Summary
我们说明如何使用微电极阵列对 4-氨基吡啶诱导的啮齿动物脑切片中的癫痫活性进行记录和电调制。一个自定义记录室保持组织的可行性在长期的实验课。实时电极映射和激发对的选择由自定义图形用户界面执行。
Abstract
颞叶癫痫是最常见的部分复杂癫痫综合征, 对药物反应最少。深脑刺激 (DBS) 是一种有希望的方法, 当药理治疗失败或神经外科不建议。急性脑切片与微电极阵列 (多边环境协定) 相结合, 是研究神经网络相互作用及其电刺激调制的重要工具。与传统的细胞外记录技术相比, 它们提供了更多的观察点和已知的电极间距离的优势, 这使得研究的传播路径和电生理速度信号。然而, 在这一记录中, 组织氧合可能会受到很大的损害, 需要高的灌注率, 这是在实验温度降低信噪比和高振荡的代价。电刺激进一步强调脑组织, 使其难以追求长期记录/刺激时代。此外, 脑切片活动的电调制需要针对脑切片中的特定结构/通路, 要求电极映射在实验过程中能够轻松快速地进行。在这里, 我们说明如何使用平面多边环境协定对 4-氨基吡啶 (4 ap) 诱导的啮齿动物脑切片中的癫痫活动进行记录和电调制。我们表明, 从小鼠获得的脑组织优于大鼠脑组织, 因此更适合于实验。该协议保证了一种稳定的癫痫模式的产生和维持, 它能忠实地再现常规领域电位记录观察到的电生理特征, 持续数小时, 经久持续电刺激为长的世纪。由于使用小体积自定义记录室, 即使在低 (1 毫升/分钟) 灌注率下, 也可以实现整个实验的组织生存能力。实时监测和选择刺激电极的快速图象映射是由自定义图形用户界面 (GUI) 执行的。
Introduction
癫痫是一种危及生命的渐进性紊乱, 导致大脑的不受控制的活动1;它携带着最高的疾病负担和重要的社会耻辱2,3。这是最常见的综合征 (40%) 和最频繁 (~ 30%) 抗癫痫药物治疗4。虽然癫痫组织的手术消融可以改善病人的病情, 但在所有患者中都是行不通的, 可能不能保证完全无癫痫的生活5。在药物治疗或神经外科不合适的情况下, 电星展集团对癫痫边缘网络的调制是一种很有前途的方法。
啮齿动物脑切片是研究神经元网络如何在健康和疾病中发挥作用的重要工具6通过体外电生理学技术, 因为它们保存, 至少部分, 大脑的原始结构和连通性感兴趣的区域 (ROI)。特别是, 水平结合的海马-嗅皮质 (海马-EC) 切片构成了所涉及的必要的神经网络, 因此在体外研究中经常使用7。
通过改变人工脑脊液 (ACSF) 的离子组成, 例如降低镁, 同时增加钾8,9,10或通过药理操作, 例如阻止抑制 GABAergic 活动 (参见11进行全面审查)。然而, 这些模型是基于激励和抑制的不平衡变化;因此, 他们不允许研究兴奋和抑制网络对 ictogenesis 的相互作用和协同作用。连续灌注脑切片与惊厥药物4AP 增强兴奋和抑制神经传递, 从而使研究急性 ictogenesis, 同时保持突触活动整体完整完好 12.
多边环境协定允许记录神经网络产生的电子活动从更多的观察点相比, 传统的细胞外场电位记录, 其中空间限制限制的电极数量, 可以在脑切片表面容纳。此外, 多边协定芯片提供了已知的电极间距离的额外优势, 这对于跟踪传播和评估记录信号的行进速度非常有用。虽然最初构思为记录从培养的神经元13,14, 多边环境协定现在也被用来表征从啮齿动物15和人类16获得的急性脑切片的电生理特征。因此, 在癫痫研究的背景下, 多边环境协定是一个有价值的工具, 用于查明神经网络在 ictogenesis16、17、18的核心中的相互作用。
然而, 在长时间 (几个小时) 实验协议中, 在获取或维持稳定的癫痫模式方面, 多边环境协定的记录本身就具有技术挑战。首先, 在大型和圆形浸没式记录室中, 组织氧合可能不足19,20典型的商用多边环境协定, 而低信噪比和温度不稳定可能影响记录的质量, 当一个高灌注率 (6-10 毫升/分钟) 是用来改善氧气供应的脑切片 (如请参见加热和灌注设备的技术说明21)。第二, 使用浸没式记录室19时很难观察到经常放电, 如癫痫放电等高频成分;当急性癫痫发作模式被化学诱导并涉及 ephaptic 机制时, 这种情况尤其如此, 因为4AP 模型22 (请参见11进行全面概述)。为了克服这些局限性, 研究人员提出了一些策略。例如, 增加灌注速率19、20 , 同时减少脑切片厚度 (≤300µM) 和区域17,18是实现组织充分氧气供应的关键因素。此外, 还可以通过使用穿孔的多边环境协定 (pMEAs) 来改善脑切片的生存能力, 从而使灌注的大脑组织从两侧18。
虽然所述方法大大提高了从脑切片记录的可行性, 但没有对长时间 (数小时) 记录和电刺激会话进行测试, 后者代表了一个重要大脑组织的压力。可能需要长时间的记录来研究癫痫模式的特定特征在时间上的演变, 这是不可能通过短期测量来揭露的。在星展研究的背景下, 可能需要长时间的实验协议来评估和比较几种刺激范式在同一脑切片中的作用。
当只有自发的电气活动需要记录时, 在数据分析过程中, 电极的映射通常是后验,即;相反, 对诱发反应或电调节范式的研究需要将刺激传递给特定的 ROI, 从而在实验过程中要求快速、容易的带电电极映射。
在这里, 我们说明了一个简单的实验协议, 允许诱导和维持一个稳定的 4 ap 诱发癫痫模式的成年啮齿动物脑切片。观察的活动忠实地再现了该模型的电生理特性, 其特点是使用常规的细胞外电生理技术。它持续了几个小时和经久持续的电刺激为重复的长的世纪。用于维持和孵化脑切片的分庭可以使用标准实验室用品 (图 1A) 轻松组装, 而一个允许最佳解决方案汇率和层流流的自定义记录室 (图 1B) 可以获得从商业来源或使用3D 印刷技术以实惠的价格。快速映射的 ROI (s) 的实时监测和选择的刺激电极是由一个自定义用户友好的 GUI 命名为mapMEA, 可以自由地根据请求提供。
图 1: 用于此协议的自定义设备.(A) 在4AP 中, 用于恢复、预热和预孵化的保温室采用烧杯和培养皿组装而成。培养皿的直径应小于断路器, 并通过注射器柱塞来保持到位。培养皿的底部被一个尼龙网 (从柔软的丝袜) 所取代, 用氰粘在培养皿的边缘上。氧气通过弯曲的脊椎针 (22 克) 提供, 插入在培养皿和烧杯的壁之间。气泡应该从烧杯的侧面冒出来, 永远不会到达尼龙网, 以避免大脑切片移位。培养皿的顶部可以作为盖子, 以避免 ACSF 蒸发和保持氧气饱和度。(B) 自定义记录室。在: 入口水库容纳热化套管和参考电极。出: 出水口水库, 可容纳吸针。录音室。( C) 玻璃巴斯德吸管, 由火抛光卷曲, 用于处理组织并调整其在录音室中的位置。( D) 自定义切片保留锚点。(E) 安装在多边环境协定芯片上的记录室的最终组装。脑切片靠在固定位置的底部。红色箭头表示覆盖加热套管的聚四氟乙烯管, 而红色圆圈表示参考电极, 这是 ACSF 在进气库中浸没的饱和氯化钾颗粒。蓝色箭头表示出入口储层中的吸力针。请单击此处查看此图的较大版本.
Protocol
这里描述的所有方法都已得到意大利卫生部 (授权 860/2015-PR) 的批准, 符合欧盟关于动物福利的 2010/63/欧共体指令。
1. 拟订多边环境协定/自定义室大会
注: 实验前2天开始。使用无环的多边环境协定 (请参阅材料表)。
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清洁多边环境协定 (持续时间:35-40 分钟)。
- 将酶清洗剂的粉末溶解到温水中。将温暖的清洁溶液刷到多边环境协定表面, 然后将其浸泡在温暖的清洁溶液中至少3小时。
- 用蒸馏水彻底冲洗, 用无绒布的无划伤组织晾干。
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将多边环境协定与记录室 (持续时间:10 分钟 + 一夜之间) 组装起来。
- 均匀地将弹性密封胶涂在记录室的底部表面。确保没有气泡。
- 在镊子的帮助下, 将录音室安装到多边环境协定中, 并施加温和的压力。如果有任何气泡, 稍微移动的房间在一个圆圈, 而施加温和的压力与手指, 直到所有的气泡消失。在记录室的外边界周围散布密封胶层。
注意:关键!请勿覆盖与密封胶的接触。 - 在15厘米培养皿内放置环境协定/室组件。放置一个5毫升培养皿或10毫升烧杯, 充满蒸馏水接近多边环境协定。遮盖一切, 保持湿润的环境。让在室温下治疗过夜。
注意: 协议可以在这里暂停。
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将该协定涂成亲水性 (持续时间: 5-10 分钟 + 隔夜)。
- 将多边环境协定放入15厘米培养皿中。将50µL 的聚 d-赖氨酸注入到多边环境协定记录区。关闭培养皿, 用密封膜密封, 并在4摄氏度过夜。
- 用蒸馏水彻底冲洗, 并将多边环境协定储存在蒸馏水的4摄氏度。
注意: 协议可以在这里暂停。涂层的多边环境可以存储和重用的几个实验。定期清洗和重新涂敷多边环境协定有助于去除组织碎片和提高信噪比。
2. 库存解决方案的编制
注: 实验开始前1天 (持续时间: ~ 2 小时)。库存解决方案有助于加速实验日的实验。他们可以预先准备和储存。有关浓度因子和组合, 请参见表 1 。有关最终解决方案的组合, 请参阅表 2 。
- 室温下在蒸馏水中溶解化学物质。用过滤瓶过滤库存溶液 (过滤器直径: 0.22 µm)。
- 存储在4摄氏度 (请参见表1以获得建议的最大存储时间)。
注意: 协议可以在这里暂停。
3. 琼脂的制备
注: 实验开始前1天 (持续时间: ~ 1 小时)。
- 将250毫升蒸馏水倒入500毫升烧杯中, 开始搅拌350转。加入5克琼脂, 等到它完全溶解。
- 将溶液加热 250-300 摄氏度。让水蒸发, 直到溶液是〜200毫升, 以产生2.5% 瓦特/v 琼脂溶液。
注意: 温度应该足够高, 让水蒸发而不起泡。 - 将琼脂溶液倒入200毫升的塑料方形盒上, 1.5 厘米高的墙壁, 让它在室温下冷却, 直到它变成固体。
- 盖上盒子, 把它存放在4摄氏度。琼脂块是好几个星期。
注意: 协议可以在这里暂停。
4. 冻结飞机的准备工作
注: 实验前1天开始。
- 填充一个平底不锈钢碗与蒸馏水高达 0.5-1 厘米以下的边缘。
- 存放在-20 °c 过夜。
5. 神经保护切割的制备ACSF
注: 在实验前1天或实验的同一天开始 (请参见表 1和表 2) (持续时间:30 分钟)。
- 在500毫升烧杯中倒入200毫升蒸馏水, 并在 350 rpm 时使用磁力搅拌器开始搅拌。
- 添加50毫升的股票 B 和50毫升的股票 C (见表 1)。
- 添加3毫米丙酮酸, 208 毫米蔗糖, 10 毫米 d-葡萄糖和1毫米 l-抗坏血酸。
注: 丙酮酸的实际体积取决于密度和纯度, 并可能随批次而变化。打开新批时, 始终计算所需的卷。 - 盖上密封膜, 让搅拌30分钟。
- 将溶液转移到500毫升容积烧瓶中, 加入蒸馏水以填充烧瓶。
- 用密封膜封住容积烧瓶, 轻轻反转 3-5 次, 直到溶液均匀清晰为止。
- 将切割 ACSF 转移到带有瓶盖的玻璃瓶中。
- 存储切割 ACSF 在-80 °c 20-30 分钟或在4°c 隔夜冷却下来到4°c。
注意: 如果需要隔夜冷却, 可以在此处暂停该协议。否则, 冷却切割 ACSF 所需的时间可用于追求步骤6。
6. 准备举行 ACSF
注: 在实验当天准备新鲜的溶液 (持续时间: 5-10 分钟)。在切片过程中, ACSF 将用于冲洗切割 ACSF 的脑切片 (见步骤 8.16), 并用于脑切片长期贮存和预热。冲洗脑切片, 100 毫升的持有 ACSF 是足够的。本协议中使用的控制和预热室是自定义的, 其容量分别为300毫升和100毫升 (cf 图 1A)。使用此设置, 500 毫升的持有 ACSF是足够的。从商业来源获得的分庭可能含有不同的数量, 在这种情况下, 拟备的总持有 ACSF 量应相应调整。
- 将200毫升蒸馏水倒入500毫升容积的烧瓶中。
- 加入50毫升的 A, 50 毫升的股票 B, 6.5 毫升的库存 M, 和1毫米 l-抗坏血酸。用旋转动作轻轻搅动, 直到 l-抗坏血酸完全溶解。
- 添加蒸馏水达到最终体积, 密封的容积瓶与密封膜, 并轻轻地反转 3-5 倍, 直到解决方案是均匀清晰。有关持有 ACSF 组合的表 2 , 请参阅。
7. 实验长凳的准备工作
注: 这需要15分钟, 加上30分钟, 以获得一个稳定的温度的温水浴。
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记录工作台
- 开始暖浴, 设置到32摄氏度, 并覆盖它以保持其温度。
注: 本协议中使用的温水浴可定制使用硬塑料盒和水族馆恒温器预设置在所需的温度。稳定的期望温度可以达到30分钟从室温开始。由于预热和孵化室坐在塑料盒的底部, 水位应该刚好足以覆盖恒温器, 以防止房间漂浮。 - 组装保温箱和预热室 (cf 图 1A), 并将持有的 ACSF 倒入其中。在室温下保持保温室, 并将预热室放在温水浴内。用 95% O2/5% CO2气体混合物开始冒泡解决方案, 并使用倒置的巴斯德吸管去除任何陷泡气泡。继续掩护
- 开始暖浴, 设置到32摄氏度, 并覆盖它以保持其温度。
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切片工作台和 vibratome
- 用氰胶水将一个小琼脂块粘到标本盘的中心。
- 把一个250毫升的烧杯放入冰桶中, 倒入切割 ACSF。
- 取两个100毫升的烧杯, 倒入50毫升的 ACSF。在室温下离开烧杯。这些是冲洗烧杯。
- 使用 95% O2/5% CO2气体混合物开始冒泡解决方案。
- 把缓冲托盘装到 vibratome 上, 用碎冰包围它。在碎冰上倒入一些乙醇, 以帮助在切片过程中保持低温。在倒入乙醇后, 根据需要添加更多的冰。
注: 温度为2摄氏度是最佳的。 - 将涌泉放在缓冲托盘内, 然后组装并装入 vibratome 刀片块。
注意: 确保刀片安装在10°的间隙角。 - 将被粉碎的冰放入500毫升烧杯中, 高达2/3 的体积, 并填充蒸馏水。
- 把冷冻碗从冰箱里拿出来, 把它倒在切片台上, 用纸巾和滤纸盘盖住。
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麻醉台
- 把一个小碗放在一个装满冰块的盘子里, 然后倒 ACSF。开始冒泡与 95% O2/5% CO2气体混合物。
8. 脑切片的制备和维护
注意: 该协议使用成人 (4-6 周) 雄性 CD1 小鼠, 但其他菌株 (例如, c57/bl617,18) 可以使用。我们还比较了用小鼠脑切片获得的实验结果, 并与同一年龄的雄性大大鼠脑切片产生的结果进行了对比。以下步骤指的是部分断开的脑切片的准备, 其中 CA3-driven快速间歇类活动被限制到海马体, 不能传播到海马旁皮层, 如23中所述。海马-皮层切断是在使用海马-EC 脑切片制剂进行电调制研究的先决条件。所用的 vibratome 是指材料表中列出的模型。其他模型可能需要不同的过程。
- 麻醉使用异氟醚5% 在卡波金气体混合物中, 在2升/分钟内送到麻醉感应室的啮齿动物。
- 在深度麻醉下 (没有反应的脚和爪子捏), 提取的大脑1分钟以下的标准程序, 如在23中。把大脑放进装有平衡冰冷切割 ACSF 的小碗里, 让 90 120s 冷却。
注意: 不要让大脑冷却太久, 否则它可能会结冰。 - 将冰冷切割 ACSF 倒入缓冲托盘中。将切割 ACSF 到放在冷冻碗上的滤纸上。将大脑放在滤纸上, 通过切除小脑并将额极直接切开, 将所需的脑组织块隔离开来。
- 在一个弯曲的刮刀的帮助下, 将大脑的背侧粘附在标本盘上, 前面的切口侧朝向琼脂块, 枕极面对 vibratome 刀片。使用薄层的氰胶水。立即将标本盘放在缓冲托盘中, 并将其固定。
- 调整切片范围, 以便将 vibratome 刀片贯穿整个组织直至琼脂块。调整标本盘高度, 达到叶片水平与脑组织块。
- 丢弃组织切片, 直到海马清晰可见 (通常为900µm)。然后, 设置切片厚度为400µm 并开始切片以保留组织部分。每个脑部分裂两个半球和修剪不必要的组织, 以获得两个脑切片。随着缓冲托盘在随后的部分增加, 填补缓冲托盘送交与冰蒸馏水 (见步骤 7.2.7)。
- 使用倒巴斯德吸管轻轻地转移在第一冲洗烧杯的脑切片, 清空巴斯德吸管, 并转移脑切片到第二冲洗烧杯。然后, 将脑切片转移到保持室, 让他们恢复至少60分钟。
注: 通常可以获得 6-8 脑切片整体。协议可能在这里暂停。
9、含 4-ap (4 ACSF-ACSF) 的制备
注: 这需要10分钟的准备, 加上20分钟的升温。警告!4-AP 是一种惊厥药物, 它是有毒的。用手套处理, 避免溢出。
- 将200毫升蒸馏水倒入500毫升容积的烧瓶中。
- 加入50毫升的 A, 50 毫升的股票 B, 5 毫升的库存 M, 和1毫米 l-抗坏血酸。用旋转动作轻轻搅动, 直到 l-抗坏血酸完全溶解。
- 添加500µL 4AP 库存。
- 添加蒸馏水达到最终体积, 密封的容积瓶与密封膜, 并轻轻地反转它 3-5 倍, 直到解决方案是均匀清晰。
- 组装4AP 孵化室 (cf 图 1A), 并将80毫升的 4 ACSF 到其中。盖住房间, 将其转移到温水浴, 并开始冒泡与 95% O2/5% CO2气体混合物。使用倒置的巴斯德吸管去除任何被困的气泡。继续掩护
- 等到 4 ACSF 温度为 30-32 摄氏度 (~ 20 分钟)。
注意: 如果脑切片仍在恢复中, 该协议可能会在此处暂停。
10. 4AP 切片预热和孵化 (持续时间:90 分钟)
- 检查预热 ACSF 和 4 ACSF 温度是 30-32 °c。
- 使用倒置玻璃巴斯德吸管将1脑切片转移到预热室, 让组织休息 25-30 分钟。然后将脑切片转移到 4 ACSF 孵化室, 让它休息60分钟。
11. 拟订多边环境协定的安排
注: 在录制前15分钟开始。
- 将 4 ACSF 的剩余体积转移到500毫升锥形瓶中。
- 将锥形烧瓶放在多边环境协定放大器上方的架子上, 并使用油管使溶液连续喂60毫升注射器。调整锥形瓶和注射器的高度, 允许重力喂食率为1毫升/分钟。
注: 正确的高度取决于油管内径 (ID)。对于5/32 英寸的油管, 30 厘米是足够的。 - 开始冒泡的 4 ap ACSF 在锥形瓶和注射器与 95% O2/5% CO2气体混合物。
- 让 4 ACSF 通过灌注管进入烧杯, 直到里面没有空气;然后停止解决方案流。
- 将在多边环境协定基础上的加热元件连接到恒温器。将干燥的协定芯片放在多边环境协定放大器中, 并确保放大器的头部安全。使用塑料巴斯德吸管将 4 ACSF 转移到记录室的入口和外储层。
- 将加热套管固定在磁支架上, 并将其尖端置于记录室入口口内;将磁保持架连接到多边环境协定放大器头上的磁条上;将灌注管连接至套管;将套管连接到恒温器。
注: 加热套管应覆盖的楔形聚四氟乙烯 (PTFE) 油管, 以达到记录室入口端口, 并尽量减少噪音, 由于金属材料的套管。当入口水库充满 4 ACSF 时, 从灌注系统中掉下的水滴不应该可见。 - 将吸针放在储层内, 通过将吸针浸入 ACSF 中, 验证是否有负压;检查是否有恒定的低频吸入噪声。
注: 应放置吸入针, 使 4 ACSF 在脑切片表面的上方流动。可使用真空线或低噪音真空泵。 - 设置流量调节器, 允许1毫升/分钟的流量, 并开始灌注。
注: 重力喂食灌注消除了蠕动泵可能引起的噪音;如果蠕动泵是首选, 低噪音模型是强制性的。 - 一旦 4 ACSF 是流经套管, 打开恒温器。将加热套管设置为37°c 和多边环境协定基至32°c, 以达到记录室内 32-34 °c 的温度。
注意:小心!不要在没有溶液的情况下加热套管, 否则它可能会不可逆转地损坏。将套管温度设置为高于记录温度 (即、32-34 °c), 以计算在加热套管尖端和记录腔内的设定值与实际值之间的固有温度偏移。记录室的流速、环境温度和体积都影响着记录溶液的温度。步骤11.9 中报告的设置针对所描述的协议和设备进行了优化。始终使用热电偶检查实际记录温度, 并根据需要调整设置。不要加热34摄氏度以上的多边环境协定, 以避免大脑切片过热。 - 将外部参考电极放在记录室进气库中。
注: 虽然多边环境协定芯片装有内部参考电极, 但这是由自定义记录室覆盖。因此, 必须使用外部参考电极。一个饱和的氯化钾颗粒是最实用的, 因为它是准备使用不需要氯化。
12. 现场制图
- 一旦 4 ACSF 水平和记录温度稳定如理想, 打开灌注和吸入 stopcocks 到关闭位置, 暂时停止他们。
- 使用倒置玻璃巴斯德吸管快速将一个脑切片转移到多边环境协定记录室。使用火抛光卷曲的巴斯德吸管 (图 1C) 或软紧凑小刷子, 在需要时调整其在多边环境协定记录区域的位置。将按住锁定 (图 1D) 放置在脑切片上。通过将 stopcocks 回原位, 重新启动灌注和吸入。
注意:关键!切片应转移, 并在六十年代内重新灌注或组织可能会死亡。切片固定锚应保持在 4 ACSF, 以防止脑切片移动, 而放置锚在脑切片由于表面张力的差异。将脑切片固定在多边环境协定上的锚点可以使用不锈钢线和尼龙线 (图 1D) 进行定制, 也可从商业来源获得。图 1E显示了与放大器头连接的多边环境协定芯片的最终实验设置: 在记录室内的多边环境协定芯片上停留的脑切片由自定义锚点按住。所述的参考电极 (红圆) 和聚四氟乙烯管覆盖加热套管 (红色箭头) 位于进气道储层中, 而吸入针 (蓝色箭头) 位于出口储层中。
- 使用倒置玻璃巴斯德吸管快速将一个脑切片转移到多边环境协定记录室。使用火抛光卷曲的巴斯德吸管 (图 1C) 或软紧凑小刷子, 在需要时调整其在多边环境协定记录区域的位置。将按住锁定 (图 1D) 放置在脑切片上。通过将 stopcocks 回原位, 重新启动灌注和吸入。
- 使用在倒置显微镜阶段安装的摄像头拍摄脑切片的图片。
- 在计算机软件上运行脚本mapMEA以启动 GUI 来映射电极。
注意: 定制的软件允许用户选择与脑切片的特定结构相对应的电极。这一步骤是关键的激活正确的途径和抑制发作活动, 通过电刺激。
图 2: live 的 GUI多边电极映射. (A) 在多边环境协定中放置的海马-EC 切片的示意图表示形式。此协议使用的默认结构为 ammonis 3 (CA3)、enthorinal 皮层 (EC)、perirhinal 皮质 (PC) 和下托 (子)。参考电极图解为三角形标记。用虚线包围的电极表示图像矫直的 XY 坐标。(B) 在实时环境协定映射过程中对 GUI 的屏幕捕获。捕获左侧的流程图指示要遵循的分步过程。请单击此处查看此图的较大版本.
- 单击浏览按钮以加载脑切片的图片。确保参考电极出现在多边环境协定 (图 2A、三角形标记) 左半端的上一行中。单击激活指针按钮, 然后在数组最左边的行中选择顶部和底部电极, 以标记用于图像矫直和电极映射的 XY 坐标。
- 从切片类型下拉菜单中选择水平。勾选默认结构复选框。
注意: 通过选择 "输入新结构" 按钮, 可以自定义结构。水平脑切片的默认结构在图 2A中描述。 - 使用 "脑切片" 图片下面的编号按钮, 选择与 ROI 对应的电极, 然后单击 "结构" 面板中相应的按钮来分配它们 (图 2B);对每个 ROI 重复此步骤。
- 按保存按钮: 软件生成一个名为#EXP_LabelledElectrodes的结果文件夹, 其中包含报告所选电极和 ROIs 的表。
13. 癫痫活动的记录和电调制
- 让大脑切片在录音室内稳定 5-10 分钟。
- 在刺激协议之前至少10分钟打开刺激单元, 以允许自我校准和稳定。启动刺激控制软件, 并验证在刺激控制软件的主面板中的绿色指示灯指示, 刺激器和多边环境调节功放是否正确连接。有关其他详细信息, 请参阅特定工具和软件的手册, cf 材料表。
- 建立双极性配置的刺激。选择与 CA1/proximal 下托 (cf 24, 25) 的金字塔单元格层接触的电极对, 其中一个映射了脚本 mapMEA (12 节). 使用导线将所选电极中的一个连接到刺激器的负插头和另一个电极到同一个刺激器通道的正插头上。使用另一根导线将刺激器的地面连接到扩音器的地面。
- 启动录制软件。若要获取数据, 请在录制软件的主面板中按播放按钮。记录至少4发作放电。
注: 采样频率为2赫, 允许获得公平分辨率的场电位, 同时最小化硬盘空间使用率。5分钟的录制文件需要 80 MB 的时间。可能需要更高的取样频率,例如记录刺激工件或多单元活动。仅观察场电位, 使用300赫兹的活低通滤波器切断多单元活动。 - 确定刺激强度。
- 在刺激控制软件中, 使用主面板设计一个平方双相正负电流脉冲持续时间为100µs/相位。
注意:小心!直流电刺激需要平衡充电脉冲, 以避免损坏设备。 - 运行快速输入/输出 (i/o) 测试以确定最佳的刺激强度。通过在相应的刺激控制软件的适当形式中添加 5 s 或更长的间脉冲间隔, 以0.2 赫兹或更低的频率提供在步骤13.5.1 中设计的刺激脉冲。在脉冲振幅选项卡输入初始脉冲振幅为100µA/相位, 并增加 50-100 µA 步骤在每次试验, 直到刺激可以可靠地唤起间歇类似的事件在海马旁皮层 (检查信号可视化的记录软件)。
- 在刺激控制软件中, 使用主面板设计一个平方双相正负电流脉冲持续时间为100µs/相位。
- 边缘 ictogenesis 的电调制
- 计划刺激单位提供的刺激协议的兴趣。使用 i/o 测试过程中确定的刺激幅度。
注意: 诱发反应的失败率应≤20%。 - 在刺激停止后, 通过记录至少4发作放电 (如步骤 13.4), 验证网络恢复到预刺激状态。
Representative Results
具有 6 x 10 布局和500µm 电极间距的平面多边环境协定是此处描述的实验协议的理想记录设备, 因为它们的记录区域贯穿整个脑切片 (图 3A), 另请参阅17。虽然穿孔的多边环境协定 (pMEAs) 将更好地改善组织氧合, 他们的记录面积太小 (2 毫米直径)。这不允许同时可视化由海马体和海马旁皮层产生的电信号 (未显示的数据; 请参见 18).
观察到的 4 ap 诱发的癫痫模式 (图 3A) 忠实地再现了在这个体外模型中使用常规场电位记录通常观察到的东西, 包括三种活动7,26: (i) 类似发作的事件 (图 3B、箭头) 是健壮持久的 (> 二十年代、范围:20-六十年代) 事件, 类似于短束和挛组件 (图3C) 的缉获活动的特征。它们是在海马旁皮质内每 3-5 分钟产生的, 并通过齿状回 (图3D, 箭头) 重新进入海马形成;(ii) 慢间歇放电 (图 3B、EC 跟踪、黑条; 在图 3E中展开) 是短 (< 1 s) 在海马-EC 脑切片制备中发作事件之间产生的种群事件无所不在并以缓慢的速度发生 (范围 10-三十年代);(iii) 快速间歇放电 (图 3B, CA3 跟踪, 黑条; 在图 3E中展开) 是 CA3 海马子字段产生的周期性短暂 (< 1 s) 种群事件;当保存谢弗络时, 快速 CA3-driven 间歇事件沿海马环传播并施加反 ictogenic 效果24 (未显示数据);为了防止发作活动断开, 为了描述的协议, CA3 输出被中断 (cf 图 3B, E)。需要注意的是, 使用多边环境协定记录的快速 CA3-driven 间歇活动的速度较慢 (~ 0.4 赫兹), 而不是使用与玻璃吸管的常规场电位记录 (~ 1 hz, 范围: 0.5-2.0 hz, 数据未显示) 所观察到的情况.
电子调节在啮齿动物脑切片中的成功结果取决于特定神经元通路的激活27以及在准备24中包括的区域之间的内在连通性。我们已经测试了从成年雄性大大鼠和 CD1 小鼠获得的切片, 我们发现, 老鼠而不是老鼠脑切片提供了最好的权衡之间的大小, 厚度和内在的连通性。首先, 由于它们的尺寸较小, 它们适合于商业上可用的多边环境协定的小记录区域 (图 4A, 左: 鼠, 右: 鼠标);其次, 它们更能适应多边环境协定记录 (cf. 导言) 所固有的不利条件: 尽管这两个组织 (图 4B) 生成的类似于发作的放电具有相似的持续时间 (图 4C左), 它们的发生率在小鼠脑切片中显著缩短 (每种种类的 n = 10 切片; 2 尾配对 t 检验, p < 0.001;图 4C右侧)。后者允许加速实验性的协议, 使得在一个实验日测试更多的脑切片成为可能: 对于这组具有代表性的结果, 我们可以测试类似数量的脑切片从两个物种 (鼠: n =58;老鼠: n = 52), 但小鼠 (n = 18) 的数量是2倍小于老鼠的数量 (n = 42)。
此外, 老鼠脑切片似乎呈现密集的连接, 因此更有可能更好地应对持续的电子调节 (图 4D)。因此, 在这种 ictogenesis 的体外模型中, 用于控制发作活动的电刺激的生存能力比大鼠脑组织要大得多。这方面也反映了使用鼠标与大鼠脑切片刺激实验的成功率显著提高, 即使在追求一些持续刺激协议(图 4E)。事实上, 老鼠脑组织似乎能够更好地抵御持续的电刺激, 这是被测试的实验时间框架内的高存活率所建议的 (图 4F)。因此, 随着更小的尺寸以及更好地保存内在连通性, 小鼠脑切片是执行海马旁的最佳候选者, 目的是研究海马-神经网络的相互作用并评估电与调节相关的协议。
在 CA1/subiculum 中传递的周期性起搏是控制 4 ap 治疗的海马-EC 切片准备24,25,27, 以1赫兹作为最有效频率27的边缘 ictogenesis。因此, 它也可以作为一种积极的控制来评估其他调节策略的有效性和效率 (如25所示)。如上所述, 通过多边环境协定直接提供的电脉冲 (即, 不需要外部刺激电极) 可以唤起啮齿动物脑组织中的人口反应 (另见28)。充分保存脑切片内的神经网络连通性, 准确定位脑切片到多边环境协定, 并适当选择刺激电极对, 允许进行电子调节实验,有效控制 ictogenesis。如图 5A所示, 可以使用平面多边环境协定作为记录和刺激装置来重现规范 1 Hz 周期性起搏协议, 并增加了电刺激效果可以在整个脑组织切片与常规的领域电位记录相比, 有更多的相同间距的观察点。图 5B显示了为 n = 9 脑切片获得的结果的量化, 表明在刺激过程中总占用时间 (总发作活动时间/观察时间25) 的显著减少 (单向方差分析, F (df):6.84 (2), p < 0.01, 费舍尔的 LSD临时测试, 保护)。结果与外部刺激电极的文献 (24、25) 一致。
为了计算总占用时间, 观察时间取决于发作事件之间的间隔, 而且它还决定了对调节的影响进行自信评估所需的刺激协议的最短持续时间。我们发现记录至少4发作放电 (因此发作事件之间至少有3间隔) 是收集样本和所需收集时间之间的良好权衡。在控制条件 (即, 不刺激) 中, 观察时间是第一次测量的发作事件开始和最后一个结束之间的滞后。在调节期间, 观测时间等于刺激协议持续时间, 因为测量的目的是量化在系统中引入扰动的整个时间内发生的现象。计算和比较发作事件的总占用时间, 而不是时间和时间间隔, 是避免第二类错误的最合适的参数。事实上, 随着完全抑制发作活动, 也可能只有一个发作事件是产生在电刺激, 而不是在控制条件下观察到的几个事件。在这种情况下, 虽然测量事件之间的间隔是不可能的, 测量发作持续时间作为刺激效果的估计不代表调节的实际结果 (即, 发作活动减少)。
总的来说, 这里提出的结果表明, 小鼠脑切片耦合到多边环境协定是有价值的工具, 为癫痫的研究和执行可靠的调节研究, 这是有关推进星展集团的癫痫治疗领域。此外, 此处描述的协议可以改善脑切片的生存能力, 并允许在几个小时内进行实验性会话 (图 6), 例如, 为了比较不同电刺激的效果范式。
图 3: 典型的 4 ap 诱发的具有平面多边环境的癫痫模型.(A) 鼠标大脑切片定位在平面 6 x 10 多边环境协定 (电极间距: 500 µm) 和并排概述的 4 ap 诱发的癫痫模式可视化的多边环境协定记录。网格中的每个正方形都能容纳在脑切片中相应位置记录的活动。虚线蓝线是指电极行, 以便更清晰。记录电极编号在每个正方形的左上角以蓝色标识。灰色交叉正方形代表参考电极。(B) 具有代表性的 EC 和 CA3 模式的跟踪段, 在较快的时间范围内可视化。箭头表示发作事件。在 EC 跟踪中, 可以欣赏慢速间歇放电 (黑条) 的发生, 而 CA3 子字段生成典型的持续 fastinterictal 模式 (黑条). (C) 发作放电的扩展记录, 显示典型的补药-挛模式。(D) 在 (B) 中由红色条标记的 EC (红色) 和 CA3 (黑色) 跟踪段的前发作到发作过渡的快速可视化。箭头表示发作放电的起始。叠加的痕迹突出表明发作事件起源于 EC, 随后传播到 CA3 子字段。(E) 在 (B) 中黑条标记的间歇期间的扩展视图强调了由 EC (红色) 和 CA3 (黑色) 生成的慢速和 fastinterictal 模式之间缺乏相关性. 请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 小鼠脑切片提供比大鼠脑切片更高的实验输出.(A) 脑切片从鼠 (左) 和鼠标 (右) 匹配的年龄。大鼠脑切片的体积比记录区大得多, 其电活动不能完全可视化。(B) 对小鼠和大鼠 enthorinal 皮质 (EC) 产生的经常性发作活动进行直观比较。(C)鼠标和大鼠脑切片产生类似持续时间的发作放电, 但这些事件之间的间隔在大鼠脑组织中几乎为2倍. * p < 0.05。(D) 与大鼠相比, 小鼠提供2倍高的脑切片产量, 用于控制 ictogenesis 的电刺激实验。电刺激的下托可以唤起海马旁皮层的人口反应, 只有20的 58 (34%) 大鼠脑切片, 而不是 33 52 (63%) 小鼠脑切片 (Chi2: 9.22;p = 0.002)。* p < 0.05。(E) 在可行切片中, 控制发作活动的成功率是2倍, 老鼠与大鼠脑切片 (老鼠:20 33 脑切片, 60%: 大鼠: 6 的20脑切片, 30%;Chi2: 4.67;p = 0.03)。* p < 0.05。(F) 小鼠脑切片可以经受持续电刺激 (灰色阴影区域) 反复延长的时代。在刺激撤退时, 小鼠脑组织表现为癫痫模式的完全恢复, 而大鼠脑组织存活率显著下降3小时.请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 用脑切片耦合到多边环境协定的 ictogenesis 电调制的代表性实验.(A) 在控制条件 (无刺激)、周期性起搏 (PP) 在1赫兹 (刺激工件被截断) 和在刺激撤退期间恢复时 4 ap 引起的发作活动在欧共体和个人计算机的录音。(B) 将 PP 在1赫兹对总占用时间的影响进行量化。* p < 0.05。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 代表 4 ap 诱发发作活动的长期记录.(A) 在脑切片过程中记录了8小时的跟踪片段, 并在4AP 应用程序中遵循了2小时。(B) 扩展的跟踪段与由字母a、 B和c在面板中标识的盒装发作放电相对应 (a) 显示了在长期观察时间-寡妇中生成的发作活动的一致性。请单击此处查看此图的较大版本.
| 库存 A | 化学 | 分子量 | 浓度 (毫米) |
| Nacl | 58.44 | 1150 | |
| 溶剂:蒸馏水 | 氯化钾 | 74.55 | 20 |
| 集中: 10x | 2PO4 | 136。1 | 12。5 |
| 存储温度: 4 °c | CaCl2* 2 H2O | 147.02 | 20 |
| 最大存储时间: 1周 | d-葡萄糖 | 180。2 | 250 |
| 注: 过滤器使用50毫米膜过滤器 | |||
| 库存 B | 化学 | 分子量 | 浓度 (毫米) |
| NaHCO3 | 84.01 | 260 | |
| 溶剂:蒸馏水 | |||
| 集中: 10x | |||
| 存储温度: 4 °c | |||
| 最大存储时间: 1周 | |||
| 注: 过滤器使用50毫米膜过滤器 | |||
| 股票 C | 化学 | 分子量 | 浓度 (毫米) |
| 氯化钾 | 74.55 | 20 | |
| 溶剂:蒸馏水 | 2PO4 | 136。1 | 12。5 |
| 集中: 10x | 氯化镁2* 6 H2O | 203。3 | 50 |
| 存储温度: 4 °c | MgSO4* 6 H2O | 246.47 | 20 |
| 最大存储时间: 2 wks | CaCl2* 2 H2O | 147.02 | 5 |
| 注: 过滤器使用50毫米膜过滤器 | |||
| 库存 M | 化学 | 分子量 | 浓度 (毫米) |
| MgSO4* 6 H2O | 246.47 | 100 | |
| 溶剂:蒸馏水 | |||
| 集中: 100x | |||
| 存储温度: 4 °c | |||
| 最大存储时间: 4 wks | |||
| 4AP 库存 | 化学 | 分子量 | 浓度 (毫米) |
| 4-氨基吡啶 | 94.11 | 250 | |
| 溶剂:蒸馏水 | |||
| 集中: 1000x | |||
| 存储温度: 4 °c | |||
| 最大存储时间: 2 wks | |||
| 注: 涡流为 2-3 分钟或 stirr 为 30-60 分钟 | |||
| 注意: 小心!4-AP 是有毒和 cinvulsant。使用手套, 避免扩散或溢出。 | |||
表 1: 库存解决方案。
| 控股 ACSF | 录制 ACSF | 切割 ACSF | |||||
| 化学 | C [mM] | 化学 | C [mM] | 化学 | C [mM] | ||
| Nacl | 115 | Nacl | 115 | 蔗糖 | 208 | ||
| 氯化钾 | 2 | 氯化钾 | 2 | 氯化钾 | 2 | ||
| 2PO4 | 1.25 | 2PO4 | 1.25 | 2PO4 | 1.25 | ||
| MgSO4 | 1。3 | MgSO4 | 1 | 氯化镁2 | 5 | ||
| CaCl2 | 2 | CaCl2 | 2 | MgSO4 | 2 | ||
| d-葡萄糖 | 25 | d-葡萄糖 | 25 | CaCl2 | 0。5 | ||
| NaHCO3 | 26 | NaHCO3 | 26 | d-葡萄糖 | 10 | ||
| l-抗坏血酸 | 1 | l-抗坏血酸 | 1 | NaHCO3 | 26 | ||
| l-抗坏血酸 | 1 | ||||||
| Ph | 7。4 | Ph | 7。4 | 丙酮酸 | 3 | ||
| 渗透 | 300 mOsm/千克 | 渗透 | 300 mOsm/千克 | ||||
| Ph | 7。4 | ||||||
| 渗透 | 300 mOsm/千克 | ||||||
表 2: 解决方案组成。
| 故障 排除 | |||||
| 问题 | 对策 | ||||
| 发作放电看起来 ' 块 ' | 通过调整吸针位置, 降低脑切片以上的 ACSF 体积。 | ||||
| 无发作活动 | (1)验证 CA3-driven 快速间歇事件不会传播到皮层。使用一个小手术刀刀片 (例如, 10) 或针切断谢弗络, 如果需要的话, 但要小心不要削减的尼龙线程的切片固定锚。立体声或直立显微镜最适合, 而倒置显微镜使这项任务非常困难。 | ||||
| (2)检查切片的生存能力: 强电刺激能触发发作活动吗？等到大约2小时的4AP 应用, 然后改变脑切片如果发作活动不发生。 | |||||
| 放置按住锚点时, 脑切片移动 | (1)轻轻移除切片锚点并重新定位脑切片。 | ||||
| (2)检查切片锚点是否均匀湿润了4个 ap ACSF。 | |||||
| (3)从记录室中删除 4 ap ACSF, 以支持脑切片与多边环境协定的粘连。 | |||||
| (4)重新定位切片固定锚点。 | |||||
| 转移后脑切片漂浮在多边环境协定芯片上 | (1)用巴斯德吸管轻轻地吸入过量的 ACSF。 | ||||
| (2)多边环境协定芯片可能需要重新涂覆。 | |||||
| 电刺激不会引起网络反应 | 增加刺激强度, 改变电极对。 | ||||
| 电刺激可以引起近端, 而不是远端皮质区域的人口反应 | 由于连接性差或刺激强度过低, 问题 ikely。电刺激在某些皮质区域可能是无效或有效的。建议改变脑切片。 | ||||
| 信号嘈杂 | (1)检查参考电极: 噪音基线有时可能是由于入口水库的不完全填充造成的, 所以参考电极不完全深入到 ACSF 中。 | ||||
| (2)检查设备的整体接地情况。 | |||||
| (3)调整吸针位置, 以便听到恒定的、柔和的吸音。地面吸针。 | |||||
| (4)使用棉签清洁多边环境协定与乙醇的外部接触。 | |||||
| (5)多边环境协定芯片可能受到损坏: 改变芯片和检查工件以及信噪比。 | |||||
表 3: 疑难解答。
Discussion
多边环境协定是神经生理学调查的宝贵工具, 近年来由于勘探和发展已达到成熟。与常规场电位记录相比, 多边环境协定提供了较高的观测点和已知电极间距离的优势, 这对于准确定位神经元网络的相互作用至关重要。
该技术还可以结合其他电生理学方法, 如膜片钳记录15, 以研究单神经元和神经网络活动之间的关系。同时, 可视化场电位和多单位活动的可能性可以为小神经元群的活动与集体神经网络的相关性提供宝贵的见解。与电压敏感染料、钙成像和光遗传学29的结合允许使用多面体方法推断神经生理学现象.除了药理学研究, 在同一系统中进行记录和刺激的可能性使得该技术的记录技巧非常强大和多才多艺: 例如, 有可能研究突触可塑性现象在内存形成的核心30, 使用此处介绍的调节协议, 与 DBS 治疗癫痫和多种脑部疾病有关。最近的证据表明, 多边环境协定记录技术可以成功地应用于人类癫痫脑组织16表明它在癫痫研究中的宝贵用处, 既了解这种破坏性疾病的基本机制并微调 DBS 算法来改善它。
然而, 由于水下记录室的要求, 以及让大脑切片在微电极的固体基底上休息的必要性, 多边环境协定迫使对脑切片的 "极限" 条件下的电生理学实验进行追求。是集成的。因此, 脑组织可能无法获得足够的氧气供应, 这反过来又可能影响录音的质量。
这里描述的协议允许可靠地记录和研究 ictogenesis 在鼠边缘网络上的耦合, 利用急性体外4AP 模型和追求长期的电刺激, 为评估提供相关信息星展的政策。
以前对癫痫边缘网络的电调节的研究基于传统的场电位记录, 使用了老鼠或鼠脑切片, 结果类似24,25;但是, 由于与小鼠7获得的脑组织相比, 大鼠脑组织的使用被证明更具挑战性。关于多边环境协定技术, 小鼠脑切片最适合的优点是它们的体积较小。此外, 鉴于小鼠与大鼠脑组织中发作放电的发生率较高, 在一个实验日进行大量的脑切片测试是可能的, 这反过来又使数据收集速度更快、效率更高, 并能减少使用的动物数量。
对于现有方法的意义:
使用此处描述的自定义分庭记录的发作排放似乎与使用传统的多边环境协定环室和相同的多边环境协定类型 (平面微电极cf 17) 所观察到的持续时间和发生率相似。然而, 需要强调的是, 当使用常规的圆形记录室和低灌注率 (1 毫升/分钟) 时, 脑切片厚度必须显著降低, 这可能会阻碍调节实验的成功追求, 因为连接不良。
在本协议中, 由膜片钳记录室设计启发的低容量自定义记录室提供了稳定和可靠的层流, 这对于成功地追求多边环境协定录音至关重要;它还允许增加脑切片厚度为400µm, 以实现公平权衡组织的生存能力和内在的连通性。确实认识到, 腔内记录解决方案的层流是非常可取的脑切片电生理学, 因为它不受温度, 氧气和 pH 梯度的影响, 在循环流圆记录观察钱伯斯19,20,31 (像提供了商业上可用的多边环境协定)。这种梯度引入实验性偏倚, 也对脑切片有害。相对较小体积 (~ 1.5 毫升) 的记录室连同高灌注率 (5-6 毫升/分)16,31允许充分交换灌注介质 (≥3时间/分钟)。定制室可以很容易地获得从商业来源以实惠的价格或生产内部使用3D 印刷技术。其他研究报告了从400µm 厚的人脑切片16使用传统的多边环境协定环室的录音, 同时保持 ACSF 体积为1毫升, 并在低噪声蠕动泵的帮助下执行高灌注率 (5-6 毫升/分钟)。但是, 作者使用了不同的 ictogenesis 模型即, 低镁2 +, 这可能比4AP 模型的影响较小, ephaptic 机制涉及显著增加细胞外 K+浓度11,22. 我们发现, 4AP 模型中不需要高的灌注率, 可能是由于累积的胞外 K+的快速冲洗, 在录制 ACSF16中可能要显著增加。事实上, 当 ASCF 灌注速度增加到 2-3 毫升/分钟, 而脑切片被厚 ACSF 层淹没时, 发作事件出现了更多的 "块", 而在返回到较低的灌注率 (1 毫升/分钟) 和较薄的 ACSF 层在组织表面水平 (没有显示数据)。本协议中描述的自定义记录室允许以1毫升/分钟的流速交换灌注介质 3-5 次/分钟。因此, 即使在相对较低的灌注率下, 脑切片的整体氧气供应也得到了强烈的改善, 同时仍然保证了记录温度和高信噪比的稳定。最重要的是, 可以将胞外 K+浓度保持为生理值。
ictogenesis 的4AP 模型不需要对 ACSF 离子成分进行任何重大修改, 例如降低 Mg2 +或增加 K+, 并提供了保持兴奋和抑制传输完好的独特优势。12, 鉴于谷氨酸和 GABAergic 网络在癫痫发作同步中的关键作用 (cf 7), 这一方面与癫癎的研究高度相关。本协议中使用的 4 ap ACSF 包含生理 K+浓度 (3.25 毫米) 和略低的镁2 +浓度比持有 ACSF (1 毫米与1.3 毫米)。这种浓度仍然是在报告的镁2 +浓度在啮齿动物脑脊液中的生理价值, 并在许多实验室使用 (见例如17,18)。对于所述协议的目的, 我们发现, 这种轻微的减少是首选的援助, 以4AP 的效果。
在以前的工作中, 4AP 已被应用于脑切片, 当它已经定位在录音室17,18中。除非实验者需要观察4AP 应用与癫痫发作模式开始之间的时间滞后, 我们发现这种方法相当耗时, 不宜进行长时间的录音和刺激疗程。本议定书所述。32摄氏度的脑切片预孵化可节省大量实验时间, 因为脑切片可以在系列中预先处理, 同时使用其他组织切片进行实验。
脑切片的长期生存能力可能有助于分析长期的网络特征。此外, 如果实验者想要比较几种刺激方案, 这些方法必须在同一脑切片中进行, 以提高对重复电刺激的适应性, 这是很有好处的。在我们的手中, 当测试3刺激协议, 每一个之前的控制阶段, 然后是一个恢复阶段, 实验可能会持续 3-5 小时。在这种情况下, 实时制图是至关重要的, 以激活正确的途径和压制, 而不是青睐 ictogenesis 通过电刺激。我们的用户友好的 GUI 代表了一个快速, 简单和灵活的工具, 绘制不同的大脑结构的电极。与商业软件相反, 即使具有基本编程技能, 也可以添加自定义的多边环境协定布局。图像可以在明亮的领域获得;因此, 任何具有良好分辨率和适合显微镜的通用相机是合适的。倒置显微镜是必不可少的可视化的电极位置相对于脑切片, 因为这些将隐藏在组织下方, 如果使用直立显微镜。然而, 如果实验者需要进行刀切来扰乱特定的神经通路, 那么除了倒置型外, 还建议使用立体显微镜。
最后, 建议的方法的一个进一步好处是便宜和相对地容易装配多数必要的工具, 象自定义录音室和存放室、温暖的浴和切片锚, 以及不必要的使用昂贵的低噪音蠕动泵。
技术的局限性:
该记录不允许可视化非常慢的波浪,即, 信号中的 DC 移位。这种基线偏差可能有助于发作放电持续时间的渐进测量, 最重要的是, 它们是研究皮质扩张性抑郁症的基础 (一种与癫痫突发意外死亡有关的现象32 , 并共享癫痫与偏头痛之间33)。
关于电子调节, 这里所描述的协议允许在不影响脑切片生存能力的情况下进行几次刺激疗程。我们可以成功地执行多达3次的刺激会话, 20-45 分钟, 类似于以前工作中报告的25。虽然脑切片可能会经受更多的刺激疗程或更长的刺激协议, 但我们没有在这方面测试脑切片。我们建议将刺激方案的数量限制在 3, 避免延长 (≥60分钟) 刺激疗程, 这可能会显著地强调在这些限制条件下维持的脑组织, 但在刺激撤退时缺乏恢复。
议定书内的关键步骤:
几个关键因素可能会阻碍成功地追求记录和调制的癫痫活动的脑切片耦合到多边环境协定。除了所使用的啮齿动物种类和脑切片的质量, 录音过程中的灌注率和 ACSF 流的动态 (i. e, 层流与圆形) 在记录室内, 我们发现恢复的条件和脑切片的长期维护以及4AP 应用的模式是最关键的步骤。
在使用浸没式保温室时, 在室温下贮存脑切片, 以保持脑组织网络活动, 有利于4AP 应用发作放电的诱导, 是至关重要的。在我们的手, 恢复和维护在32°c 恶化了脑组织在 3-4 小时内切片。
然而, 4 ACSF 的脑切片在室温下孵化并记录在32摄氏度是不可取的。在这种情况下, 我们发现有许多困难在观察健壮的复发发作放电。事实上, 在20–24°c 范围内的低温已经报告, 以抑制或甚至防止 4 ap 诱发 ictogenesis 两个在体外34和在体内35。因此, 4AP 孵化和记录温度必须在 30-34 摄氏度以内, 必须匹配。为了避免把大脑组织置于太大的压力下, 由于同时诱导 hyperexcitability 4AP 和脑切片的突然暴露从室温到温暖 (32 °c) 4 ap-ACSF, 这是基本的执行中间预热步骤, 让大脑切片习惯在持有 ACSF 在32°c 20-30 分钟. 跳过此步骤可能会影响 ictogenesis 感应4AP。
另一个需要提及的方面是 ACSF 后的 d-葡萄糖浓度在切片后的重要性。25毫米的浓度保持脑切片优于10毫米浓度在许多实验室使用, 它也提高了发作活动的发生率, 这是2倍更快 (因此, 使其更容易进行长系列的实验规程在几脑切片每天)。
最后, 需要指出切片过程中的一些重要细节。首先, 不要让完整的大脑和脑切片冻结在冷切割 ACSF。为 < 2 分钟冷却的大脑是足够的, 因为小鼠的大脑大小。组织切片应立即从缓冲托盘转移到冲洗烧杯室温。冲洗切割 ACSF 是非常重要的, 否则高蔗糖浓度将使脑切片坚持在尼龙网眼的保持室。为了有效地冲洗组织, 重要的是尽量减少切割 ACSF 的内容内的转移吸管, 以避免污染的持有 ACSF 过度。2级冲洗有助于减少污染。切片程序完成后, 应立即将组织切片从冲洗烧杯转移到保温室, 在保持 ACSF 中, 软尼龙网暂停中途, 可使两侧的组织氧合。在切片过程后的所有阶段都应采用同样的原理: 脑切片不应该坐在烧杯的底部, 他们不应该接触到持有商会的两侧, 他们不应该接触对方, 也不应该重叠。
修改和疑难解答:
ACSF 成分可根据实验者的需要进行修改。例如, 可以添加药物来解剖特定的神经递质或离子通道对电调节的功效的贡献。此外, 可以省略丙酮和抗坏血酸 (cf 表 2), 尽管我们发现它们发挥了强大的神经保护作用。我们在表 3中报告了在本协议中可以遇到的最常见问题以及如何处理它们。
结论：
这一记录无疑是解决神经网络在健康和疾病中相互作用的宝贵技术。除了药理学研究, 还可以评估与星展集团应用于癫痫和其他神经系统疾病相关的电调节协议。在本议定书中, 我们已经表明, 有可能重现典型的周期性刺激实验, 其结果与常规细胞外磁场电位记录和外部刺激电极获得的效果相似。越来越多的商用用户友好设备和先进的软件工具, 使多边环境协定记录技术也适用于闭环刺激实验, 对脑组织提供特别刺激, 并研究反馈机制对神经网络反应的贡献。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
他是由欧洲联盟 MSCA-IF-2014 项目资助的玛丽居里夫人-居里研究员. b. 美国, g.a.n. 660689, 框架计划 H2020。GUI mapMEA 是免费提供的要求, 作者 ilaria.colombi@iit.it ilaria. colombi@iit。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Adrich | P7886 | Needed for MEA coating |
| NaCl | Sigma-Adrich | S9888 | Chemical |
| KCl | Sigma-Adrich | P9541 | Chemical |
| KH2PO4 | Sigma-Adrich | 795488 | Chemical |
| CaCl2*2 H2O | Sigma-Adrich | C3306 | Chemical |
| D-Glucose | Sigma-Adrich | RDD016 | Chemical |
| NaHCO3 | Sigma-Adrich | S5761 | Chemical |
| MgCl2*6 H2O | Sigma-Adrich | M2670 | Chemical |
| MgSO4*6 H2O | Sigma-Adrich | M5921 | Chemical |
| Sucrose | Sigma-Adrich | RDD023 | Chemical |
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma-Adrich | 107360 | Chemical |
| 4-aminopyridine | Sigma-Adrich | A78403 | Convulsant drug |
| STG-2004 | Multichannel System | STG4004-1.6mA | 4-channel stimulus generator with voltage (±8 V) and current output (±1.6 mA) |
| MEA1060 | Multichannel System | N/A | MEA amplifier |
| planar MEA | Multichannel System | 60MEA500/30iR-Ti w/o ring | Must be without ring to allow using the custom recordingchamber |
| McRack | Multichannel System | Recording software | |
| McStimulus II | Multichannel System | STG4004 control software | |
| TC02 | Multichannel System | TC02 | 2-channel thermostat |
| PH01 | Multichannel System | PH01 | Heating perfusion canula |
| MPH | Multichannel System | MPH | Magnetic holder for PH01 and suction needle |
| Elastostil E43 | Wacker | E43 | Elastomeric sealant used to mount the custom recording chamber onto the MEA |
| MEA Custom Chamber | Crisel Instrument | SKE-chamber MEA | Custom recording chamber |
| Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm | Crisel Instrument | 64-1309 | Reference electrode for the custom recording chamber |
| Tergazyme | Sigma-Adrich | Z273287-1EA | Enzymatic cleaner |
| MATLAB | The Mathworks | Programming environment for electrodemapping | |
| VT1000S | Leica Biosystems | VT1000S | Vibratome |
| Warner Instruments | 64-1309 | Ag-AgCl Electrode Pellet 1.0 mm (E205). Reference electrode. |
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