Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

פפטידים מיקרוביאלית המיוצר על ידי ההתאגדות הלחץ הסלקטיבי של חומצות אמינו קאנונית

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57551
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 3, 2, 1
1Department of Biocatalysis, Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin, 2Department of Bioenergetics, Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin, 3Molecular Genetics Group, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, Department of Molecular Genetics, University of Groningen
* These authors contributed equally

Summary

הפרוטוקול מציג את Escherichia coli-המבוסס על הלחץ הסלקטיבי השתלבות של חומצות אמינו קאנונית (ncAAs) nisin פפטיד מיקרוביאלית lactococcal. ניתן לשנות את מאפייניו במהלך רקומביננטי ביטוי באמצעות החלפת עם ncAAs הרצוי בתקשורת צמיחה מוגדרים. השינויים הנובעים מכך באתריים ממופים על ידי הצמיחה עיכוב מבחני פלורסצנטיות מיקרוסקופ.

Abstract

לטבע יש מגוון של אפשרויות ליצירת חלבון פונקציות חדשות על-ידי שינוי הרצף של אבני הבניין חומצת אמינו בודדות. עם זאת, כל הווריאציות מבוססים על 20 הקנוני חומצות אמינו (cAAs). דרך להציג מאפיינים נוספים physicochemical לתוך polypeptides, שילוב של חומצות אמינו קאנונית (ncAAs) משמשת יותר ויותר בהנדסת חלבונים. בשל אורכם הקצר יחסית, השינוי של פפטידים מסונתז ribosomally, post-translationally ששונה על-ידי ncAAs הוא אטרקטיבי במיוחד. פונקציונליות חדשה וידיות כימי יכול להיווצר על ידי שינויים ספציפיים של שאריות בודדים. השיטה ההתאגדות (SPI) הלחץ הסלקטיבי מנצל שמקודדים המארח auxotrophic הם משוללי חומצת אמינו חיונית בתקשורת צמיחה מוגדרים כימי. מספר תחליפי חומצת אמינו דומים מבחינה מבנית רחמנא ליצלן אז יכול להיות מופעל על ידי המעביר-aminoacyl-tRNA המתאים ומספקים ספציפיים שאריות cAA(s) ← ncAA(s) ההחלפות ברצף פפטיד או חלבון המטרה. למרות זאת, בהקשר של השיטה SPI, ncAAs גם משולבים פרוטאום מארח בשלב של ביטוי גנים רקומביננטי, רוב המשאבים של התא מוקצות הביטוי של הגן היעד. פעולה זו מאפשרת שאריות ספציפי יעיל, תיאגוד ncAAs מלווה לעיתים קרובות עם כמויות גבוהות של יעד שונה. העבודה הציג מתאר את ויוו השתלבות של שישה פרולין תחליפי פפטיד מיקרוביאלית nisin, lantibiotic המיוצר באופן טבעי על ידי lactis הכרוכים. מאפיינים מיקרוביאלית של nisin ניתן לשנות, הרחיב במהלך התסיסה שלו, ביטוי auxotrophic Escherichia coli זנים בתקשורת צמיחה מוגדרים. ובכך, ההשפעות של החלפת ספציפיים שאריות של cAAs עם ncAAs יכול לספק שינויים ב פעילות מיקרוביאלית וספציפיות. מבחני פעילות מיקרוביאלית, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות משמשים כדי לבדוק את גרסאות nisin חדשות עבור עיכוב גדילה של זן מחוון גראם חיוביים lactis הכרוכים . לספקטרומטרית משמש כדי לאשר התאגדות המכללות nisin ביואקטיביות משתנים.

Introduction

הגילוי של אנטיביוטיקה במאה העשרים, פיתוח מקביל של תרכובות חדשות מיקרוביאלית כנגד מיקרואורגניזמים פתוגניים מופעלת לפלח טיפולים של זיהומים חיידקיים. עם זאת, בשל הופעתה של פתוגנים multidrug עמידים כגון סטפילוקוקוס עמיד methicillin- Staphylococcusaureus (MRSA), enterococci vancomycin עמידים (VRE), הקלד MDR (multidrug עמידים) סלמונלה typhimurium phage 10 (DT10 ), קלבסיאלה pneumoniae, זה הכרחי ליצור antimicrobial סוכנים חדשים1. פפטידים מיקרוביאלית (אמפר) הם תרכובות רב צדדי, ספציפי לעיתים קרובות מאוד מבטיח מועמדים הפיתוח של תרופות חדשות בזכות תכונותיהם physicochemical, גמישות, גודל, hydrophobicity, ואת מצב של פעולה2. מגברים הם פפטידים קטן המורכב בדרך כלל 7-100 חומצות אמינו. לעתים קרובות, יש להם מבנה cationic עשיר הטעון חיובית שאריות ארגינין, ליזין, אשר אינטראקציה עם קרום התא יישוב חיידקים, אשר מחויב הפוך3. קבוצת משנה מסוימת של המגברים הינם פפטידים ribosomally מסונתז, ששונה posttranslationally (RiPPs)4. אלה מיוצרים על ידי אורגניזמים רבים מן הממלכה של פטריות, התחום של חיידקים. אחד RiPPs הידוע והשימוש בהם נפוץ הוא nisin, המיוצר באופן טבעי על ידי החיידק חומצה לקטית הכרוכים lactis (lactis ל'). פעיל נגד פאנל של חיידקים גראם חיוביים, nisin שימש בתור biopreservative בתעשיית המזון יותר מ-50 שנה בשל תכונותיו מיקרוביאלית ואת העדר התנגדות מפותחת בכל יישוב זני חיידקים5. מחקרים הראו nisin הזה שיערער ומייצר נקבוביות בחיידקיים קרום התא, שמוביל פעילות מיקרוביאלית נגד שני פתוגנים גראם גראם שליליים ו-6. באמצעות קשירה השומנים II, סינתזה הקיר תא החיידק הוא מאופק7. Nisin מקודד על ידי nisA כמו פפטיד קודמן ליניארי, אשר מורכב של מנהיג, אזור פפטיד הליבה (איור 1). לאחר סינתזה ribosomal, prenisin קודם שינה את dehydratase NisB. כאן, סרין, תראונין משקעים באזור הליבה prepeptide הם יבשים dehydroalanine (Dha), dehydrobutyrine (Dhb)8. לאחר מכן, משקעי מיובשת נמצאים ביחד עם ציסטאין טופס lanthionine טבעות (ומכאן השם "lantibiotic" lanthionine המכילים טבעת אנטיביוטיקה) על ידי תוספת מייקל מזורז-אנזים. את השינוי posttranslational (PTM) הוא מזורז על ידי cyclase NisC. ב- lactis ל', prenisin ששונה מועבר מכן מחוץ לתאים על-ידי טרנספורטר NisT ולאחר פפטיד המנהיג הוא ביקע מאת proteinase NisP לשחרר את הטופס הפעיל ובוגרת nisin9. מנהיג אחראי peptidase NisP יש ירידה לפרטים המצע גבוה, מאז זה רק תהליכי שינוי nisin ביעילות10.

באופן כללי, פעיל RiPPs תוצאה של הפעולה של אנזימים PTM (למשל NisBC), אשר באופן דרסטי להגדיל את שטח הכימית של פפטידים קצרים, למשל, דרך acetylation, גליקוזילציה, מתילציה או זירחון. רמה זו של מורכבות נוספת ניתן להרחיב באמצעות שילוב ישיר של ncAAs. אמנם לעתים קרובות ריאלי, סינתזה של מגברים הוא אתגר עבור ייצור בקנה מידה גדול עקב המורכבות מבניים שלהם. לדוגמה, סינתזה כימית סך של lactosin lantibiotic S בשלבים תגובה 71 הושגה עם תשואה הסופי של 10% וזו של nisin עם תשואה גולמי בלבד 0.003%11,12. לכן, ייצור ביולוגי מציע אלטרנטיבה מעשית, בגלל הדור stereocenters נכונה וריכוז מוצר גבוהה.

עד היום, יותר מ 150 ncAAs, למשל, שיש קבוצות פונקציונליות המכילים פלואור או azides, שולב חומרים ולאחר מספר דוגמאות של מגברים המכללות-השתנה כבר דווח על13,14, 15,16. עם כניסתה של ncAAs, מאפיינים physicochemical הרומן ניתן להפיק בהשוואה מוטגנזה מכוונת קונבנציונלי. המגוון של פפטידים הקיים יכול להיות מוגברת, שיכול להוביל אנטיביוטיקה הרומן.

שיטה אחת עבור שילוב של ncAAs לתוך פפטידים רקומביננטי היא התאגדות הלחץ הסלקטיבי (SPI) מבוסס על השימוש של זני חיידקים auxotrophic17. זנים אלו אינם מסוגלים לסנתז אנלוגי לפנות לסוכנות המקביל של ncAA. המתודולוגיה משתמש יחודיות הנצפה לעתים קרובות המצע רגועה, תכונה של aminoacyl הטבעי-tRNA רבים synthetases (aaRSs)18. מלבד מצעים לפנות לסוכנות הטבעי שלהם, אנזימים אלה לעיתים קרובות מסוגל לזהות ולהפעיל את המכללות הרצוי, כדי לטעון את זה על tRNA(s) cognate שלהם. זה מוביל ribosomal תיאגוד ncAA לתוך המוצר ג'ין היעד באופן ספציפי שאריות (קרי, לפנות לסוכנות ← ncAA החלפה). זה כמובן אפשרי רק כאשר ncAA הרצויה היא מבנית רחמנא ליצלן דומה לחומצה אמינית הקנוני, נסבל על ידי הפיזיולוגיה של התא, את מכונות תרגום ואת הרצף פפטיד או חלבון המטרה. ב מבנה ניסיוני מסוים, התאים מארח auxotrophic מתורבתים במדיום מוגדר מסופק עם ריכוז חומצת אמינו מקורית ביותר שיוחלפו המגביל. צמיחה סלולרי או exchange על-ידי מדיום נטול לפנות לסוכנות מובילה אל תאיים דלדול של המנהל האזרחי. בשלב הבא, ncAA נוסף, בביטוי הגן היעד הוא המושרה. באופן בלתי נמנע, ncAAs עכשיו גם משולבים בחלבונים רבים אחרים בתא המארח במהלך שלב זה היעד גנים. למרות זאת, הרעילות של ההתקנה SPI נשמרת ברמה נמוכה מאז המתח Escherichia coli (e. coli) משתנה עם פלסמיד נושא את הגן המטרה תחת שליטה של מקדם מכירות חזק (נפוץ מקדם T7 תחרותי / מערכת ה-RNA פולימראז)19. מיד לאחר אינדוקציה (בדרך כלל כאשר המנהל האזרחי הוא מותש), המארח תאים חדל לצמוח, machineries אנזימטי cytoplasmic שלהם משמשים בעיקר עבור ביטוי הגן מבוססת על פלסמיד היעד. מוטגנזה ניתן להגדיר את האתר של שאריות ספציפיים ncAA התקנת ג'ין היעד20.

כמו פפטיד מודל עבור שילוב של ncAAs, nisin כח pentacyclic A נבחר. 34 חומצות אמינו ארוך ויש רק משקע פרולין בודדת ברצף פפטיד הליבה (איור 1). כמו סבטיליזין ericin A, S, כמו גם epidermin nisin Z, nisin Q, פרולין שנשמרת נראה חיוני עבור פעילות9,21. פרולין לפנות לסוכנות ממלאת תפקיד חשוב במיוחד peptidyl-prolyl אמיד סיבוב וייצוב מבנה שניוני. שרשרת הצד שלו מצלצל הייצורים החיים (exo / אנדו קימוט) אחראים על ייצוב תרמודינמי ההדבקה אמיד. שינויים כימיים יישוב (כגון hydroxylations, fluorinations, methylations) של prolyl קימוט להשפיע לעיתים קרובות באופן ביקורתי את יציבות מתקפלים, קשיחות לגרדום והפונקציות של מבנים ביולוגיים רבים22. לכן סביר לצפות כי החלפות אנלוגי פרולין Pro→ להעניק טבעת B, הטבעת השנייה של nisin, עם הרומן ומאפיינים יוצא דופן.

כאן, של פרולין-auxotrophic e. coli זן שימש לייצור nisin רקומביננטי. פעולה זו דורשת את הביטוי של ג'ין prepeptide nisA , כמו גם את השינוי גנים של האנזים nisBC. המוצר פפטיד מקודדים גנטית נושא N-סופני שלו מתויג מנהיג עבור טיהור באמצעות כרומטוגרפיית זיקה. עבור פעילות נחישות, ל' lactis להביע והוא מפריש NisPT משמשת להפעלת על גרסאות רקומביננטי nisin lysates תא החיידק או דגימות פפטיד מטוהרים (איור 1). מגבר בוגר הוא שוחרר לאחר המחשוף של המנהיג על ידי NisP. בשיטה זו דיפוזיה אגר, המדגם המגבר מפזרת לתוך מדיום הגידול מוצק, יכול לעכב את הצמיחה של בקטריה גראם חיוביים. לאחר דגירה, זה יכול להיות שנצפו ויזואלית על ידי הצמיחה עיכוב הילות. בנוסף ל' lactis כמחוון, שינוי גרסאות nisin הראו פעילות מיקרוביאלית נגד Enterococcus faecalis, Bacillus קובו, Staphylococcus aureus, לקטובצילוס johnsonii 21,23.

שיטה אלטרנטיבית ושונה השפעול לשלב ncAAs ב RiPPs הוא stop codon דיכוי (SCS)24. בשביל זה, tRNA אורתוגונלית / aminoacyl-סינתזת המעביר (aaRS) זוג נדרש עבור ncAA המתאימים. באופן אידיאלי, כל שלושת הרכיבים האלה הם bioorthogonal, קרי, הם לא לקיים אינטראקציה עם tRNAs ו aaRSs אנדוגני. AaRS ncAA ספציפי יכול להיווצר על ידי שינוי של האתר הפעיל של אנזים והקרנת ספריות גנטי של מוטציה synthetases25. יתר על כן, המבוא של ncAA מחייב של codon אשר מוקצית, אשר לא קידוד עבור המנהל האזרחי. בדרך כלל, אמבר stop codon נמצא בשימוש24,26.

לאחרונה, SPI הוקמה עבור שילוב של α-chloroacetamide-המכילים ', לחץ על-כימיה-תואם ncAAs לתוך NisA27. לדוגמה, Nε- היתרים-ליזין סופחה את captistruin פפטיד לאסו בייעודי לאתר (SCS), שאריות ספציפיים (SPI) התאגדות שיטות, לאחר מכן שונה חוץ גופית בתוך מאת שיכול עיצורים מזורז רותניום28 . בהשוואה ל- SPI השיטה SCS מורכבת יותר מאז tRNA אורתוגונלית / זוג aaRS חייב להיות ביטוי במשותף. עד כה, o-זוגות על התאגדות פרולין היה מפותח29, אך לפי מיטב ידיעתנו, דווח אף דוגמא התאגדות אנלוגי פרולין.

יצוין, כי לא כל ncAAs ניתן לשלב באמצעות המתודולוגיה SPI. קודם כל, ספיגת ncAAs לתוך הציטופלסמה מוסדר על ידי מספר רב של חלבונים תחבורה מוטבעות ממברנה cytoplasmic, המהווה הקרום הפנימי עבור חיידקים גראם שליליים כמו e. coli. בדרך כלל, e. coli הוא המסוגל להעביר מגוון רחב של תחליפי חומצת אמינו לתוך התא עם שרשראות צד מבנית דומה מבחינה כימית הקנוני חומצות אמינו. שנית, רבים ncAAs תגובתי מבחינה כימית או לא יציב יכול לשמש מעכב לקראת צמיחה סלולרי, כפי שהם רעילים כי חילוף החומרים, פיזיולוגיה של המחשב המארח תא30. לפיכך, ספיגת ורעילות של ncAA עבור המארח הייצור צריך להיבדק מראש. כדי להימנע איון של מכונות PTM כתופעת לוואי, מלכודת מבוקר בקפדנות ביטוי של גנים אחראים יכול לשמש כדי לשלב את חומצת אמינו טבעי אנזימים השינוי (למשל, nisBC) ו- ncAA לתוך הגן היעד ( למשל, nisA). זה יכול להתבצע באמצעות שני היזמים שונים, אינדוקציה של ביטוי גנים היעד, כפי שמתואר ב SPI שתוכנן במיוחד פרוטוקולים31. כמתואר לעיל, שיטת SPI מסתמך על יחודיות המצע רגועה של aaRS, אשר מאפשר הפעלת המכללות tRNA cognate טעינה. לאחר מכן, סינתזת יועברו אל הריבוזום ואחריו אמיד בונד היווצרות וקיפול של פפטיד היעד (פולי). בתהליכי הזה, הגהה ועריכה מנגנונים עלולים להיות רלוונטי32. מסיבות אלו, יש חשיבות גדולה יש מטרה המכללות דומה מבחינה מבנית רחמנא ליצלן המנהל האזרחי. נקודות חיוניים אחרים הן יציבות מספקת (שניהם בתקשורת צמיחה, חשוף חילוף החומרים הסלולר), המסיסות של ncAA. בנוסף, זה צריך להיות או זמינים מסחרית או קל להיות מסונתז כימית.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור SPI, ומאפשר תיאגוד ספציפיים שאריות ncAAs לתוך RiPPs רקומביננטי. במיוחד, פרולין שונים תחליפי משולבים של פפטיד מיקרוביאלית nisin A באמצעות e. coli כמו האורגניזם המארח. ספקטרומטר מסה משמש לאימות החלפת חומצת אמינו, מוצרים פפטיד מנותחים על אתריים באמצעות מבחני עיכוב גדילה ומיקרוסקופיה פלורסצנטיות באמצעות זני חיידקים אינדיקטור.

הדרישה הבסיסית nisin רקומביננטי מוצלחת הביטוי מוגדר ncAAs דורשת פרולין מתאימים auxotrophic e. coli זן. על זה auxotrophy, proA חייב להיות לקוי, למשל מושגת על ידי הסתרה גנומית. התאים לגמרי משולל ביוסינטזה Pro תאיים (קרי, מחיקה של proABC) ללא אפשרות השחזור הם auxotrophs יציב. שיטות נוקאאוט גנטי נפוץ הן phage התמרה חושית או נוקאאוט יחיד-גנטי לפי דצנקו & Wanner33. יתר על כן, ניתן להשיג proA נוקאאוט זנים מאגרים ציבוריים כגון Addgene, CGSC או האוסף קאיו. מאז הביטוי רקומביננטי nisABC המוצגת כאן מסתמך על השימוש T7 היזמים, המתח מארח ביטוי יש לשאת את הגן inducible T7 RNA פולימראז. זה יכול להתבצע על ידי החדרת prophage λDE3 לתוך הגנום המארח, לדוגמה באמצעות ערכת מסחרי. לחלופין, זנים כמו BL21(DE3) יכול להתבצע auxotrophic כמתואר לעיל.

Protocol

1. שיבוט של הביטוי וקטורים וטרנספורמציה של זן הפקה auxotrophic

במסמך זה, הגנים של הביוסינתזה nisin, כלומר nisABC, יש כבר שנלקחו ל' lactis והועבר לתוך פלסמיד מבוסס-T7 ביטוי וקטורים. רצפי DNA המלאה של nisABC ניתן למצוא ב GenBank כניסה X6830734. הגן פפטיד קודמן (nisA) הושם על וקטור pET-3a זה מקנה עמידות אמפיצילין. גנים עבור dehydratase (nisB) ו cyclase (nisC) מוקמו על וקטור pRSFDuet-1, כפי שדווח מוקדם יותר35, אשר מקנה עמידות kanamycin.

הערה: עבור nisA, codons חומצות אמינו (ASPR) ארבע של הרצף מנהיג היו מוטציה לקידוד VSLR36 לרנדר את שאריות פרולין בפפטיד הליבה ייחודי, כדי להבטיח prepeptide נאות עיבוד על ידי NisP. -קצה אמיני, תג hexa-היסטידין ולצדו מקשר שאריות נוספה למטרות טיהור (ראה איור 1).

Figure 1
איור 1 . ייצוג סכמטי של הביוסינתזה ו PTM NisA ב e. coli כמו גם מנהיג המחשוף מאת המתח מחוון lactis ל' ב וזמינותו פעילות עוקבות. בשלב הראשון, prenisin ליניארי לא פעילים (מורכב של מנהיג של אזור הליבה פפטיד המכיל של פרולין ייחודי (ורוד) במיקום 9) מקודד על ידי nisA הוא מסונתז ribosomally. בשלב הבא, prenisin posttranslationally השתנה על-ידי התייבשות של שאריות סרין טראונין ו- dehydroalanine (Dha), dehydrobutyrine (Dhb) כמו על ידי NisB. Cyclase NisC יוצרת את thioether גשרים באמצעות מייקל תוספת של ציסטאין sulfhydryl קבוצות עם Dha או Dhb. Prenisin ששונה לא פעילים מכל e. coli , לגילוי פעילות מיקרוביאלית. . הנה, זה מועבר לתוך התא של המתח מחוון גראם חיוביים lactis ל' . המנהיג הוא ביקע על ידי פרוטאז NisP (כמצוין על-ידי חץ) כדי לשחרר nisin פעיל מלא. זה יכול להיות גם שהוסר במבחנה על ידי טיפול עם טריפסין (*). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. השתמש מכת חום רגיל בפרוטוקול37 או אלקטרופורציה38 כדי להפוך את פרולין auxotrophic e. coli זן (ראה לעיל) עם פלסמידים pET-3a nisA(VSLR), pRSFDuet-1 nisBC.
  2. Pipette 25-100 µL תא טרנספורמציה השעיה על פלטות אגר המכיל אמפיצילין, kanamycin, גלוקוז 1% (w/v). השתמש מפזר צלחת או חרוזי זכוכית כדי להפיץ את הפתרון באופן שווה על הלוחות.
  3. דגירה צלחות בן לילה ב 37 º C.
  4. למחרת אחר הצהריים, השתמש שמושבה בודדת כדי לחסן בינוני 10 מ ל LB המכיל אמפיצילין, kanamycin ו- 1% (w/v) גלוקוז בבקבוקון 50 מ.
  5. לנער תרבות בין לילה (12-16 שעות)-37 ° C ו 200 סל ד.
  6. לקחת 250 גליצרול 80% סטרילי µL ותרבות 550 µL, מערבבים היטב את צינור 2 מ"ל ומאוחסן כערכה תא קפואים מלאי-80 מעלות צלזיוס.

2. חדש הכנה בינונית מזערי (NMM)

הערה: פרוטוקול זה משתמשת NMM20 כמדיום מוגדרים כימי נוזלי התפתחות חיידקים. כמו כן, מומלץ לעקוב אחר הסדר של הכנה בלבד. אחרת, משקעים יכול להתרחש. לקבלת טפסים חומצת אמינו שונות מאלה הרשומים בטבלה חומרים (למשל, hydrochlorides), בדוק מסיסות. NMM19 מכיל 19 חומצות אמינו חוץ מ"שטחי להחליפו (כאן, פרולין) על ידי המכללות אנלוגי. ראה טבלה 1. המרכיב האחרון הריכוזים. בהתאם המתח חיידקי לייצור, ביוטין, תיאמין ייתכן אופציונלי.

  1. הכנת התערובת חומצת אמינו
    1. להמיס 0.5 g Phe, Trp ו- Tyr ב- 100 מ ל ddH2O עם התוספת של מספר טיפות של HCl מרוכזת עד התפרקות.
    2. שוקלים לצאת 0.5 גר' כל אחת מחומצות האמינו 16 הנותרים. מערבבים עם 22 מ"ל של 1 מ' ח'2PO4 ו- 48 מ"ל של 1 מ' K2HPO4. להוסיף ddH2O ~ 800 מ. ומערבבים עד הפתרון נעשה ברור.
    3. הוסף את המומס Phe, Trp Tyr ולכוונן את העוצמה של הפתרון 1 ליטר עם ddH2O.
    4. לחטא את התערובת חומצת אמינו על-ידי סינון ואקום עם יחידת המסנן העליון בקבוק.
  2. פתרונות מניות NMM19
    1. תחילה, הכן 1 מ' מניות פתרונות של המרכיבים הבאים: (NH4)2כדי4,2פו ח'4, K-2-HPO-4, MgSO4 ו- 5 מ' במניה תמיסת NaCl. לחטא על-ידי autoclaving.
    2. הכנת 50 מ ל מניות של D-גלוקוז (1 מ'), CaCl2 (1 g/L), FeCl2 (1 g/L), תיאמין (10 גרם/ליטר), ביוטין (10 גרם/ליטר) ויסודות קורט (CuSO4, ZnCl2, MnCl2, (NH4)2MoO4; 1 מ ג/ליטר ). לעקר כל אחד על-ידי סינון עם מסנן מזרק.
  3. הכנה NMM19
    1. לערבב את כל הפתרונות מניות בריכוז הסופי של 7.5 מ"מ (NH4)2אז4, מ מ 1.7 NaCl, 22 מ מ ח'2PO4, 50 מ מ K-2-HPO-4, 1 מ MgSO4 ו- 20 מ מ D-גלוקוז, חומצות אמיניות 50 מ ג/ליטר מערבבים, µg/L 1 CaCl2, µg/L 1 FeCl2, תיאמין µg/L 10, ביוטין 10 mg/L ו- 0.01 יסודות קורט µg/mL.

3. ביטוי של Recombinant Nisin עם שילוב של פרולין תחליפי מאת SPI

בסעיף זה, ביטוי רקומביננטי prepeptide (כאן: nisA) וגם PTM הגנים (כאן: nisBC) מתבצע. ראשית, תאים הם בוגרים בנוכחות כל cAAs, מאז בינוני מורכבים LB משמש. גלוקוז מתווסף להדחיק את היעד גנים ברמת הרקע, אחרת להוביל הייצור של פפטיד פראי-סוג (כאן: nisin) עקב leakiness של היזמים. רק אחרי המטרה לפנות לסוכנות (כאן: פרולין) היא דלה, ncAA מתווסף ואת היעד גנים מושרה במדיום מוגדר מבחינה כימית. דגירה של תרבויות נוזלי צריכה להתבצע במתאים מבחנות עם אוורור (למשל, 500 מ ל בקבוקון Erlenmeyer 2 L-200 סל"ד).

  1. באמצעות טיפ פיפטה סטרילי, להתחיל תרבות לילה טריים מניות תא קפואים או טריים המושבה (ראו שלב 1). 25 מ ל LB בינוני המכיל אמפיצילין, kanamycin ו- 1% (w/v) גלוקוז ולהשתמש דגירה לילה (12-16 ג) ב 37 ° C ו- 200 סל ד.
  2. לחסן 1 ליטר של אמצעי טריים סטרילי עם התרבות לילה 10 מ ל (1% v/v), דגירה-37 ° C ו 200 סל ד עד OD600 = 0.5.
  3. צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ב 4,500 x g.
  4. יוצקים את תגובת שיקוע, resuspend בגדר עם 20 מ ל NMM19 (להכין בשלב 2.3) המכילה אנטיביוטיקה ו 1% (w/v) גלוקוז. צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 4,500 x g.
  5. Resuspend תא גלולה ב 500 מ"ל של המדיום אותו, דגירה של 30 מעלות צלזיוס, סל ד 200 לשעה.
    הערה: בשלב זה, דלדול סי (כאן, פרולין) מתקיים.
  6. לחלק את התרבות בחלקים שווים (אחד עבור כל המכללות). זירוז כל תרבות עם 1 מ מ איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), לספק תחליפי פרולין 1 מ"מ (4S/R- fluoroproline, 4S/R- hydroxyproline או 4S/R- methanoproline).
    הערה: הפקד, תרבות אחת יכול להיות מסופק עם 1 מ מ פרולין, וכתוצאה מכך ייצור פראי-סוג פפטיד.
  7. דגירה לילה (12-16 ג) ב 28 ° C ו- 200 סל ד.
  8. Centrifuge התא תרבויות צינורות 50 מ ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ב- 5,000 x g... יוצקים את תגובת שיקוע לאחסן כדורי ב-80 מעלות צלזיוס עד טיהור.

4. בידוד ולטיהור שלו מתויג Nisin תחליפי

פפטידים כבר טהור תחת denaturing התנאים עם guanidine הידרוכלוריד (GuHCl)39, חזק denaturant.

התראה: GuHCl מזיק אם לבלוע או בשאיפה וגורם לעור וגירוי עיניים חמורות. לענוד הגנה העין וכפפות.

  1. להכין 250 מ של איגוד מאגר (5 מ' GuHCl, 300 מ"מ NaCl, 25 מ מ טריס, pH 7.4), שטיפת מאגר (300 מ מ NaCl, 25 מ מ טריס, imidazole 25 מ מ, pH 7.4) ו • תנאי מאגר (300 מ מ NaCl, 25 מ מ טריס, 250 מ מ imidazole, pH 7.4). עבור אלה, להעביר המוצקים לתוך בקבוק 250 מ ל, למלא עד 200 מ עם ddH2O. לערבב היטב ולהתאים את ה-pH ל 7.4 עם 1 M NaOH או HCl. לאחר מכן, למלא עד 250 מ עם ddH2O. מסנן כל מאגר הפתרונות באמצעות יחידת המסנן העליון בקבוק.
  2. פירוק התא
    כאן, משמש sonicator (עם פלט 200 W בתדירות גבוהה המרבי (HF)); שימו לב כי הגדרות צריכת החשמל הדרושה לשבירת תאים עשויים להיות שונים עבור מכשירים אחרים. כל הצעדים מבוצעים על קרח. לחלופין, ניתן להשתמש פירוק כימי תא, של מהמגן נוזלי או מכבש צרפתי.
    1. להוסיף 12 מ ל איגוד מאגר כל שפופרת צנטריפוגה (מתוך שלב 3.8), resuspend על ידי vortexing.
    2. להטביע את קצה המכשיר sonicator לתוך התליה תא. הגדר sonicator ב 40% משרעת עם דופק של 1 s ב / 5 s. למשך 15 דקות.
      הערה: לנקות את הטיפ sonicator בין דוגמאות כדי להימנע דחויים. נגב את המכשיר sonicator עם 70% אתנול.
    3. Centrifuge התליה תא lysed ב 4 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות ב 15,000 g x כדי הצניפה שאריות תאים. להעביר את supernatants צינור התגובה.
  3. כרומטוגרפיית זיקה
    קיבוע יון מתכת זיקה כרומטוגרפיה (IMAC)40, משאבה סחרור או מערכת FPLC יכול לשמש עם מחסנית 1 מ"ל (כאן מלא שרף Ni-נ). הכנה של מאגרים, ראה שלב 4.1.
    הערה: IMAC טיהור הוא ריאלי מאז פפטיד רקומביננטי המיוצר נושא N-סופני שלו מתויג מנהיג, אשר יוסר בשלב 6 על ידי מנהיג peptidase NisP, שחרור nisin בוגרת. לבצע טיהור בטמפרטורת החדר או ב- 4 מעלות צלזיוס. השתמש קצב זרימה של 1 מ"ל לדקה אם ישים מחסנית ה-IMAC.
    1. ראשית, לשטוף את המחסנית עם 5 טורים נפחי (cv) ddH2O להסיר את מאגר אחסון.
    2. Equilibrate עם 10 קורות חיים מחייב המאגר.
    3. תהליך תא lysate (שלב 4.2) באמצעות מזרק לסנן כדי להסיר חלקיקים, ולאחר מכן להחיל מיכל הדיו.
    4. תשטוף עם 15 cv מאגר לשטוף כדי להסיר חומר ספציפי והלא מאוגדים.
    5. Elute עם 10 קורות חיים • תנאי מאגר ושברים לאסוף 1 מ"ל 1.5 mL צינורות. חנות השברים ב 4 ° C לטווח קצר (עד 3 ימים) או ב-20 ° C לתקופות זמן רב יותר.
    6. לאחסון, לשטוף את המחסנית עם 10 קורות חיים של ddH2O ואחריו 5 קורות חיים של 20% אתנול.

5. LC-ESI-תוף ניתוח Spectrometric המוני של תחליפי Nisin

הערה: ראה חומרים טבלה לדוגמה ומכשור כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית electrospray יינון זמן-של-טיסה ספקטרומטר מסה (LC-ESI-תוף-MS).

  1. לבצע הפרדה HPLC של 15-20-µL-פפטיד-פתרון (להכין בשלב 4.3) על עמודה C5 עם שלב ניידים של מים (א) ו- acetonitrile (ב) שניהם בתוספת חומצה פורמית 0.1% ומעבר הדרגתי מב' 5-80% מעל 20 דקות. ספקטרומטר מסה (MS), להשתמש • תנאי לאחר 5 דקות.
    הערה: בהתאם לתוכן פפטיד זיקה אל העמודה HPLC, לדוגמה ואמצעי הפרדה ייתכן שיהיה עליך אופטימיזציה.
  2. השתמש בתוכנה המתאימה כדי deconvolute ספקטרום נמדד בנפח גדול ולחשב שהמטען פפטיד שונה קובע41. להשוות את המסה מינים שנצפו פפטיד למסה פראי-סוג מחושב ששונו כתוצאה ההחלפה ncAA ← לפנות לסוכנות. לקחת בחשבון כי prepeptide ליניארי posttranslationally שונה על-ידי שמונה dehydrations (H-82O), חמש cyclizations (ראה איור 1).
    הערה: באמצעות מאגרי המכיל נתרן, MS ניתוח במצב חיובי יכול להראות נתרן adducts. אלה הופכים גלויים כמו פסגות נוספות עם מסה deconvoluted גבוהה יותר (עבור כל נתרן adduct, נצפתה המסה deconvoluted הוא גבוה ב- 22.99 Da). כדי להסיר את אלה adducts, HPLC לטיהור42 או דיאליזה נרחב43 יכול להתבצע.

6. בדיקת פעילות מיקרוביאלית

  1. הכנת לוחות GM17-אגר בתנאים סטריליים
    1. להכין את תרבות לילה של הגלוקוז זן lactis ל' NZ9000 נושאת פלסמיד pNG nisPT44 ב 30 ° C ב- M17 מרק45 עם 1% (w/v) מחוון (= GM17) ו 5 כלורמפניקול µg/mL.
    2. למדוד OD600, לחסן בינוני טריים OD600 = 0.1, דגירה עד OD600 = 0.4-0.6. אז הניחו את הבקבוק על קרח.
      הערה: כל אחת מהמידות600 OD לצרוך תרבות נפח. יש לזכור כי עבור כל assay צלחת אגר, יהיה צורך התרבות חיידקי 1 מ"ל. במידת הצורך, לשנות את עוצמת הקול של תרבית נוזלית בהתאם.
    3. עבור 1.5% אגר, שוקל לצאת אגר 4.5 גרם בבקבוק זכוכית מדיה. מוסיפים 300 מ ל ddH2O, מערבבים ו אוטוקלב.
    4. להכין 2 x M17 מרק (two-times מרוכז) ב 300 מ"ל ddH2O והחיטוי.
    5. מערבבים 25 מ ל ציר x M17 2 המכילה 10 µg/mL כלורמפניקול, 2% גלוקוז עם 1 מ"ל lactis ל' preculture (4% v/v).
    6. להוסיף 25 מ ל מותכת 1.5% אגר (טרי בלוק או מחוממת במיקרוגל).
      הערה: לפני כן, ומצננים את הבקבוק לגעת (בסביבות 50 ° C). דבר זה הכרחי מכיוון lactis ל' הוא יצור mesophilic רגיש לטמפרטורות גבוהות.
    7. שופכים את הפתרון לתוך צלחת פטרי גדולה. צלחות יבש למשך 10-15 דקות.
    8. לחטא את הקצוות של כוס פסטר פיפטה על ידי להבה. חכה לזה להתקרר ולאחר מכן להשתמש בקצה רחב ליצירת חורים, GM17-אגר הקרושה.
  2. הכנת הדוגמא
    1. קח 1 מ"ל של e. coli ביטוי התרבויות (שנוצרו בשלב 3.7) שכותרתה mL 1.5 שפופרת, צנטריפוגה למשך 3 דקות ב x 7,000 ג'י וביופסיה המדיום הנותרים, resuspend בגדר תא ב- 500 µL Na-P (50 מ מ מאגר סודיום פוספט pH 7.4 זני 0.5 M נתרן dihydrogen פוספט, פוספט ניתרן 0.5 M).
    2. Sonicate את הדוגמאות על קרח (השווה שלב 4.2.2). להטביע את קצה המכשיר sonicator לתוך התליה תא. הגדר sonicator ב- 30% משרעת עם דופק של 1 s s על ו- 5 הנחה למשך 3 דקות.
    3. Centrifuge תא lysate 10 דקות ב 13,000 g x כדי הצניפה שאריות תאים. להעביר את תגובת שיקוע צינור התגובה על קרח.
    4. לדלל, לנרמל את supernatants תמצית תא כדי 1 מ"ל OD600 = 0.6, ביחס צפיפות תא שנקטפו, עם Na-פ
  3. בדיקת פעילות
    1. להוסיף 40 µL של כל מדגם מנורמל לתוך חור של צלחת אגר מחוון (איור 3). להשתמש כלורמפניקול µg 400/mL כפקד אנטיבקטריאלי מורכבים. • תנאי שימוש מאגר כפקד שלילי. המתן עד כל דוגמאות הם ינטרלו לתוך אגר. דגירה את הצלחת ללון ב- 30 ° C.
    2. תצלמי תמונות של הלוחות אגר באמצעות סורק שטוח או מצלמה דיגיטלית. הצמיחה עיכוב הילה גדלים ניתן נמדד באופן ידני או באמצעות ImageJ46.

7. זריחה מיקרוסקופ

על מנת לצפות את ההשפעה של אמפר על תאים חיידקיים, מיקרוסקופ אור, קרינה פלואורסצנטית יכול לשמש. שימו לב כי מצב nisin של הפעולה מסתמך על destabilization והיווצרות נקבוביות פקיעת קרומים חיידקיים6. כאן, הנילוס האדום משמש כדי להכתים את קרום התא חיידקי, אשר הופכת תא פזורים, צבורים על פירוק.

הערה: ראה חומרים טבלה לדוגמה מכשור. ניתן להתאים כמויות של פתרון כח נוסף בהתאם פפטיד ריכוז bioactivity.

  1. הכנה תא
    1. הכינו 10 מ מ אדום הנילוס פתרון מניות ב דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד).
    2. לגדול ל' lactis מחוון מאמץ יתר600 = 1.0 כמו שלב 6.1.1-6.1.2.
    3. צנטריפוגה תרבות 1 mL עבור מינימום 3-4 ° C ו- 5,000 x g.
    4. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend ב 1 מ"ל תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS)47.
    5. צנטריפוגה, resuspend שוב.
    6. הוספת פתרון מניות הנילוס אדום µL 1, לערבב בעדינות.
  2. ייבוא תמונות מיקרוסקופיות
    1. להוסיף 30 µL של הכנה תא בשקופית כיסוי תוך מרגש-520 ננומטר.
    2. הגדר רכישת זמן 0.2 s, סדרת קינטי 0.1 הרץ, סדרת אורך 200 תמונות.
    3. להוסיף 0.3 - 1.5 µL של התא lysate או IMAC מדגם (מתוך שלב 6.2.4 או 4.3.5, בהתאמה). לקבלת דוגמאות IMAC, מאגר • תנאי יכול לשמש פקד שלילי.
    4. פליטת קרינה פלואורסצנטית צג ולהקליט אצל λ ≥ 560 ננומטר.
  3. ניתוח נתונים
    1. רצפי תמונות מיקרוסקופ מאוחסנות כקבצים סרט (.avi). תמונות יחיד הם ניתחו עם ImageJ46.

Representative Results

פרוטוקול זה תוכנן כדי לאפשר הייצור של ליגת המכללות-השתנה nisin גרסאות עם שאריות ספציפיים התאגדות של פרולין תחליפי בשיטת SPI. בעבר, הכדאיות ואת התשואות של 24 מ ג/ליטר דווחו לייצור רקומביננטי nisin פראי-סוג שונה לחלוטין39. שימוש בשיטת SPI, היעד אלקטרופיזיולוגיה/תשואות טובות לעתים קרובות, יכולים להגיע כמויות קרוב ייצור פראי-סוג48. כמו הניסויים הראשונים, הפקה RiPP פראי-סוג רקומביננטי צריך להיבדק במארח auxotrophic שבחרת. הנה, פרולין auxotrophic e. coli MG1655 ΔproBA:: והשפלתם Δלשגרה:: והשפלתם (DE3) שימש מארח זן. כהכנה לסיפוח ncAAs, טיפוח, אינדוקציה ניתן למטב הרכב בתזמון, כמו גם בינוני וטמפרטורה לכיוון תשואה מקסימלית פפטיד.

פעילות מיקרוביאלית assay
ייצור פראי-סוג nisin רקומביננטי, טיהור בוצעו בעקבות בפרוטוקול לעיל. במקרה זה, פרולין שימש במקום ונגזרותיו ncAA בשלב 3.6. וזמינותו פעילות מיקרוביאלית שימש כדי לוודא RiPP ייצור וכדי להשוות את פעילות מיקרוביאלית לפני ואחרי טיהור. עבור פעילות וזמינותו, שברים • תנאי ו IMAC זרימה דרך היו בשימוש ישירות, כנגדם המתח מחוון גראם חיוביים lactis ל' (איור 2). זן זה מבטא NisP, nisin וריאציות הכלול lysates תא החיידק או מטוהרים פפטיד דגימות, בהתאמה, להיות מופעל על ידי פצילות הפרוטאוליטי של פפטיד מנהיג. אין ספק, הזרימה דרך הראה צמיחה-מעכבות פעילות. זו יכולה להיות מוסברת על ידי חומר ביו לא מחייב את העמודה ה-IMAC. כל השברים • תנאי שנבדקו הראו פעילות מוגברת בהשוואה המדגם ולזרימה, המציינת את ריכוז פפטיד מתויג שלו על ידי ה-IMAC. שימו לב כי המאגר • תנאי (כמו שליטה שלילי) לא להשפיע על הגידול של ל' lactis assay הזה.

Figure 2
איור 2 . פעילות מיקרוביאלית בודק לאחר טיהור IMAC של recombinantly מיוצר פראי-סוג nisin. • תנאי שברים 5-15, את הזרימה של ה-IMAC טיהור נבדקו בהשוואה lysate בתא ולזרימה (מדולל עבור OD נירמול600 ) נגד המתח מחוון lactis ל' . הגודל של הילות עיכוב גדילה מציין פעילות מיקרוביאלית. כלורמפניקול-ריכוז של 400 µg/mL שימש בתור פקד חיובי ושאר המאגר • תנאי IMAC שליטה שלילי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

כדי להוכיח את פעילות מיקרוביאלית של recombinantly מיוצר nisin משתנים המכילים שש תחליפי פרולין שונים, וזמינותו פעילות בוצעה לבחון עיכוב של המתח מחוון lactis ל' . איור 3 מראה הצמיחה עיכוב חמש מתוך שש דגימות המיוצר באמצעות תחליפי פרולין. התוצאות הטובות ביותר (כפי נשפט מן ההילה גדלים) נצפו על הניסויים התאגדות של אנלוגי (4R) - fluoroproline, (4R) - hydroxyproline ו- (4S)-methanoproline. השוואת גודל ההילה עיכוב גדילה כדי nisin פראי-סוג המיוצרים ובדק במקביל, כל שלושת המשתנים nisin הראה כוח עיכוב דומה. עם זאת, גודל הילה לבד לא יכול להיות פעם התחת פעילות ספציפית, מאז הריכוז של המגבר לא נקבע. לכן, מבחני לשרת רק בדיקה איכותית אם פעילות מיקרוביאלית של המשתנים nisin וכתוצאה מכך הוא נשמר או אבד. כדי לקבוע את פעילות ספציפית, הריכוז של המשתנים nisin להיות כימות (ראה דיון).

Figure 3
איור 3 . פעילות מיקרוביאלית וזמינותו של lysates התא המכיל את nisin וריאציות המיוצר באמצעות SPI עם תחליפי פרולין. השוואה של nisin משתנים עם דגימות פראי-סוג רקומביננטי. כל הדגימות היו יתר600-מנורמל לאחר פירוק התא ביחס הצפיפות תרבות תא שנקטפו. הילות מציינים אתריים בצורה של מחוון זן הצמיחה עיכוב. בשורה הראשונה משמאל לימין: (4R)-fluoroproline, (4R) - hydroxyproline, (4R) - methanoproline, כלורמפניקול (400 µg/mL; מיקרוביאלית בקרה חיובית). שורה שנייה: (4S)-fluoroproline, (4S) - hydroxyproline, (4S) - methanoproline, פרולין (פראי-סוג פקד). הערה המינוח הכימי; למשל, (4R) - fluoroproline גם נקרא טרנס-4 - fluoroproline. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

ספקטרומטר מסה LC-ESI-תוף
לאחר טיהור IMAC, שיתוף ncAAs לתוך nisin נותחה על ידי LC-ESI-תוף ספקטרומטר מסה. איור 4 מציג את ספקטרום המוני deconvoluted של משתנה nisin המכיל (4R)-fluoroproline. וריאנט זה היה ה-IMAC מטוהרים כמתואר לעיל, לאחר מכן נותחו על ידי LC-ESI-תוף ספקטרומטר מסה, אז זה עדיין נשא המנהיג. הפסגה המרכזית איור 4A תואמת nisin ששונה המכיל (4R)-fluoroproline עם מסה deconvoluted של דה 6883.18 (המסה המחושבת 6882.05 דא, לחשב כמות פפטיד פראי-סוג התואם עם פרולין- עמדת 9 הינה 6864.06 Da). שתי הפסגות עם שפע התחתון, מסה גבוהה יותר שיתאימו נתרן adducts כמצוין. איור 4 B מראה אחרת טעונה מינים של הראשי במתחם כפי שנמצא על ידי האלגוריתם deconvolution. לדוגמה, הפסגה-מ 1148.11/z מתייחס המינים טעונים six-fold ([M + 6H]6 +).

Figure 4
איור 4 . LC-ESI-תוף ספקטרומטר מסה של טיהור-IMAC nisin רקומביננטי משתנים המכילים (4R)-fluoroproline. (א) Deconvoluted chromatogram ספקטרומטר מסה (הגדלה שיבוץ) עבור הגרסה nisin (עדיין נושא את המנהיג) עם (4R)-fluoroproline (צפוי ההמונים (Da): [M + H]+ = 6882.05, [M + Na]+ = 6904.03, [M + 2Na]2 + = 6926.02). (B) במתחם spectra עבור מינים [M + H]+. צפוי ההמונים (Da): [M + 5H]5 + = 1377.41, [M + 6 H]6 + = 1148.01, [M + 7 H]7 + = 984.15, [M + 8 H]8 + = 861.26, [M + 9 H]9 + = 765.67, [M + 10 H]10 + = 689.21, [M + 11 H]11 + = 626.64, [M + 12 H] 12 + = 574.50. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית
ניתן גם להראות פעילות מיקרוביאלית של nisin רקומביננטי והווריאנטים שלה המכילים המכללות על ידי התבוננות ישירה ל' lactis מחוון זן באמצעות קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. הנילוס אדום, הפלורסנט מאוד הידרופוביות, שימש כדי להכתים את קרום תא החיידק. איור 5 מראה את השינוי האיכותי של מצב צבירה של תרבית תאים, תא בודד מורפולוגיה. התאים היו מוכתמים באדום הנילוס, שהופקדו על שקופית כיסוי מיקרוסקופ. בשורה העליונה מציגה את התאים ישירות בהתחלה כאשר מאגר, רקומביננטי פראי-סוג nisin, או nisin המכיל (4R)-fluoroproline, או (4R)-hydroxyproline נוספו. החלונית התחתונה מציגה את התמונות המתאימות לאחר 20 דקות של דגירה.

Figure 5
איור 5 . קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה של nisin רקומביננטי השפעות על תאים גראם חיובי. תמונות מיקרוסקופיות של 30 µL ל' lactis מחוון זן (OD600 = 1) מסומן עם הנילוס אדום צולמו לפני (החלונית העליונה) ואחרי (החלונית התחתונה) הדגירה 20 דקות עם מאגר 1 µL (A), 0.3 µL רקומביננטי פראי-סוג nisin (B), 0.6 משתנים nisin של µL, המכילים (4R)-fluoroproline (ג) ו- (4R)-hydroxyproline (D). העיגולים הכחולים לסמן אזורים עם תאים צבור או מעוות, כחול נקודת חצים לאזורים שבהם יכול להיות שנצפו פעפוע של קרום פלורסנט קטעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5 א מראה כי המראה הכללי של התאים לא השתנה בתוך 20 דקות של התבוננות. רק את מספר התאים שנוצרו בזמן הוורד זמן ולכן כמות גדולה של תאים הוא גלוי בתוך מיקרומטר מיקרומטר 80 x 80 האזור שנצפו. איור 5 B מראה התאים גראם חיוביים הופיע צבורים מטושטשים (מסומנים בעיגולים כחולים) לאחר 20 דקות של חשיפה פראי-סוג nisin, נוספו גם כאשר נמוך כמויות (כאן, • IMAC תנאי µL 0.3). בנוסף, חומר אור פיזור מתאי למאגר, המציין כי קרום שברי המסומנים הנילוס אדום הונעו במהלך מסגרת הזמן (מסומן על ידי החצים הכחולים). ממצאים אלה מצביעים על פירוק התא כמוצג זה היה להתרחש בעת טיפול עם6,nisin49. תופעות דומות נצפו לאחר דגירה עם nisin variant המכיל (4R) - fluoroproline (איור 5C) וגם nisin המכיל (4R) - hydroxyproline (איור 5D) מציג שני גדולים כמויות של תאים מעוותים ולא צבורים אחרי 20 דקות, בניגוד בולט המדגם שליטה (איור 5א).

רכיב ריכוז
(NH4) 2 אז4  7.5 מ מ
NaCl 8.5 מ מ
2פו ח'4 22 מ מ
K-2-HPO-4 50 מ מ
MgSO4 1 מ מ
D-גלוקוז 20 מ מ
כל חומצות האמינו הקנונית
(פרט אחד כדי להחליף)		 50 מ"ג/ליטר
Ca2 + µg 1/mL
Fe2 + µg 1/mL
יסודות קורט
(Cu2 +Zn2 +, Mn2 +, MoOH2 +)		 µg 0.01/mL
תיאמין µg 10/mL
ביוטין µg 10/mL

טבלה 1. ההרכב של NMM19 מוגדרים כימי בינוני התפתחות חיידקים לאחר הכנה לפי שלב 2.

Discussion

באמצעות SPI להכנסה של תחליפי פרולין, המבנים nisin יישוב יכול להיות משמעותי שונה, יצירת גרסאות הרומן פפטיד עם שילובים רצף ייחודי ומאפיינים כימי. בדרך זו, גבול בסיסי בטכנולוגיה גנטית קלאסית יכול שיפרו, אשר הוא מוגבל ל הצד שרשרת בדיקות, הביוכימיה של cAAs 20. In vivo גיוון הכימית של nisin כפי שהודגם לעיל ממחיש הגישה המשלימה PTMs טבעי וכדי לשפר באופן דרמטי את שטח הכימית של RiPPs. אנו מאמינים כי הרחבת הרפרטואר חומצות אמינו טבעיות מחזיקה הבטחה גדולה במיוחד עבור מגברים. בחלבונים, מגוון עצום של פונקציות יכול להתממש באמצעות סידור מוגדר של cAAs 20 מבנים תלת מימדיים. עם רק 7-100 aa אורך3, דרכים להשיג תכונות מבניות כגון רק דרך cAAs יהיה מוגבל עבור מגברים. זה ולכן לא מפתיע כי מגברים טבעי בצורה של RiPPs הם בדרך כלל ששונה בהרחבה post-translationally4. באותו אופן, ncAAs כאבני בנייה אלטרנטיבית החזק הבטחה גדולה כדי לשפר את הפרמטרים שלהם pharmacodynamic, פרמקוקינטיקה ופרמקודינמיקה (ראה באומן. ואח 201735 והפניות בו).

המתודולוגיה SPI המשמשים את יתרונות עבודה הגדרת הניסוי קל יחסית, ביצוע פעולה פשוטה, הפארמצבטית גבוהה. עקב החלפת גלובלית, ncAA ריבוי האתרים, שהשתלבה פפטידים המטרה היא גם אפשרית. מצד שני, השיטה לא ייתכן נאותה להחלפה של חומצות אמינו המתרחשים לעתים קרובות המוצר ג'ין היעד. באופן עקרוני, ניתן לשינוי עמדות בלתי רצויה על ידי מוטגנזה, אך שינויים נוספים אלה עשויים גם להשפיע על מספר מאפיינים המגבר כולל מבנה אתריים. ברגע זן auxotrophic לייצור זמין, ניתן לבחון את ncAAs מספר מבלי לדרוש שינויים נרחבים ברמה הגנטית. יתר על כן, השיטה אינה מוגבלת auxotrophic e. coli זנים, אך ניתן גם לבצע באמצעות המחשב המארח הייצור הטבעי. לדוגמה, ג'ואו. et al. הראה SPI לייצור של הרומן RiPPs פועל גם ב- באופן טבעי Trp-auxotroph ל' lactis: שימוש מוגדר מדיה, שלוש תחליפי טריפטופן שולבו בשעה ארבע עמדות nisin50.

מאז השיטה SPI מוביל להחלפת הכללית של הנבחרת סי על ידי ncAA, זה חלים באופן כללי על מגוון רחב של היעד פפטידים וחלבונים. מגוון של auxotrophic e. coli זנים זמין (ראה שלב 1), המאפשר מספר cAAs כל להיבדק להחלפה ע י ncAAs. פגשתי תחליפי שולבו באמצעות מטא-זנים לקוי (למשל, B834(DE3)) הם בדרך כלל מועסקים. דוגמאות isostructural Met מקבילים הן azidohomoalanine (Aha) ו homopropargylglycine (Hpg), ncAAs זמינים מסחרית אשר ניתן לשלב ביעילות. שניהם מציגים ידיות bioorthogonal אשר מאפשרים מצורף של מולקולות נושאת של אלקין תואם או פונקציונליות אזיד, בהתאמה. לדוגמה, צבעי פלורסנט או moieties פוליאתילן גליקול (PEG) יכול להיות מצורף על ידי נחושת (I)-מזורז אזיד אלקין cycloaddition (CuAAC)51.

למרות שתי השיטות התאגדות רקומביננטי ncAA (SPI ו- SCS) בדרך כלל להשיג יעד בכמות מספקת, התשואות מופחתים לעיתים קרובות יחסית ייצור פראי-סוג של פפטידים המתאימים, חלבונים. כפי purities תדירות לתאם עם יעילות הייצור, שלבי טיהור נוסף יהיה צורך, במיוחד עבור מינים נמוך-בשפע. במקרה ספציפי זה של ייצור nisin רקומביננטי, הרצף מנהיג שלו מתויג מאוד מפשט טיהור RiPP על ידי העשרת סלקטיבי של lysates התא. הטיהור שמוצג פרוטוקול זה משפר את הטוהר ואת ריכוז של nisin, אבל לעתים קרובות אינה נותנת כח purities מספיק כדי להחליט מה ביבול ובאיכות פעילות ספציפית. מלבד IMAC, שיטות לטיהור המגבר נפוצים כוללים HPLC, יונים כרומטוגרפיה (חברת החשמל), משקעים (למשל. באמצעות אצטון או חומצת חומץ טריכלור (TCA)) או צירופם - והתוצאה היא ערכה רב שלבי טיהור52 . יצוין כי שלהם בדרך כלל polycationic הטבע יכול להקל על חברת החשמל טיהור. ליופיליזציה משמש לעתים קרובות כדי לאחסן אמפר מטוהרים.

באופן אידיאלי, ncAAs על השתלבות אמפר הנמכרים במחירים סבירים או בקלות המיוצר על ידי סינתזה לשחזור ופשוט פרוטוקולים. תנאי מוקדם חשוב לא פחות עבור שיטת SPI הוא ncAA היא מזוהה, מופעל גובים על גבי tRNA cognate aaRS אנדוגני או ביטוי במשותף. זה יכול להיות נבדק במבחנה על ידי חומצת אמינו הפעלה או tRNA aminoacylation assay53. כחלופה נוחה, SPI ביטויים מבחן של מודל חלבונים כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) שנערך שניהם בנוכחות, בהעדר ncAA תוספי יכול להתבצע. יתר על כן, המסיסות צמיחה בינוני ותא פרמאביליות, כמו גם לשחיקה מהווים גורמים חשובים.

בדוגמה זו, פעילות מיקרוביאלית הוקרן באמצעות זן מחוון גראם חיוביים. זה מבטא את מנהיג peptidase NisP, השלב הסופי של התבגרות nisin מזורז. הסרה של הרצף מנהיג (שלו מתויג למטרות טיהור) יכול להיות גם בביצוע במבחנה על ידי טיפול עם מטוהרים NisP50 או טריפסין54. מעבר להיקף של עבודה זו, אורגניזמים פתוגניים וללחצים multidrug עמידים ואז ניתן לבחון עיכוב bacteriostatic או אחרים על-ידי אמפר באמצעות מתודולוגיה דומה. היעד הרלוונטית קלינית מינים כוללים MRSA, MDR שחפת Mycobacterium, VRE, Acinetobacter baumannii, סטרפטוקוקוס pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa , קלבסיאלה pneumoniae. מלבד פעפוע צלחת אגר assay המובאים כאן, הצמיחה עיכוב יכול גם להתבצע באמצעות המדיה המתאימה נוזלי מחוסן עם המין חיידקי, בתוספת כח. באמצעות שיטות לדילול ציר, הריכוז המעכב מינימלי (MIC) ניתן לקבוע באמצעות פפטידים טהור55. וזמינותו הפעילות המוצגת כאן יכול לשמש גם כדי להעריך את bioactivity ואת עוצמת מגבר המכיל פתרונות ביחס הפניה תרכובות, nisin לדוגמה זמינים מסחרית.

ייצור רקומביננטי RiPPs לעתים קרובות ריאלי39, אשר בדרך כלל כולל שיתוף ביטוי של גנים PTM. ברגע המתח הייצור הועבר לתוך מדיום מינימלי מוגדר באופן כימי או סינתטי המכיל של ncAA מתאימים, שאריות ספציפיים החלפה של המנהל האזרחי המתאימים מתקיים. לפיכך, RiPPs אחרים יכול להיות מיוצר על ידי המתודולוגיה זהה, ובלבד ייצורם רקומביננטי הוא ריאלי, תנאים ניתן למצוא איפה התאגדות המכללות, PTM תשואות כמויות מספיקות של המוצר היעד. שימו לב כי מלבד פרוטאום התא המארח, המכונות PTM פפטיד יכולים להפוך גם המכללות-השתנה במהלך SPI. כתוצאה מכך, העיתוי של היעד ביטוי אינדוקציה ואורך תקופת הדגירה הבאים תוכל לדרוש אופטימיזציה. מאז ncAA שהשתלבה אנזימים PTM יכול להשפיע על היציבות שלהם, פעילות, ייצור RiPP מעובד באופן עקרוני יושפעו. מספיק PTM אנזים היעילות שציין היווצרות של prepeptide מעובד, כפי שזוהו על-ידי מבחני MS ו- bioactivity. כפי שהובאו לעיל, היזמים inducible שונים יכול להיות מועסק על מנת לייצר את PTM גנים קודם (בהעדר ncAA) ואחריו אינדוקציה של הגן פפטיד קודמן בנוכחות של ncAA. באופן כללי, חייבים לדכא הייצור של המכילות סי פפטיד היעד לפני תוספת של ncAA, ולכן דיכוי חזק של הגן קודמן נדרש. בתוך פרוטוקול זה, זו מושגת על ידי דיכוי קטבולי באמצעות התוספת של גלוקוז למדיום הגידול. במיוחד מאז PTM אנזימים הדרושים לעיבוד prepeptide מקורן בדרך כלל מחשב מארח מרוחק מבחינה גנטית, השימוש טמפרטורה, codon הביטוי של הגנים המתאימים תוכל לדרוש אופטימיזציה אם הייצור רקומביננטי טרם בוטלה הקים. בעקרון, הנוכחות של ncAAs, prepeptide יכול להתערב עם זיהוי ועיבוד של אנזימים PTM, במקרה של nisin NisBC ו- NisP. עבור ליגת המכללות שהשתלבה אמפר, ובכך מומלץ לבצע ניסויים בקנה מידה קטן ביטוי תחילה כדי לזהות ביטוי מתאים לתנאים והאמינות של המגבר פעילות וזמינותו.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

J.H.N., שחפת, מ ב לאשר מימון על-ידי התוכנית האיחוד האירופי FW7 (SYNPEPTIDE). י. פ-ס ו טי להכיר במימון משרד החינוך הפדרלי, מדע (BMBF תוכנית "HSP 2020", TU-WIMIplus פרוייקט SynTUBio) ושל קרן מחקר גרמני (אשכול של מצוינות "Unifying מושגים זרז").

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sodium chloride Carl Roth, Germany P029
guanidine hydrochloride Carl Roth, Germany 0035.2
dipotassium hydrogen phosphate Carl Roth, Germany P749.3
potassium dihydrogen phosphate Carl Roth, Germany 3904.3
sodium dihydrogen phosphate monohydrate Carl Roth, Germany K300.2
disodium hydrogen phosphate Carl Roth, Germany P030.2
L-alanine Carl Roth, Germany 3076.2
L-arginine Carl Roth, Germany 3144.3
L-asparagine monohydrate Carl Roth, Germany HN23.1
L-aspartic acid Carl Roth, Germany T202.1
L-cysteine Carl Roth, Germany 3467.3
L-glutamine Carl Roth, Germany 3772.1
L-glutamic acid Carl Roth, Germany 3774.1
L-glycine Carl Roth, Germany 3187.3
L-histidine Carl Roth, Germany 3852.3
L-isoleucine Carl Roth, Germany 3922.3
L-leucine Carl Roth, Germany 3984.3
L-lysine monohydrate Carl Roth, Germany 4207.2
L-methionine Carl Roth, Germany 9359.4
L-phenylalanine Carl Roth, Germany 4491.2
L-proline Carl Roth, Germany T205.3
L-serine Carl Roth, Germany 4682.4
L-threonine Carl Roth, Germany T206.2
L-tryptophan Carl Roth, Germany 4858.2
L-tyrosine Carl Roth, Germany T207.2
L-valine Carl Roth, Germany 4879.4
ammonium sulfate Carl Roth, Germany 3746.3
magnesium sulfate Carl Roth, Germany 0261.2
D-glucose Carl Roth, Germany 6780 prepare a 20% (w/v) solution for addition into molten agar
calcium chloride Carl Roth, Germany PN93.2
iron(II) chloride Sigma-Aldrich, Germany 372870
thiamine hydrochloride Sigma-Aldrich, Germany T1270
biotin Carl Roth, Germany 3822.2
copper(II) sulfate Merck, Germany 102792
manganese(II) chloride Carl Roth, Germany KK36.2
zinc chloride Merck, Germany 108816
immonium orthomolybdate Sigma-Aldrich, Germany 277908
glycerol Carl Roth, Germany 7533.3
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Sigma-Aldrich, Germany I6758
ampicillin sodium salt Carl Roth, Germany K029.5 working concentration 100 µg/mL for E. coli, prepare 100 mg/mL stock in ddH2O
kanamycin sulfate Carl Roth, Germany T832.2 working concentration 50 µg/mL for E. coli, prepare 50 mg/mL stock in ddH2O
chloramphenicol Carl Roth, Germany 3886.1 working concentration 5 µg/mL for L. lactis, prepare 37 mg/mL stock in ethanol
(4S)-fluoroproline Bachem, Switzerland F-3970
(4R)-fluoroproline Bachem, Switzerland F-3975
(4S)-hydroxyproline Bachem, Switzerland F-1395
(4R)-hydroxyproline Bachem, Switzerland F-2980
(4S)-methanoproline chemically synthesized
(4R)-methanoproline chemically synthesized
hydrochloric acid (HCl) Carl Roth, Germany P074.4
ethanol VWR, Germany 20825.324
M17-broth Sigmal-Aldrich, Germany 56156 commercial product, see Terzaghi BE & Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13 for contents and preparation
agar-agar Carl Roth, Germany 5210.5
Nisin from Lactococcus lactis  Sigma-Aldrich, Germany N5764 commercial product, can be used as reference for bioactivity
dimethyl sulfoxide (DMSO) Carl Roth, Germany A994.1
imidazole Carl Roth, Germany 3899.3
1.5 mL autosampler vial for LC-MS Sigma-Aldrich, Germany Supelco 854165
acetonitrile VWR, Germany HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 LC-MS grade required
formic acid VWR, Germany HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 LC-MS grade required
1 mL Ni-NTA IMAC column, e.g. HisTrap FF Crude GE Healthcare, UK 29-0486-31 different manufacturers and resins available for IMAC
0.45 µm bottle top filter unit VWR, Germany 10040-470 sterile filtration of solutions using a vacuum pump
0.45 µm syringe filter PVDF membrane Carl Roth, Germany CCY1.1 sterile filtration of solutions using a syringe and to remove particles from cell lysates
luer-lock syringe, PP, 50 ml Carl Roth, Germany T552.2 sterile filtration of solutions  
1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf, Germany 30120086
petri dishes (polystyrene, sterile) Carl Roth, Germany TA19
Nile red Sigma-Aldrich, Germany 72485
E. coli ΔproA strain CGSC, Keio collection JW0233-2 proline-auxotrophic E. coli K-12 strain
E. coli B834(DE3) Novagen (Merck), Germany 69041 methionine-auxotrophic E. coli B strain
λDE3 Lysogenization Kit Novagen (Merck), Germany 69734-3
Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT bacterial indicator strain, see Khusainov R & Kuipers OP, PLoS One, 8 (9), e74890
benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf, Germany 5427 R
peristaltic pump GE Healthcare, UK P1
FPLC system GE Healthcare, UK Äkta Purifier 10 or the like
inverted microscope Nikon TI Eclipse wide-field fluorescence microscope  with 100x (N.A. 1.4) objective and Mercury Lamp example setup for fluorescence microscopy
electron multiplying CCD (EMCCD) camera Andor Technologies, UK Andor Luca  example setup for fluorescence microscopy
fluorescence excitation filter Thorlabs, USA Dichroic cube (TLV-U-MF2-TRITC) example setup for fluorescence microscopy
fluorescence emission filter AHF Analysentechnik, Germany T 560 LPXR example setup for fluorescence microscopy
cover slip 24 x 60 mm Carl Roth, Germany LH26.1 example setup for fluorescence microscopy
Immersion Oil Carl Zeiss, Germany Immersol 518 F example setup for fluorescence microscopy
probe sonicator Bandelin, Germany Sonopuls HD3200 with sonotrode MS-72 200 W maximum HF output
C5 HPLC column (2.1x100 mm, 3 µm particle size) Sigma-Aldrich, Germany 567227-U example setup for mass spectrometry
ESI-TOF coupled to HPLC system Agilent, USA Agilent 6530 Accurate Mass QTOF with 1260 HPLC example setup for mass spectrometry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferri, M., Ranucci, E., Romagnoli, P., Giaccone, V. Antimicrobial resistance: A global emerging threat to public health systems. Crit Rev Food Sci Nutr. 57 (13), 2857-2876 (2017).
  2. Bahar, A. A., Ren, D. Antimicrobial peptides. Pharmaceuticals. 6 (12), 1543-1575 (2013).
  3. Ageitos, J. M., Sánchez-Pérez, A., Calo-Mata, P., Villa, T. G. Antimicrobial peptides (AMPs): Ancient compounds that represent novel weapons in the fight against bacteria. Biochem Pharmacol. 133, 117-138 (2017).
  4. Arnison, P. G., et al. Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide natural products: overview and recommendations for a universal nomenclature. Nat Prod Rep. 30 (1), 108-160 (2013).
  5. Lubelski, J., Rink, R., Khusainov, R., Moll, G. N., Kuipers, O. P. Biosynthesis, immunity, regulation, mode of action and engineering of the model lantibiotic nisin. Cell Mol Life Sci. 65 (3), 455-476 (2008).
  6. Shin, J. M., Gwak, J. W., Kamarajan, P., Fenno, J. C., Rickard, A. H., Kapila, Y. L. Biomedical applications of nisin. J Appl Microbiol. 120 (6), 1449-1465 (2016).
  7. Scherer, K. M., Spille, J. -H., Sahl, H. -G., Grein, F., Kubitscheck, U. The lantibiotic nisin induces lipid II aggregation, causing membrane instability and vesicle budding. Biophys J. 108 (5), 1114-1124 (2015).
  8. Jung, G. Lantibiotica - ribosomal synthetisierte Polypeptidwirkstoffe mit Sulfidbrücken und α,β-Didehydroaminosäuren. Angew Chemie. 103 (9), 1067-1084 (1991).
  9. Rink, R., et al. Lantibiotic structures as guidelines for the design of peptides that can be modified by lantibiotic enzymes. Biochemistry. 44 (24), 8873-8882 (2005).
  10. Lagedroste, M., Smits, S. H. J., Schmitt, L. Substrate Specificity of the Secreted Nisin Leader Peptidase NisP. Biochemistry. 56 (30), 4005-4014 (2017).
  11. Ross, A. C., Liu, H., Pattabiraman, V. R., Vederas, J. C. Synthesis of the lantibiotic lactocin S using peptide cyclizations on solid phase. J Am Chem Soc. 132 (2), 462-463 (2010).
  12. Fukase, K., et al. Synthetic Study on Peptide Antibiotic Nisin. V. Total Synthesis of Nisin. Bull Chem Soc Jpn. 65 (8), 2227-2240 (1992).
  13. Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology. Chem Sci. 6 (1), 50-69 (2015).
  14. Kuthning, A., Durkin, P., Oehm, S., Hoesl, M. G., Budisa, N., Süssmuth, R. D. Towards Biocontained Cell Factories: An Evolutionarily Adapted Escherichia coli Strain Produces a New-to-nature Bioactive Lantibiotic Containing Thienopyrrole-Alanine. Sci Rep. 6, 33447 (2016).
  15. Piscotta, F. J., Tharp, J. M., Liu, W. R., Link, A. J. Expanding the chemical diversity of lasso peptide MccJ25 with genetically encoded noncanonical amino acids. Chem Commun (Camb). 51 (2), 409-412 (2015).
  16. Hartman, M. C. T., Josephson, K., Lin, C. -W., Szostak, J. W. An expanded set of amino acid analogs for the ribosomal translation of unnatural peptides. PLoS One. 2 (10), 972 (2007).
  17. Johnson, J. A., Lu, Y. Y., Van Deventer, J. A., Tirrell, D. A. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids into proteins: recent developments and applications. Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 774-780 (2010).
  18. Ibba, M., Söll, D. Aminoacyl-tRNAs: setting the limits of the genetic code. Genes Dev. 18 (7), 731-738 (2004).
  19. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
  20. Budisa, N., Steipe, B., Demange, P., Eckerskorn, C., Kellermann, J., Huber, R. High-level biosynthetic substitution of methionine in proteins by its analogs 2-aminohexanoic acid, selenomethionine, telluromethionine and ethionine in Escherichia coli. Eur J Biochem. 230 (2), 788-796 (1995).
  21. Rink, R., et al. Dissection and modulation of the four distinct activities of nisin by mutagenesis of rings A and B and by C-terminal truncation. Appl Environ Microbiol. 73 (18), 5809-5816 (2007).
  22. Kubyshkin, V., Durkin, P., Budisa, N. Energetic contribution to both acidity and conformational stability in peptide models. New J Chem. 40 (6), 5209-5220 (2016).
  23. Molloy, E. M., Field, D., O'Connor, P. M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Saturation mutagenesis of lysine 12 leads to the identification of derivatives of nisin A with enhanced antimicrobial activity. PLoS One. 8 (3), 58530 (2013).
  24. Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
  25. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  26. Anderson, J. C., Wu, N., Santoro, S. W., Lakshman, V., King, D. S., Schultz, P. G. An expanded genetic code with a functional quadruplet codon. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (20), 7566-7571 (2004).
  27. Zambaldo, C., Luo, X., Mehta, A. P., Schultz, P. G. Recombinant macrocyclic lanthipeptides incorporating non-canonical amino acids. J Am Chem Soc. 139 (34), 11646-11649 (2017).
  28. Al Toma, R. S., et al. Site-directed and global incorporation of orthogonal and isostructural noncanonical amino acids into the ribosomal lasso peptide capistruin. Chembiochem. 16 (3), 503-509 (2015).
  29. Chatterjee, A., Xiao, H., Schultz, P. G. Evolution of multiple, mutually orthogonal prolyl-tRNA synthetase/tRNA pairs for unnatural amino acid mutagenesis in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (37), 14841-14846 (2012).
  30. Budisa, N., Pal, P. P. Designing novel spectral classes of proteins with a tryptophan-expanded genetic code. Biol Chem. 385 (10), 893-904 (2004).
  31. Voller, J. -s, Thi To, T. M., Biava, H., Koksch, B., Budisa, N. Global substitution of hemeproteins with noncanonical amino acids in Escherichia coli with intact cofactor maturation machinery. Enzyme Microb Technol. 106, 55-59 (2017).
  32. Moghal, A., Hwang, L., Faull, K., Ibba, M. Multiple Quality Control Pathways Limit Non-protein Amino Acid Use by Yeast Cytoplasmic Phenylalanyl-tRNA Synthetase. J Biol Chem. 291 (30), 15796-15805 (2016).
  33. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  34. Engelke, G., Gutowski-Eckel, Z., Hammelmann, M., Entian, K. D. Biosynthesis of the lantibiotic nisin: genomic organization and membrane localization of the NisB protein. Appl Environ Microbiol. 58 (11), 3730-3743 (1992).
  35. Baumann, T., Nickling, J. H., Bartholomae, M., Buivydas, A., Kuipers, O. P., Budisa, N. Prospects of In vivo Incorporation of Non-canonical Amino Acids for the Chemical Diversification of Antimicrobial Peptides. Front Microbiol. 8, 124 (2017).
  36. Plat, A., Kluskens, L. D., Kuipers, A., Rink, R., Moll, G. N. Requirements of the engineered leader peptide of nisin for inducing modification, export, and cleavage. Appl Environ Microbiol. 77 (2), 604-611 (2011).
  37. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. J Vis Exp. , (2017).
  38. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. J Vis Exp. , (2017).
  39. Shi, Y., Yang, X., Garg, N., van der Donk, W. A. Production of lantipeptides in Escherichia coli. J Am Chem Soc. 133 (8), 2338-2341 (2011).
  40. Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. Nat Biotechnol. 6 (11), 1321-1325 (1988).
  41. Zhang, Z., Marshall, A. G. A universal algorithm for fast and automated charge state deconvolution of electrospray mass-to-charge ratio spectra. J Am Soc Mass Spectrom. 9 (3), 225-233 (1998).
  42. JoVE Science Education Database. High-Performance Liquid Chromatography (HPLC). J Vis Exp. , (2017).
  43. JoVE Science Education Database. Dialysis: Diffusion Based Separation. J Vis Exp. , (2017).
  44. Khusainov, R., Kuipers, O. P. The presence of modifiable residues in the core peptide part of precursor nisin is not crucial for precursor nisin interactions with NisB- and NisC. PLoS One. 8 (9), 74890 (2013).
  45. Terzaghi, B. E., Sandine, W. E. Improved medium for lactic streptococci and their bacteriophages. Appl Microbiol. 29 (6), 807-813 (1975).
  46. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  47. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
  48. van Hest, J. C. M., Tirrell, D. A. Efficient introduction of alkene functionality into proteins in vivo. Febs Lett. 428 (1-2), 68-70 (1998).
  49. Prince, A., et al. Lipid-II Independent Antimicrobial Mechanism of Nisin Depends On Its Crowding And Degree Of Oligomerization. Sci Rep. 6 (1), 37908 (2016).
  50. Zhou, L., et al. Incorporation of tryptophan analogues into the lantibiotic nisin. Amino Acids. 48 (5), 1309-1318 (2016).
  51. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Curr Protoc Chem Biol. 3 (4), 153-162 (2011).
  52. Abts, A., et al. Easy and rapid purification of highly active nisin. Int J Pept. 2011, 175145 (2011).
  53. Francklyn, C. S., First, E. A., Perona, J. J., Hou, Y. -M. Methods for kinetic and thermodynamic analysis of aminoacyl-tRNA synthetases. Methods. 44 (2), 100-118 (2008).
  54. van Heel, A. J., et al. Production and Modification of Five Novel Lantibiotics Using the Promiscuous Nisin Modification Machinery. ACS Synth Biol. 5 (10), 1146-1154 (2016).
  55. Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 135 Nisin RiPPs מגברים ncAAs lantibiotic פרולין אנלוגיות הרומן אנטיביוטיקה פעילות assay חיידקים גראם חיוביים ייצור רקומביננטי שינוי posttranslational ביולוגיה סינתטית
פפטידים מיקרוביאלית המיוצר על ידי ההתאגדות הלחץ הסלקטיבי של חומצות אמינו קאנונית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nickling, J. H., Baumann, T.,… More

Nickling, J. H., Baumann, T., Schmitt, F. J., Bartholomae, M., Kuipers, O. P., Friedrich, T., Budisa, N. Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids. J. Vis. Exp. (135), e57551, doi:10.3791/57551 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter