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Bioengineering

गैर-विहित अमीनो एसिड के चुनिंदा दबाव निगमन द्वारा उत्पादित रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57551
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 3, 2, 1
1Department of Biocatalysis, Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin, 2Department of Bioenergetics, Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin, 3Molecular Genetics Group, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, Department of Molecular Genetics, University of Groningen
* These authors contributed equally

Summary

प्रोटोकॉल ई कोलाई-गैर विहित एमिनो एसिड के lactococcal रोगाणुरोधी पेप्टाइड निस्ां में (ncaas) के चयनात्मक दबाव शामिल आधारित प्रस्तुत करता है । इसके गुणों को परिभाषित विकास मीडिया में वांछित ncaas के साथ प्रतिस्थापन के माध्यम से रिकॉमबिनेंट अभिव्यक्ति के दौरान बदला जा सकता है । विकास निषेध परख और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रतिचित्रित कर रहे है में परिवर्तन के परिणामस्वरूप ।

Abstract

प्रकृति की संभावनाओं की एक किस्म है व्यक्तिगत एमिनो एसिड इमारत ब्लॉकों के अनुक्रम को संशोधित करके नए प्रोटीन कार्य बनाने के लिए । हालांकि, सभी रूपों 20 विहित अमीनो एसिड (cAAs) पर आधारित हैं । एक तरह से polypeptides में अतिरिक्त भौतिक गुण परिचय के रूप में, गैर-विहित अमीनो एसिड का शामिल (ncaas) तेजी से प्रोटीन इंजीनियरिंग में प्रयोग किया जाता है । उनके अपेक्षाकृत कम लंबाई के कारण, ribosomally के संशोधन संश्लेषित और पोस्ट-अनुवाद द्वारा संशोधित पेप्टाइड्स ncaas द्वारा विशेष रूप से आकर्षक है । नई कार्यक्षमताओं और रासायनिक संभालती व्यक्तिगत अवशेषों के विशिष्ट संशोधनों के द्वारा उत्पंन किया जा सकता है । चयनात्मक दबाव निगमन (SPI) विधि auxotrophic मेजबान उपभेदों है कि रासायनिक परिभाषित विकास मीडिया में एक आवश्यक अमीनो एसिड से वंचित कर रहे है का उपयोग करता है । कई संरचनात्मक और रासायनिक समान एमिनो एसिड सादृश्य तो इसी aminoacyl-tRNA synthetase द्वारा सक्रिय किया जा सकता है और अवशेषों-विशिष्ट cAA (ओं) → ncAA (एस) लक्ष्य पेप्टाइड या प्रोटीन अनुक्रम में प्रतिस्थापन प्रदान करते हैं । हालांकि, SPI विधि के संदर्भ में, ncaas भी रिकॉमबिनेंट जीन अभिव्यक्ति के चरण के दौरान मेजबान proteome में शामिल किए गए हैं, सेल के संसाधनों का बहुमत लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति के लिए आवंटित कर रहे हैं । यह सक्षम बनाता है कुशल अवशेषों के ncaas के विशिष्ट शामिल करने अक्सर संशोधित लक्ष्य की उच्च मात्रा के साथ साथ । प्रस्तुत कार्य में रोगाणुरोधी पेप्टाइड निस्ां, एक स्वाभाविक रूप से Lactococcus लैकि्टसद्वारा उत्पादित lantibiotic में छह लाइन सादृश्य के vivo में शामिल है । निस्ां के रोगाणुरोधी गुणों को बदला जा सकता है और आगे परिभाषित विकास मीडिया में auxotrophic ई कोलाई उपभेदों में अपनी किण्वन और अभिव्यक्ति के दौरान विस्तार किया । इस प्रकार, अवशेषों के प्रभाव-ncaas के साथ cAAs के विशिष्ट प्रतिस्थापन रोगाणुरोधी गतिविधि और विशिष्टता में परिवर्तन प्रदान कर सकते हैं । रोगाणुरोधी गतिविधि परख और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी एक ग्राम पॉजिटिव Lactococcus लैकि्टस संकेतक तनाव के विकास के अवरोध के लिए नए निस्ां वेरिएंट का परीक्षण करने के लिए उपयोग किया जाता है । मास स्पेक्ट्रोस्कोपी को सक्रिय निस्ां वेरिएंट में ncAA शामिल करने की पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

Introduction

बीसवीं सदी में एंटीबायोटिक दवाओं की खोज और रोगजनक सूक्ष्मजीवों के खिलाफ नई रोगाणुरोधी यौगिकों के समानांतर विकास बैक्टीरियल संक्रमण के लक्षित उपचार सक्षम होना चाहिए । हालांकि, बहुऔषध के उद्भव के कारण प्रतिरोधी रोगजनकों जैसे methicillin प्रतिरोधी Staphylococcusaureus (MRSA), vancomycin प्रतिरोधी enterococci (VRE), एमडीआर (बहुऔषध-प्रतिरोधी) साल्मोनेला typhimurium फेज प्रकार 10 (DT10 ), और Klebsiella निमोनिया, यह तत्काल नए रोगाणुरोधी एजेंटों1उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है । रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स (AMPs) बहुमुखी, अक्सर अत्यधिक विशिष्ट यौगिकों कि उनके भौतिक गुण, लचीलापन, आकार, hydrophobicity, और कार्रवाई के मोड2के लिए नई दवाओं धन्यवाद के विकास के लिए उंमीदवारों का वादा कर रहे हैं । AMPs आम तौर पर 7-100 अमीनो एसिड से मिलकर छोटे पेप्टाइड्स हैं. अक्सर, वे एक cationic सकारात्मक आरोप लगाया arginine और lysine अवशेषों में अमीर संरचना है, जो लक्षित माइक्रोबियल कोशिका झिल्ली है, जो विपरीत है के साथ बातचीत3। AMPs के एक विशेष उपसमूह ribosomally संश्लेषित और posttranslationally संशोधित पेप्टाइड्स (फट)4रहे हैं । इन कवक के राज्य और बैक्टीरिया के डोमेन से कई जीवों द्वारा उत्पादित कर रहे हैं । सबसे अच्छा ज्ञात है और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया फट में से एक निस्ां है, स्वाभाविक रूप से लैक्टिक एसिड जीवाणु Lactococcus लैकि्टस (एल. लैकि्टस) द्वारा उत्पादित । ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया के एक पैनल के खिलाफ सक्रिय, निस्ां से अधिक ५० अपनी रोगाणुरोधी संपत्तियों के कारण और लक्षित माइक्रोबियल उपभेदों में विकसित प्रतिरोध के अभाव के लिए खाद्य उद्योग में एक परिरक्षक के रूप में इस्तेमाल किया गया है5। अध्ययनों से पता चला है कि निस्ां स्थिर और उत्पन्न करता है, जीवाणु कोशिका झिल्ली में pores, दोनों ग्राम पॉजिटिव और ग्राम-नकारात्मक रोगजनकों6के खिलाफ गतिविधि रोगाणुरोधी करने के लिए अग्रणी । लिपिड द्वितीय के लिए बाध्यकारी द्वारा, बैक्टीरियल कोशिका दीवार संश्लेषण7हिचकती है. निस्ां एक रैखिक प्रणेता पेप्टाइड, जो एक नेता और एक कोर पेप्टाइड क्षेत्र (चित्रा 1) से बना है के रूप में निसा द्वारा इनकोडिंग है । राइबोसोमल संश्लेषण के बाद prenisin को सर्वप्रथम dehydratase NisB द्वारा संशोधित किया जाता है । यहां, serine और threonine के अवशेषों को पेप्टाइड कोर क्षेत्र में dehydroalanine (Dha) और dehydrobutyrine (Dhb)8के लिए निर्जलित रहे हैं । बाद में, निर्जलित अवशेषों cysteine के साथ युग्मित कर रहे है lanthionine के छल्ले फार्म (इसलिए नाम "lantibiotic" lanthionine अंगूठी युक्त एंटीबायोटिक दवाओं के लिए) एक एंजाइम-catalyzed माइकल इसके अलावा द्वारा । यह posttranslational संशोधन (PTM) cyclase NisC द्वारा catalyzed है । एल लैकि्टसमें, संशोधित prenisin फिर ट्रांसपोर्टर NisT द्वारा सेल से बाहर पहुंचाया जाता है, और नेता पेप्टाइड proteinase NisP द्वारा परिपक्व और सक्रिय निस्ां फार्म9जारी करने के लिए सट जाता है । जिंमेदार नेता peptidase NisP एक उच्च सब्सट्रेट विशिष्टता है, क्योंकि यह केवल संशोधित निस्ां कुशलता10प्रक्रियाओं ।

सामांय में, PTM एंजाइमों की कार्रवाई से सक्रिय फट परिणाम (उदाहरण के लिए NisBC), जो काफी कम पेप्टाइड्स के रासायनिक अंतरिक्ष में वृद्धि, जैसे, के माध्यम से acetylation, glycosylation, मिथाइल या फास्फारिलीकरण. जटिलता का यह स्तर आगे ncaas के प्रत्यक्ष निगमन द्वारा विस्तारित किया जा सकता है । जबकि अक्सर संभव है, AMPs के रासायनिक संश्लेषण उनके संरचनात्मक जटिलता के कारण बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक चुनौती है । उदाहरण के लिए, ७१ प्रतिक्रिया चरणों में lantibiotic lactosin एस के कुल रासायनिक संश्लेषण 10% की एक अंतिम उपज के साथ प्राप्त किया गया था और केवल ०.००३%11,12की एक कच्चे तेल की उपज के साथ कि निस्ां की । इसलिए, जैविक उत्पादन एक व्यवहार्य विकल्प प्रदान करता है, सही stereocenters और उच्च उत्पाद एकाग्रता की पीढ़ी के कारण ।

आज तक, १५० से अधिक ncaas, जैसे, कार्यात्मक फ्लोरीन या azides युक्त समूहों, रिकॉमबिनेंट प्रोटीन में शामिल किया गया है, और ncAA के कई उदाहरण संशोधित AMPs13,14सूचित किया गया है, 15,16. ncaas के परिचय के साथ, उपंयास भौतिक गुण पारंपरिक mutagenesis की तुलना में उत्पंन किया जा सकता है । मौजूदा पेप्टाइड्स की विविधता बढ़ सकता है, संभवतः उपंयास एंटीबायोटिक दवाओं के लिए अग्रणी ।

रिकॉमबिनेंट पेप्टाइड्स में ncaas के शामिल करने के लिए एक विधि चयनात्मक दबाव शामिल है (SPI) auxotrophic जीवाणु उपभेदों के उपयोग के आधार पर17. इन उपभेदों ncAA के इसी cAA अनुरूप synthesizing के लिए सक्षम नहीं हैं । पद्धति अक्सर मनाया आराम सब्सट्रेट विशिष्टता, कई प्राकृतिक aminoacyl की एक विशेषता का उपयोग करता है-tRNA synthetases (aaRSs)18। उनके प्राकृतिक cAA सब्सट्रेट के अलावा, इन एंजाइमों अक्सर पहचान करने के लिए सक्षम हैं और वांछित ncAA को सक्रिय करने और अपने cognate tRNA (ओं) पर इसे चार्ज करने के लिए. यह एक अवशेष में लक्ष्य जीन उत्पाद में ncAA के राइबोसोमल को शामिल करने की ओर जाता है-विशिष्ट तरीके से (यानी, cAA → ncaa प्रतिस्थापन) । यह निश्चित रूप से ही संभव है जब वांछित ncAA संरचनात्मक और रासायनिक विहित अमीनो एसिड के समान है और कोशिका शरीर क्रिया विज्ञान द्वारा सहन, अनुवाद मशीनरी और लक्ष्य पेप्टाइड या प्रोटीन अनुक्रम । एक विशेष प्रायोगिक सेटअप में, auxotrophic मेजबान कोशिकाओं को परिभाषित मूल एमिनो एसिड की एक सीमित एकाग्रता के साथ आपूर्ति के लिए प्रतिस्थापित किया जा माध्यम में संस्कृति रहे हैं । सेलुलर विकास या cAA द्वारा विनिमय-मुक्त माध्यम cAA की intracellular घट की ओर जाता है । अगले कदम में, ncAA जोड़ा और लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति प्रेरित है । अनिवार्य रूप से, ncaas अब भी मेजबान सेल में कई अंय प्रोटीन में लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति के इस चरण के दौरान शामिल हैं । बहरहाल, SPI सेटअप के विषाक्तता के बाद से एक निंन स्तर पर रखा है ई कोलाई (ई. कोलाई) तनाव एक प्लाज्मिड के साथ एक मजबूत प्रमोटर के नियंत्रण में लक्ष्य जीन ले जाने के साथ बदल गया है (सामान्यतः अत्यधिक प्रतिस्पर्धी T7 प्रवर्तक/ आरएनए पोलीमरेज़ सिस्टम)19. प्रेरण के तुरंत बाद (आमतौर पर जब cAA समाप्त हो जाता है), मेजबान कोशिकाओं के विकास के लिए संघर्ष और उनके cytoplasmic एंजाइमी मशीनरी मुख्य रूप से प्लाज्मिड की अभिव्यक्ति के लिए उपयोग किया जाता है-लक्ष्य जीन आधारित है । साइट निर्देशित mutagenesis को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है साइट (ओं) के अवशेषों का लक्ष्य जीन में विशिष्ट ncAA अधिष्ठापन20।

ncaas के शामिल करने के लिए एक मॉडल पेप्टाइड के रूप में, pentacyclic AMP निस्ां एक चुना गया था. यह ३४ अमीनो एसिड लंबे समय है और केवल कोर पेप्टाइड अनुक्रम में एक एकल लाइन अवशेष है (चित्र 1) । subtilisin में के रूप में, ericin ए और एस, और epidermin के रूप में अच्छी तरह के रूप में निस्ां जेड और निस्ां क्ष में, संरक्षण की रेखा के लिए गतिविधि के लिए आवश्यक लगता है9,21। cAA peptidyl-prolyl रोटेशन और माध्यमिक संरचना स्थिरीकरण के बीच में एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । इसकी ओर श्रृंखला की अंगूठी अनुरूपता (exo/इंडो पक) के बीच बांड के एक ऊष्मा स्थिरीकरण के लिए जिंमेदार हैं । लक्षित रासायनिक संशोधनों (जैसे hydroxylations, fluorinations, मिथाइल) prolyl पक के रूप में अक्सर गंभीर तह स्थिरता, पाड़ कठोरता और कई जैविक संरचनाओं के कार्य22को प्रभावित करते हैं । इस प्रकार, यह उंमीद है कि समर्थक → रूपरेखा अनुरूप प्रतिस्थापन राज्यसत्ता अंगूठी बी, निस्ां की दूसरी अंगूठी, उपंयास और असामांय गुणों के साथ होगा प्रशंसनीय है ।

यहां, एक लाइन auxotrophic ई. कोलाई तनाव रिकॉमबिनेंट निस्ां उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया गया था । इस पेप्टाइड जीन निसा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संशोधन एंजाइम जीन nisBCकी अभिव्यक्ति की आवश्यकता है । आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग पेप्टाइड उत्पाद एक N-टर्मिनली अपने-टैग अपनत्व क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से शुद्धि के लिए नेता किया जाता है । गतिविधि निर्धारण के लिए, एल लैकि्टस व्यक्त और स्रावी NisPT ई. कोलाई सेल lysates या शुद्ध पेप्टाइड नमूनों (चित्रा 1) से रिकॉमबिनेंट निस्ां वेरिएंट को सक्रिय करने के लिए प्रयोग किया जाता है । परिपक्व AMP NisP द्वारा नेता के क्लीवेज के बाद जारी की है. इस आगर प्रसार विधि में, AMP नमूना ठोस विकास माध्यम में फैलाना और ग्राम पॉजिटिव सूक्ष्मजीवों के विकास को बाधित कर सकते हैं । गर्मी के बाद, यह विकास अवरोध प्रभामंडल द्वारा नेत्रहीन मनाया जा सकता है । एक संकेतक के रूप में एल लैकि्टस के अलावा, संशोधित निस्ां वेरिएंट Enterococcus faecalis, बैसिलस cereus, Staphylococcus aureus, और लैक्टोबैसिलस johnsonii के खिलाफ रोगाणुरोधी गतिविधि दिखाया 21,23.

एक वैकल्पिक और प्रयोगात्मक अलग विधि फट में ncaas शामिल करने के लिए रोक codon दमन (SCS)24है । इस के लिए, एक ओर्थोगोनल tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) जोड़ी इसी ncAA के लिए आवश्यक है । आदर्श रूप में, इन सभी तीन घटकों bioorthogonal हैं, यानी, वे अंतर्जात tRNAs और aaRSs के साथ बातचीत नहीं करते । एक ncAA-विशिष्ट aaRS एंजाइम सक्रिय साइट और उत्परिवर्ती synthetases25के आनुवंशिक पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के संशोधन के द्वारा उत्पंन किया जा सकता है । इसके अलावा, एक ncAA का परिचय एक codon जो और पुनः असाइन किया गया है जो cAA के लिए सांकेतिक शब्दों में बदलना नहीं है की आवश्यकता है । आमतौर पर, एंबर stop codon24,26का प्रयोग किया जाता है ।

हाल ही में, SPI α के शामिल करने के लिए स्थापित किया गया था-chloroacetamide युक्त और क्लिक करें-रसायन विज्ञान-निसा27में संगत ncaa. उदाहरण के लिए, Nε-alloc-lysine साइट के साथ कमंद पेप्टाइड captistruin में शामिल किया गया था-विशिष्ट (SCS) और अवशेषों-विशिष्ट (SPI) निगमन तरीकों और बाद में ruthenium द्वारा इन विट्रो में संशोधित-catalyzed विपयर्य28 . SPI की तुलना में, SCS विधि और अधिक जटिल है के बाद से एक ओर्थोगोनल tRNA/aaRS जोड़ी को सह व्यक्त किया है । तारीख करने के लिए, ओ-लाइन शामिल करने के लिए जोड़े को विकसित किया गया है29, लेकिन हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, रेखा अनुरूप शामिल करने का कोई उदाहरण नहीं बताया गया है ।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि नहीं सभी ncaas SPI पद्धति का उपयोग कर शामिल किया जा सकता है । सबसे पहले, कोशिका द्रव्य में ncaas के अधिक परिवहन प्रोटीन है कि cytoplasmic झिल्ली, जो ग्राम के लिए भीतरी झिल्ली है में एंबेडेड है की एक भीड़ द्वारा विनियमित है- ई.कोलाई जैसे नकारात्मक जीवाणुओं । आम तौर पर, ई. कोलाई पक्ष जंजीरों के साथ सेल में एमिनो एसिड सादृश्य की एक विस्तृत श्रृंखला के परिवहन के लिए सक्षम है संरचनात्मक और रासायनिक विहित अमीनो एसिड के समान । दूसरा, कई रासायनिक प्रतिक्रियाशील या अस्थिर ncaas सेलुलर विकास की दिशा में एक अवरोधक के रूप में कार्य हो सकता है, के रूप में वे मेजबान सेल के चयापचय और फिजियोलॉजी30के लिए विषाक्त कर रहे हैं । इस प्रकार, और ncAA के उत्पादन मेजबान के लिए विषाक्तता पहले से परीक्षण किया जाना चाहिए । एक पक्ष प्रभाव के रूप में PTM मशीनरी की निष्क्रियता से बचने के लिए, जिंमेदार जीन के एक कड़ाई से नियंत्रित अभिव्यक्ति सेटअप को संशोधन एंजाइमों में प्राकृतिक एमिनो एसिड शामिल किया जा सकता है (जैसे, nisBC) और ncAA लक्ष्य जीन में ( उदा., निसा). यह दो अलग प्रमोटरों का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है और लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति की प्रेरण, के रूप में विशेष रूप से डिजाइन SPI प्रोटोकॉल31में प्रदर्शन किया । के रूप में ऊपर उल्लिखित, SPI विधि aaRS के आराम सब्सट्रेट विशिष्टता पर निर्भर करता है, जो ncAA सक्रियण और cognate tRNA चार्ज करने के लिए अनुमति देता है । बाद में, tRNA बांड गठन और लक्ष्य (पाली) पेप्टाइड की तह के बीच से पीछा ribosome के लिए दिया जाता है । इस प्रक्रिया में, ठीक करना और संपादन तंत्र३२प्रासंगिक हो सकता है । इन कारणों के लिए, यह बहुत महत्व का है कि संरचनात्मक और रासायनिक cAA के समान है एक लक्ष्य ncAA है । अंय महत्वपूर्ण अंक पर्याप्त स्थिरता रहे है (दोनों विकास मीडिया में और सेलुलर चयापचय से अवगत कराया) और ncAA के घुलनशीलता । इसके अतिरिक्त, यह या तो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध होना चाहिए या रासायनिक संश्लेषित किया जा करने के लिए आसान है ।

यहां, हम SPI के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन, अवशेषों-रिकॉमबिनेंट फट में ncaas के विशिष्ट शामिल करने की अनुमति । विशेष रूप से, विभिंन रूपरेखा सादृश्य रोगाणुरोधी पेप्टाइड निस्ां एक मेजबान जीव के रूप में ई. कोलाई का उपयोग कर में शामिल कर रहे हैं । मास स्पेक्ट्रोमेट्री अमीनो एसिड प्रतिस्थापन और पेप्टाइड उत्पादों को सत्यापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है विकास निषेध परख और सूक्ष्म जीवाणु संकेतक उपभेदों का उपयोग कर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर जैविक गतिविधि के लिए विश्लेषण कर रहे हैं ।

परिभाषित ncaas के साथ सफल रिकॉमबिनेंट निस्ां अभिव्यक्ति के लिए बुनियादी आवश्यकता एक उपयुक्त लाइन auxotrophic ई. कोलाई तनाव की आवश्यकता है । इस auxotrophy के लिए, proA बेकार हो गया है, उदाहरण के लिए जीनोमिक नॉकआउट द्वारा हासिल की । कोशिकाओं को पूरी तरह से intracellular प्रो के संश्लेषण से वंचित (यानी, proABCके विलोपन) के लिए संभावना के बिना संस्करण स्थिर auxotrophs हैं. व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जीन नॉकआउट तरीके फेज transduction या Datsenko & Wanner३३के अनुसार एकल जीन नॉकआउट कर रहे हैं । इसके अलावा, proA पीटकर उपभेदों ऐसे Addgene, CGSC या कईयो संग्रह के रूप में सार्वजनिक खजाने से प्राप्त किया जा सकता है । के बाद से रिकॉमबिनेंट nisABC अभिव्यक्ति यहां दिखाया T7 प्रवर्तकों के उपयोग पर निर्भर करता है, अभिव्यक्ति मेजबान तनाव को T7 आरएनए पोलीमरेज़ के लिए एक inducible जीन ले गया है । यह मेजबान जीनोम में λDE3 prophage का परिचय द्वारा पूरा किया जा सकता है, उदाहरण के लिए वाणिज्यिक किट का उपयोग कर । वैकल्पिक रूप से, उपभेदों जैसे BL21 (DE3) auxotrophic बनाया जा सकता है के रूप में ऊपर वर्णित है ।

Protocol

1. अभिव्यक्ति वैक्टर और एक auxotrophic उत्पादन तनाव के परिवर्तन की क्लोनिंग

इस के साथ साथ, निस्ां के लिए जीन का संश्लेषण, अर्थात् nisABC, एल लैकि्टस से लिया गया है और T7 में स्थानांतरित-आधारित प्लाज्मिड अभिव्यक्ति वैक्टर. पूर्ण डीएनए nisABC के अनुक्रम GenBank प्रविष्टि X68307३४में पाया जा सकता है । प्रणेता पेप्टाइड (निसा) के लिए जीन एक पीईटी-3 ए वेक्टर पर रखा गया है जो एम्पीसिलीन प्रतिरोध प्रदान करता है । dehydratase (nisB) और cyclase (nisC) के लिए जीन वेक्टर pRSFDuet-1 पर रखा गया है, जैसा कि पहले३५बताया गया है, जो कनमीसिन प्रतिरोध प्रदान करते हैं ।

नोट: निसाके लिए, पिछले चार अमीनो एसिड (नेता अनुक्रम के ASPR) के codons के लिए सांकेतिक शब्दों में बदलना करने के लिए VSLR३६ के लिए मुख्य पेप्टाइड में एक साथ अवशेषों को रेंडर करने के लिए और अद्वितीय NisP द्वारा उचित पेप्टाइड प्रसंस्करण सुनिश्चित करने के लिए रूपांतरित किया गया । N-टर्मिनस पर, एक हेक्सा-histidine टैग के लिए linker अवशेषों द्वारा पार्श्व शुद्धि प्रयोजनों के लिए जोड़ा गया था ( चित्र 1देखें) ।

Figure 1
चित्र 1 . ई. कोलाई में निसा के PTM और साथ ही नेता दरार के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व एल लैकि्टस संकेतक तनाव के बाद एक गतिविधि परख में । पहले चरण में, निष्क्रिय रैखिक prenisin (एक नेता की रचना की और एक कोर पेप्टाइड क्षेत्र की स्थिति 9 पर एक अद्वितीय (गुलाबी) रेखा से युक्त) निसा द्वारा इनकोडिंग ribosomally संश्लेषित है । अगले, prenisin है posttranslationally serine और threonine अवशेषों की निर्जलीकरण द्वारा संशोधित dehydroalanine (Dha) और dehydrobutyrine के रूप में Dhb (catalyzed) NisB द्वारा । cyclase NisC Dha या sulfhydryl के साथ cysteine Dhb समूहों के माइकल इसके अलावा द्वारा thioether पुलों रूपों । निष्क्रिय संशोधित prenisin ई. कोलाई से शुद्ध है और रोगाणुरोधी गतिविधि के लिए परीक्षण किया है । इधर, इसे ग्राम पॉजिटिव एल लैकि्टस संकेतक तनाव की कोशिका में पहुँचाया जाता है. नेता NisP को छेड़ने से सट जाता है (जैसा कि एक arrowhead ने दर्शाया है) पूरी तरह सक्रिय निस्ां जारी करने के लिए । यह भी trypsin (*) के साथ उपचार द्वारा इन विट्रो में हटाया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. का प्रयोग करें मानक हीट शॉक प्रोटोकॉल३७ या electroporation३८ auxotrophic ई. कोलाई तनाव को बदलने के लिए (ऊपर देखें) के साथ plasmids पीईटी-3 ए निसा(VSLR) और pRSFDuet-1 nisBC।
  2. पिपेट 25-100 µ एम्पीसिलीन, कनमीसिन और 1% (डब्ल्यू/वी) ग्लूकोज युक्त प्लेटों पर रूपांतरित सेल निलंबन के एल । प्लेटों पर समान रूप से समाधान फैलाने के लिए एक प्लेट स्प्रर या कांच के मोतियों का प्रयोग करें ।
  3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर मशीन प्लेटें ।
  4. निंनलिखित दोपहर, एक कॉलोनी का उपयोग करने के लिए inoculate 10 मिलीलीटर पौंड एम्पीसिलीन युक्त मध्यम, कनमीसिन और एक ५० मिलीलीटर कुप्पी में 1% (डब्ल्यू/
  5. हिला संस्कृति रातोंरात (12-16 ज) ३७ डिग्री सेल्सियस और २०० rpm पर ।
  6. ले २५० µ l बाँझ ८०% ग्लिसरॉल और ५५० µ एल संस्कृति, एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में अच्छी तरह से मिलाएं और ८० डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए सेल शेयर के रूप में स्टोर ।

2. नई न्यूनतम मध्यम (NMM) तैयारी

नोट: यह प्रोटोकॉल एक रासायनिक परिभाषित तरल जीवाणु विकास माध्यम के रूप में NMM20 का उपयोग करता है । साथ ही तैयारी के आदेश का कड़ाई से पालन करने की भी सलाह दी है । अंयथा, वर्षण हो सकता है । एमिनो एसिड के लिए सामग्री तालिका में सूचीबद्ध उन से भिंन रूपों (जैसे, hydrochlorides), घुलनशीलता की जांच करें । NMM19 19 अमीनो एसिड होता है के अलावा cAA के लिए प्रतिस्थापित किया जा करने के लिए (यहां, पंक्ति) ncAA एनालॉग द्वारा । अंतिम संघटक सांद्रता के लिए 1 तालिका देखें । जीवाणु तनाव के आधार पर उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया, बायोटिन और thiamine वैकल्पिक हो सकता है ।

  1. एमिनो एसिड मिश्रण की तैयारी
    1. भंग ०.५ जी Phe, टीआरपी और १०० मिलीलीटर ddH में Tyr2ओ विघटन तक केंद्रित एचसीएल की कुछ बूंदों के अलावा के साथ ।
    2. शेष 16 अमीनो एसिड में से प्रत्येक के ०.५ ग्राम बाहर वजन । 1 मीटर KH2पीओ4 और ४८ एमएल के 1 एम K2HPO4के 22 एमएल के साथ मिक्स । ddH2O में जोड़ें ~ ८०० mL । हलचल जब तक समाधान स्पष्ट हो जाता है ।
    3. भंग Phe, टीआरपी और Tyr जोड़ें और समाधान की मात्रा 1 एल के लिए ddH2O के साथ समायोजित करें ।
    4. एक बोतल शीर्ष फिल्टर इकाई के साथ वैक्यूम निस्पंदन द्वारा एमिनो एसिड मिश्रण निष्फल ।
  2. NMM19 के लिए स्टॉक समाधान
    1. सबसे पहले, निंनलिखित घटकों के 1 मीटर स्टॉक समाधान तैयार: (NH4)2सू4, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4 और NaCl का 5 मीटर स्टॉक सॉल्यूशन । autoclaving द्वारा निष्फल ।
    2. D-ग्लूकोज के ५० एमएल स्टॉक्स तैयार करें (1 M), CaCl2 (1 g/l), FeCl2 (1 g/l), thiamine (10 ग्राम/एल), बायोटिन (10 g/l) और ट्रेस तत्वों (CuSO4, ZnCl2, MnCl2, (NH4)2मू4; 1 mg/l ). एक सिरिंज फिल्टर के साथ निस्पंदन द्वारा प्रत्येक निष्फल.
  3. NMM19 तयारी
    1. मिक्स सभी स्टॉक समाधान ७.५ mM (NH4) के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए2तो4, १.७ मिमी NaCl, 22 मिमी KH2पीओ4, ५० मिमी कश्मीर2HPO4, 1 मिमी MgSO4 और 20 मिमी डी-ग्लूकोज, ५० मिलीग्राम/एल एमिनो एसिड मिश्रण, 1 µ g/l CaCl2, 1 µ g/l FeCl2, 10 µ g/l thiamine, 10 mg/l बायोटिन और ०.०१ µ g/एमएल ट्रेस तत्वों ।

3. SPI द्वारा रिकॉमबिनेंट निस्ां की रूपरेखा के साथ अभिव्यक्ति

इस खंड में, रिकॉमबिनेंट की अभिव्यक्ति (यहां: निसा) और PTM जीन (यहां: nisBC) का प्रदर्शन किया जाता है । सबसे पहले, कोशिकाओं सभी cAAs की उपस्थिति में बड़े हो रहे हैं, के बाद से पौंड जटिल माध्यम का उपयोग किया जाता है । ग्लूकोज पृष्ठभूमि स्तर पर लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति दबाने के लिए जोड़ा गया है, जो अंयथा जंगली प्रकार पेप्टाइड के उत्पादन के लिए नेतृत्व कर सकते है (यहां: निस्ां) प्रवर्तकों के leakiness के कारण । केवल लक्ष्य cAA के बाद (यहां: रूपरेखा) समाप्त हो गया है, ncAA जोड़ा और लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति रासायनिक परिभाषित माध्यम में प्रेरित है । तरल संस्कृतियों की मशीन वातन के साथ उपयुक्त कुप्पी में प्रदर्शन किया जाना चाहिए (जैसे, २०० rpm पर एक 2 एल Erlenmeyer कुप्पी में ५०० मिलीलीटर) ।

  1. एक बाँझ पिपेट टिप का उपयोग करना, जमे हुए सेल स्टॉक या ताजा कॉलोनी से एक ताजा रातोंरात संस्कृति शुरू (चरण 1 देखें). 25 मिलीलीटर एम्पीसिलीन, कनमीसिन और 1% (डब्ल्यू/वी) ग्लूकोज और ३७ डिग्री सेल्सियस और २०० rpm पर रात भर गर्मी (12-16 ज) युक्त मध्यम का उपयोग करें ।
  2. 10 मिलीलीटर रातोंरात संस्कृति के साथ बाँझ ताजा मध्यम के 1 एल Inoculate (1% वी/) और ३७ डिग्री सेल्सियस और २०० rpm पर मशीन जब तक आयुध डिपो६०० = ०.५ ।
  3. ४,५०० x जी पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक
  4. supernatant बंद डालो और 20 मिलीलीटर NMM19 (चरण २.३ में तैयार) एंटीबायोटिक दवाओं और 1% (डब्ल्यू/वी) ग्लूकोज युक्त के साथ गोली reसस्पेंड । ४,५०० x जी पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक
  5. एक ही माध्यम के ५०० मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड और 30 डिग्री सेल्सियस और 1 एच के लिए २०० rpm पर मशीन ।
    नोट: इस कदम पर, cAA घट (यहां, रूपरेखा) जगह लेता है ।
  6. संस्कृति को बराबर भागों में विभाजित (प्रत्येक ncAA के लिए एक) । 1 मिमी isopropyl के साथ प्रत्येक संस्कृति प्रेरित β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) और आपूर्ति 1 मिमी की रेखा के अनुरूप (4एस/आर-fluoroproline, 4s/r-hydroxyproline या 4s/r-methanoproline).
    नोट: नियंत्रण के रूप में, एक संस्कृति 1 मिमी लाइन के साथ आपूर्ति की जा सकती है, जंगली प्रकार पेप्टाइड उत्पादन में जिसके परिणामस्वरूप.
  7. 28 ° c और २०० rpm पर रात भर (12-16 ज) मशीन ।
  8. ५० मिलीलीटर ट्यूबों में सेल संस्कृतियों के लिए 4 ° c में ५,००० x g पर 20 मिनट के लिए बंद supernatant और दुकान छर्रों डालना-८० ° c जब तक शुद्धि ।

4. अलगाव और उसके-टैग निस्ां अनुरूप की शुद्धि

पेप्टाइड्स guanidine हाइडरोक्लॉराइड (GuHCl)३९, एक मजबूत denaturant के साथ denaturing शर्तों के तहत शुद्ध कर रहे हैं ।

चेतावनी: GuHCl अगर निगल लिया या सांस और त्वचा और गंभीर आंख जलन का कारण बनता है हानिकारक है । आंख संरक्षण और दस्ताने पहनते हैं ।

  1. बाध्यकारी बफर के २५० मिलीलीटर तैयार (5 एम GuHCl, ३०० एमएम NaCl, 25 एमएम Tris, पीएच ७.४), वाश बफर (३०० एमएम NaCl, 25 एमएम Tris, 25 एमएम imidazole, पीएच ७.४) और रेफरेंस बफर (३०० एमएम NaCl, 25 एमएम Tris, २५० एमएम imidazole, पीएच ७.४) । इन के लिए, एक २५० मिलीलीटर की बोतल में ठोस हस्तांतरण और ddH2ओ के साथ २०० मिलीलीटर को भरने के लिए अच्छी तरह से मिश्रण और 1 मीटर NaOH या एचसीएल के साथ ७.४ के लिए पीएच समायोजित करें । फिर, ddH2O के साथ २५० मिलीलीटर तक भरें । एक बोतल शीर्ष फिल्टर इकाई का उपयोग कर सभी बफर समाधान फ़िल्टर ।
  2. सेल lysis
    यहां, एक sonicator (२०० डब्ल्यू अधिकतम उच्च आवृत्ति (HF) उत्पादन के साथ) का उपयोग किया जाता है; ध्यान दें कि कक्ष व्यवधान के लिए आवश्यक पावर सेटिंग्स अंय उपकरणों के लिए भिंन हो सकती हैं । सभी कदम बर्फ पर प्रदर्शन कर रहे हैं । वैकल्पिक रूप से, रासायनिक कोशिका lysis, एक तरल homogenizer या एक फ्रेंच प्रेस इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    1. प्रत्येक केंद्रापसारक ट्यूब (३.८ कदम से) के लिए 12 मिलीलीटर बाध्यकारी बफर जोड़ें और भंवर से reसस्पेंड ।
    2. कक्ष निलंबन में sonicator जांच की नोक जलमग्न । /5 पर 1 एस की नब्ज के साथ ४०% आयाम पर sonicator सेट 15 मिनट के लिए बंद ।
      नोट: carryover से बचने के लिए नमूनों के बीच sonicator टिप को साफ करें । sonicator जांच ७०% इथेनॉल के साथ पोंछ ।
    3. ४० मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर लीजड ड सेल सस्पेंशन के लिए १५,००० x g पर गोली सेल मलबे के लिए । supernatants एक नई प्रतिक्रिया ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
  3. अपनत्व क्रोमैटोग्राफी
    के लिए मैटीरियल धातु आयन संबध क्रोमैटोग्राफी (IMAC)४०, एक सिकुड़नेवाला पंप या एक FPLC प्रणाली एक 1 मिलीलीटर कारतूस के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है (यहां Ni-ंत् राल से भरा) । बफ़र्स की तैयारी के लिए, चरण ४.१ देखें ।
    नोट: IMAC शुद्धि के बाद से उत्पादित रिकॉमबिनेंट पेप्टाइड एक एन-टर्मिनली अपने-नेता टैग, जो नेता peptidase NisP द्वारा 6 कदम में हटा दिया जाता है, परिपक्व निस्ां जारी किया जाता है संभव है । कमरे के तापमान पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर शुद्धि प्रदर्शन । IMAC कारतूस के लिए लागू अगर प्रति मिनट 1 मिलीलीटर की एक प्रवाह दर का प्रयोग करें ।
    1. सबसे पहले, 5 कॉलम खंड (cv) के साथ कारतूस धो ddH2O संग्रहण बफ़र को निकालने के लिए ।
    2. Equilibrate बाइंडिंग बफ़र के 10 cv के साथ ।
    3. प्रक्रिया सेल lysate (चरण ४.२) एक सिरिंज फिल्टर का उपयोग कणों को हटाने के लिए, तो कारतूस के लिए लागू होते हैं ।
    4. के साथ धो 15 धोने बफर के cv के क्रम में विशिष्ट और असीम सामग्री को दूर करने के लिए ।
    5. Elute के 10 cv के साथ रेफरेंस बफर और १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में 1 एमएल अंश इकट्ठा । छोटी अवधि के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंशों (अप करने के लिए 3 दिन) या पर-20 डिग्री सेल्सियस लंबी शर्तों के लिए स्टोर ।
    6. भंडारण के लिए, ddH के 10 cv के साथ कारतूस धो2O द्वारा पीछा किया 5 20% इथेनॉल के cv ।

5. LC-ईएसआई-तोफ निस्ां के अनुरूप जन Spectrometric विश्लेषण

नोट: electrospray ionization समय-की-उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा-ईएसआई-तोफ-MS) के साथ युग्मित तरल क्रोमैटोग्राफी के लिए उदाहरण इंस्ट्रूमेंटेशन के लिए सामग्री तालिका देखें ।

  1. 15-20 µ l पेप्टाइड समाधान की HPLC पृथक्करण (चरण ४.३ में तैयार) एक C5 स्तंभ पर एक मोबाइल चरण के साथ पानी (a) और acetonitrile (B) दोनों पूरक के साथ ०.१% प्रपत्र एसिड और एक ढाल 5-80% B से अधिक 20 मिनट. मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के लिए, 5 मिनट के बाद रेफरेंस का इस्तेमाल करें ।
    नोट: पेप्टाइड सामग्री और HPLC स्तंभ के संबंध के आधार पर, नमूना वॉल्यूम और जुदाई अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है ।
  2. मापा द्रव्यमान स्पेक्ट्रा को deconvolute करने के लिए उपयुक्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें और विभिन्न पेप्टाइड चार्ज राज्यों४१की गणना करें । मनाया पेप्टाइड प्रजातियों की गणना जंगली प्रकार के बड़े पैमाने पर cAA → ncAA प्रतिस्थापन द्वारा बदल मास की तुलना करें । ध्यान रखें कि रैखिक पेप्टाइड posttranslationally आठ निर्जलीकरण द्वारा संशोधित किया गया है (-8 एच2O) और पांच cyclizations ( चित्रा 1देखें) ।
    नोट: सोडियम युक्त बफ़र्स का उपयोग कर, सकारात्मक मोड में एमएस विश्लेषण सोडियम adducts दिखा सकते हैं । ये उच्च deconvoluted मास के साथ अतिरिक्त चोटियों के रूप में दिखाई देते हैं (प्रत्येक सोडियम adduct के लिए, मनाया deconvoluted मास २२.९९ डीए उच्चतर है). इन adducts को दूर करने के लिए HPLC शुद्धिकरण४२ या व्यापक डायलिसिस४३ को किया जा सकता है ।

6. रोगाणुरोधी गतिविधि परीक्षण

  1. बाँझ शर्तों के तहत GM17-आगर प्लेटों की तैयारी
    1. संकेतक तनाव एल लैकि्टस NZ9000 ले प्लाज्मिड pNG के एक रातोंरात संस्कृति तैयार nisPT४४ में 30 ° c M17 शोरबा४५ में 1% (डब्ल्यू/वी) ग्लूकोज (= GM17) और 5 µ जी/एमएल क्लॉरॅंफेनिकोल के साथ ।
    2. माप आयुध डिपो६००, inoculate ताजा माध्यम से आयुध डिपो६०० = ०.१ और मशीन ओडी६०० = 0.4-0.6 तक । इसके बाद कुप्पी को बर्फ पर लगाएं ।
      नोट: प्रत्येक आयुध डिपो६०० माप कल्चर वॉल्यूम का उपभोग करेगा । ध्यान रखें कि प्रत्येक परख आगर प्लेट के लिए, 1 मिलीलीटर बैक्टीरियल संस्कृति की जरूरत होगी । यदि आवश्यक हो, ऊपर तरल संस्कृति मात्रा तदनुसार स्केल ।
    3. के लिए १.५% आगर, एक ग्लास मीडिया बोतल में ४.५ ग्राम आगर बाहर तौलना । जोड़ें ३०० एमएल ddH2ओ, मिश्रण, और आटोक्लेव ।
    4. 2x M17 शोरबा तैयार (दो बार केंद्रित) ३०० मिलीलीटर ddH में2हे और आटोक्लेव ।
    5. मिश्रण 25 मिलीलीटर 2x M17 10 µ g/एमएल क्लॉरॅंफेनिकोल और 2% ग्लूकोज के साथ 1 मिलीलीटर एल लैकि्टस संस्कृति (4% वी/
    6. जोड़ें 25 मिलीलीटर पिघला हुआ १.५% आगर (ताजा autoclaved या एक माइक्रोवेव में गरम) ।
      नोट: इस से पहले, बोतल (लगभग ५० डिग्री सेल्सियस) स्पर्श करने के लिए शांत करते हैं । यह एल लैकि्टस के बाद से आवश्यक है एक mesophilic उच्च तापमान के प्रति संवेदनशील जीव है ।
    7. एक बड़ी पेट्री डिश में समाधान डालो । 10-15 मिनट के लिए सूखी प्लेटें ।
    8. लौ द्वारा एक गिलास पाश्चर पिपेट के सिरों को निष्फल । इसके लिए रुको ठंडा करने के लिए, तो विस्तृत अंत का उपयोग जम GM17-आगर में छेद बनाने के लिए ।
  2. नमूना तैयारी
    1. ई. कोलाई अभिव्यक्ति संस्कृतियों की 1 मिलीलीटर ले (३.७ चरण में बनाया) एक बला १.५ एमएल ट्यूब में और 3 मिनट के लिए केंद्रापसारक पर ७,००० एक्स जी महाप्राण शेष मध्यम और ५०० µ l Na में सेल गोली reसस्पेंड-P (५० mM सोडियम फॉस्फेट बफर , पीएच ७.४ ०.५ एम सोडियम dihydrogen फॉस्फेट और ०.५ मीटर disodium हाइड्रोजन फास्फेट) से बना है.
    2. Sonicate बर्फ पर नमूने (कदम 4.2.2 की तुलना) । कक्ष निलंबन में sonicator जांच की नोक जलमग्न । पर 1 की नाड़ी के साथ 30% आयाम पर sonicator सेट और 5 एस के लिए रवाना 3 मिनट ।
    3. १३,००० एक्स जी में 10 मिनट के लिए सेल lysate के लिए सेल मलबे गोली केंद्रापसारक । बर्फ पर एक नई प्रतिक्रिया ट्यूब करने के लिए supernatant स्थानांतरण ।
    4. पतला और सामान्य सेल निकालने के लिए supernatants 1 एमएल आयुध डिपो६०० = ०.६, काटा सेल घनत्व के सापेक्ष, ना-पी के साथ.
  3. गतिविधि परीक्षण
    1. सूचक आगर प्लेट के एक छेद में प्रत्येक सामान्यीकृत नमूना के ४० µ एल जोड़ें (चित्रा 3). जीवाणुरोधी नियंत्रण यौगिक के रूप में ४०० µ जी/एमएल में क्लॉरॅंफेनिकोल का प्रयोग करें । एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में रेफरेंस बफर का उपयोग करें । सभी नमूनों को आगर में फैलाना तक प्रतीक्षा करें । 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर थाली मशीन ।
    2. एक flatbed स्कैनर या डिजिटल कैमरा का उपयोग कर आगार प्लेटों की तस्वीरें ले लो । विकास निषेध हेलो आकार हाथ से मापा जा सकता है या ImageJ४६का उपयोग कर ।

7. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

आदेश में बैक्टीरियल कोशिकाओं पर AMPs के प्रभाव का पालन करने के लिए, प्रकाश और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इस्तेमाल किया जा सकता. ध्यान दें कि कार्रवाई के निस्ां मोड स्थिरीकरण और के गठन पर निर्भर करता है जीवाणु झिल्ली में pores6। यहां, नील लाल बैक्टीरिया कोशिका झिल्ली, जो बिखरे हुए और सेल lysis पर एकत्रित हो जाता है दाग के लिए प्रयोग किया जाता है ।

नोट: उदाहरण इंस्ट्रूमेंटेशन के लिए सामग्री तालिका देखें । जोड़ा AMP समाधान की मात्रा पेप्टाइड एकाग्रता और प्रतिक्रिया के आधार पर समायोजित किया जा सकता है ।

  1. सेल की तैयारी
    1. dimethyl sulfoxide (DMSO) में 10 एमएम नील रेड स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें ।
    2. बढ़ो एल लैकि्टस संकेतक तनाव आयुध डिपो के लिए६०० = १.० चरण 6.1.1-6.1.2 के रूप में ।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस और ५,००० एक्स जी में 3 मिनट के लिए 1 मिलीलीटर संस्कृति केंद्रापसारक
    4. supernatant छोड़ें, 1 मिलीलीटर फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पंजाब)४७में पुनर्निलंबित करें ।
    5. केंद्रापसारक और फिर से स्थगित ।
    6. जोड़ें 1 µ एल नील लाल स्टॉक समाधान, धीरे मिश्रण ।
  2. सूक्ष्म छवि अधिग्रहण
    1. ५२० एनएम पर रोमांचक जबकि एक कवर स्लाइड पर सेल तैयारी के 30 µ एल जोड़ें ।
    2. अधिग्रहण समय ०.२ एस, काइनेटिक श्रृंखला ०.१ हर्ट्ज, श्रृंखला लंबाई २०० छवियां सेट करें ।
    3. सेल lysate या IMAC नमूना के ०.३-१.५ µ एल जोड़ें (चरण 6.2.4 या 4.3.5, क्रमशः से) । IMAC नमूनों के लिए, रेफरेंस बफ़र का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जा सकता है ।
    4. मॉनिटर और रिकॉर्ड प्रतिदीप्ति उत्सर्जन पर λ ≥ ५६० एनएम ।
  3. डेटा विश्लेषण
    1. माइक्रोस्कोपी छवि दृश्यों फिल्म फ़ाइलें (. avi) के रूप में जमा हो जाती है । एकल छवियों ImageJ४६के साथ विश्लेषण कर रहे हैं ।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल SPI विधि द्वारा अवशेषों-विशिष्ट रूपरेखा के शामिल होने के साथ ncAA-संशोधित निस्ां वेरिएंट के उत्पादन को सक्षम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । पहले, व्यवहार्यता और 24 मिलीग्राम/L की पैदावार पूरी तरह से संशोधित वंय प्रकार निस्ां३९के रिकॉमबिनेंट उत्पादन के लिए सूचित किया गया । SPI विधि का उपयोग करना, लक्ष्य पेप्टाइड/प्रोटीन पैदावार अक्सर अच्छे होते है और जंगली प्रकार के उत्पादन४८के लिए बंद मात्रा तक पहुंच सकते हैं । पहले प्रयोगों के रूप में, रिकॉमबिनेंट वाइल्ड-टाइप फट उत्पादन चुना auxotrophic मेजबान में परीक्षण किया जाना चाहिए । यहां, रेखा-auxotrophic ई. कोलाई MG1655 ΔproBA:: frt Δप्रक्रिया:: frt (DE3) मेजबान तनाव के रूप में इस्तेमाल किया गया था । ncaas के शामिल करने के लिए, खेती और प्रेरण समय के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मध्यम संरचना और तापमान अधिकतम पेप्टाइड उपज की ओर अनुकूलित किया जा सकता है ।

रोगाणुरोधी गतिविधि परख
इसके बाद के संस्करण प्रोटोकॉल के बाद जंगली प्रकार रिकॉमबिनेंट निस्ां उत्पादन और शुद्धि प्रदर्शन किया गया । इस मामले में, इसके बजाय ३.६ कदम पर अपनी ncAA डेरिवेटिव की रेखा का इस्तेमाल किया गया था । एक रोगाणुरोधी गतिविधि परख के लिए फट उत्पादन सत्यापित करने के लिए और रोगाणुरोधी गतिविधि से पहले और शुद्धि के बाद तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । गतिविधि परख के लिए, रेफरेंस अंशों और IMAC प्रवाह के माध्यम से सीधे इस्तेमाल किया गया और ग्राम पॉजिटिव एल लैकि्टस संकेतक तनाव (चित्रा 2) के खिलाफ जांच की । के रूप में यह तनाव NisP एक्सप्रेस, निस्ां ई. कोलाई सेल lysates या शुद्ध पेप्टाइड नमूनों में निहित वेरिएंट, क्रमशः, नेता पेप्टाइड के proteolytic दरार द्वारा सक्रिय हो जाते हैं । जाहिर है, प्रवाह के माध्यम से विकास-निरोधात्मक गतिविधि दिखाया । यह IMAC कॉलम के लिए बाध्यकारी नहीं है सक्रिय सामग्री द्वारा समझाया जा सकता है । परीक्षण किया रेफरेंस अंश सभी शुद्ध नमूना की तुलना में वृद्धि हुई गतिविधि दिखाया, अपने-IMAC द्वारा पेप्टाइड टैग की एकाग्रता का संकेत है । ध्यान दें कि रेफरेंस बफर (नकारात्मक नियंत्रण के रूप में) इस परख में एल लैकि्टस के विकास को प्रभावित नहीं किया ।

Figure 2
चित्र 2 . recombinantly उत्पादित जंगली प्रकार निस्ां की IMAC शुद्धि के बाद रोगाणुरोधी गतिविधि परीक्षण. रेफरेंस 5 से 15 और प्रवाह IMAC शुद्धि के माध्यम से शुद्ध कोशिका lysate के साथ तुलना में परीक्षण किया गया था (६०० सामान्यीकरण के लिए पतला) एल लैकि्टस संकेतक तनाव के खिलाफ. विकास निषेध हेलो के आकार रोगाणुरोधी गतिविधि इंगित करता है । ४०० µ जी/एमएल की एकाग्रता पर क्लॉरॅंफेनिकोल एक सकारात्मक नियंत्रण और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में IMAC रेफरेंस बफर के रूप में इस्तेमाल किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

recombinantly के रोगाणुरोधी गतिविधि साबित करने के लिए छह अलग रूपरेखा निस्ां युक्त वेरिएंट का उत्पादन किया, एक गतिविधि परख के लिए L. लैकि्टस संकेतक तनाव के निषेध का परीक्षण करने के लिए निष्पादित किया गया था । चित्रा 3 छह नमूनों में से पांच के लिए वृद्धि अवरोध से पता चलता है रेखा के अनुरूप का उपयोग उत्पादित । सबसे अच्छा परिणाम (के रूप में हेलो आकार से ंयाय) एनालॉग (4आर)-fluoroproline, (4आर)-hydroxyproline और (4एस)-methanoproline के शामिल करने के लिए प्रयोग किया गया । जंगली प्रकार निस्ां उत्पादित और समानांतर में परीक्षण करने के लिए विकास निषेध हेलो आकार की तुलना, सभी तीन निस्ां वेरिएंट समान संकोच ताकत दिखाई । हालांकि, अकेले हेलो आकार एक विशिष्ट गतिविधि का आकलन नहीं किया जा सकता है, के बाद से AMP की एकाग्रता निर्धारित नहीं किया गया था । इसलिए, परख केवल गुणात्मक परीक्षण करने के लिए कि परिणामी निस्ां वेरिएंट के रोगाणुरोधी गतिविधि संरक्षित या खो दिया है कि क्या सेवा । विशिष्ट गतिविधि का निर्धारण करने के लिए, निस्ां वेरिएंट की एकाग्रता quantified होना चाहिए (चर्चा देखें).

Figure 3
चित्र 3 . सेल lysates की रोगाणुरोधी गतिविधि परख निस्ां वेरिएंट के साथ SPI के माध्यम से उत्पादन की रूपरेखा अनुरूप. रिकॉमबिनेंट वाइल्ड-टाइप नमूनों के साथ निस्ां वेरिएंट की तुलना । सभी नमूनों थे आयुध डिपो६००-सेल के बाद सामान्यीकृत प्रसंस्कृत सेल संस्कृति घनत्व के सापेक्ष lysis. हेलो संकेतक तनाव वृद्धि अवरोध के रूप में एक प्रकार की क्रिया से संकेत मिलता है । बाएं से दाएं पहली पंक्ति: (4r)-fluoroproline, (4r)-hydroxyproline, (4r)-methanoproline और क्लॉरॅंफेनिकोल (४०० µ g/mL; रोगाणुरोधी पॉजिटिव कंट्रोल) । दूसरी पंक्ति: (4एस)-fluoroproline, (4एस)-hydroxyproline, (4एस)-methanoproline और (वंय-प्रकार नियंत्रण) । रासायनिक नामकरण नोट; उदा., (४आर)-fluoroproline को ट्रांस-4-fluoroproline भी कहा जाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

LC-ईएसआई-तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री
IMAC शुद्धि के लिए बाद में, निस्ां में ncaas के शामिल LC-ईएसआई-तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया था । चित्रा 4 (4आर) युक्त एक निस्ां संस्करण के deconvoluted मास स्पेक्ट्रा से पता चलता है-fluoroproline. इस संस्करण के रूप में ऊपर वर्णित है और बाद में नियंत्रण रेखा से विश्लेषण-ईएसआई-तोफ जन स्पेक्ट्रोमेट्री, तो यह अभी भी नेता किया शुद्ध IMAC था । चित्रा 4में मुख्य शिखरएक संशोधित निस्ां युक्त (4आर) से मेल खाती है-६८८३.१८ डीए की एक deconvoluted मास के साथ fluoroproline (परिकलित मास ६८८२.०५ दा, इस तरह के जंगली में के साथ संगत प्रकार पेप्टाइड की गणना द्रव्यमान पर स्थिति 9 है ६८६४.०६ Da) । कम बहुतायत और उच्च द्रव्यमान के साथ दो चोटियों सोडियम adducts के अनुरूप संकेत के रूप में । चित्र 4 बी deconvolution एल्गोरिथ्म द्वारा पाया के रूप में मुख्य यौगिक की अलग से चार्ज प्रजातियों से पता चलता है. उदाहरण के लिए, चोटी पर ११४८.११ m/z से मेल खाती है छह गुना चार्ज प्रजातियों ([m + 6H]6 +) ।

Figure 4
चित्र 4 . LC-ईएसआई-तोफ के मास स्पेक्ट्रोमेट्री IMAC-शुद्ध रिकॉमबिनेंट निस्ां वेरिएंट युक्त (4R)-fluoroproline । (क) Deconvoluted मास स्पेक्ट्रोमेट्री वर्णलेख (इनसेट में बाहर ज़ूम) निस्ां संस्करण के लिए (अभी भी नेता ले) (4आर) के साथ-fluoroproline (उंमीद जनता (डीए): [m + ज]+ = ६८८२.०५, [m + ना]+ = ६९०४.०३, [m + 2Na]2 + = ६९२६.०२) । (ख) प्रजातियों के लिए यौगिक स्पेक्ट्रा [M + H]+. अपेक्षित मास (डीए): [m + 5H]5 + = १३७७.४१, [एम + 6H]6 + = ११४८.०१, [m + 7H]7 + = ९८४.१५, [m + 8H]8 + = ८६१.२६, [एम + 9H]9 + = ७६५.६७, [m + 10H]10 + = ६८९.२१, [m + 11H]11 + = ६२६.६४, [m + 12घं] 12 + = ५७४.५० । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी
रिकॉमबिनेंट निस्ां के रोगाणुरोधी गतिविधि और इसके ncAA-युक्त वेरिएंट भी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से एल लैकि्टस संकेतक तनाव के प्रत्यक्ष अवलोकन द्वारा दिखाया जा सकता है. नील लाल, एक अत्यधिक hydrophobic फ्लोरोसेंट डाई, जीवाणु कोशिका झिल्ली दाग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । चित्र 5 कक्ष संस्कृति और एकल कक्ष आकृति विज्ञान के एकत्रीकरण राज्य के गुणात्मक परिवर्तन को दिखाता है । कोशिकाओं नील लाल के साथ दाग और एक सूक्ष्म कवर स्लाइड पर जमा किया गया । ऊपरी पंक्ति प्रारंभ में सीधे कक्षों को दिखाती है जब बफ़र, रिकॉमबिनेंट वाइल्ड-प्रकार निस्ां, या निस्ां युक्त (4r)-fluoroproline, या (4r)-hydroxyproline जोड़े गए थे । निचली पैनल 20 मिनट की मशीन के बाद इसी इमेज को दिखाता है ।

Figure 5
चित्र 5 . ग्राम पॉजिटिव कोशिकाओं पर रिकॉमबिनेंट निस्ां इफेक्ट की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी. 30 µ एल एल की सूक्ष्म छवियां लैकि्टस संकेतक तनाव (आयुध डिपो६०० = 1) नील लाल के साथ चिह्नित (ऊपरी पैनल) से पहले ले जाया गया था और (निचले पैनल) 1 µ एल बफर (एक), ०.३ µ एल रिकॉमबिनेंट जंगली प्रकार निस्ां (बी) के साथ 20 मिनट की मशीन और ०.६ µ l निस्ां वेरिएंट युक्त (4आर)-fluoroproline (सी) और (4आर)-hydroxyproline (D). नीली वृत्तियां एकत्रित या विकृत कक्षों वाले क्षेत्रों को चिह्नित करते हैं, नीले तीर उन क्षेत्रों को इंगित करते हैं जहां फ्लोरोसेंट झिल्ली के टुकड़ों को फैलाना देखा जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्र 5 एक पता चलता है कि कोशिकाओं के सामांय उपस्थिति अवलोकन के 20 मिनट के भीतर नहीं बदला । केवल समय के दौरान जमा किए गए कक्षों की संख्या और गुलाब, इसलिए, कक्षों की एक बड़ी मात्रा स्वीकार्य क्षेत्र के ८० µm x ८० µm के भीतर दृश्यमान है । चित्र 5 ख से पता चलता है कि ग्राम सकारात्मक कोशिकाओं के समग्र और धुंधला दिखाई (नीली हलकों के साथ चिह्नित) जंगली प्रकार निस्ां के लिए जोखिम के 20 मिनट के बाद, यहां तक कि जब कम मात्रा में (यहां, ०.३ µ एल IMAC रेफरेंस) जोड़ा गया । इसके अलावा, प्रकाश सामग्री बफर में कोशिकाओं से फैलाना, यह दर्शाता है कि झिल्ली के टुकड़े नील लाल के साथ चिह्नित किया गया था समय सीमा के दौरान जुटाए (नीले तीर द्वारा चिह्नित) । इन निष्कर्षों के रूप में यह निस्ां6,४९के साथ उपचार पर होने के लिए दिखाया गया था सेल lysis संकेत मिलता है । इसी तरह के प्रभाव निस्ां युक्त (4आर)-fluoroproline (चित्रा 5सी) और निस्ां युक्त (4आर)-hydroxyproline (चित्रा 5घ) के साथ साथ मशीन के बाद मनाया दोनों बड़े दिखा नियंत्रण नमूने के लिए चिह्नित कंट्रास्ट (चित्र 5A) में 20 मिनट बाद विकृत और समेकित कक्षों की मात्रा ।

घटक एकाग्रता
(एनएच4) 2 तो4  ७.५ एमएम
Nacl ८.५ एमएम
KH2पो4 22 एमएम
K2HPO4 50mm
MgSO4 1 मिमी
D-ग्लूकोज 20 एमएम
सभी विहित अमीनो अम्ल
(एक को प्रतिस्थापित करने के लिए छोड़कर)		 ५० mg/L
Ca2 + 1 µ g/mL
Fe2 + 1 µ g/mL
ट्रेस तत्वों
(घन2 +, Zn2 +, Mn2 +, MoOH2 +)		 ०.०१ µ g/mL
Thiamine 10 µ g/mL
बायोटिन 10 µ g/mL

तालिका 1. NMM19 की रचना रासायनिक रूप से परिभाषित बैक्टीरियल विकास मध्यम चरण 2 के अनुसार तैयारी के बाद ।

Discussion

रेखा के अनुरूप के लिए SPI का उपयोग करके, लक्षित निस्ां संरचनाओं काफी संशोधित किया जा सकता है, अद्वितीय अनुक्रम संयोजन और रासायनिक गुणों के साथ उपंयास पेप्टाइड वेरिएंट बनाने । इस तरह से शास्त्रीय जीन तकनीक की मूल सीमा को दरकिनार किया जा सकता है, जो २० cAAs की सुसाइड चेन chemistries को विवश कर रहा है. vivo में निस्ां के रासायनिक विविधीकरण के रूप में ऊपर उदाहरण प्राकृतिक PTMs पूरक करने के लिए और नाटकीय रूप से फट के रासायनिक अंतरिक्ष में वृद्धि करने के लिए एक सामान्य दृष्टिकोण को दर्शाता है. हमें विश्वास है कि प्राकृतिक अमीनो एसिड की प्रदर्शनियों का विस्तार AMPs के लिए विशेष रूप से महान वादा रखती है । प्रोटीन में, कार्यक्षमताओं की एक जबरदस्त रेंज तीन आयामी संरचनाओं में 20 cAAs की एक निर्धारित व्यवस्था के माध्यम से महसूस किया जा सकता है । लंबाई3में केवल 7-100 एए के साथ, तरीके केवल cAAs के माध्यम से ऐसी संरचनात्मक सुविधाओं को प्राप्त करने के लिए AMPs के लिए सीमित हो जाएगा. यह इस प्रकार आश्चर्य की बात नहीं है कि फट के रूप में प्राकृतिक AMPs आमतौर पर बड़े पैमाने पर पोस्ट-अनुवाद4संशोधित कर रहे हैं । एक ही फैशन में, वैकल्पिक निर्माण ब्लॉकों के रूप में ncaas अपने pharmacodynamic और pharmacokinetic मापदंडों में सुधार करने के लिए महान वादा पकड़ (Baumann एट अल. २०१७३५ और उसमें संदर्भ देखें) ।

इस कार्य में प्रयुक्त SPI पद्धति अपेक्षाकृत आसान प्रायोगिक स्थापक, सीधा निष्पादन और उच्च reproducibility से लाभ करती है. वैश्विक प्रतिस्थापन के कारण, लक्ष्य पेप्टाइड्स में multisite ncAA शामिल करना भी संभव है । दूसरी ओर, विधि अक्सर लक्ष्य जीन उत्पाद में होने वाली अमीनो एसिड के प्रतिस्थापन के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है । सिद्धांत रूप में, अवांछित पदों साइट द्वारा बदला जा सकता है निर्देशित mutagenesis, लेकिन इन अतिरिक्त परिवर्तन भी संरचना और गैर-सक्रियता सहित कई AMP गुण को प्रभावित कर सकता है । एक बार उत्पादन के लिए एक auxotrophic तनाव उपलब्ध है, कई ncaas आनुवंशिक स्तर पर व्यापक परिवर्तन की आवश्यकता के बिना परीक्षण किया जा सकता है । इसके अलावा, विधि auxotrophic ई. कोलाई उपभेदों तक ही सीमित नहीं है, लेकिन यह भी प्राकृतिक उत्पादन की मेजबानी का उपयोग किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, झोउ एट अल दिखाया है कि उपंयास के उत्पादन के लिए SPI फट भी स्वाभाविक रूप से टीआरपी में काम करता है-auxotroph एल लैकि्टस: परिभाषित मीडिया का प्रयोग, तीन tryptophan सादृश्य निस्ां५०में चार पदों पर शामिल किया गया ।

के बाद से SPI विधि ncAA द्वारा चुना cAA के वैश्विक प्रतिस्थापन की ओर जाता है, यह आम तौर पर लक्ष्य पेप्टाइड्स और प्रोटीन की एक व्यापक रेंज के लिए लागू होता है । auxotrophic ई. कोलाई उपभेदों की एक श्रृंखला उपलब्ध है (चरण 1 देखें), कई cAAs प्रत्येक की अनुमति के लिए ncaas द्वारा प्रतिस्थापन के लिए परीक्षण किया जाएगा । मुलाकात की मेटाकमी उपभेदों (जैसे, B834 (DE3)) का उपयोग कर शामिल सादृश्य सबसे अधिक कार्यरत हैं । isostructural के उदाहरणों से मुलाकात की एनालॉग azidohomoalanine है (अहा) और homopropargylglycine (Hpg), व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ncaas जो कुशलतापूर्वक शामिल किया जा सकता है । दोनों परिचय bioorthogonal संभालती है जो एक संगत alkyne या azide कार्यशीलता, क्रमशः ले जाने के अणुओं के लगाव की अनुमति । उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट रंजक या पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) moieties तांबे (I)-catalyzed azide alkyne cycloaddition (CuAAC)५१द्वारा संलग्न किया जा सकता है ।

हालांकि दोनों रिकॉमबिनेंट ncAA निगमन तरीकों (SPI और SCS) आम तौर पर पर्याप्त लक्ष्य मात्रा को प्राप्त करने, पैदावार अक्सर इसी पेप्टाइड्स और प्रोटीन के जंगली प्रकार के उत्पादन के सापेक्ष कम कर रहे हैं । के रूप में purities अक्सर उत्पादन क्षमता के साथ सहसंबंधी बनाना, अतिरिक्त शोधन कदम विशेष रूप से कम प्रचुर प्रजातियों के लिए, की आवश्यकता हो सकती है । रिकॉमबिनेंट निस्ां उत्पादन के इस विशेष मामले में, अपने-नेता अनुक्रम टैग बहुत सेल lysates से चयनात्मक संवर्धन द्वारा तेजस्वी शुद्धि को सरल करता है । इस प्रोटोकॉल में दिखाया शुद्धि शुद्धता और निस्ां की एकाग्रता में सुधार, लेकिन अक्सर AMP purities उपज और विशिष्ट गतिविधि निर्धारित करने के लिए पर्याप्त उपज नहीं है । IMAC के अलावा, आमतौर पर इस्तेमाल किया AMP शोधन विधियों HPLC शामिल हैं, आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी (आईईसी) और वर्षण (उदा . एसीटोन या trichloroacetic अम्ल (टीसीए) का उपयोग करना) या तत्संबंधी संयोजन-एक multistep शुद्धिकरण योजना में जिसके परिणामस्वरूप५२ . यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि उनके सामान्यतः polycationic प्रकृति आईईसी शुद्धिकरण की सुविधा दे सकती है. फ्रीज-सुखाने अक्सर शुद्ध AMPs की दुकान करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

आदर्श रूप में, AMPs में शामिल करने के लिए ncaas सस्ती कीमतों पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध होना चाहिए या आसानी से सरल और reproducible रासायनिक संश्लेषण प्रोटोकॉल द्वारा उत्पादित. SPI विधि के लिए एक समान रूप से महत्वपूर्ण शर्त यह है कि ncAA मांयता प्राप्त है, सक्रिय है और अंतर्जात या सह द्वारा cognate tRNA पर आरोप लगाया aaRS व्यक्त की है । यह अमीनो एसिड सक्रियण या tRNA aminoacylation परख५३द्वारा इन विट्रो में परीक्षण किया जा सकता है । एक आसान विकल्प के रूप में, SPI इस तरह के ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में मॉडल प्रोटीन का परीक्षण अभिव्यक्ति (GFP) दोनों उपस्थिति में और ncAA पूरकता की अनुपस्थिति में आयोजित किया जा सकता है । इसके अलावा, विकास मध्यम और कोशिका पारगम्यता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रासायनिक स्थिरता में घुलनशीलता महत्वपूर्ण कारकों का गठन ।

इस उदाहरण में, रोगाणुरोधी गतिविधि एक ग्राम सकारात्मक संकेतक तनाव का उपयोग कर दिखलाई गई । जैसा कि यह नेता peptidase NisP व्यक्त करता है, निस्ां परिपक्वता के अंतिम चरण catalyzed है । नेता अनुक्रम को हटाना (अपने-शुद्धि प्रयोजनों के लिए टैग) भी इन विट्रो में शुद्ध NisP५० या trypsin५४के साथ उपचार द्वारा किया जा सकता है । इस काम के दायरे से परे, रोगजनक जीवों और बहुऔषध प्रतिरोधी उपभेदों तो एक समान पद्धति का उपयोग कर AMPs द्वारा बैक्टीरियोस्टेटिक या जीवाणुनाशक निषेध के लिए परीक्षण किया जा सकता है. चिकित्सकीय प्रासंगिक लक्ष्य प्रजातियों MRSA, एमडीआर माइकोबैक्टीरियम तपेदिक, VRE, Acinetobacter baumannii, स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया, Pseudomonas aeruginosa और Klebsiella निमोनियाशामिल हैं । इसके अलावा आगर प्लेट प्रसार परख यहाँ प्रस्तुत, विकास निषेध भी जीवाणु प्रजातियों के साथ inoculated उपयुक्त तरल मीडिया का उपयोग कर प्रदर्शन किया जा सकता है और AMP के साथ पूरक. शोरबा कमजोर पड़ने तरीकों का प्रयोग, ंयूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (MIC) शुद्ध पेप्टाइड्स५५का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है । यहां प्रस्तुत गतिविधि परख भी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और अधिक गतिविधि AMP युक्त समाधान संदर्भ यौगिकों के सापेक्ष की शक्ति, उदाहरण के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध निस्ां ।

फट के रिकॉमबिनेंट उत्पादन अक्सर व्यवहार्य३९है, जो सामांयतः PTM जीन की सह अभिव्यक्ति शामिल है । जैसे ही उत्पादन तनाव एक रासायनिक परिभाषित या सिंथेटिक न्यूनतम एक उपयुक्त ncAA युक्त माध्यम में स्थानांतरित कर दिया है, अवशेषों-इसी cAA के विशिष्ट प्रतिस्थापन जगह लेता है । इस प्रकार, अंय फट एक ही पद्धति द्वारा उत्पादित किया जा सकता है, बशर्ते कि उनके रिकॉमबिनेंट उत्पादन संभव है और शर्तों पाया जा सकता है, जहां ncAA निगमन और PTM लक्ष्य उत्पाद की पर्याप्त मात्रा में उपज । ध्यान दें कि मेजबान सेल proteome के अलावा, पेप्टाइड PTM मशीनरी भी ncAA-SPI के दौरान संशोधित हो सकता है । नतीजतन, लक्ष्य अभिव्यक्ति प्रेरण और निंनलिखित मशीन अवधि की लंबाई के समय अनुकूलन की आवश्यकता कर सकते हैं । के बाद से PTM एंजाइमों में ncAA शामिल उनके स्थिरता और गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं, प्रोसेस्ड रिप का उत्पादन सिद्धांत रूप में प्रभावित हो सकता है । पर्याप्त PTM एंजाइम प्रभावकारिता संसाधित पेप्टाइड के गठन के द्वारा संकेत दिया है, के रूप में एमएस और के द्वारा पता लगाया गतिविधि परख. के रूप में ऊपर शुरू की, विभिंन inducible प्रमोटरों के क्रम में PTM जीन पहले का उत्पादन करने के लिए कार्यरत किया जा सकता है (ncaa की अनुपस्थिति में) ncaa की उपस्थिति में प्रणेता पेप्टाइड जीन की प्रेरण के बाद । सामांय में, cAA के उत्पादन-लक्ष्य पेप्टाइड युक्त ncAA, जो है क्यों के अग्रदूत जीन के तंग दमन की आवश्यकता है के अलावा पहले दबाया जाना चाहिए । इस प्रोटोकॉल के भीतर, यह वृद्धि मध्यम करने के लिए ग्लूकोज के अलावा के माध्यम से catabolic दमन द्वारा हासिल की है । खासकर के बाद से PTM के लिए आवश्यक एंजाइमों एक आनुवंशिक रूप से दूर मेजबान से आमतौर पर शुरू, अभिव्यक्ति तापमान और इसी जीन के codon उपयोग अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है अगर रिकॉमबिनेंट उत्पादन अभी तक नहीं किया गया है स्थापित. सिद्धांत रूप में, निस्ां NisBC और NisP के मामले में PTM एंजाइमों की मांयता और प्रसंस्करण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, पेप्टाइड में ncaas की उपस्थिति । AMPs में ncAA शामिल करने के लिए, यह इस तरह के लिए उपयुक्त अभिव्यक्ति की स्थिति और AMP गतिविधि परख की विश्वसनीयता की पहचान करने के लिए पहले छोटे पैमाने पर अभिव्यक्ति प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है.

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

J.H.N., T.B. और M.B. यूरोपीय संघ FW7 कार्यक्रम (SYNPEPTIDE) द्वारा धन स्वीकार करते हैं । एफ.-J.S. और T.F. शिक्षा और विज्ञान के संघीय मंत्रालय द्वारा धन स्वीकार (BMBF कार्यक्रम "HSP २०२०", टू-WIMIplus परियोजना SynTUBio) और जर्मन अनुसंधान फाउंडेशन (उत्कृष्टता के क्लस्टर "Catalysis में अवधारणाओं को एकीकृत") ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sodium chloride Carl Roth, Germany P029
guanidine hydrochloride Carl Roth, Germany 0035.2
dipotassium hydrogen phosphate Carl Roth, Germany P749.3
potassium dihydrogen phosphate Carl Roth, Germany 3904.3
sodium dihydrogen phosphate monohydrate Carl Roth, Germany K300.2
disodium hydrogen phosphate Carl Roth, Germany P030.2
L-alanine Carl Roth, Germany 3076.2
L-arginine Carl Roth, Germany 3144.3
L-asparagine monohydrate Carl Roth, Germany HN23.1
L-aspartic acid Carl Roth, Germany T202.1
L-cysteine Carl Roth, Germany 3467.3
L-glutamine Carl Roth, Germany 3772.1
L-glutamic acid Carl Roth, Germany 3774.1
L-glycine Carl Roth, Germany 3187.3
L-histidine Carl Roth, Germany 3852.3
L-isoleucine Carl Roth, Germany 3922.3
L-leucine Carl Roth, Germany 3984.3
L-lysine monohydrate Carl Roth, Germany 4207.2
L-methionine Carl Roth, Germany 9359.4
L-phenylalanine Carl Roth, Germany 4491.2
L-proline Carl Roth, Germany T205.3
L-serine Carl Roth, Germany 4682.4
L-threonine Carl Roth, Germany T206.2
L-tryptophan Carl Roth, Germany 4858.2
L-tyrosine Carl Roth, Germany T207.2
L-valine Carl Roth, Germany 4879.4
ammonium sulfate Carl Roth, Germany 3746.3
magnesium sulfate Carl Roth, Germany 0261.2
D-glucose Carl Roth, Germany 6780 prepare a 20% (w/v) solution for addition into molten agar
calcium chloride Carl Roth, Germany PN93.2
iron(II) chloride Sigma-Aldrich, Germany 372870
thiamine hydrochloride Sigma-Aldrich, Germany T1270
biotin Carl Roth, Germany 3822.2
copper(II) sulfate Merck, Germany 102792
manganese(II) chloride Carl Roth, Germany KK36.2
zinc chloride Merck, Germany 108816
immonium orthomolybdate Sigma-Aldrich, Germany 277908
glycerol Carl Roth, Germany 7533.3
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Sigma-Aldrich, Germany I6758
ampicillin sodium salt Carl Roth, Germany K029.5 working concentration 100 µg/mL for E. coli, prepare 100 mg/mL stock in ddH2O
kanamycin sulfate Carl Roth, Germany T832.2 working concentration 50 µg/mL for E. coli, prepare 50 mg/mL stock in ddH2O
chloramphenicol Carl Roth, Germany 3886.1 working concentration 5 µg/mL for L. lactis, prepare 37 mg/mL stock in ethanol
(4S)-fluoroproline Bachem, Switzerland F-3970
(4R)-fluoroproline Bachem, Switzerland F-3975
(4S)-hydroxyproline Bachem, Switzerland F-1395
(4R)-hydroxyproline Bachem, Switzerland F-2980
(4S)-methanoproline chemically synthesized
(4R)-methanoproline chemically synthesized
hydrochloric acid (HCl) Carl Roth, Germany P074.4
ethanol VWR, Germany 20825.324
M17-broth Sigmal-Aldrich, Germany 56156 commercial product, see Terzaghi BE & Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13 for contents and preparation
agar-agar Carl Roth, Germany 5210.5
Nisin from Lactococcus lactis  Sigma-Aldrich, Germany N5764 commercial product, can be used as reference for bioactivity
dimethyl sulfoxide (DMSO) Carl Roth, Germany A994.1
imidazole Carl Roth, Germany 3899.3
1.5 mL autosampler vial for LC-MS Sigma-Aldrich, Germany Supelco 854165
acetonitrile VWR, Germany HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 LC-MS grade required
formic acid VWR, Germany HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 LC-MS grade required
1 mL Ni-NTA IMAC column, e.g. HisTrap FF Crude GE Healthcare, UK 29-0486-31 different manufacturers and resins available for IMAC
0.45 µm bottle top filter unit VWR, Germany 10040-470 sterile filtration of solutions using a vacuum pump
0.45 µm syringe filter PVDF membrane Carl Roth, Germany CCY1.1 sterile filtration of solutions using a syringe and to remove particles from cell lysates
luer-lock syringe, PP, 50 ml Carl Roth, Germany T552.2 sterile filtration of solutions  
1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf, Germany 30120086
petri dishes (polystyrene, sterile) Carl Roth, Germany TA19
Nile red Sigma-Aldrich, Germany 72485
E. coli ΔproA strain CGSC, Keio collection JW0233-2 proline-auxotrophic E. coli K-12 strain
E. coli B834(DE3) Novagen (Merck), Germany 69041 methionine-auxotrophic E. coli B strain
λDE3 Lysogenization Kit Novagen (Merck), Germany 69734-3
Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT bacterial indicator strain, see Khusainov R & Kuipers OP, PLoS One, 8 (9), e74890
benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf, Germany 5427 R
peristaltic pump GE Healthcare, UK P1
FPLC system GE Healthcare, UK Äkta Purifier 10 or the like
inverted microscope Nikon TI Eclipse wide-field fluorescence microscope  with 100x (N.A. 1.4) objective and Mercury Lamp example setup for fluorescence microscopy
electron multiplying CCD (EMCCD) camera Andor Technologies, UK Andor Luca  example setup for fluorescence microscopy
fluorescence excitation filter Thorlabs, USA Dichroic cube (TLV-U-MF2-TRITC) example setup for fluorescence microscopy
fluorescence emission filter AHF Analysentechnik, Germany T 560 LPXR example setup for fluorescence microscopy
cover slip 24 x 60 mm Carl Roth, Germany LH26.1 example setup for fluorescence microscopy
Immersion Oil Carl Zeiss, Germany Immersol 518 F example setup for fluorescence microscopy
probe sonicator Bandelin, Germany Sonopuls HD3200 with sonotrode MS-72 200 W maximum HF output
C5 HPLC column (2.1x100 mm, 3 µm particle size) Sigma-Aldrich, Germany 567227-U example setup for mass spectrometry
ESI-TOF coupled to HPLC system Agilent, USA Agilent 6530 Accurate Mass QTOF with 1260 HPLC example setup for mass spectrometry

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Nickling, J. H., Baumann, T.,… More

Nickling, J. H., Baumann, T., Schmitt, F. J., Bartholomae, M., Kuipers, O. P., Friedrich, T., Budisa, N. Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids. J. Vis. Exp. (135), e57551, doi:10.3791/57551 (2018).

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