyldes forskelle i de overfladiske spændinger. Anker at sikre hjernen skive på MEA kan være skræddersyede bruger rustfrit stål wire og nylon tråd (fig. 1 d) eller fra kommercielle kilder. Figur 1E viser den endelige eksperimentelle set-up med MEA chip forbundet til forstærkerens hoved: en hjerne skive hvilende på MEA chip i optagelse kammeret er holdt nede af den brugerdefinerede anker. Referenceelektrode (rød cirkel) og PTFE slanger, som dækker varme kanyle (rød pil) er placeret i inlet reservoir, der henviser til, at suge nålen (blå pil) er placeret i outlet reservoir.
  2. Tage et billede af hjernen skive ved hjælp af et kamera monteret på en inverteret mikroskop scenen.
  3. Kør scriptet mapMEA på computersoftware til at starte GUI for at kortlægge elektroderne.
    Bemærk: Den skræddersyede software tillader brugeren at vælge de elektroder, der svarer til specifikke strukturer i hjernen skive. Dette trin er afgørende for at aktivere den korrekte sti og undertrykke ictal aktivitet ved hjælp af elektrisk stimulation.

Figure 2
Fig 2: GUI for live MEA elektrode kortlægning. (A) skematisk fremstilling af kombinerede hippocampus-EF skive placeret på MEA. De standard konstruktioner, der anvendes til denne protokol er cornu ammonis 3 (CA3), enthorinal cortex (EF), perirhinal cortex (PC), og subiculum (SUB). Referenceelektrode er skematiserede som trekant markør. Elektroder omringet i punkterede linjer repræsenterer XY koordinater for billedet, glatning. (B) raster fange for GUI under live MEA kortlægning. Flowdiagram til venstre af separation angiver den trinvise procedure til følge. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Klik på knappen Gennemse for at indlæse billedet af hjernen skive. Sørg for, at referenceelektrode vises i den øverste række af til venstre halvdel af MEA (figur 2A, trekant mark). Klik på knappen Aktivere markøren , og vælg de øverste og nederste elektroder i rækken længst til venstre for matrixen til at markere XY koordinater for billede glatning og elektrode kortlægning.
  2. Vælg vandretfra rullemenuen udsnitstype . Marker afkrydsningsfeltet standard strukturer .
    Bemærk: Det er muligt at tilpasse strukturer ved at vælge knappen Angiv nye strukturer . Standard strukturer for horisontale hjernen skive er afbildet i figur 2A.
  3. Ved hjælp af de nummererede trykknapper under hjernen skive billede, Vælg elektroderne svarer til Investeringsafkastet og klik på den tilsvarende trykknap i panelet strukturer til at tildele dem (figur 2B); Gentag dette trin for hver ROI.
  4. Tryk på knappen Gem : softwaren genererer en resultatet mappe med navnet #EXP_LabelledElectrodes der indeholder en tabel rapportering valgte elektroder og ROIs.

13. optagelse og elektriske graduering af Epileptiform aktivitet

  1. Tillad hjernen skive at stabilisere inden for optagelse salen for 5-10 min før optagelse.
  2. Drej på stimulus enhed mindst 10 min. før stimulation protokollen at tillader selvstændig kalibrering og stabilisering. Start stimulus kontrol software og kontrollér, at stimulator og MEA forstærker er korrekt tilsluttet som angivet af en grøn LED i de vigtigste panel af stimulus kontrol software. Henvises til manualerne af specifikke instrumenter og software for yderligere detaljer, cf. Materialer tabel.
  3. Nedsat stimulation i bipolar konfiguration. Vælg elektrode par i kontakt med den pyramideformede cellelag af de CA1/proksimale subiculum (jf.24,25) blandt de kortlagt med script mapMEA (jf. afsnit 12). Bruge en ledning til at forbinde en af de valgte elektroder til den negative stik af stimulatoren og anden elektroden til den positive stik af den samme stimulator kanal. Brug en anden ledning til jorden af stimulatoren til jorden af forstærkeren.
  4. Start optagelse software. For at erhverve data, skal du trykke på knappen Afspil i de vigtigste panel af optagelse software. Optage mindst 4 ictal udledninger.
    Bemærk: En sampling hyppighed af 2 kHz kan erhverve felt potentialer med rimelig opløsning og minimere hard disk plads skik. En 5-min recording-fil tager ~ 80 MB. Højere samplingsfrekvenser kan være nødvendig, fxtil at optage stimulus artefakter eller multi-enhed aktivitet. Observere felt potentialer kun, bruge en levende low-pass filter ved 300 Hz til at afskære multi-enhed aktivitet.
  5. Bestemme stimulus intensitet.
    1. I stimulus kontrol software, skal du bruge de vigtigste panel til at designe en firkantet bifasisk positive-negative Aktuel puls varighed af 100 µs/fase.
      Bemærk: forsigtighed! Jævnstrøm stimulation kræver en afbalanceret afgift puls til at undgå at beskadige udstyret.
    2. Køre en hurtig input/output (I/O) test for at identificere de bedste stimulus intensitet. Levere stimulation pulsen designet på trin 13.5.1 på 0,2 Hz eller lavere ved at tilføje et Inter puls interval på 5 s eller længere i den relevante form af stimulus kontrol software. Angiv en indledende puls amplitude af 100 µA/fase i fanen puls amplitude og øge af 50-100 µA trin på hvert forsøg indtil stimulation kan pålideligt fremmane interictal-lignende begivenheder i parahippocampal cortex (check signaler visualiseret ved den optagelse software).
  6. Elektriske graduering af limbiske ictogenesis
  7. Programmet stimulus enhed til at levere stimulation protokollen af interesse. Bruge stimulus amplitude identificeret under I/O test.
    Bemærk: Fejlrate af evoked svar skal være ≤20%.
  8. Efter stimulation stopper, skal du kontrollere netværk gendannelse til før stimulus tilstand ved at optage mindst 4 ictal udledninger (som i trin 13.4).

Representative Results

Planar MEAs med 6 x 10 500 µm elektrode afstand for layout og er den ideelle optagelsesenhed for eksperimentel protokollen beskrevet her, da deres optagelse område strækker sig over hele hjernen skive i sin helhed (figur 3A, se også17). Selvom perforeret MEAs (pMEAs) ville være at foretrække at forbedre væv iltning, deres optagelse område er for lille (~ 2 mm i diameter). Dette tillader ikke den samtidige visualisering af elektriske signaler genereret af hippocampus og parahippocampal cortex (data ikke vist; Se18).

Observerede 4AP-induceret epileptiform mønster (figur 3A) gengiver trofast hvad er typisk observeret i denne in vitro- model ved hjælp af konventionelle felt potentielle optagelse og består af tre typer af aktivitet7, 26: (jeg) ictal-lignende begivenheder (figur 3B, pilespidser) er robuste langvarige (> 20 s, sortiment: 20-60 s) begivenheder der ligner de electrographic funktioner af beslaglæggelse aktivitet med tonic og kloniske komponenter (figur 3 c); de er dannet inde parahippocampal cortex hvert 3-5 min og genindtaste hippocampus dannelse gennem den dentate gyrus (figur 3D, pil); (ii) langsom interictal-lignende udledninger (figur 3B, EF spor, sorte bjælke, udvidet i figur 3E) er korte (< 1 s) befolkning begivenheder genereret mellem ictal begivenheder allestedsnærværende i hippocampus-EF hjernen skive forberedelse og forekomme i et langsomt tempo (range 10-30 s); (iii) hurtiginterictal-lignende udledninger (figur 3B, CA3 spore, sorte bjælke; udvidet i figur 3E) er tilbagevendende brief (< 1 s) befolkning begivenheder genereret af CA3 hippocampus subfelt; Når Schaffer soeskende er bevaret, hurtigt CA3-drevet interictal begivenheder udbrede langs hippocampus løkken og udøve en anti-ictogenic effekt24 (data ikke vist); for at forhindre ictal aktivitet nedslidte, med henblik på den beskrevne protokol, CA3 output er forstyrret (jf. figur 3B, E). Det skal bemærkes, at den hurtigt CA3-drevet interictal aktivitet registreres ved hjælp af multilaterale miljøaftaler forekommer langsommere (~ 0,4 Hz) end hvad er observeret ved hjælp af konventionelle felt potentiale optagelse med glas pipetter (~ 1 Hz, rækkevidde: 0,5 - 2,0 Hz, data ikke vist).

Det vellykkede resultat af elektriske Neuromodulationsbehandling i gnavere hjernen skiver afhænger aktivering af specifikke neuronal veje27 sammen med den iboende tilslutning blandt de regioner, der er inkluderet i den forberedelse24. Vi har testet skiver fremstillet af voksne mandlige Sprague-Dawley rotter og CD1 mus og vi har fundet at musen i stedet for rat brain skiver tilbyder den bedste afvejning mellem størrelse og tykkelse samt iboende connectivity. Først, takket være deres størrelse, de passer området små optagelse af kommercielt tilgængelige MEAs bedre (figur 4A, venstre: rotte, højre: mus); for det andet, de er mere modstandsdygtige over for den ufordelagtige betingelse, der er iboende til MEA optagelse (jf. indledningen): selv om ictal-lignende udledninger genereret af disse to væv (figur 4B) er af samme varighed ()Figur 4 c venstre), deres forekomst er betydeligt kortere i mus hjernen skiver (n = 10 skiver arter; 2-tailed uparret t-test, p < 0,001; Figur 4 c ret). Sidstnævnte giver mulighed for fremskyndelse de eksperimentelle protokoller, gør det muligt at afprøve et større antal hjernen skiver under en enkelt eksperimenterende dag: for dette sæt af repræsentative resultater, kunne vi prøve et tilsvarende antal hjernen skiver fra de to arter (rotte: n = 58; mus: n = 52), men antallet af mus (n = 18) var 2-fold mindre end antallet af rotter (n = 42).

Derudover mus hjernen skiver synes at præsentere med tættere forbindelser og er derfor mere tilbøjelige til at reagere bedre på vedvarende elektriske Neuromodulationsbehandling (figur 4D). Således i denne in vitro- model af ictogenesis er levedygtighed for elektrisk stimulation med henblik på at kontrollere ictal aktivitet betydeligt større for mus end for rotte hjernevæv. Dette aspekt er også afspejlet af betydeligt højere succesrate på stimulation eksperimenter udført ved hjælp af musen versus rotte hjernen skiver, selv når forfølger flere vedvarende stimulering protokoller ()figur 4E). I virkeligheden, vises mus hjernevæv bedre modstå vedvarende elektrisk stimulation som foreslået af den højere overlevelsesrate inden for den testede eksperimentelle tidsramme af 4 h (figur 4F). Således, den mindre størrelse sammen med bedre bevarelse af iboende connectivity gør musen hjernen skiver den bedste kandidat til at udføre MEA optagelse med henblik på at studere hippocampus-parahippocampal netværk interaktioner og evaluere elektriske Neuromodulationsbehandling protokoller, der er relevante for TLE.

Periodiske pacing leveret i CA1/subiculum er kendt for at styre limbiske ictogenesis i 4AP-behandlede hippocampus-EF skive forberedelse24,25,27, med 1 Hz som den mest effektive frekvens27. Derfor er det også nyttigt som positiv kontrol at evaluere effekten og effektiviteten af andre Neuromodulationsbehandling politikker (Se for eksempel25). Som nævnt ovenfor, elektriske impulser leveret direkte gennem MEA (dvs.uden brug af en ekstern stimulerende elektrode) kan fremkalde befolkning svar i gnavere hjernevæv (Se også28). Tilstrækkelig konservering af neuronal netværk connectivity i hjernen skive, præcis positionering af hjernen skive på MEA, og det korrekte valg af stimulerende elektrode par giver mulighed for at forfølge elektriske Neuromodulationsbehandling eksperimenter, effektivt at kontrollere ictogenesis. Som vist i figur 5A, det er muligt at gengive de kanoniske 1 Hz periodiske pacing protokollen ved hjælp af planar MEAs, både som en optagelse og en stimulerende enhed, med den ekstra fordel, at effekten af elektrisk stimulation kan visualiseres i hele den hjernens væv afsnit med et højere antal ligeligt fordelte observationspunkter i forhold til konventionelle felt potentielle optagelse. Figur 5B viser kvantificering af resultaterne for n = 9 hjernen skiver, der viser en betydelig reduktion af den samlede beslaglæggelse tid (samlede ictal aktivitet varighed/observation tid25) under stimulation (én måde-ANOVA, F(df): 6.84(2), p < 0,01, Fisher's LSD post hoc test, beskyttet). Resultaterne er i overensstemmelse med litteraturen for eksterne stimulerende elektroder24,25.

Til at beregne den samlede beslaglæggelse observation tid afhænger af intervallet mellem ictal begivenheder, og det bestemmer også minimumsvarigheden af stimulation protokol skal trygt vurdere virkningerne af Neuromodulationsbehandling. Vi finder, at optage mindst 4 ictal udledninger (og dermed mindst 3 intervaller mellem ictal begivenheder) er en god afvejning mellem indsamlede prøver og krævede afhentningstidspunkt. I kontrol tilstand (dvs., ingen stimulation) er observationsperiodens tidsforskydning mellem starten af den første målte ictal arrangement og afslutning af den sidste ene. Under Neuromodulationsbehandling svarer observationsperiodens stimulus protokol varighed, da formålet med målingen er at kvantificere fænomener forekommer i hele den tid, den undertrykkelse af netbårne er indført i systemet. Computing og sammenligne den samlede beslaglæggelse tid i stedet for varighed og interval af ictal begivenheder er den mest hensigtsmæssige parameter hen til undgå type II fejl. I virkeligheden, sammen med fuldstændig undertrykkelse af ictal aktivitet er det også muligt, at kun én ictal begivenhed er genereret ved elektrisk stimulation i modsætning til de flere begivenheder observeret i kontrol tilstand. I dette tilfælde måle intervallet mellem begivenheder er ikke muligt, repræsenterer måling ictal varighed som en estimator stimulation effektivitet ikke det faktiske resultat af Neuromodulationsbehandling (dvs., ictal aktivitet reduktion).

Samlet set viser resultaterne præsenteres her, at musen hjernen skiver koblet til multilaterale miljøaftaler er værdifulde værktøjer til epilepsi forskning og til at udføre pålidelige Neuromodulationsbehandling undersøgelser, der er relevante for fremskridt inden for DBS for epilepsi behandling. Derudover protokollen beskrevet her forbedrer hjernens skive levedygtighed og giver mulighed for at forfølge eksperimentelle sessioner i flere timer (figur 6), som kan være nødvendige, eksempelvis for at sammenligne effekter af forskellige elektrisk stimulation paradigmer.

Figure 3
Figur 3 : Typisk 4AP-induceret epileptiform mønster visualiseret med planar ventetid (A) mus hjerne skive placeret på en planar 6 x 10 MEA (elektrode afstanden: 500 µm) og side-by-side oversigt over 4AP-induceret epileptiform mønster visualiseret med MEA optagelse. Hvert kvadrat i gitteret rummer aktivitet registreret på det tilsvarende sted i hjernen skive. Stiplede blå linjer henviser til elektrode rækker til mere klarhed. Optagelse elektrode antallet er identificeret i blå i det øverste venstre hjørne af hver firkant. Den grå krydset firkantet repræsenterer referenceelektrode. (B) repræsentative trace segmenter af EF og CA3 mønstre visualiseret på en hurtigere tidsskala. Pilespidser angive ictal begivenheder. I sporingen af EF er det muligt at vurdere forekomsten af langsomme interictal udledninger (sorte bjælke), mens CA3 subfelt genererer typisk vedvarende fastinterictal mønster (sort bar). (C) udvidet optagelse af en ictal decharge viser den typiske tonisk-kloniske mønster. (D) Fast-skala visualisering af pre-ictal-til-ictal overgangen svarende til EF (rød) og CA3 (sort) trace segmenter præget af den røde bar i (B). Pilen angiver starten af ictal decharge. De overlejrede spor fremhæve at hændelsen ictal stammer i EF og derefter overfører til CA3 subfelt. (E) den udvidede visning af interictal perioder præget af de sorte bjælker i (B) fremhæver manglen sammenhæng mellem den langsomme og fastinterictal mønstre genereret af EF (rød) og CA3 (sort), henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Musen hjernen skiver tilbyder en højere eksperimentelle output end rotte hjernen skiver. (A) hjerne skær fra en rotte (venstre) og en mus (til højre) af matchede aldre. Rotte hjernen skive er meget større end areal, MEA optagelse og dens elektriske aktivitet kan visualiseres i fuld. (B) direkte visuel sammenligning af tilbagevendende ictal aktivitet genereret af mus og rotter enthorinal cortex (EF). (C) Mus og rotter hjernen skiver generere ictal udledninger af samme varighed, men intervallet mellem disse begivenheder er næsten 2-fold i rotte hjernevæv. * p < 0,05. (D) i forhold til rotter, mus tilbyder en 2-fold højere udbytte af hjernen skiver rentabelt for elektrisk stimulation eksperimenter med henblik på kontrol af ictogenesis. Elektrisk stimulation af subiculum kunne fremkalde befolkning svar i parahippocampal cortex i kun 20 58 (34%) rotte hjernen skiver, i modsætning til 33 52 (63%) mus hjernen skiver (Chi2: 9.22; p = 0,002). p < 0,05. (E) blandt levedygtige skiver, succesrate i at kontrollere ictal aktivitet er 2-fold med musen versus rotte hjernen skiver (mus: 20 af 33 hjernen skiver, 60%: rotte: 6 af 20 hjernen skiver, 30%; Chi2: 4,67; p = 0,03). p < 0,05. (F) mus hjernen skiver kan modstå gentaget langvarig epoker af vedvarende elektrisk stimulation (grå skygge områder). Ved stimulus udbetaling, mus hjernevæv udviser fuld tilbagebetaling af epileptiform mønsteret, mens rotte hjernen væv levedygtighed falder dramatisk på 3 h. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Repræsentant eksperiment af elektriske graduering af ictogenesis ved hjælp af hjernen skiver koblet til ventetid (A) optagelser af 4AP-induceret ictal aktivitet i EF og PC under kontrol tilstand (ingen stimulation), periodiske pacing (PP) ved 1 Hz (stimulus artefakt er afkortet), og under genoprettelse ved stimulus udbetaling. (B) kvantificering af effekten af PP ved 1 Hz på den samlede beslaglæggelse tid. p < 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Repræsentant langsigtede optagelse af 4AP-induceret ictal aktivitet. (A) Trace segmenter indspillet 8 efter hjernen udskæring procedure og følgende 2 h af 4AP ansøgning. (B) udvidet spore segmenter svarer til de boxed ictal udledninger identificeret ved de bogstaver en, b, og c i panelet (A) Vis sammenhængen i genererede ictal aktivitet hele langvarig observation tid-enke. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Stock A Kemiske Molekylær vægt Koncentration (mM)
NaCl 58.44 1150
Opløsningsmiddel: destilleret vand KCl 74.55 20
Koncentrat: 10 x  KH2PO4 136.1 12.5
Temperatur ved opbevaring: 4 ° C CaCl2* 2 H2O 147.02 20
Maksimal opbevaringstid: 1 uge D-glukose 180.2 250
Bemærk: filtrere ved hjælp af en 50 mm membranfilter
Stock B Kemiske Molekylær vægt Koncentration (mM)
NaHCO3 84.01 260
Opløsningsmiddel: destilleret vand
Koncentrat: 10 x 
Temperatur ved opbevaring: 4 ° C
Maksimal opbevaringstid: 1 uge
Bemærk: filtrere ved hjælp af en 50 mm membranfilter
Stock C Kemiske Molekylær vægt Koncentration (mM)
KCl 74.55 20
Opløsningsmiddel: destilleret vand KH2PO4 136.1 12.5
Koncentrat: 10 x MgCl2* 6 H2O 203.3 50
Temperatur ved opbevaring: 4 ° C MgSO4* 6 H2O 246.47 20
Maksimal opbevaringstid: 2 wks CaCl2* 2 H2O 147.02 5
Bemærk: filtrere ved hjælp af en 50 mm membranfilter
Lager M Kemiske Molekylær vægt Koncentration (mM)
MgSO4* 6 H2O 246.47 100
Opløsningsmiddel: destilleret vand
Koncentrat: 100 x
Temperatur ved opbevaring: 4 ° C
Maksimal opbevaringstid: 4 wks
4AP lager Kemiske Molekylær vægt Koncentration (mM)
4-aminopyridine 94.11 250
Opløsningsmiddel: destilleret vand
Koncentrat: 1000 x
Temperatur ved opbevaring: 4 ° C
Maksimal opbevaringstid: 2 wks
Bemærk: vortex for 2-3 min. eller stirr for 30-60 min
Bemærk: forsigtighed! 4-AP er giftige og cinvulsant. Brug handsker og undgå spredning eller spilde.

Tabel 1: Lager løsninger.

HOLDER ACSF OPTAGELSE ACSF SKÆRING ACSF
Kemiske C [mM] Kemiske C [mM] Kemiske C [mM]
NaCl 115 NaCl 115 Saccharose 208
KCl 2 KCl 2 KCl 2
KH2PO4 1,25 KH2PO4 1,25 KH2PO4 1,25
MgSO4 1.3 MgSO4 1 MgCl2 5
CaCl2 2 CaCl2 2 MgSO4 2
D-glukose 25 D-glukose 25 CaCl2 0,5
NaHCO3 26 NaHCO3 26 D-glukose 10
L-ascorbinsyre 1 L-ascorbinsyre 1 NaHCO3 26
L-ascorbinsyre 1
pH 7.4 pH 7.4 Pyrodruesyre syre 3
Osmolalitet 300 mOsm/Kg Osmolalitet 300 mOsm/Kg
pH 7.4
Osmolalitet 300 mOsm/Kg

Tabel 2: Løsninger sammensætning.

Fejlfinding
SPØRGSMÅL MODFORANSTALTNINGER
Ictal udledninger ser "chunked" Formindske perfusion sats og/eller sænke den ACSF over hjernen udsnit ved at justere positionen suge nål.
Ingen ictal aktivitet (1) Kontroller, som CA3-drevet hurtigt interictal begivenheder ikke overføres til cortex. Brug en lille skalpel klinge (f.eks. n.10) eller en nål til at afskære Schaffer soeskende hvis skal være, men pas på ikke at skære nylon tråde af skive hold-down anker. En stereo- eller opretstående mikroskop er bedst egnet, mens omvendt mikroskopet gør denne opgave meget vanskelig.
(2) kontrollere skive levedygtighed: stærk elektrisk stimulation udløse ictal aktivitet? Vente indtil omkring 2 h af 4AP program, så ændre hjernen skive hvis ictal aktivitet ikke forekommer.
Hjernen skive flytter når markedsføring hold-down anker (1) forsigtigt fjerne udsnit anker og flytte hjernen skive.
(2) kontrollere, at skive anker er jævnt våd af 4AP-ACSF.
(3) fjerne 4AP-ACSF fra optagelse kammer at favorisere hjernen skive vedhæftning til MEA.
(4) flytte skive hold-down anker.
Hjernen skive svæver på MEA chip efter overføres (1) Aspirér forsigtigt overskydende ACSF med Pasteur pipette.
(2) the MEA chip måske skal være re-coatede.
Elektrisk stimulation fremkalde ikke netværk svar Øge stimulus intensitet, ændre elektrode par.
Elektrisk stimulation kan fremkalde befolkning svar i de proksimale men ikke distal kortikale områder Spørgsmålet er ikely på grund af dårlig forbindelse eller for lav stimulus intensitet. Elektrisk stimulation kan være ineffektive eller effektiv i nogle kortikale områder kun. Det anbefales at ændre hjernen skive.
Signalet er støjende (1) check referenceelektrode: støjende baseline kan til tider være forårsaget af ufuldstændige fyld af inlet reservoir, sådan at referenceelektroder gør ikke helt dybt ind i ACSF.
(2) kontrollere den samlede grundstødning af udstyr.
(3) Juster positionen suge nål for at høre en konstant, bløde suge lyden. Jorden suge nålen.
(4) ren MEA eksterne kontaktpersoner med ethanol ved hjælp af en vatpind.
(5) den MEA chip kan blive beskadiget: ændre MEA chip og kontrollere artefakter og signal / støj-forhold.

Tabel 3: fejlfinding.

Discussion

MMA er et uvurderligt værktøj for neurofysiologi undersøgelser og har nået modenhed i de seneste år takket være årtiers udforskning og udvikling. I forhold til konventionelle felt potentielle optagelse tilbyde foran den store fordel af et højere antal observationspunkter og kendte Inter elektrode afstanden, som er afgørende for præcist lokalisere neuronal netværk interaktioner.

MEA optagelse teknik kan også være koblet til andre Elektrofysiologi tilgange, såsom patch-clamp optagelse15, at undersøge forholdet mellem enkelt neuron og neuronal netværksaktivitet. Desuden kan mulighed for at visualisere felt potentialer og multi-enhed aktivitet samtidig give værdifuld indsigt i sammenhængen mellem aktiviteten af små neuronal ensembler og kollektive neuronal netværk. Kombination med spænding-følsomme farvestoffer, calcium imaging og optogenetics29 giver udlede neurofysiologi fænomener ved hjælp af polyeder tilgange. Ud over farmakologiske undersøgelser, mulighed for at udføre både optagelse og stimulation med det samme system gør MEA optagelse teknik meget kraftfulde og alsidige: for eksempel, det er muligt at studere synaptisk plasticitet fænomener i den kernen i hukommelse dannelse30, ved hjælp af protokollerne Neuromodulationsbehandling præsenteres her, som er relevante for DBS til behandling af epilepsi og en bred vifte af hjernen lidelser. De seneste beviser MEA optagelse teknik kan være anvendt med succes til epileptiske menneskehjerne væv16 viser sin uvurderlig nytte i epilepsi forskning, både for at forstå de grundlæggende mekanismer, der ligger til grund for denne ødelæggende sygdom og finjustere DBS algoritmer for at rette op på det.

Imidlertid MEAs tvinge udøvelse af Elektrofysiologi eksperimenter under «begrænse» betingelserne for hjernen skiver, på grund af kravet om en neddykket optagelse kammer og nødvendigheden af at lade hjernen skær resten på den fast substrat hvor mikro-elektroder er integreret. Således, hjernevæv kan ikke modtage tilstrækkelig ilt levering, hvilket igen kan påvirke kvaliteten af optagelserne.

Protokollen beskrevet her tillader at pålideligt registrere og studere ictogenesis i gnavere limbiske netværk koblet til MEAs ved hjælp af akut in vitro-4AP model og at forfølge langvarig epoker af elektrisk stimulation, der kan give relevante oplysninger til evaluering DBS politikker.

Tidligere undersøgelser på elektriske Neuromodulationsbehandling af epileptiske limbiske netværk baseret på brugen af konventionelle felt potentielle optagelse har brugt enten mus eller rotte hjernen skiver med lignende resultater24,25; men brugen af rotte hjernevæv viste sig at være mere udfordrende, rimeligt på grund af de svagere connectivity i forhold til hjernevæv fra mus7. Med hensyn til MEA teknik er mus hjernen skiver bedst egnet i kraft af deres størrelse. Derudover er gives højere forekomst af ictal-lignende udledninger i mus versus rotte hjernevæv, det muligt at teste betydeligt mere hjerne skiver hele en eksperimenterende dag, hvilket igen gør dataindsamling hurtigere og mere effektiv, og kan reducere antallet af forsøgsdyr.

Betydning med hensyn til eksisterende metoder:

Ictal udledninger registreres ved hjælp af den brugerdefinerede kammer beskrevet her synes at være lignende i varighed og satsen for forekomst til dem, der observeres ved hjælp af konventionelle MEA ring kammeret og den samme MEA type (planar mikro-elektroder, jf. 17). Det skal dog understreges, at hjernen skive tykkelse skal reduceres betydeligt, når ved hjælp af konventionelle runde optagelse mødesalen sammen med en lav perfusion sats (1 mL/min), som kan hindre en vellykket udøvelse af Neuromodulationsbehandling eksperimenter skyldes dårlig forbindelse.

I denne protokol giver en lav-volumen brugerdefineret indtaling kammer inspireret af patch-clamp optagelse kammer design stabil og pålidelig laminar flow, der er afgørende for vellykket udøvelse af MEA optagelser; Det giver også øget hjerne skive tykkelse til 400 µm for at opnå en rimelig afvejning mellem væv levedygtighed og iboende connectivity. Det er faktisk anerkendt at laminar flow af optagelse løsning inden for sal er meget ønskeligt, om hjernen skive Elektrofysiologi, da det påvirkes ikke af temperatur, ilt, og pH forløb, der er observeret i cirkulære-flow runde optagelse kamre19,20,31 (som dem forsynet med kommercielt tilgængelige MEA). Sådan forløb indføre eksperimentelle bias og er også skadeligt for hjernen skive. Optagelse kamre i en relativt lille volumen (~1.5 mL) sammen med en høj perfusion sats (5-6 mL/min)16,31 mulighed for passende udveksling af perfusion medium (≥3 gange / min). Den brugerdefinerede salen kan være let fra kommercielle kilder til en overkommelig pris eller produceres internt ved hjælp af 3D udskrivning teknologi. Andre undersøgelser har rapporteret MEA optagelser fra 400 µm tykt menneskelige hjerne skiver16 ved hjælp af de konventionelle MEA ring kammer, samtidig med at holde ACSF volumen til 1 mL og håndhæve en høj perfusion sats (5-6 mL/min) ved hjælp af en simpel-larmen peristaltisk pumpe. Men forfatterne har anvendt en anden model af ictogenesis, dvs., de lave Mg2 +, som er sandsynligvis mindre påvirket end 4AP model af ephaptic mekanismer der indebærer betydelige stigninger i ekstracellulær koncentration, K+ 11 , 22. vi har fundet, at en høj perfusion ikke er ønskeligt i 4AP model, muligvis på grund af den hurtige vaskes ud af akkumulerede ekstracellulære K+, som muligvis skal forøges betydeligt i indspilning ACSF16. Faktisk syntes ictal begivenheder mere "chunked' når ASCF perfusion hastighed blev forøget til 2-3 mL/min og hjernen skive blev oversvømmet af en tyk ACSF lag, der henviser til, at fuld-blæst udledninger udstiller robust tonisk-kloniske komponenter kunne genoprettes efter tilbagevenden til en lavere perfusion sats (1 mL/min) og en tyndere ACSF lag lige ved væv overflade niveau (data ikke vist). Brugerdefineret indtaling salen beskrevet i denne protokol giver mulighed for at udveksle perfusion medium 3 - 5 gange / min med en væskehastighed på 1 mL/min. Således er samlede ilttilførslen til hjernen skiver stærkt forbedret selv ved relativt lave perfusion satserne, samtidig stadig sikre en stabil temperatur og høj signal-støj-forhold. Vigtigst af alt, er det muligt at holde den ekstracellulære K+ koncentration til en fysiologisk værdi.

4AP model af ictogenesis kræver ikke nogen væsentlig ændring af ACSF Ioniske sammensætning, såsom sænkning Mg2 + eller stigende K+, og byder på den unikke fordel med både excitatoriske og hæmmende transmissioner intakt 12, et aspekt, som er yderst relevante i epilepsi forskning i lyset af den afgørende rolle af både glutamatergic og GABAergic netværk i epileptiform synkronisering (jf. 7). 4AP-ACSF anvendes i denne protokol indeholder en fysiologisk K+ koncentration (3,25 mM) og en lidt lavere Mg2 + koncentration end bedrift ACSF (1 mM versus 1,3 mM). Denne koncentration stadig henhører under de rapporterede fysiologiske værdier i Mg2 + koncentration i gnaver CSF og det anvendes i mange laboratorier (Se for eksempel17,18). Formålet med den beskrevne protokol, har vi fundet, at denne mindre nedgang er foretrukket til støtte for 4AP virkning.

I tidligere arbejde, er 4AP blevet anvendt til hjernen skive, når det var allerede placeret inde optagelse afdeling17,18. Medmindre eksperimentatoren skal observere tid latenstiden mellem programmet 4AP og udbrud af epileptiform mønstre, finder vi, at denne tilgang er temmelig tidskrævende og er ikke egnet til at forfølge langvarig optagelse og stimulation sessioner beskrevet i denne protokol. Præ-inkubation af hjernen skiver i 4AP ved 32 ° C giver mulighed for besparende meget eksperimenterende tid, da hjernen skiver kan blive forbehandlet i serien samtidig føre eksperimentet ved hjælp af andre væv sektioner.

Hjernen skiver langvarig levedygtighed kan være nyttigt at analysere netværksfunktioner på lang sigt. Deres bedre modstandskraft over for gentagne elektrisk stimulation er desuden af stor fordel hvis eksperimentatoren ønsker at sammenligne flere stimulation protokoller, som skal udføres i den samme hjerne skive for statistiske robusthed. I vores hænder, når du tester 3 stimulation protokoller, hver efterfulgt af en kontrol fase og efterfulgt af en genopretningsfasen, eksperimentet kan vare 3-5 h. I denne forbindelse er live MEA kortlægning afgørende for at aktivere den korrekte sti og undertrykke snarere end at favorisere ictogenesis via elektrisk stimulation. Vores brugervenlig GUI repræsenterer en hurtig, enkel og fleksibel værktøj til at kortlægge elektroderne på forskellige hjernestrukturer. I modsætning til kommerciel software er det muligt at tilføje brugerdefinerede MEA layouts selv med grundlæggende programmering færdigheder. Billeder kan erhverves i lysfelt; eventuelle generelle formål kamera, der har god opløsning og passer på et mikroskop er således velegnet. En inverteret mikroskop er afgørende for at visualisere microelectrodes position i forhold til hjerne-skive, da disse vil være skjult under vævet hvis bruger en opretstående mikroskop. Et stereo-mikroskop anbefales dog ud over typen omvendt hvis eksperimentatoren skal udføre kniv-nedskæringer for at forstyrre specifikke neuronal veje.

Endelig, en yderligere fordel af den foreslåede tilgang er den billige og forholdsvis let forsamling for de fleste af de nødvendige værktøjer, som brugerdefineret indtaling kammer og bedrift kamre, varmt bad og skive anker samt den unødig brug af et dyrt støjsvage peristaltisk pumpe.

Begrænsninger af teknikken:

MEA optagelse tillader ikke visualisere meget langsom bølger, dvs, DC forskydninger i signalet. Sådanne baseline omlaegninger kan hjælpe asymptotiske måling af ictal decharge varighed, og mest vigtigt, de er grundlæggende at studere kortikale sprede depression (et fænomen, der vedrører pludselig uventet død i epilepsi32 og deles mellem epilepsi og migræne33).

Med hensyn til elektriske Neuromodulationsbehandling tillader protokollen beskrevet her udfører flere stimulation sessioner uden at påvirke hjernen skive levedygtighed. Vi kunne med held udføre op til 3 stimulation sessioner af 20-45 min, svarende til hvad rapporteret i tidligere arbejde25. Selv om hjernen skiver kan sandsynligvis klare et højere antal stimulation sessioner eller længere stimulation protokoller, har vi ikke teste hjernen skiver i denne henseende. Vi anbefaler, at begrænse antallet af stimulation protokoller til 3 og undgå langvarig (≥60 min) stimulation sessioner, som væsentligt kan understrege hjernevæv vedligeholdes disse betingelser grænse, op til manglen inddrivelse ved stimulus udbetaling.

Kritiske trin i protokollen:

Flere kritiske faktorer kan hindre vellykket udøvelse af optagelse og graduering af epileptiform aktivitet i hjernen skiver koblet til MEA. Udover de gnavere arter anvendes og kvaliteten af hjernen skiver, perfusion rate under optagelse og dynamikken i ACSF flow (dvs., laminar versus cirkulære) inden for optagelse kammer, har vi fandt, at betingelserne for inddrivelse og langsigtede vedligeholdelse af hjernen skiver samt mode 4AP anvendelse er de mest kritiske trin.

Når du bruger en neddykket bedrift kammer er det afgørende at gemme hjernen skiver ved stuetemperatur til at bevare hjernens væv netværksaktivitet og favorisere induktion af ictal-lignende udtømning af 4AP ansøgning. I vores hænder forringet genopretning og vedligeholdelse ved 32 ° C hjernevæv inden for 3-4 h af udskæring.

Inkubation af hjernen skiver i 4AP-ACSF ved stuetemperatur og optagelse ved 32 ° C er imidlertid ikke ønskeligt. Vi har fundet mange vanskeligheder med at overholde robust tilbagevendende ictal udledninger i denne tilstand. Faktisk, lave temperaturer i området 20-24 ° C er blevet rapporteret til at dæmpe eller endog forhindre 4AP-induceret ictogenesis både in vitro34 og i vivo35. Således 4AP inkubation og optagelse temperaturer skal ligge inden for 30-34 ° C og skal følges. For at undgå at sætte hjernevæv under for meget stress på grund af den samtidige induktion af hyperexcitabilitet 4AP og den pludselige eksponering af hjernen skiver fra stuetemperatur til varme (32 ° C) 4AP-ACSF, er det afgørende at udføre en mellemliggende præ-opvarmning trin og lad skiverne er hjernen habituate på bedrift ACSF ved 32 ° C i 20-30 min. springe dette trin kan påvirke ictogenesis induktion af 4AP.

Et andet aspekt, der skal nævnes, er betydningen af D-glukose koncentration i ACSF efter udskæring. En 25 mM koncentration bevarer hjernen skiverne er bedre end 10 mM koncentrationen anvendes i mange laboratorier og det forbedrer også satsen for forekomst af ictal aktivitet, som er 2-fold hurtigere (dermed, gøre det lettere at føre en lang række eksperimentelle protokoller i flere hjernen skiver hver dag).

Endelig, nogle vigtige fine detaljer under den udskæring procedure skal nævnes. Først, lad ikke de intakte hjernen og hjernen skiver til at fryse i kolde skære ACSF. Nedkøling hjernen for < 2 min er nok givet den lille størrelse af musen hjernen. Væv sektioner skal overføres straks fra pufferkar til de føres bægre ved stuetemperatur. Skylning opskæring er ACSF meget vigtigt, ellers den høje saccharose vil gøre hjernen skiver stick til nylon mesh bedrift kammer. Du kan effektivt skyl væv, er det vigtigt at minimere opskæring ACSF indhold inden for overførsel pipette så ikke forurene bedrift ACSF overdrevent. 2-trins skylning aids i at minimere kontaminering. Efter afslutningen af proceduren for udskæring, skal væv sektioner overføres straks fra de føres bægre til bedriften kammer, hvor den bløde nylon mesh suspenderede halvvejs i bedriften ACSF tillader væv iltning på begge sider. Samme princip bør anvendes på alle stadier proceduren udskæring: hjernen skiver skal aldrig sidde i bunden af bægerglasset, bør de ikke være i kontakt med siderne af bedriften kamre, og de bør aldrig være i kontakt med hinanden eller overlapning.

Ændringer og fejlfinding:

ACSF sammensætning kan ændres efter den eksperimentatoren behov. For eksempel kan medicin tilføjes for at dissekere bidrag af specifikke neurotransmittere eller Ionkanaler til effektiviteten af elektriske Neuromodulationsbehandling. Derudover kan pyrodruesyre og ascorbinsyre (jf. tabel 2) udelades, selv om vi finder, at de udøver en kraftfuld neuroprotektive rolle. I tabel 3 rapport vi de mest almindelige problemer, der kan opstå i denne protokol og hvordan man kan håndtere dem.

Konklusioner:

MEA optagelse er uden tvivl en uvurderlig teknik til at løse interaktionerne af neuronal netværk i sundhed og sygdom. Ud over farmakologiske undersøgelser er det også muligt at evaluere elektriske Neuromodulationsbehandling protokoller, der er relevante for DBS anvendes til epilepsi og andre neurologiske lidelser. I denne protokol, har vi vist, at det er muligt at gengive typisk periodiske stimulation eksperimenter med lignende resultater til dem, der opnås med konventionelle ekstracellulære felt potentielle optagelse og eksterne stimulere elektroder. Den øgede tilgængelighed af kommercielle brugervenligt udstyr og avancerede software-værktøjer gøre MEA optagelse teknik også velegnet til lukkede kredsløb stimulation eksperimenter, at yde ad hoc- stimulation til hjernevæv og undersøge bidrag af feedbackmekanismer til neuronal netværk svar.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

G.P. er en Marie Skłodowska-Curie Fellow finansieret af EU MSCA-IF-2014 projektet Re.B.Us, G.A. n.660689, under programmet rammer H2020. GUI mapMEA er frit tilgængelig på anmodning til forfatter ilaria.colombi@iit.it.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-D-Lysine  Sigma-Adrich P7886 Needed for MEA coating
NaCl Sigma-Adrich S9888 Chemical
KCl Sigma-Adrich P9541 Chemical
KH2PO4 Sigma-Adrich 795488 Chemical
CaCl2*2 H2O Sigma-Adrich C3306 Chemical
D-Glucose Sigma-Adrich RDD016 Chemical
NaHCO3 Sigma-Adrich S5761 Chemical
MgCl2*6 H2O Sigma-Adrich M2670 Chemical
MgSO4*6 H2O Sigma-Adrich M5921 Chemical
Sucrose Sigma-Adrich RDD023 Chemical
Pyruvic Acid, 98%  Sigma-Adrich 107360 Chemical
4-aminopyridine Sigma-Adrich A78403 Convulsant drug
STG-2004 Multichannel System STG4004-1.6mA 4-channel stimulus generator with voltage (±8 V) and current output (±1.6 mA)
MEA1060 Multichannel System N/A MEA amplifier
planar MEA Multichannel System 60MEA500/30iR-Ti w/o ring Must be without ring to allow using the custom recordingchamber
McRack Multichannel System Recording software
McStimulus II Multichannel System STG4004 control software
TC02 Multichannel System TC02 2-channel thermostat
PH01 Multichannel System PH01 Heating perfusion canula
MPH  Multichannel System MPH  Magnetic holder for PH01 and suction needle
Elastostil E43 Wacker E43 Elastomeric sealant used to mount the custom recording chamber onto the MEA
MEA Custom Chamber Crisel Instrument SKE-chamber MEA Custom recording chamber
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm  Crisel Instrument 64-1309 Reference electrode for the custom recording chamber
Tergazyme Sigma-Adrich Z273287-1EA Enzymatic cleaner
MATLAB The Mathworks Programming environment for electrodemapping
VT1000S Leica Biosystems VT1000S Vibratome
Warner Instruments 64-1309 Ag-AgCl Electrode Pellet 1.0 mm (E205). Reference electrode.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fisher, R. S., et al. Operational classification of seizure types by the International League Against Epilepsy: Position Paper of the ILAE Commission for Classification and Terminology. Epilepsia. 58 (4), 522-530 (2017).
  2. WHO. Epilepsy Facts Sheet. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs999/en/ (2017).
  3. Fiest, K. M., Birbeck, G. L., Jacoby, A., Jette, N. Stigma in epilepsy. Curr Neurol Neurosci Rep. 14 (5), 444 (2014).
  4. Brodie, M. J., Barry, S. J., Bamagous, G. A., Norrie, J. D., Kwan, P. Patterns of treatment response in newly diagnosed epilepsy. Neurology. 78 (20), 1548-1554 (2012).
  5. Tanriverdi, T., Poulin, N., Olivier, A. Life 12 years after temporal lobe epilepsy surgery: a long-term, prospective clinical study. Seizure. 17 (4), 339-349 (2008).
  6. Dingledine, R. Brain slices. , Plenum Press. (1984).
  7. Avoli, M., et al. Network and pharmacological mechanisms leading to epileptiform synchronization in the limbic system in vitro. Prog Neurobiol. 68 (3), 167-207 (2002).
  8. Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. Epileptiform activity induced by changes in extracellular potassium in hippocampus. J Neurophysiol. 54 (5), 1363-1374 (1985).
  9. Mody, I., Lambert, J. D., Heinemann, U. Low extracellular magnesium induces epileptiform activity and spreading depression in rat hippocampal slices. J Neurophysiol. 57 (3), 869-888 (1987).
  10. Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nat Neurosci. 14 (5), 627-634 (2011).
  11. Pitkanen, A. Models of seizures and epilepsy. , (2017).
  12. Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. 4-Aminopyridine produces epileptiform activity in hippocampus and enhances synaptic excitation and inhibition. J Neurophysiol. 57 (6), 1911-1924 (1987).
  13. Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. A new fixed-array multi-microelectrode system designed for long-term monitoring of extracellular single unit neuronal activity in vitro. Neurosci Lett. 6 (2-3), 101-105 (1977).
  14. Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. J Neurosci Methods. 2 (1), 19-31 (1980).
  15. Reinartz, S., Biro, I., Gal, A., Giugliano, M., Marom, S. Synaptic dynamics contribute to long-term single neuron response fluctuations. Front Neural Circuits. 8, 71 (2014).
  16. Dossi, E., Blauwblomme, T., Nabbout, R., Huberfeld, G., Rouach, N. Multi-electrode array recordings of human epileptic postoperative cortical tissue. J Vis Exp. (92), (2014).
  17. Boido, D., et al. Cortico-hippocampal hyperexcitability in synapsin I/II/III knockout mice: age-dependency and response to the antiepileptic drug levetiracetam. Neuroscience. 171 (1), 268-283 (2010).
  18. Gonzalez-Sulser, A., et al. The 4-aminopyridine in vitro epilepsy model analyzed with a perforated multi-electrode array. Neuropharmacology. 60 (7-8), 1142-1153 (2011).
  19. Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
  20. Ivanov, A., Zilberter, Y. Critical state of energy metabolism in brain slices: the principal role of oxygen delivery and energy substrates in shaping neuronal activity. Front Neuroenergetics. 3, 9 (2011).
  21. MultichannelSystems. Manual PH01. , Available from: https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/PH01_Manual.pdf (2018).
  22. Zhang, M., et al. Propagation of epileptiform activity can be independent of synaptic transmission, gap junctions, or diffusion and is consistent with electrical field transmission. J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).
  23. Panuccio, G., et al. In vitro ictogenesis and parahippocampal networks in a rodent model of temporal lobe epilepsy. Neurobiol Dis. 39 (3), 372-380 (2010).
  24. Barbarosie, M., Avoli, M. CA3-driven hippocampal-entorhinal loop controls rather than sustains in vitro limbic seizures. J Neurosci. 17 (23), 9308-9314 (1997).
  25. Panuccio, G., Guez, A., Vincent, R., Avoli, M., Pineau, J. Adaptive control of epileptiform excitability in an in vitro model of limbic seizures. Exp Neurol. 241, 179-183 (2013).
  26. Benini, R., Avoli, M. Rat subicular networks gate hippocampal output activity in an in vitro model of limbic seizures. J Physiol. 566 (Pt 3), 885-900 (2005).
  27. D'Arcangelo, G., Panuccio, G., Tancredi, V., Avoli, M. Repetitive low-frequency stimulation reduces epileptiform synchronization in limbic neuronal networks. Neurobiol Dis. 19 (1-2), 119-128 (2005).
  28. Steidl, E. M., Neveu, E., Bertrand, D., Buisson, B. The adult rat hippocampal slice revisited with multi-electrode arrays. Brain Res. 1096 (1), 70-84 (2006).
  29. Pulizzi, R., et al. Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks. Sci Rep. 6, 24701 (2016).
  30. Liu, M. G., Chen, X. F., He, T., Li, Z., Chen, J. Use of multi-electrode array recordings in studies of network synaptic plasticity in both time and space. Neuroscience Bulletin. 28 (4), 409-422 (2012).
  31. Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An approach for reliably investigating hippocampal sharp wave-ripples in vitro. PLoS One. 4 (9), e6925 (2009).
  32. Aiba, I., Noebels, J. L. Spreading depolarization in the brainstem mediates sudden cardiorespiratory arrest in mouse SUDEP models. Sci Transl Med. 7 (282), 282ra246 (2015).
  33. MA, R., et al. Jasper's Basic Mechanisms of the Epilepsies . Avoli, M., Noebels, J. L., Rogawski, M. A., et al. , 4th, National Center for Biotechnology Information (US). Bethesda (MD). (2012).
  34. Motamedi, G. K., et al. Termination of epileptiform activity by cooling in rat hippocampal slice epilepsy models. Epilepsy Res. 70 (2-3), 200-210 (2006).
  35. Yang, X. F., Duffy, D. W., Morley, R. E., Rothman, S. M. Neocortical seizure termination by focal cooling: temperature dependence and automated seizure detection. Epilepsia. 43 (3), 240-245 (2002).

Tags

Neurovidenskab spørgsmålet 135 epilepsi 4-aminopyridine hjernen skive mus multielectrode array Neuromodulationsbehandling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Panuccio, G., Colombi, I.,More

Panuccio, G., Colombi, I., Chiappalone, M. Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays. J. Vis. Exp. (135), e57548, doi:10.3791/57548 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter