Summary
ويقدم البروتوكول الإشريكيّة القولونية-على أساس إدماج الضغط الانتقائي من الأحماض الأمينية غير المقبول (ncAAs) في نيسين الببتيد الميكروبات لاكتوكوككال. يمكن تغيير الخصائص الخاصة به أثناء المؤتلف التعبير عن طريق استبدال مع ncAAs المطلوب في وسائط النمو المحددة. يتم تعيين التغييرات الناجمة عن ذلك في بيواكتيفيتي فحوصات تثبيط النمو والفحص المجهري الأسفار.
Abstract
الطبيعة لديها مجموعة متنوعة من الإمكانيات لإنشاء مهام جديدة من البروتين عن طريق تعديل التسلسل لبنات بناء الأحماض الأمينية الفردية. ومع ذلك، تستند كافة التباينات 20 الأحماض الأمينية الكنسي (الهيئة). كوسيلة لإدخال إضافية الخصائص الفيزيائية الكيميائية البروتينية، يزداد يستخدم دمج الأحماض الأمينية غير المقبول (ncAAs) في هندسة البروتينات. نظراً لمدة قصيرة نسبيا، تعديل الببتيدات تجميعي مشفر وتعديل بوستترانسلاتيونالي من ncAAs جاذبية خاصة. يمكن إنشاء وظائف جديدة ومقابض الكيميائية بتعديلات محددة من بقايا الفردية. تستخدم طريقة إدماج (SPI) الضغط الانتقائي سلالات المضيف أوكسوتروفيك أن يحرم من الأحماض الأمينية الأساسية في وسائط النمو محددة كيميائيا. يمكن ثم يمكن تنشيطه بواسطة سينثاتيز aminoacyl-الحمض الريبي النووي النقال المقابلة عدة النظير من الأحماض الأمينية متشابهة كيميائيا وهيكليا وتوفير cAA(s) الخاصة بالمخلفات ← ncAA(s) استبدالات في تسلسل الببتيد أو البروتين الهدف. على الرغم من ذلك، في سياق الأسلوب SPI، أدرجت أيضا ncAAs في البروتين المضيف أثناء مرحلة التعبير الجيني المؤتلف، يتم تعيين معظم الموارد للخلية للتعبير عن الجين المستهدف. وهذا يتيح إدراج خاصة ببقايا كفاءة ncAAs غالباً ما يترافق مع كميات كبيرة من المعدل المستهدف. يصف العمل الذي قدم في فيفو إدراج ستة برولين النظير في نيسين الببتيد مضادات الميكروبات، لانتيبيوتيك طبيعة الحال التي تنتجها لاكتيس لاكتوكوككوس. يمكن تغيير خصائص مضادات الميكروبات نيسين وتوسيع أثناء التخمير والتعبير في أوكسوتروفيك الإشريكيّة القولونية سلالات في وسائط النمو المحددة. وبالتالي، يمكن تسليم آثار الاستبدال الخاصة بالمخلفات من الهيئة مع ncAAs التغيرات في نشاط مضادات الميكروبات وخصوصية. فحوصات نشاط مضادات الميكروبات والأسفار الفحص المجهري تستخدم لاختبار المتغيرات نيسين الجديدة لتثبيط النمو من سلالة مؤشرات إيجابية لاكتيس لاكتوكوككوس . يتم استخدام التحليل الطيفي الشامل للتأكد من إدماج نكا في المتغيرات نيسين النشطة بيولوجيا.
Introduction
اكتشاف المضادات الحيوية في القرن الحادي والعشرين، والتطور الموازي لمركبات مضادات جديدة ضد الأحياء المجهرية الممرضة تمكين تستهدف علاج العدوى البكتيرية. ومع ذلك، نظراً لظهور مسببات المقاوم للأدوية المتعددة مثل مقاومة للميثيسيلين ستافيلوكوككوسوريوس (الجرثومة)، المكوّرات مقاومة للفانكوميسين (فري)، اكتب بالعاثية المقاوم للأدوية المتعددة (المقاوم للأدوية المتعددة) typhimurium السالمونيلا 10 (DT10 )، الكلبسيله الرئوية، من الضروري على وجه الاستعجال لتوليد مضادات الجراثيم الجديدة1. مضادات الميكروبات الببتيدات (الامبير) هي مركبات تنوعاً، ومحددة للغاية وكثيراً ما أن المرشحين الواعدين لتطوير أدوية جديدة بفضل الخصائص الفيزيائية، والمرونة، وحجمها وهيدروفوبيسيتي، ووضع الإجراء2. هي الامبير الببتيدات الصغيرة عادة ما تتألف من الأحماض الأمينية 7-100. وكثيراً ما لديهم بنية الموجبة غنية ببقايا ارجينين ويسين مشحونة بشكل إيجابي، التي تتفاعل مع غشاء الخلية الميكروبية المستهدفة، التي يتوجب معاكس3. هي مجموعة فرعية معينة من الامبير الببتيدات تجميعي مشفر وتعديل بوستترانسلاتيونالي (ريبس)4. وتصدر هذه العديد من الكائنات الحية من مملكة الفطريات والمجال للبكتيريا. واحد ريبس المعروفة والمستخدمة على نطاق واسع نيسين، وبطبيعة الحال التي تنتجها بكتيريا حمض الالكتيك لاكتيس لاكتوكوككوس (L. lactis). نشطة ضد فريق بكتيريا إيجابية، نيسين قد استخدمت بيوبريسيرفاتيفي في صناعة الأغذية لأكثر من 50 عاماً بسبب خصائصه المضادة للميكروبات، وغياب المقاومة تطورت في السلالات الجرثومية المستهدف5. وقد أظهرت الدراسات أن نيسين يزعزع ويولد المسام في أغشية الخلايا البكتيرية، مما يؤدي إلى نشاط مضادات الميكروبات ضد كل من الجراثيم إيجابية وسلبية الغرام6. ملزمة للدهن الثاني، هو توليف جدار الخلية البكتيرية تحول دون7. يتم ترميز نيسين النساء ببتيد سلائف خطية، التي تتألف من زعيم ومنطقة ببتيد أساسية (الشكل 1). بعد توليف ريبوسومال، يتم تعديل برينسين أولاً قبل ديهيدراتاسي نسب. هنا، بقايا سيرين وثريونين في منطقة كور بريبيبتيدي المجففة ديهيدروالانيني (Dha) وديهيدروبوتيريني (المجالس الصحية المحلية)8. لاحقاً، بقايا المجففة تقترن سيستين للنموذج لانثيونيني الخواتم (ومن ثم اسم "لانتيبيوتيك" للمضادات الحيوية التي تحتوي على حلقة لانثيونيني) بإضافة مايكل حفز إنزيم. هذا التعديل بوستترانسلاشونال (PTM) هو تحفزها cyclase كبيرة. في لاكتيس لام، ثم ينقل برينيسين تعديل الخروج من الزنزانة بالناقل نيست، وهو المشقوق الببتيد زعيم من البروتيناز نيسب بالإفراج عن نيسين الناضجة والنشطة نموذج9. Peptidase زعيم مسئول نسب خصوصية عالية الركازة، نظراً إلى أن العمليات فقط تعديل نيسين كفاءة10.
وبصفة عامة، يؤدي ريبس النشطة من عمل الإنزيمات PTM (على سبيل المثال نيسبك)، التي تزيد مساحة الكيميائية من الببتيدات قصيرة، مثلاً، عن طريق أسيتيليشن، جليكوسيليشن، مثلايشن أو الفسفرة جذريا. ويمكن توسيع هذا المستوى من التعقيد كذلك بإدراج مباشرة من ncAAs. في حين غالباً ما كان ذلك ممكناً، التوليف الكيميائي للمكاتب الإقليمية للمرأة يمثل تحديا للإنتاج على نطاق واسع بسبب تعقيدها الهيكلية. على سبيل المثال، أنجز توليف الكيميائية الإجمالية لاكتوسين لانتيبيوتيك S في 71 رد فعل الخطوات مع عائد نهائي من 10% وأن نيسين مع عائد النفط خام من11،0.003% فقط12. ولذلك، يقدم الإنتاج البيولوجي بديل قابل للتطبيق، بسبب توليد ستيريوسينتيرس الصحيح وتركيز المنتج عالية.
حتى اليوم، أكثر من 150 ncAAs، مثلاً، وجود المجموعات الوظيفية التي تحتوي على الفلور أو أزيدات، قد أدمجت في البروتينات المؤتلف، ومن عدة أمثلة لتعديل نكا الامبير قد تم الإبلاغ عن13،14، ،من 1516. مع الأخذ ncAAs، يمكن إنشاء الخصائص الفيزيائية الكيميائية الرواية مقارنة بالطفرات التقليدية. ويمكن زيادة تنوع الببتيدات القائمة، مما قد يؤدي إلى رواية المضادات الحيوية.
أسلوب واحد لإدراج ncAAs في الببتيدات المؤتلف إدماج الضغط الانتقائي (SPI) استناداً إلى استخدام السلالات البكتيرية أوكسوتروفيك17. هذه السلالات غير قادر على توليف التناظرية الجهاز المركزي للمحاسبات المقابلة من ncAA. يستخدم المنهجية خصوصية الركازة خففت كثيرا ما لوحظ، سمة من سمات العديد من أمينواسيل الطبيعية-الحمض الريبي النووي النقال سينثيتاسيس (آرس)18. وبصرف النظر عن على ركائز الجهاز المركزي للمحاسبات الطبيعية، هذه الإنزيمات غالباً ما تكون قادرة على الاعتراف وتنشيط نكا المرجوة وتوجيه الاتهام إلى ما tRNA(s) المشابهة. هذا يؤدي إلى إدراج ريبوسومال ncAA في المنتج الجينات المستهدفة بصورة خاصة ببقايا (أي هيئة الطيران المدني ← نكا الاستبدال). هذا هو بالطبع ممكناً إلا عندما نكا المطلوب مشابه كيميائيا وهيكليا للأحماض الأمينية المتعارف عليه وتتغاضى عن فسيولوجيا الخلية، والترجمة الآلية وتسلسل الببتيد أو البروتين الهدف. في إعداد تجريبية خاصة، تستزرع خلايا المضيف أوكسوتروفيك في متوسطة المعرفة المتوفرة مع تركيز الأحماض الأمينية الأصلي الاستعاضة عن الحد. النمو الخلوية أو الصرف بواسطة خالية من الجهاز المركزي للمحاسبات يؤدي إلى نضوب داخل الخلايا للجهاز المركزي للمحاسبات. في الخطوة التالية، يتم إضافة نكا وفعل التعبير الجيني المستهدف. لا محالة، ncAAs الآن أيضا مدرجة في العديد من البروتينات الأخرى في الخلية المضيفة أثناء هذه المرحلة من التعبير الجيني المستهدف. ومع ذلك، يتم الاحتفاظ سمية الإعداد SPI عند مستوى منخفض حيث تتحول سلالة الإشريكيّة القولونية (كولاي) مع بلازميد تحمل الجينات المستهدفة تحت سيطرة أحد المروجين القوى (عادة ذات قدرة تنافسية عالية T7 المروج/ رنا بوليميراز النظام)19. فورا بعد التعريفي (عادة عندما يتم استنفاد الجهاز المركزي للمحاسبات) والمضيف تتوقف الخلايا تنمو وأجهزتهما الانزيمية هيولى تستخدم أساسا للتعبير عن الهدف القائم على بلازميد الجينات. يمكن استخدام الطفرات الموجهة من الموقع لتحديد المواقع الخاصة ببقايا نكا التثبيت في الجينات الهدف20.
ببتيد نموذجي لإدراج ncAAs، اختير نيسين أمبير بينتاسيكليك A. الأحماض الأمينية 34 طويلة وبقايا برولين واحد فقط في تسلسل الببتيد الأساسية (الشكل 1). كما هو الحال في سوبتيليسين، أرسين A وق، وابيديرمين، وكذلك كما هو الحال في نيسين Z ونيسين Q، يبدو أن برولين المصانة أساسيا للنشاط9،21. برولين الجهاز المركزي للمحاسبات يلعب دوراً بالغ أهمية في بيبتيديل-بروليل أميد التناوب واستقرار الهيكل الثانوي. حلقة في سلسلة جانبية والتشكلات (exo/بوكيرس إندو) هي المسؤولة عن استقرار حراري للسندات أميد. غالباً خطيرة تؤثر التعديلات الكيميائية المستهدفة (مثل هيدروكسيليشنز، فلورينيشنز، ميثيليشنز) من ملمس بروليل الاستقرار والصلابة سقالة والوظائف للعديد من الهياكل البيولوجية22قابلة للطي. وبالتالي، فمن المعقول أن نتوقع أن يمنح استبدالات التناظرية برولين Pro→ خاتم ب، الحلقة الثانية من نيسين، مع الرواية وخصائص غير عادية.
هنا، برولين أوكسوتروفيك كولاي سلالة استخدمت لإنتاج نيسين المؤتلف. وهذا يتطلب التعبير عن الجينات بريبيبتيدي سورة النساء ، فضلا عن الجينات إنزيم التعديل نيسبك. يحمل المنتج الببتيد المرمز وراثيا زعيم صاحب معلم ن لا شفاء منها لتنقية عبر التقارب اللوني. لتحديد النشاط، ويستخدم لاكتيس L. معربا عن وإفراز نسبت لتنشيط الخيارين نيسين المؤتلف من ليساتيس كولاي الخلية أو عينات الببتيد المنقي (الشكل 1). يتم تحرير أمبير ناضجة بعد انشقاق الزعيم بنسب. في هذا الأسلوب نشر أجار، عينة أمبير ينشر في متوسط نمو متين ويمكن أن تعوق نمو الكائنات الدقيقة إيجابية. بعد حضانة، وهذا يمكن ملاحظة بصريا بهالات تثبيط النمو. بالإضافة إلى لاكتيس ل. كمؤشر، تعديل متغيرات نيسين أظهرت نشاط مضادات الميكروبات ضد فايكاليس البرازيةو المكوّرات العنقودية الذهبية، و الشمعية Bacillus جوهنسوني اكتوباكيللوس 21،23.
هو أسلوب بديل ومختلف تجريبيا لدمج ncAAs في ريبس كودون وقف قمع (المنبوذة)24. لهذا، الحمض الريبي النووي النقال متعامد/أمينواسيل-الحمض الريبي النووي النقال سينثاتيز (aaRS) زوج مطلوب نكا المقابلة. ومن الناحية المثالية، كل هذه المكونات الثلاث هي بيورثوجونال، أي أنها لا تتفاعل مع ترنس الذاتية وآرس. AaRS نكا محددة يمكن إنشاؤها بواسطة تعديل الموقع النشط في الإنزيم والفرز للمكتبات الوراثية سينثيتاسيس متحولة25. وعلاوة على ذلك، يتطلب الأخذ نكا كودون التي يتم إعادة تعيينها والتي غير والتي ترميز للجهاز المركزي للمحاسبات. عادة، هو كودون وقف العنبر تستخدم24،26.
في الآونة الأخيرة، أنشئت SPI لإدماج ncAAs المحتوية على تشلورواسيتاميدي α وانقر-الكيمياء-متوافق في سورة النساء27. على سبيل المثال، قد أدرج Nε-التخصيص-يسين كابتيستروين الببتيد ﻻسو بمواقع محددة (SCS) والخاصة بالمخلفات (SPI) إدماج أساليب المعدلة لاحقاً في المختبر التي حفزت الروثينيوم الناتج28 . بالمقارنة مع SPI، الأسلوب المنبوذة أكثر تعقيداً منذ الحمض الريبي النووي النقال متعامد/زوج aaRS يجب أن يكون أعرب عن المشاركة. حتى الآن، تم س-أزواج لإدماج برولين المتقدمة29، ولكن أفضل معرفتنا، لم يبلغ أي مثال التأسيس برولين التناظرية.
تجدر الإشارة إلى أن ncAAs ليست كلها يمكن إدراجها باستخدام منهجية SPI. أولاً، ينظم العديد من البروتينات النقل المضمنة في غشاء هيولى، وهي الغشاء الداخلي للبكتيريا سلبية الغرام مثل كولايامتصاص ncAAs في السيتوبلازم. عادة، يتم كولاي قادرة على نقل مجموعة واسعة من النظير من الأحماض الأمينية في الخلية مع سلاسل الجانب هيكلياً ومشابه كيميائيا للأحماض الأمينية المتعارف عليه. ثانيا، العديد من ncAAs رد الفعل أو غير مستقرة كيميائيا قد تعمل كمثبط اتجاه النمو الخلوي، حيث أنها سامة للتمثيل الغذائي وعلم وظائف الأعضاء المضيفة خلية30. وهكذا، بالاقبال وسمية نكا للمضيف الإنتاج ينبغي اختبار مسبقاً. لتجنب المنظمة إليه PTM كأثر جانبي، يمكن استخدام إعداد تعبير رقابة صارمة من المورثات المسؤولة لدمج الأحماض الأمينية الطبيعية الإنزيمات التعديل (مثلاً، نيسبك)، والرابطة الوطنية لرياضة في الجينات المستهدفة ( سورة النساء مثلاً،). هذا أن يمكن إنجاز باستخدام اثنين من المروجين مختلفة والتعريفي للتعبير الجيني المستهدف، كما هو موضح في البروتوكولات SPI المصممة خصيصا31. كما هو مبين أعلاه، يعتمد الأسلوب SPI على خصوصية الركازة استرخاء aaRS، الذي يسمح لتفعيل نكا والمشابهة الحمض الريبي النووي النقال الشحن. بعد ذلك، يتم تسليم الحمض الريبي النووي النقال الريبوسوم تليها أميد تشكيل السندات وقابلة للطي من الببتيد المستهدفة (بولي). في هذه العمليات، وتصحيح التجارب المطبعية، وتحرير آليات قد تصبح ذات الصلة32. لهذه الأسباب، فإنها ذات أهمية كبيرة ليكون هدفا نكا مشابهة كيميائيا وهيكليا للجهاز المركزي للمحاسبات. نقاط حاسمة أخرى هي الاستقرار كافية (سواء في وسائط الاستنبات ويتعرض الأيض الخلوية) وذوبان ncAA. بالإضافة إلى ذلك، فإنه ينبغي متوفرة تجارياً أو سهلة ليتم تصنيعه كيميائيا.
هنا، نحن وصف بروتوكول للحزب الاشتراكي الإيراني، السماح بإدراج خاصة ببقايا ncAAs في المؤتلف ريبس. خاصة، تدمج النظير برولين مختلفة نيسين الببتيد الميكروبات باستخدام كولاي كالكائن الحي المضيف. يتم استخدام الطيف الكتلي للتحقق من استبدال حمض أميني ويتم تحليل المنتجات الببتيد بيواكتيفيتي استخدام فحوصات تثبيط النمو والأسفار مجهرية باستخدام السلالات الجرثومية مؤشر.
يتطلب الشرط الأساسي للتعبير نيسين المؤتلف ناجحة مع ncAAs محددة مناسبة برولين أوكسوتروفيك كولاي سلالة. لهذا أوكسوتروفي، proA قد تكون مختلة، فعلى سبيل المثال حققت بالجينوم بالضربة القاضية. خلايا المحرومين تماما من داخل الخلايا برو الحيوي (أي حذف بروابك) دون إمكانية العودة أوكسوتروفس مستقرة. أساليب خروج المغلوب الجينات المستخدمة على نطاق واسع هي توصيل بالعاثية أو خروج المغلوب وحيدة الجين وفقا داتسينكو & وانير33. وعلاوة على ذلك، يمكن الحصول على سلالات proA خروج المغلوب من المستودعات العامة مثل أدجيني أو كجسك أو مجموعة كيو. منذ التعبير المؤتلف نيسابك هو موضح هنا تعتمد على استخدام المروجين T7, قد سلالة المضيف التعبير للقيام جينات إيندوسيبلي بوليميريز الحمض النووي الريبي T7. يمكن إنجاز هذا بإدخال بروفاجي λDE3 في جينوم المضيف، على سبيل المثال باستخدام مجموعة تجارية. وبدلاً من ذلك، يمكن إجراء سلالات مثل BL21(DE3) أوكسوتروفيك كما هو موضح أعلاه.
Protocol
1-استنساخ متجهات التعبير والتحول سلالة إنتاج أوكسوتروفيك
هنا، تم مأخوذة من لاكتيس L. الجينات تخليق نيسين الحيوي، إلا وهي نيسابك، ونقلها إلى نواقل التعبير بلازميد المستندة إلى T7. يمكن الاطلاع على كامل تسلسل الحمض النووي من نيسابك في بنك الجينات دخول X6830734. قد وضعت في الجينات للسلائف الببتيد (النساء) على ناقل الحيوانات الأليفة-3a يمنح المقاومة الأمبيسلّين. وضعت الجينات ديهيدراتاسي (نسب) وسيكلاسي (كبيرة) على ناقل برسفدويت-1، كما تم الإبلاغ عنها سابقا35، الذي يمنح المقاومة كاناميسين.
ملاحظة: ل النساء، كانت تحور codons الأحماض الأمينية الأربعة الأخيرة (ASPR) في التسلسل زعيم لترميز VSLR36 لتجعل بقايا برولين في الببتيد أساسية فريدة من نوعها وضمان بريبيبتيدي السليم معالجة بواسطة نيسب. في N-المحطة، تمت إضافة علامة سداسي-الحامض الأميني الذي كان واقفاً إلى جانب بقايا رابط لأغراض تنقية (انظر الشكل 1).
الشكل 1 . التمثيل التخطيطي تخليق الحيوي و PTM نيسا في كولاي فضلا عن انشقاق الزعيم بالسلالة مؤشر لاكتيس L. في تحليل نشاط لاحقاً. في الخطوة الأولى، برينسين الخطي غير نشط (تتألف من زعيم ومنطقة ببتيد أساسية التي تحتوي على برولين فريدة من نوعها (الوردي) في الموضع 9) مرمزة بواسطة مشفر يتم تصنيعه نيسا . بعد ذلك، بوستترانسلاتيونالي يتم تعديل برينسين بجفاف بقايا سيرين وثريونين ديهيدروالانيني (Dha) وديهيدروبوتيريني (المجالس الصحية المحلية) كما حفزت بنسب. أشكال سيكلاسي كبيرة في ثيوثير الجسور عن طريق إضافة مايكل سيستين سلفهيدريل الجماعات مع إدارة الشؤون الإنسانية أو المجالس الصحية المحلية. برينيسين تم التعديل غير نشط هو تنقيته من كولاي واختبارها لنشاط مضادات الميكروبات. وهنا ينقل داخل خلية سلالة مؤشرات إيجابية لاكتيس لام . هو المشقوق الزعيم بحوزتي نسب (كما هو مبين برأس سهم) بالإفراج عن نيسين نشط بشكل كامل. كما يمكن إزالتها في المختبر بالمعاملة مع التربسين (*). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- استخدام صدمة الحرارة القياسية البروتوكول37 أو انهانسر38 لتحويل برولين أوكسوتروفيك كولاي سلالة (انظر أعلاه) مع البلازميدات الحيوانات الأليفة-3a نيسا(VSLR) وبرسفدويت-1 نيسبك.
- "الماصة؛" 25-100 ميليلتر من تعليق خلية المحولة على أجار لوحات تتضمن الأمبيسلّين، كاناميسين، والجلوكوز 1% (w/v). استخدام الناشرة لوحة أو الخرز الزجاج لنشر الحل بشكل متساو على اللوحات.
- احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- بعد ظهر اليوم التالي، استخدم مستعمرة واحدة لتطعيم متوسطة 10 مل رطل تتضمن الأمبيسلّين، كاناميسين، والجلوكوز 1% (w/v) في قارورة 50 مل.
- هزة الثقافة بين عشية وضحاها (12-16 ح) في 37 درجة مئوية و 200 لفة في الدقيقة.
- تأخذ 250 ميكروليتر معقمة 80% والغليسيرول والثقافة ميليلتر 550 ومزيج جيد في أنبوب 2 مل وتخزينها كمخزون الخلية مجمدة عند 80 درجة مئوية.
2-إعداد الحد الأدنى المتوسطة (نم) الجديدة
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول نم20 كوسيلة محددة كيميائيا نمو بكتيرية سائلة. أيضا، فإنه ينصح باتباع ترتيب إعداد دقة. وبخلاف ذلك، يمكن أن يحدث هطول الأمطار. لأشكال من الأحماض الأمينية مختلفة عن تلك المذكورة في الجدول المواد (مثلاً، هيدروتشلوريديس)، والتحقق من قابلية الذوبان. NMM19 يحتوي على 19 الأحماض الأمينية فيما عدا الجهاز المركزي للمحاسبات لتحل محلها (هنا، برولين) ببث نكا. انظر الجدول 1 لتركيزات العنصر النهائي. اعتماداً على سلالة البكتيريا المستخدمة للإنتاج، البيوتين والثيامين قد تكون اختيارية.
- إعداد الخليط من الأحماض الأمينية
- حل ز 0.5 الفنيل ألانين، الحزب وصور في 100 مل ddH2س مع إضافة بضع قطرات من HCl تتركز حتى انحلال.
- تزن من 0.5 ز كل من الأحماض الأمينية 16 المتبقية. مزيج مع 22 مل من 1 م خ2ص4 و 48 مل من 1 م ك2مكتب البراءات الهنغاري4. إضافة ddH2س لمل ~ 800. يقلب حتى يصبح الحل واضح.
- إضافة المذاب الفنيل ألانين والراديكالي وصور وضبط مستوى الصوت حل ل 1 مع ddH2o.
- تعقيم الخليط من الأحماض الأمينية عن طريق الترشيح فراغ مع وحدة تصفية أعلى زجاجة.
- حلول الأسهم ل NMM19
- أولاً، إعداد 1 م الحلول المخزون من العناصر التالية: (NH4)2حتى4، خ2ص4، ك2مكتب البراءات الهنغاري4، مجسو4 ومن 5 م الأسهم الحل من كلوريد الصوديوم. تعقيم بالتعقيم.
- إعداد الأرصدة 50 مل د-الجلوكوز (1 م)، كاكل2 (1 غرام/لتر)، فيكل2 (1 غرام/لتر)، الثيامين (10 غرام/لتر)، البيوتين (10 غرام/لتر) والعناصر النزرة (CuSO4، الحركة2(NH4)2مو4، زنكل2؛ 1 مغ/لتر ). تعقيم كل منهما عن طريق الترشيح مع عامل تصفية المحاقن.
- إعداد NMM19
- تخلط جميع الحلول الأسهم للحصول على تركيز نهائي من 7.5 مم (NH4)2هكذا4مم 1.7 كلوريد الصوديوم، 22 مم خ2ص4، 50 مم ك2مكتب البراءات الهنغاري4، 1 مم MgSO4 وعيار 20 ملم د-الجلوكوز، والأحماض الأمينية 50 مغ/لتر مزيج، 1 ميكروغرام/لتر كاكل2, 1 ميكروغرام/لتر فيكل2، 10 ميكروغرام/لتر الثيامين، البيوتين 10 مغ/لتر والعناصر النزرة ميكروغرام/مل 0.01.
3-التعبير عن نيسين المؤتلف مع إدماج النظير برولين من SPI
في هذا القسم، التعبير المؤتلف من بريبيبتيدي (هنا: النساء) والجينات PTM (هنا: نيسبك) يتم تنفيذ. أولاً، الخلايا وتزرع في حضور الهيئة كافة، حيث يتم استخدام وسيلة معقدة رطل. يتم إضافة السكر لقمع التعبير الجيني الهدف على مستوى الخلفية، التي يمكن أن يؤدي إلا إلى إنتاج ببتيد البرية من نوع (هنا: نيسين) سبب يجتازها المروجين. فقط بعد الهدف الجهاز المركزي للمحاسبات (هنا: برولين) هو النضوب، إضافة نكا وهو فعل التعبير الجيني المستهدف في المتوسط محددة كيميائيا. ينبغي القيام بالحضانة للثقافات السائل في قوارير مناسبة مع تهوية (مثلاً 500 مل في قارورة Erlenmeyer ل 2 200 لفة في الدقيقة).
- ابدأ باستخدام تلميح ماصة معقمة، ثقافة جديدة بين عشية وضحاها من مخزون الخلايا المجمدة أو مستعمرة جديدة (راجع الخطوة 1). استخدام مل 25 رطل المتوسطة المحتوية على الأمبيسلّين، كاناميسين، والجلوكوز 1% (w/v) واحتضان بين عشية وضحاها (12-16 ح) عند 37 درجة مئوية و 200 لفة في الدقيقة.
- تطعيم 1 لتر متوسطة الطازجة عقيمة مع الثقافة بين عشية وضحاها 10 مل (1% v/v)، واحتضان في 37 درجة مئوية و 200 لفة في الدقيقة حتى OD600 = 0.5.
- أجهزة الطرد المركزي في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في 4,500 س ز.
- من أجل إيقاف المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع 20 مل NMM19 (تم إعداده في الخطوة 2، 3) التي تحتوي على المضادات الحيوية والجلوكوز 1% (w/v). أجهزة الطرد المركزي في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في 4,500 س ز.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 500 مل الوسط نفسه واحتضان في 30 درجة مئوية و 200 لفة في الدقيقة ح 1.
ملاحظة: في هذه الخطوة، استنفاد الجهاز المركزي للمحاسبات (هنا، برولين) يأخذ مكان. - تقسيم الثقافة إلى أجزاء متساوية (واحد لكل نكا). حمل كل ثقافة مع 1 مم الأيزوبروبيل β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي (إيبتج) والعرض 1 مم برولين النظير (4S/R-فلوروبروليني، 4S/R-برولين أو 4S/R-ميثانوبروليني).
ملاحظة: كمراقبة، يمكن توفيره ثقافة واحدة مع برولين 1 مم، أسفر عن إنتاج ببتيد البرية من نوع. - تبني بين عشية وضحاها (12-16 ح) عند 28 درجة مئوية و 200 لفة في الدقيقة.
- الطرد المركزي الخلية الثقافات في أنابيب 50 مل عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في غ. س 5,000 من أجل إيقاف المادة طافية وتخزين الكريات في-80 درجة مئوية حتى تنقية.
4-عزل وتنقية من النظير نيسين صاحب معلم
يتم تنقيتها الببتيدات تحت يشوه الظروف مع غوانيدين هيدروكلوريد (جوكل)39، قوية ديناتورانت.
تنبيه: جوهكل ضار إذا ابتلع أو استنشق ويسبب الجلد وتهيّج العين الخطيرة. ارتداء القفازات وحماية العين.
- تحضير 250 مل ملزمة المخزن المؤقت (5 م جوكل، 300 مم كلوريد الصوديوم، 25 مم تريس، ودرجة الحموضة 7.4) ويغسل المخزن المؤقت (300 ملم كلوريد الصوديوم، 25 مم تريس، ايميدازول 25 مم، الرقم الهيدروجيني 7.4) وشطف المخزن المؤقت (300 ملم كلوريد الصوديوم، 25 مم تريس، ايميدازول 250 مم، الرقم الهيدروجيني 7.4). لهؤلاء، نقل المواد الصلبة في زجاجة 250 مل وملء يصل إلى 200 مل مع مزيج O. ddH2جيدا وضبط ال pH إلى 7.4 مع 1 م هيدروكسيد الصوديوم أو HCl. ثم ملء يصل إلى 250 مل مع تصفية O. ddH2جميع الحلول المخزن المؤقت باستخدام وحدة تصفية أعلى زجاجة.
- تحلل الخلية
وهنا، يستخدم سونيكاتور (مع إخراج أقصى عالية التردد (HF) ث 200)؛ لاحظ أن إعدادات الطاقة اللازمة لتعطيل الخلية قد تختلف عن غيرها من الصكوك. يتم تنفيذ كافة الخطوات في الجليد. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام تحلل الخلية الكيميائية، الخالطون سائلة أو صحافة فرنسية.- إضافة 12 مل ربط المخزن المؤقت لكل أنبوبة الطرد المركزي (من الخطوة 3، 8) وريسوسبيند فورتيكسينج.
- غمر غيض المسبار سونيكاتور في تعليق خلية. تعيين سونيكاتور في السعة 40% مع نبض 1 s على/5 s إيقاف لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: تنظيف تلميح سونيكاتور بين عينات لتجنب ترحيل. مسح المجس سونيكاتور مع الإيثانول 70%. - الطرد المركزي وقف تفكيك خلية عند 4 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة في 15,000 س ز بيليه خلية الحطام. نقل سوبيرناتانتس إلى أنبوب رد فعل جديد.
- التقارب اللوني
لايون معدني المعطل تداولها التقارب اللوني (ايماك)40، يمكن استخدام مضخة تمعجية أو نظام فبلك مع خرطوشة 1 مل (شغل هنا مع الراتنج ني-الإدارة الوطنية للسياحة). لإعداد المخازن المؤقتة، راجع الخطوة رقم 4، 1.
ملاحظة: من الممكن تنقية ايماك منذ الببتيد المؤتلف المنتجة يحمل ن شفاء صاحب معلم مسؤول، التي تتم إزالتها في الخطوة 6 من قبل زعيم peptidase نسب، الإفراج عن نيسين ناضجة. إجراء التنقية في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجات مئوية. استخدم معدل تدفق من 1 مل في الدقيقة الواحدة إذا أمكن لخرطوشة ايماك.- أولاً، أغسل الخرطوشة مع العمود 5 مجلدات (cv) ddH2س لإزالة المخزن المؤقت لتخزين.
- حجته مع 10 السيرة الذاتية لربط المخزن المؤقت.
- عملية الخلية ليستي (الخطوة 4، 2) استخدام المحاقن تصفية لإزالة الجسيمات، ثم تنطبق على الخرطوشة.
- أغسل مع 15 السيرة الذاتية من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي من أجل إزالة المواد غير محدد وغير منضم.
- الوت مع 10 السيرة الذاتية للمخزن المؤقت شطف ومل 1 جمع الكسور في أنابيب 1.5 مل. تخزين الكسور في 4 درجات مئوية لمدة قصيرة (تصل إلى 3 أيام) أو عند-20 درجة مئوية لمدة أطول.
- للتخزين، وتغسل الخرطوشة مع 10 السيرة الذاتية ddH2س تليها 5 السيرة ذاتية إيثانول 20%.
5-LC-ESI-TOF التحليل الشامل والمطيافيه من النظير نيسين
ملاحظة: انظر مواد الجدول على سبيل المثال أجهزة قياس اللوني السائل مقرونا اليكتروسبراي التأين وقت الطيران الطيف الكتلي (LC-ESI-TOF-MS).
- تنفيذ فصل [هبلك] 15-20 ميليلتر الببتيد الحل (تم إعداده في الخطوة 4، 3) على عمود C5 بمرحلة متنقلة للمياه (A) والاسيتو الانيتريل (ب) على حد سواء وتستكمل مع حمض الفورميك 0.1% وتدرج من 5-80% ب ما يزيد على 20 دقيقة. الكتلي (مللي ثانية)، استخدام شطف بعد 5 دقائق.
ملاحظة: اعتماداً على محتوى الببتيد وتقارب للعمود [هبلك]، حجم العينة وفصل تحتاج التحسين. - استخدام البرمجيات المناسبة ديكونفولوتي الأطياف الشامل قياس وحساب المسؤول ببتيد مختلفة عن الدول41. مقارنة كتلة الأنواع الببتيد الملاحظة إلى الكتلة البرية من نوع محسوب تم تعديلها من قبل هيئة الطيران المدني ← نكا الاستبدال. تأخذ في الاعتبار أن بريبيبتيدي الخطي بوستترانسلاتيونالي معدلة بواسطة ثمانية ديهيدريشنز (-8 ح2س)، وخمسة سيكليزيشنز (انظر الشكل 1).
ملاحظة: باستخدام المخازن المؤقتة التي تحتوي على الصوديوم، يمكن إظهار تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد في وضع إيجابي adducts الصوديوم. هذه تصبح مرئية كقمم إضافية مع كتلة ديكونفولوتيد أعلى (لكل الصوديوم أدوكت، كتلة ديكونفولوتيد لوحظ أعلى 22.99 دا). لإزالة هذه أدوكتس، ويمكن أن يؤديها [هبلك] تنقية42 أو الغسيل الكلوي واسعة43 .
6-مضادات الميكروبات نشاط الاختبار
- إعداد لوحات أجار GM17 تحت ظروف معقمة
- إعداد ثقافة بين عشية وضحاها من الجلوكوز سلالة NZ9000 L. lactis يحمل بلازميد بابوا نيو غينيا نسبت44 في 30 درجة مئوية في مرق M1745 مع 1% (w/v) مؤشر (= GM17) و 5 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول.
- قياس القطر الخارجي600، وتطعيم متوسطة جديدة للتطوير التنظيمي600 = 0.1 واحتضان حتى OD600 = 0.4-0.6. ثم ضع قارورة على الجليد.
ملاحظة: سوف تستهلك كل قياس600 OD حجم الثقافة. ضع في اعتبارك أن لكل لوحة أجار المقايسة، ستكون هناك حاجة ثقافة البكتيرية 1 مل. إذا لزم الأمر، مقياس يصل حجم السائل الثقافة تبعاً لذلك. - لاجار 1.5 ٪، تزن بها أجار ز 4.5 في زجاجة وسائل الإعلام زجاج. إضافة 300 مل ddH2س ومزيج اﻷوتوكﻻف.
- إعداد 2 مرق x M17 (two-times مركزة) في 300 مل ddH2س والاوتوكلاف.
- مزيج 25 مل مرق x M17 2 التي تحتوي على 10 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول والسكر 2% مع 1 مل لاكتيس ل. بريكولتوري (4% v/v).
- إضافة 25 مل المنصهر أجار 1.5% (طازجة يعقم أو ساخنة في فرن ميكروويف).
ملاحظة: قبل ذلك، السماح لتبرد زجاجة للمس (حوالي 50 درجة مئوية). وهذا ضروري نظراً لاكتيس لام كائن الوسطى حساسة لدرجات الحرارة المرتفعة. - من أجل الحل في طبق بتري كبيرة. لوحات جافة لمدة 10-15 دقيقة.
- تعقيم ينتهي من الزجاج ماصة باستور باللهب. انتظر حتى تبرد، ثم استخدم في نهاية نطاق واسع لخلق ثقوب في طدت GM17-أجار.
- إعداد نموذج
- أخذ 1 مل ثقافات التعبير كولاي (تم إنشاؤه في الخطوة 3، 7) في أنبوب توسم 1.5 مل والطرد المركزي لمدة 3 دقائق في غ. س 7,000 Aspirate المتوسطة المتبقية وريسوسبيند بيليه الخلية في 500 ميليلتر نا ف (50 مم فوسفات الصوديوم العازلة ، درجة الحموضة 7.4 من فوسفات هيدروجين الصوديوم 0.5 م 0.5 م ثنائي فوسفات هيدروجين).
- Sonicate العينات على الجليد (الخطوة مقارنة 4-2-2). غمر غيض المسبار سونيكاتور في تعليق خلية. تعيين سونيكاتور في السعة 30% مع نبض 1 s s 5 وعلى إيقاف لمدة 3 دقائق.
- الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 13,000 س ز بيليه الحطام الخلية الخلية. نقل المادة طافية إلى أنبوب رد فعل جديد على الجليد.
- تمييع وتطبيع supernatants استخراج الخلية إلى 1 مل OD600 = 0.6، بالنسبة إلى كثافة الخلية المقطوع، مع نا-ص
- اختبار النشاط
- إضافة 40 ميليلتر لكل عينة تم تسويتها في حفرة من لوحة أجار مؤشر (الشكل 3). استخدام الكلورامفينيكول في 400 ميكروغرام/مل كمضاد عنصر تحكم مركب. استخدام شطف المخزن المؤقت كعنصر سلبي. انتظر حتى هي موزع جميع العينات إلى أجار. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
- التقاط صور لوحات أجار باستخدام الكاميرا الرقمية أو الماسح الضوئي المسطح. يمكن أن تكون أحجام هالة تثبيط النمو يقاس باليد أو باستخدام إيماجيج46.
7-الأسفار الفحص المجهري
من أجل مراقبة تأثير الامبير على الخلايا البكتيرية، يمكن استخدام مجهر الضوء والأسفار. علما أن وضع نيسين العمل يعتمد على زعزعة الاستقرار وتشكيل المسام في الأغشية البكتيرية6. هنا، يتم استخدام النيل الأحمر لوصمة عار غشاء الخلية البكتيرية، التي يصبح تحلل الخلية متناثرة ومجمعة على.
ملاحظة: انظر مواد الجدول الأجهزة على سبيل المثال. ويمكن تعديل المبالغ المضافة إلى حل أمبير اعتماداً على تركيز الببتيد وبيواكتيفيتي.
- إعداد الخلية
- إعداد 10 ملم النيل الأحمر حل الأسهم في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]).
- تنمو سلالة مؤشر لاكتيس L. OD600 = 1.0 كما هو الحال في الخطوة 6.1.1-6.1.2.
- الطرد المركزي 1 مل الثقافة لمدة 3 دقيقة في 4 درجات مئوية و 5,000 x ز.
- تجاهل المادة طافية، ريسوسبيند في 1 مل مخزنة الفوسفات المالحة (PBS)47.
- أجهزة الطرد المركزي وريسوسبيند مرة أخرى.
- إضافة 1 ميليلتر النيل الأحمر حل الأسهم، وتخلط بلطف.
- الحصول على الصور المجهرية
- إضافة 30 ميليلتر من إعداد الخلية على شريحة غطاء أثناء مثيرة في 520 نانومتر.
- تعيين اكتساب الوقت 0.2 s، السلسلة الحركية 0.1 هرتز، سلسلة طولها 200 الصور.
- أضف 0.3-1.5 ميليلتر من الخلية ليساتي أو عينة ايماك (من الدرجة 6.2.4 أو 4.3.5، على التوالي). للحصول على نماذج ايماك، يمكن استخدام شطف المخزن المؤقت كعنصر سلبي.
- رصد وتسجيل الانبعاثات fluorescence في λ ≥ 560 نانومتر.
- تحليل البيانات
- تسلسل صورة مجهرية يتم تخزينها كملفات الفيلم (.avi). ويتم تحليل الصور واحدة مع إيماجيج46.
Representative Results
هذا البروتوكول يهدف إلى تمكين إنتاج متغيرات معدلة نكا نيسين مع التأسيس الخاصة بالمخلفات من النظير برولين بواسطة الأسلوب SPI. سابقا، أفيد عن المؤتلف إنتاج معدلة تماما البرية من نوع نيسين39جدوى ومردود 24 ملغم/لتر. استخدام الأسلوب SPI، غلة الببتيد/البروتين المستهدف جيدة كثيرا ويمكن أن تصل كميات قريبة من الإنتاج البرية من نوع48. كالتجارب الأولى، ينبغي اختبار البرية من نوع المؤتلف شأن الإنتاج في البلد المضيف أوكسوتروفيك الذي تم اختياره. هنا، برولين أوكسوتروفيك كولاي MG1655 ΔproBA:: frt Δبروك:: frt (DE3) استخدمت كسلالة المضيف. لدمج ncAAs وزراعة وتحريض تكوين التوقيت فضلا عن المتوسط ودرجة الحرارة يمكن أن يكون الأمثل نحو الغلة القصوى الببتيد.
تحليل نشاط مضادات الميكروبات
نيسين المؤتلف البرية من نوع الإنتاج وتنقية أجريت في أعقاب البروتوكول أعلاه. وفي هذه الحالة، استخدم برولين بدلاً من مشتقاته نكا في الخطوة 3، 6. فحص نشاط مضادات الميكروبات واستخدمت للتحقق من شأن الإنتاج ومقارنة نشاط مضادات الميكروبات قبل وبعد تنقية. لتحليل النشاط، الكسور شطف ايماك التدفق من خلال استخدامها مباشرة واختبارها ضد سلالة مؤشرات إيجابية لاكتيس لام (الشكل 2). كما تعرب هذه السلالة عن نسب، تصبح تنشيط نيسين المتغيرات الواردة في ليساتيس كولاي الخلية أو تنقية العينات الببتيد، على التوالي، بانشقاق proteolytic من الببتيد الزعيم. ومن الواضح أن التدفق عبر أظهرت نشاط النمو المثبطة. وهذا يمكن تفسيره بالمواد النشطة بيولوجيا ليست ملزمة للعمود ايماك. الكسور شطف اختبار كافة أظهرت زيادة النشاط مقارنة بالعينة أونبوريفيد، مما يشير إلى تركيز الببتيد صاحب معلم من ايماك. علما بأن المخزن المؤقت شطف (كالمراقبة السلبية) لم تؤثر عدم نمو L. lactis في هذا التحليل.
الشكل 2 . اختبار نشاط مضادات الميكروبات بعد تنقية ايماك لإنتاج ريكومبينانتلي البرية من نوع نيسين. تم اختبار شطف كسور 5 إلى 15 والتدفق من خلال تنقية ايماك بالمقارنة مع الخلية أونبوريفيد ليستي (المخفف لتطبيع600 OD) ضد سلالة مؤشر لاكتيس لام . يشير حجم هالات تثبيط النمو إلى نشاط مضادات الميكروبات. الكلورامفينيكول بتركيز 400 ميكروغرام/مل كمراقبة سلبية كعنصر إيجابي وشطف ايماك المخزن المؤقت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
لإثبات نشاط مضادات الميكروبات ريكومبينانتلي أنتجت نيسين المتغيرات التي تحتوي على ستة برولين مختلفة النظير، أنجز نشاط الإنزيم لاختبار تثبيط سلالة مؤشر لاكتيس لام . ويبين الشكل 3 تثبيط النمو لخمسة من ستة العينات المنتجة باستخدام النظير برولين. ولوحظت أفضل النتائج (كما يحكم من أحجام هالو) لإدماج تجارب التناظرية (4ص)-فلوروبروليني، (ص4)-برولين و (4S)-ميثانوبروليني. مقارنة حجم هالة تثبيط النمو إلى نيسين البرية من نوع أنتجت واختبرت في نفس الوقت، أظهرت كل ثلاثة متغيرات نيسين مماثلة تثبيط قوة. ومع ذلك، لا يمكن أن يكون حجم هالة وحدها المستخدمة لتقويم نشاط معين، حيث لم يتحدد تركيز أمبير. ولذلك، فحوصات لا تؤدي إلا إلى اختبار نوعيا عما إذا كان هو الحفاظ على نشاط مضادات الميكروبات من الخيارين نيسين الناتجة أو فقدت. لتحديد نشاط معين، يجب أن يكون تركيز المتغيرات نيسين كمياً (انظر المناقشة).
الشكل 3 . تحليل نشاط مضادات الميكروبات من ليساتيس الخلية التي تحتوي على متغيرات نيسين أنتجت عن طريق SPI مع النظير برولين. مقارنة بين المتغيرات نيسين مع المؤتلف البرية من نوع العينات. وكانت جميع عينات OD600-تطبيع بعد تحلل الخلية بالنسبة لكثافة ثقافة الخلية المقطوع. وتبين هالات بيواكتيفيتي في شكل مؤشر سلالة إعاقة النمو. الصف الأول من اليسار إلى اليمين: (4ص)-فلوروبروليني، (ص4)-برولين، (ص4)-ميثانوبروليني والكلورامفينيكول (400 ميكروغرام/مل؛ مراقبة إيجابية مضادات الميكروبات). الصف الثاني: (4S)-فلوروبروليني، (ق4)-برولين، (4S)-ميثانوبروليني وبرولين (البرية من نوع عنصر التحكم). ملاحظة التسمية الكيميائية؛ على سبيل المثال، (4ص)-فلوروبروليني ويشار أيضا إلى ترانس-4-فلوروبروليني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
LC-ESI-TOF الكتلي
بعد تنقية ايماك، إدماج ncAAs نيسين تم تحليلها بواسطة LC-ESI-TOF الكتلي. ويبين الشكل 4 الأطياف الشامل ديكونفولوتيد من نيسين متغير يحتوي على (4ص)-فلوروبروليني. وكان هذا البديل ايماك تنقيته كما هو موضح أعلاه، وبعد تحليلها بواسطة LC-ESI-TOF الكتلي، حيث أنه مازال يحمل الزعيم. الذروة الرئيسية في الشكل 4A يناظر نيسين المعدلة تتضمن (4ص)-فلوروبروليني مع كتلة ديكونفولوتيد دا 6883.18 (الكتلة المحسوبة 6882.05 دا، حسبت كتلة من الببتيد البرية من نوع المقابلة مع برولين في هو موقف 9 دا 6864.06). تتوافق مع قمم اثنين مع وفرة أدنى وأعلى كتلة الصوديوم adducts كما هو مبين. الشكل 4 ب يبين مشحونة بمختلف الأنواع الرئيسية المركبة التي توصلت إليها خوارزمية deconvolution. على سبيل المثال، يتوافق مع الذروة في 1148.11 m/z للأنواع مشحونة بمقدار ستة إضعاف ([M + 6 ح]6 +).
الشكل 4 . LC-ESI-TOF الكتلي لتنقية ايماك نيسين المؤتلف المتغيرات التي تحتوي على (4ص)-فلوروبروليني. (أ) ديكونفولوتيد تشروماتوجرام الكتلي (التصغير في اقحم) للبديل نيسين (التي لا تزال تحمل الزعيم) مع (4ص)-فلوروبروليني (المتوقع أن الجماهير (دا): [M + H]+ = 6882.05، [M + Na]+ = 6904.03، [M + 2Na]2 + = 6926.02). (ب) مركب الأطياف للأنواع [M + H]+. توقع الجماهير (دا): [M + 5 ح]5 + = 1377.41، [M + 6 ح]6 + = 1148.01، [M + 7 ح]7 + = 984.15، [M + 8 س]8 + = 861.26، [M + 9 ح]9 + = 765.67، [M + 10 ح]10 + = 689.21، [M + H 11]11 + = 626.64، [M + H 12] 12 + = 574.50. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
مجهر الأسفار
يمكن أيضا إظهار نشاط مضادات الميكروبات نيسين المؤتلف وعن المتغيرات التي تحتوي على الرابطة الوطنية لرياضة بالملاحظة المباشرة من سلالة لاكتيس L. المؤشر عبر مجهرية الأسفار. النيل الأحمر وصبغة فلورسنت عالية مسعور، استخدمت لوصمة عار غشاء الخلية البكتيرية. يبين الشكل 5 التغيير النوعي من الدولة التراكم الثقافة خلية ومورفولوجيا خلية مفردة. كانت ملطخة بالأحمر النيل الخلايا وأودعت على شريحة مجهرية غطاء. تظهر الخلايا مباشرة في البداية من الصف العلوي عند المخزن المؤقت، المؤتلف البرية من نوع نيسين، أو تتضمن نيسين (4ص)-فلوروبروليني، أو (4ص)-أضيفت برولين. لوحة أقل يظهر الصور المقابلة بعد 20 دقيقة حضانة.
الشكل 5 . مجهر الأسفار من آثار نيسين المؤتلف في الخلايا إيجابية. الصور المجهرية من 30 ميليلتر L. lactis مؤشر الضغط (OD600 = 1) تميز بالنيل الأحمر قد اتخذت قبل (اللوحة العلوية) وبعد (أسفل اللوحة) الحضانة 20 دقيقة مع المخزن المؤقت 1 ميليلتر (A)، 0.3 ميليلتر المؤتلف البرية من نوع نيسين (ب) و ميليلتر 0.6 نيسين المتغيرات التي تحتوي على (4ص)-فلوروبروليني (ج) و (4ص)-برولين (د). دوائر زرقاء علامة المناطق مع الخلايا المجمعة أو مشوهة، والأزرق الأسهم نقطة إلى المناطق حيث يمكن ملاحظة انتشار شظايا غشاء الفلورسنت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 ويبين أن المظهر العام للخلايا لم تتغير في غضون 20 دقيقة للمراقبة. عدد الخلايا التي أودعت خلال روز مرة فقط، وبالتالي، كمية أكبر من الخلايا مرئياً ضمن ميكرومتر 80 µm x 80 من منطقة المشاهدة. الشكل 5 ب يبين أن الخلايا إيجابية ظهرت مجمعة وضبابية (ملحوظ مع دوائر زرقاء) بعد 20 دقيقة تعرض إلى البرية من نوع نيسين، أضيفت المبالغ حتى عندما منخفضة (هنا، 0.3 شطف ايماك ميليلتر). وبالإضافة إلى ذلك، تنتشر المواد الخفيفة من الخلايا في المخزن المؤقت، مشيراً إلى أن أجزاء الغشاء ملحوظ مع النيل الأحمر حشدت خلال الإطار الزمني (تميزت أسهم زرقاء). تشير هذه النتائج إلى تحلل الخلية كما اتضح أن تحدث عند العلاج مع نيسين6،49. ولوحظت آثار مماثلة بعد الحضانة مع نيسين متغير يحتوي على (4ص)-فلوروبروليني (الشكل 5ج) ونيسين الذي يحتوي على (4ص)-برولين (الشكل 5د) كل عرض كبير كميات من خلايا مشوهة ومجمعة بعد 20 دقيقة، في تناقض ملحوظ إلى نموذج عنصر تحكم (الشكل 5ألف).
| المكون | تركيز |
| (NH4) 2 حتى4 | 7.5 مم |
| كلوريد الصوديوم | 8.5 مم |
| خ2ص4 | 22 ملم |
| ك2هبو4 | 50 مم |
| مجسو4 | 1 مم |
| د-الجلوكوز | 20 مم |
| جميع الأحماض الأمينية متعارف عليه (باستثناء واحد ليحل محل) |
50 مغ/لتر |
| Ca2 + | 1 ميكروغرام/مل |
| Fe2 + | 1 ميكروغرام/مل |
| عناصر التتبع (Cu2 +Zn2 +Mn2 +،، موه2 +) |
0.01 ميكروغرام/مل |
| الثيامين | 10 ميكروغرام/مل |
| بيوتين | 10 ميكروغرام/مل |
الجدول 1. تحديد تشكيلة NMM19 كيميائيا المتوسطة النمو البكتيري بعد إعداد وفقا للخطوة 2.
Discussion
باستخدام SPI لإدراج النظير برولين، هياكل نيسين المستهدفة يمكن إلى حد كبير تعديل، إنشاء متغيرات الببتيد الرواية مع تركيبات تسلسل فريدة وخصائص المواد الكيميائية. وبهذه الطريقة، الحد الأساسي لتكنولوجيا الجينات الكلاسيكية يمكن التحايل عليها، التي هي مقيدة لكيمياء سلسلة جانبية من الهيئة 20. في فيفو الكيميائية تنويع نيسين كما يتضح أعلاه يدل على نهج عام لتكمل بتمس الطبيعية وتعزيز هائلة المساحة الكيميائية من ريبس. ونحن نعتقد أن توسيع مرجع الأحماض الأمينية الطبيعية يحمل وعدا كبيرا خاصة بالنسبة للمكاتب الإقليمية للمرأة. في البروتينات، يمكن تحقيق مجموعة هائلة من الوظائف من خلال ترتيب محدد للهيئة 20 في هياكل ثلاثية الأبعاد. مع فقط 7-100 ألف بطول3، سيكون السبل الكفيلة بتحقيق هذه السمات الهيكلية إلا من خلال الهيئة محدودة بالنسبة للمكاتب الإقليمية للمرأة. وبالتالي فإنه ليس من المستغرب أن الامبير الطبيعية في شكل ريبس يشيع على نطاق واسع بوستترانسلاتيونالي معدلة4. وبنفس الطريقة، ncAAs كلبنات البناء البديلة تبشر كبيرة لتحسين المعلمات ميكروبيولوجية والحرائك الدوائية الخاصة بهم (انظر باومان et al. عام 201735 والمراجع فيها).
SPI المنهجية المستخدمة في هذا فوائد العمل من الإعداد التجريبية سهلة نسبيا، والتنفيذ مباشرة وإمكانية تكرار نتائج عالية. سبب استبدال العالمية، من الممكن أيضا إدماج نكا المواقع المتعددة في الببتيدات المستهدفة. من ناحية أخرى، قد لا تكون الطريقة كافية لاستبدال الأحماض الأمينية التي كثيرا ما تحدث في منتج الجين المستهدف. من حيث المبدأ، يمكن تغيير مواقف غير مرغوب فيها بواسطة الطفرات الموجهة من الموقع، ولكن هذه التغييرات إضافية قد تؤثر أيضا على العديد من خصائص أمبير، بما في ذلك هيكل وبيواكتيفيتي. حالما يتوفر سلالة أوكسوتروفيك للإنتاج، يمكن أن يكون اختبار ncAAs عدة دون الحاجة إلى تغييرات واسعة النطاق على الصعيد الوراثي. وعلاوة على ذلك، الطريقة لا تقتصر على أوكسوتروفيك كولاي سلالات، ولكن يمكن أيضا إجراء باستخدام المضيف الإنتاج الطبيعي. على سبيل المثال، أظهرت تشو وآخرون أن SPI لإنتاج رواية ريبس يعمل أيضا بطبيعة الحال الحزب أوكسوتروف L. lactis: استخدام تعريف وسائط الإعلام، وأدرجت ثلاثة التربتوفان النظير في أربعة مواقع في نيسين50.
نظراً للأسلوب SPI ويؤدي إلى استبدال العالمي المختار الجهاز المركزي للمحاسبات نكا، وعموما ينطبق على طائفة واسعة من الببتيدات المستهدفة والبروتينات. مجموعة من أوكسوتروفيك كولاي سلالات يتوفر (راجع الخطوة 1)، السماح للهيئة عدة كل اختبار للاستبدال بواسطة ncAAs. اجتمع النظير إدراج استخدام metA-قصور سلالات (مثلاً، B834(DE3)) هي الأكثر استخداماً. أمثلة من نظائرها Met إيسوستروكتورال أزيدوهوموالانيني (اها) وهوموبروبارجيلجليسيني (Hpg)، ncAAs المتاحة تجارياً التي يمكن أن تدمج كفاءة. كل عرض مقابض بيورثوجونال التي تسمح للحجز على جزيئات تحمل على ألكاين متوافقة أو أزيد وظيفة، على التوالي. على سبيل المثال، يمكن إرفاق الأصباغ الفلورية أو مويتيس البولي إثيلين غليكول (شماعة) من النحاس (I)-حفز أزيد ألكاين سيكلواديشن (كواك)51.
على الرغم من أن كلا أساليب إدماج نكا المؤتلف (SPI والطوائف المنبوذة) عادة تحقيق الهدف كميات كافية، وكثيراً ما تخفض الغلال بالنسبة إلى الإنتاج البرية من نوع المقابلة الببتيدات والبروتينات. كما بورتيس غالباً ما ترتبط بكفاءة الإنتاج، قد تكون خطوات تنقية إضافية المطلوبة، خاصة بالنسبة للأنواع منخفضة وفيرة. في هذه الحالة بالذات لإنتاج نيسين المؤتلف، يبسط التسلسل الزعيم صاحب معلم إلى حد كبير شأن تنقية بتخصيب انتقائية من ليساتيس الخلية. يحسن نقاء وتركيز نيسين تنقية المبينة في هذا البروتوكول، ولكن غالباً ما لا تسفر عن بورتيس أمبير كافية لتحديد العائد ونشاط معين. وإلى جانب ايماك، تشمل أساليب تنقية أمبير استخداماً [هبلك] والتبادل الأيوني اللوني (IEC) وهطول الأمطار (مثلاً. استخدام الأسيتون أو حمض التريكلوروسيتيك (TCA)) أو مزيج منها-أسفر عن نظام تنقية متعددة الخطوات52 . من الجدير أن بهم عادة طبيعة بوليكاتيونيك يمكن أن يسهل تنقية اللجنة الانتخابية المستقلة. التجميد وكثيراً ما يستخدم لتخزين الامبير المنقي.
من الناحية المثالية، ينبغي أن تكون متاحة تجارياً وبأسعار معقولة ncAAs لإدماجها في المكاتب الإقليمية للمرأة أو التي تنتجها البروتوكولات التوليف الكيميائية البسيطة واستنساخه بسهولة. شرط نفس القدر من أهمية للأسلوب SPI هو أن ncAA المعترف بها، وتنشيط ويتقاضاها aaRS الذاتية أو أعربت عن المشاركة إلى الحمض الريبي النووي النقال المشابهة. وهذا يمكن اختبارها في المختبر بالأحماض الأمينية التنشيط أو الحمض الريبي النووي النقال أمينواسيليشن المقايسة53. كبديل سهل، أجريت على حد سواء في وجود SPI اختبار تعبيرات البروتينات النموذجية مثل البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) وفي غياب نكا مكملات يمكن أن يؤديها. وعلاوة على ذلك، تشكل القابلية للذوبان في نفاذية الخلية والمتوسطة النمو، فضلا عن الاستقرار الكيميائي عوامل هامة.
في هذا المثال، تم فحص نشاط مضادات الميكروبات باستخدام سلالة مؤشرات إيجابية. كما تعرب عن بيبتيداسي زعيم نسب، هو حفز الخطوة النهائية لنضوج نيسين. إزالة تسلسل الزعيم (صاحب الموسومة لأغراض تنقية) يمكن أيضا أن يؤديها في المختبر بالمعاملة مع تنقية50 أو التربسين نسب54. خارج نطاق هذا العمل، يمكن بعد ذلك اختبار الكائنات المسببة للأمراض والسلالات المقاومة للأدوية المتعددة لتثبيط والاريثروسين أو جراثيم بالأمبير باستخدام منهجية مماثلة. وتشمل الأنواع المستهدفة ذات الصلة سريرياً هذه الجرثومة والمقاوم بكتريا السل، فري، Acinetobacter baumannii، العقدية الرئوية، و الزائفة الزّنجاريّة و الكلبسيله الرئوية. وإلى جانب نشر لوحة أجار المقايسة المقدمة هنا، النمو تثبيط يمكن إجراء باستخدام الوسائط المناسبة السائل تلقيح مع الأنواع البكتيرية وتستكمل مع أمبير أيضا. استخدام أساليب تمييع مرق، يمكن تحديد تركيز الحد الأدنى المثبطة (MIC) استخدام الببتيدات نقية55. يمكن أيضا استخدام مقايسة النشاط المعروضة هنا لتقدير بيواكتيفيتي وفاعلية الحلول التي تحتوي على أمبير بالنسبة للمركبات الإشارة، نيسين المتاحة تجارياً على سبيل المثال.
إنتاج ريبس المؤتلف في كثير من الأحيان ممكناً39، التي تشمل عادة المشارك التعبير عن الجينات PTM. حالما يتم نقل إنتاج سلالة إلى وسيط الحد أدنى كيميائيا محددة أو الاصطناعية التي تحتوي على نكا مناسبة، يجري استبدال الخاصة بالمخلفات من الجهاز المركزي للمحاسبات المقابلة. وهكذا، يمكن أن تنتج ريبس الأخرى بنفس المنهجية، شريطة أن الممكن إنتاجها المؤتلف والظروف ويمكن الاطلاع فيها إدراج نكا و PTM تسفر عن كميات كافية من المنتج المستهدف. علما أن إلى جانب البروتين الخلية المضيفة، الآلية PTM الببتيد التي يمكن أن تصبح أيضا تعديل نكا خلال SPI. ونتيجة لذلك، توقيت الهدف التعبير التعريفي، وطول فترة الحضانة التالية يمكن أن تتطلب التحسين. حيث يمكن أن تؤثر على إدماج نكا الإنزيمات PTM استقرارها والنشاط، إنتاج شأن معالجة يمكن من حيث المبدأ أن تتأثر. تتم الإشارة إلى فعالية إنزيم PTM كافية بتشكيل بريبيبتيدي المجهزة، كما الكشف عنها بواسطة فحوصات مرض التصلب العصبي المتعدد وبيواكتيفيتي. كما عرضت أعلاه، المروجين إيندوسيبلي مختلفة يمكن استخدامها من أجل إنتاج PTM الجينات أولاً (في غياب ncAA) متبوعة بتحريض الجينات الببتيد السلائف في وجود ncAA. بشكل عام، يجب قمعها إنتاج ببتيد المستهدفة التي تحتوي على الجهاز المركزي للمحاسبات قبل إضافة نكا، ولهذا السبب مطلوب القمع ضيق من الجينات السلائف. ضمن هذا البروتوكول، ويتحقق ذلك من خلال القمع تقويضي من خلال إضافة السكر إلى متوسط النمو. لا سيما وأن الإنزيمات PTM المطلوبة لتجهيز بريبيبتيدي تنشأ عادة من مضيف بعيد وراثيا، التعبير درجة الحرارة وكودون استخدام الجينات المقابلة يمكن أن تتطلب الأمثل إذا لم يتم إنتاج المؤتلف المنشأة. من حيث المبدأ، يمكن أن تتداخل وجود ncAAs في بريبيبتيدي مع الاعتراف وتجهيز الإنزيمات PTM، في حالة نيسين نيسبك ونسب. لدمج نكا في المكاتب الإقليمية للمرأة، وبالتالي يوصي بالقيام بتجارب صغيرة التعبير أولاً لتحديد شروط التعبير المناسب والموثوقية لتحليل النشاط أمبير.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
J.H.N.، يد وم الاعتراف بالتمويل عن طريق برنامج FW7 الاتحاد الأوروبي (سينبيبتيدي). واو-ج. س. وأمورنا نعترف بالتمويل من جانب الوزارة الاتحادية للتعليم والعلوم (برنامج الفدرالية "HSP 2020"، والمشروع ويميبلوس تو سينتوبيو) ومؤسسة البحوث الألمانية (الكتلة للتميز "مفاهيم أونيفيينج في الحفز").
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium chloride | Carl Roth, Germany | P029 | |
| guanidine hydrochloride | Carl Roth, Germany | 0035.2 | |
| dipotassium hydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | P749.3 | |
| potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | 3904.3 | |
| sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Carl Roth, Germany | K300.2 | |
| disodium hydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | P030.2 | |
| L-alanine | Carl Roth, Germany | 3076.2 | |
| L-arginine | Carl Roth, Germany | 3144.3 | |
| L-asparagine monohydrate | Carl Roth, Germany | HN23.1 | |
| L-aspartic acid | Carl Roth, Germany | T202.1 | |
| L-cysteine | Carl Roth, Germany | 3467.3 | |
| L-glutamine | Carl Roth, Germany | 3772.1 | |
| L-glutamic acid | Carl Roth, Germany | 3774.1 | |
| L-glycine | Carl Roth, Germany | 3187.3 | |
| L-histidine | Carl Roth, Germany | 3852.3 | |
| L-isoleucine | Carl Roth, Germany | 3922.3 | |
| L-leucine | Carl Roth, Germany | 3984.3 | |
| L-lysine monohydrate | Carl Roth, Germany | 4207.2 | |
| L-methionine | Carl Roth, Germany | 9359.4 | |
| L-phenylalanine | Carl Roth, Germany | 4491.2 | |
| L-proline | Carl Roth, Germany | T205.3 | |
| L-serine | Carl Roth, Germany | 4682.4 | |
| L-threonine | Carl Roth, Germany | T206.2 | |
| L-tryptophan | Carl Roth, Germany | 4858.2 | |
| L-tyrosine | Carl Roth, Germany | T207.2 | |
| L-valine | Carl Roth, Germany | 4879.4 | |
| ammonium sulfate | Carl Roth, Germany | 3746.3 | |
| magnesium sulfate | Carl Roth, Germany | 0261.2 | |
| D-glucose | Carl Roth, Germany | 6780 | prepare a 20% (w/v) solution for addition into molten agar |
| calcium chloride | Carl Roth, Germany | PN93.2 | |
| iron(II) chloride | Sigma-Aldrich, Germany | 372870 | |
| thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Germany | T1270 | |
| biotin | Carl Roth, Germany | 3822.2 | |
| copper(II) sulfate | Merck, Germany | 102792 | |
| manganese(II) chloride | Carl Roth, Germany | KK36.2 | |
| zinc chloride | Merck, Germany | 108816 | |
| immonium orthomolybdate | Sigma-Aldrich, Germany | 277908 | |
| glycerol | Carl Roth, Germany | 7533.3 | |
| isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich, Germany | I6758 | |
| ampicillin sodium salt | Carl Roth, Germany | K029.5 | working concentration 100 µg/mL for E. coli, prepare 100 mg/mL stock in ddH2O |
| kanamycin sulfate | Carl Roth, Germany | T832.2 | working concentration 50 µg/mL for E. coli, prepare 50 mg/mL stock in ddH2O |
| chloramphenicol | Carl Roth, Germany | 3886.1 | working concentration 5 µg/mL for L. lactis, prepare 37 mg/mL stock in ethanol |
| (4S)-fluoroproline | Bachem, Switzerland | F-3970 | |
| (4R)-fluoroproline | Bachem, Switzerland | F-3975 | |
| (4S)-hydroxyproline | Bachem, Switzerland | F-1395 | |
| (4R)-hydroxyproline | Bachem, Switzerland | F-2980 | |
| (4S)-methanoproline | chemically synthesized | ||
| (4R)-methanoproline | chemically synthesized | ||
| hydrochloric acid (HCl) | Carl Roth, Germany | P074.4 | |
| ethanol | VWR, Germany | 20825.324 | |
| M17-broth | Sigmal-Aldrich, Germany | 56156 | commercial product, see Terzaghi BE & Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13 for contents and preparation |
| agar-agar | Carl Roth, Germany | 5210.5 | |
| Nisin from Lactococcus lactis | Sigma-Aldrich, Germany | N5764 | commercial product, can be used as reference for bioactivity |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Carl Roth, Germany | A994.1 | |
| imidazole | Carl Roth, Germany | 3899.3 | |
| 1.5 mL autosampler vial for LC-MS | Sigma-Aldrich, Germany | Supelco 854165 | |
| acetonitrile | VWR, Germany | HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 | LC-MS grade required |
| formic acid | VWR, Germany | HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 | LC-MS grade required |
| 1 mL Ni-NTA IMAC column, e.g. HisTrap FF Crude | GE Healthcare, UK | 29-0486-31 | different manufacturers and resins available for IMAC |
| 0.45 µm bottle top filter unit | VWR, Germany | 10040-470 | sterile filtration of solutions using a vacuum pump |
| 0.45 µm syringe filter PVDF membrane | Carl Roth, Germany | CCY1.1 | sterile filtration of solutions using a syringe and to remove particles from cell lysates |
| luer-lock syringe, PP, 50 ml | Carl Roth, Germany | T552.2 | sterile filtration of solutions |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf, Germany | 30120086 | |
| petri dishes (polystyrene, sterile) | Carl Roth, Germany | TA19 | |
| Nile red | Sigma-Aldrich, Germany | 72485 | |
| E. coli ΔproA strain | CGSC, Keio collection | JW0233-2 | proline-auxotrophic E. coli K-12 strain |
| E. coli B834(DE3) | Novagen (Merck), Germany | 69041 | methionine-auxotrophic E. coli B strain |
| λDE3 Lysogenization Kit | Novagen (Merck), Germany | 69734-3 | |
| Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT | bacterial indicator strain, see Khusainov R & Kuipers OP, PLoS One, 8 (9), e74890 | ||
| benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf, Germany | 5427 R | |
| peristaltic pump | GE Healthcare, UK | P1 | |
| FPLC system | GE Healthcare, UK | Äkta Purifier 10 or the like | |
| inverted microscope | Nikon | TI Eclipse wide-field fluorescence microscope with 100x (N.A. 1.4) objective and Mercury Lamp | example setup for fluorescence microscopy |
| electron multiplying CCD (EMCCD) camera | Andor Technologies, UK | Andor Luca | example setup for fluorescence microscopy |
| fluorescence excitation filter | Thorlabs, USA | Dichroic cube (TLV-U-MF2-TRITC) | example setup for fluorescence microscopy |
| fluorescence emission filter | AHF Analysentechnik, Germany | T 560 LPXR | example setup for fluorescence microscopy |
| cover slip 24 x 60 mm | Carl Roth, Germany | LH26.1 | example setup for fluorescence microscopy |
| Immersion Oil | Carl Zeiss, Germany | Immersol 518 F | example setup for fluorescence microscopy |
| probe sonicator | Bandelin, Germany | Sonopuls HD3200 with sonotrode MS-72 | 200 W maximum HF output |
| C5 HPLC column (2.1x100 mm, 3 µm particle size) | Sigma-Aldrich, Germany | 567227-U | example setup for mass spectrometry |
| ESI-TOF coupled to HPLC system | Agilent, USA | Agilent 6530 Accurate Mass QTOF with 1260 HPLC | example setup for mass spectrometry |
References
- Ferri, M., Ranucci, E., Romagnoli, P., Giaccone, V. Antimicrobial resistance: A global emerging threat to public health systems. Crit Rev Food Sci Nutr. 57 (13), 2857-2876 (2017).
- Bahar, A. A., Ren, D. Antimicrobial peptides. Pharmaceuticals. 6 (12), 1543-1575 (2013).
- Ageitos, J. M., Sánchez-Pérez, A., Calo-Mata, P., Villa, T. G. Antimicrobial peptides (AMPs): Ancient compounds that represent novel weapons in the fight against bacteria. Biochem Pharmacol. 133, 117-138 (2017).
- Arnison, P. G., et al. Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide natural products: overview and recommendations for a universal nomenclature. Nat Prod Rep. 30 (1), 108-160 (2013).
- Lubelski, J., Rink, R., Khusainov, R., Moll, G. N., Kuipers, O. P. Biosynthesis, immunity, regulation, mode of action and engineering of the model lantibiotic nisin. Cell Mol Life Sci. 65 (3), 455-476 (2008).
- Shin, J. M., Gwak, J. W., Kamarajan, P., Fenno, J. C., Rickard, A. H., Kapila, Y. L. Biomedical applications of nisin. J Appl Microbiol. 120 (6), 1449-1465 (2016).
- Scherer, K. M., Spille, J. -H., Sahl, H. -G., Grein, F., Kubitscheck, U. The lantibiotic nisin induces lipid II aggregation, causing membrane instability and vesicle budding. Biophys J. 108 (5), 1114-1124 (2015).
- Jung, G. Lantibiotica - ribosomal synthetisierte Polypeptidwirkstoffe mit Sulfidbrücken und α,β-Didehydroaminosäuren. Angew Chemie. 103 (9), 1067-1084 (1991).
- Rink, R., et al. Lantibiotic structures as guidelines for the design of peptides that can be modified by lantibiotic enzymes. Biochemistry. 44 (24), 8873-8882 (2005).
- Lagedroste, M., Smits, S. H. J., Schmitt, L. Substrate Specificity of the Secreted Nisin Leader Peptidase NisP. Biochemistry. 56 (30), 4005-4014 (2017).
- Ross, A. C., Liu, H., Pattabiraman, V. R., Vederas, J. C. Synthesis of the lantibiotic lactocin S using peptide cyclizations on solid phase. J Am Chem Soc. 132 (2), 462-463 (2010).
- Fukase, K., et al. Synthetic Study on Peptide Antibiotic Nisin. V. Total Synthesis of Nisin. Bull Chem Soc Jpn. 65 (8), 2227-2240 (1992).
- Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology. Chem Sci. 6 (1), 50-69 (2015).
- Kuthning, A., Durkin, P., Oehm, S., Hoesl, M. G., Budisa, N., Süssmuth, R. D. Towards Biocontained Cell Factories: An Evolutionarily Adapted Escherichia coli Strain Produces a New-to-nature Bioactive Lantibiotic Containing Thienopyrrole-Alanine. Sci Rep. 6, 33447 (2016).
- Piscotta, F. J., Tharp, J. M., Liu, W. R., Link, A. J. Expanding the chemical diversity of lasso peptide MccJ25 with genetically encoded noncanonical amino acids. Chem Commun (Camb). 51 (2), 409-412 (2015).
- Hartman, M. C. T., Josephson, K., Lin, C. -W., Szostak, J. W. An expanded set of amino acid analogs for the ribosomal translation of unnatural peptides. PLoS One. 2 (10), 972 (2007).
- Johnson, J. A., Lu, Y. Y., Van Deventer, J. A., Tirrell, D. A. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids into proteins: recent developments and applications. Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 774-780 (2010).
- Ibba, M., Söll, D. Aminoacyl-tRNAs: setting the limits of the genetic code. Genes Dev. 18 (7), 731-738 (2004).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
- Budisa, N., Steipe, B., Demange, P., Eckerskorn, C., Kellermann, J., Huber, R. High-level biosynthetic substitution of methionine in proteins by its analogs 2-aminohexanoic acid, selenomethionine, telluromethionine and ethionine in Escherichia coli. Eur J Biochem. 230 (2), 788-796 (1995).
- Rink, R., et al. Dissection and modulation of the four distinct activities of nisin by mutagenesis of rings A and B and by C-terminal truncation. Appl Environ Microbiol. 73 (18), 5809-5816 (2007).
- Kubyshkin, V., Durkin, P., Budisa, N. Energetic contribution to both acidity and conformational stability in peptide models. New J Chem. 40 (6), 5209-5220 (2016).
- Molloy, E. M., Field, D., O'Connor, P. M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Saturation mutagenesis of lysine 12 leads to the identification of derivatives of nisin A with enhanced antimicrobial activity. PLoS One. 8 (3), 58530 (2013).
- Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
- Anderson, J. C., Wu, N., Santoro, S. W., Lakshman, V., King, D. S., Schultz, P. G. An expanded genetic code with a functional quadruplet codon. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (20), 7566-7571 (2004).
- Zambaldo, C., Luo, X., Mehta, A. P., Schultz, P. G. Recombinant macrocyclic lanthipeptides incorporating non-canonical amino acids. J Am Chem Soc. 139 (34), 11646-11649 (2017).
- Al Toma, R. S., et al. Site-directed and global incorporation of orthogonal and isostructural noncanonical amino acids into the ribosomal lasso peptide capistruin. Chembiochem. 16 (3), 503-509 (2015).
- Chatterjee, A., Xiao, H., Schultz, P. G. Evolution of multiple, mutually orthogonal prolyl-tRNA synthetase/tRNA pairs for unnatural amino acid mutagenesis in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (37), 14841-14846 (2012).
- Budisa, N., Pal, P. P. Designing novel spectral classes of proteins with a tryptophan-expanded genetic code. Biol Chem. 385 (10), 893-904 (2004).
- Voller, J. -s, Thi To, T. M., Biava, H., Koksch, B., Budisa, N. Global substitution of hemeproteins with noncanonical amino acids in Escherichia coli with intact cofactor maturation machinery. Enzyme Microb Technol. 106, 55-59 (2017).
- Moghal, A., Hwang, L., Faull, K., Ibba, M. Multiple Quality Control Pathways Limit Non-protein Amino Acid Use by Yeast Cytoplasmic Phenylalanyl-tRNA Synthetase. J Biol Chem. 291 (30), 15796-15805 (2016).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Engelke, G., Gutowski-Eckel, Z., Hammelmann, M., Entian, K. D. Biosynthesis of the lantibiotic nisin: genomic organization and membrane localization of the NisB protein. Appl Environ Microbiol. 58 (11), 3730-3743 (1992).
- Baumann, T., Nickling, J. H., Bartholomae, M., Buivydas, A., Kuipers, O. P., Budisa, N. Prospects of In vivo Incorporation of Non-canonical Amino Acids for the Chemical Diversification of Antimicrobial Peptides. Front Microbiol. 8, 124 (2017).
- Plat, A., Kluskens, L. D., Kuipers, A., Rink, R., Moll, G. N. Requirements of the engineered leader peptide of nisin for inducing modification, export, and cleavage. Appl Environ Microbiol. 77 (2), 604-611 (2011).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. J Vis Exp. , (2017).
- Shi, Y., Yang, X., Garg, N., van der Donk, W. A. Production of lantipeptides in Escherichia coli. J Am Chem Soc. 133 (8), 2338-2341 (2011).
- Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. Nat Biotechnol. 6 (11), 1321-1325 (1988).
- Zhang, Z., Marshall, A. G. A universal algorithm for fast and automated charge state deconvolution of electrospray mass-to-charge ratio spectra. J Am Soc Mass Spectrom. 9 (3), 225-233 (1998).
- JoVE Science Education Database. High-Performance Liquid Chromatography (HPLC). J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Dialysis: Diffusion Based Separation. J Vis Exp. , (2017).
- Khusainov, R., Kuipers, O. P. The presence of modifiable residues in the core peptide part of precursor nisin is not crucial for precursor nisin interactions with NisB- and NisC. PLoS One. 8 (9), 74890 (2013).
- Terzaghi, B. E., Sandine, W. E. Improved medium for lactic streptococci and their bacteriophages. Appl Microbiol. 29 (6), 807-813 (1975).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82 (7-8), 518-529 (2015).
- Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
- van Hest, J. C. M., Tirrell, D. A. Efficient introduction of alkene functionality into proteins in vivo. Febs Lett. 428 (1-2), 68-70 (1998).
- Prince, A., et al. Lipid-II Independent Antimicrobial Mechanism of Nisin Depends On Its Crowding And Degree Of Oligomerization. Sci Rep. 6 (1), 37908 (2016).
- Zhou, L., et al. Incorporation of tryptophan analogues into the lantibiotic nisin. Amino Acids. 48 (5), 1309-1318 (2016).
- Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Curr Protoc Chem Biol. 3 (4), 153-162 (2011).
- Abts, A., et al. Easy and rapid purification of highly active nisin. Int J Pept. 2011, 175145 (2011).
- Francklyn, C. S., First, E. A., Perona, J. J., Hou, Y. -M. Methods for kinetic and thermodynamic analysis of aminoacyl-tRNA synthetases. Methods. 44 (2), 100-118 (2008).
- van Heel, A. J., et al. Production and Modification of Five Novel Lantibiotics Using the Promiscuous Nisin Modification Machinery. ACS Synth Biol. 5 (10), 1146-1154 (2016).
- Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).
