Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Antimikrobiella peptider produceras av selektionstryck införlivandet av icke-kanoniska aminosyror

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57551
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 3, 2, 1
1Department of Biocatalysis, Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin, 2Department of Bioenergetics, Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin, 3Molecular Genetics Group, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, Department of Molecular Genetics, University of Groningen
* These authors contributed equally

Summary

Presenteras i protokollet den Escherichia coli-baserat selektionstryck införlivandet av icke-kanoniska aminosyror (ncAAs) i Lactococcus antimikrobiell peptid nisin. Dess egenskaper kan ändras under rekombinant uttryck via substitution med önskad ncAAs i definierade tillväxt medier. Förändringar i bioaktivitet mappas av tillväxt hämning analyser och fluorescensmikroskopi.

Abstract

Naturen har en mängd möjligheter att skapa nya protein funktioner genom att ändra sekvensen av enskilda aminosyror byggstenar. Men är alla varianter baserade på de 20 kanoniska aminosyrorna (cAAs). Som ett sätt att införa ytterligare fysikalisk-kemiska egenskaper i polypeptider, används införlivandet av icke-kanoniska aminosyror (ncAAs) alltmer i proteinteknik. På grund av sin relativt korta längd och är ändring av ribosomally syntetiserade och post-translationally modifierade peptider av ncAAs särskilt attraktiva. Nya funktioner och kemiska handtag kan genereras av särskilda modifikationer av enskilda rester. Selektionstryck inkorporering (SPI) metoden utnyttjar auxotrophic värd stammar som berövas en essentiell aminosyra i kemiskt definierade tillväxt medier. Flera strukturellt och kemiskt liknande aminosyra analoger kan sedan aktiveras av den motsvarande aminoacyl-tRNA-syntetas och ge rester-specifika cAA(s) → ncAA(s) substitutioner i sekvensen mål peptid eller protein. Även om, i samband med metoden SPI, ncAAs också införlivas i det värd proteomet under fasen av rekombinant genuttryck, tilldelas majoriteten av cellens resurser uttrycket av målgenen. Detta möjliggör effektiv rester-specifika inkorporering av ncAAs ofta tillsammans med höga mängder av modifierade mål. Presenterade arbetet beskrivs i vivo införlivandet av sex proline analoger i den antimikrobiella peptid nisin, en lantibiotic som produceras naturligt av Lactococcus lactis. Antimikrobiella egenskaper av nisin kan ändras och byggas under jäsning och uttryck i auxotrophic Escherichia coli stammar i definierade tillväxt medier. Därmed kan effekterna av rester-specifika byte av cAAs med ncAAs leverera förändringar i antimikrobiell aktivitet och specificitet. Antimikrobiella aktivitet analyser och fluorescensmikroskopi används för att testa den nya nisin varianter för tillväxthämning av en grampositiva Lactococcus lactis indikator stam. Massa spektroskopi används för att bekräfta ncAA inkorporering bioaktiva nisin varianter.

Introduction

Upptäckten av antibiotika i det tjugonde århundradet och den parallella utvecklingen av nya antimikrobiella föreningar mot patogena mikroorganismer aktiverat riktade behandlingar av bakteriella infektioner. Dock på grund av uppkomsten av multiresistenta patogener såsom meticillinresistenta Staphylococcusaureus (MRSA), vankomycinresistenta enterokocker (VRE), MDR (multiresistenta) Salmonella typhimurium phage Skriv 10 (DT10 ), och Klebsiella pneumoniae, det är absolut nödvändigt att generera nya antimikrobiella medel1. Antimikrobiella peptider (ampere) är mångsidig, ofta mycket specifika substanser som är lovande kandidater för utveckling av nya läkemedel tack vare sina fysikalisk-kemiska egenskaper, flexibilitet, storlek, vattenavvisande egenskaper och läge för åtgärd2. Ampere är små peptider vanligtvis bestående av 7-100 aminosyror. Ofta har de en katjoniska struktur som är rik på positivt laddade arginin och lysin rester, som interagerar med riktade mikrobiell cellmembranet, som debiteras oppositely3. En särskild undergrupp av ampere är ribosomally syntetiserade och posttranslationally modifierade peptider (RiPPs)4. Dessa tillverkas av många olika organismer från riket svampar och domänen för bakterier. En av de mest kända och mest använda RiPPs är nisin, produceras naturligt av mjölksyra bakterien Lactococcus lactis (L. lactis). Aktiv mot en panel av grampositiva bakterier, nisin har använts som en biopreservative inom livsmedelsindustrin för mer än 50 år på grund av dess antimikrobiella egenskaper och avsaknad av utvecklade resistens i riktade mikrobiell stammar5. Studier har visat att nisin destabiliserar och genererar porer i bakteriell cellmembran, leder till antimikrobiell aktivitet mot både grampositiva och gramnegativa patogener6. Genom bindning till lipid II är bakteriella cellväggen syntesen hämmad7. Nisin är kodad av nisA som en linjär föregångare peptid, som består av en ledare och en core peptid region (figur 1). Efter ribosomal proteinsyntes ändras först prenisin genom dehydratase NisB. Här, är serin och treonin rester i regionen prepeptide kärna uttorkade till dehydroalanine (Dha) och dehydrobutyrine (Dhb)8. Därefter torkade rester är tillsammans med cystein till formuläret lantionin ringar (därav namnet ”lantibiotic” för lantionin ring-innehållande antibiotika) av en enzymkatalyserade Michael tillägg. Denna posttranslationell modifiering (PTM) är katalyseras av cyclase NisC. I L. lactis, den modifierade prenisin sedan transporteras ut ur cellen av transportören NisT och ledare peptiden är klyvs av proteinas NisP att släppa den mogna och aktiva nisin form9. De ansvariga ledare-hämmare NisP har en hög substrat specificitet, eftersom det endast processer modifierade nisin effektivt10.

I allmänhet resulterar aktiva RiPPs från handlingen av PTM enzymer (exempelvis NisBC), vilket drastiskt öka kemiska loppet av kort peptider, t.ex. via acetylering, glycosylation, metylering eller fosforylering. Denna nivå av komplexitet kan ytterligare utökas genom direkta införlivandet av ncAAs. Medan ofta genomförbart, är kemisk syntes ampere en utmaning för storskalig produktion på grund av deras strukturella komplexitet. Till exempel uppnåddes totala kemiska syntesen av den lantibiotic lactosin S i 71 reaktionen kliver med en slutlig avkastning på 10% och det av nisin med en rå kapacitet på endast 0,003%11,12. Därför, biologisk produktion erbjuder ett lönsamt alternativ, på grund av generationen av rätt stereocenters och hög koncentration.

Fram till idag, mer än 150 ncAAs, exempelvis att ha funktionella grupper som innehåller fluor eller azider, har införlivats i rekombinanta proteiner, och flera exempel på ncAA-modifierade ampere har varit rapporterade13,14, 15,16. Med införandet av ncAAs, kan det skapas nya fysikalisk-kemiska egenskaper jämfört med konventionella mutagenes. Mångfalden av befintliga peptider kan ökas, möjligen kan leda till nya antibiotika.

En metod för införlivandet av ncAAs i rekombinanta peptider är selektionstryck inkorporering (SPI) baserat på användning av auxotrophic bakteriestammar17. Dessa stammar är inte kan syntetisera motsvarande cAA analog av ncAA. Metoden används frekvent observerade avslappnad substrat specificitet, en funktion i många naturliga aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs)18. Bortsett från deras naturliga cAA-substrat klarar dessa enzymer ofta att erkänna och aktivera önskad ncAA och ladda det på deras besläktat tRNA(s). Detta leder till ribosomal införlivandet av ncAA i mål genen produkten på ett sätt som rester-specifika (dvs. Luftfartsverket → ncAA substitution). Detta är naturligtvis bara möjligt när önskad ncAA är strukturellt och kemiskt liknar den kanoniska aminosyran och tolereras av cellfysiologi, översättning maskiner och målet peptid eller protein sekvensen. I en viss experimentell setup odlas de auxotrophic värdcellerna i definierade medium medföljer en begränsande koncentration av infödda aminosyran ska ersättas. Den cellulära tillväxt eller utbyte av cAA-fri medium leder till intracellulär utarmning av Luftfartsverket. I nästa steg, ncAA läggs och målet genuttrycket induceras. Oundvikligen, ncAAs nu också ingår i många andra proteiner i värdcellen under denna fas av målet genuttryck. Dock toxiciteten av SPI setup hålls på en låg nivå eftersom Escherichia coli (E. coli) stammen förvandlas med en plasmid som transporterar målgenen under kontroll av en stark tillskyndare (vanligen mycket konkurrenskraftiga T7 promotorn / RNA-polymeras system)19. Omedelbart efter induktion (vanligtvis när Luftfartsverket är slut), värd celler upphöra att växa och deras cytoplasmiska enzymatisk maskinerier används främst för uttryck av plasmid-baserade målgenen. Webbplats riktad mutagenes kan användas för att definiera industriområden av rester-specifika ncAA installation i målet gen20.

Som en modell peptid för införlivandet av ncAAs valdes den gemensamma AMP nisin A. Det är 34 aminosyror lång och har bara en enda proline rester i sekvensen core peptid (figur 1). Liksom i subtilisin, ericin A och S, och epidermin såväl som i nisin Z och nisin Q verkar den bevarade prolin vara avgörande för aktivitet9,21. Den cAA prolin spelar en särskilt viktig roll i peptidyl-prolyl amide rotation och sekundärt strukturera stabilisering. Dess sidokedjan ring konformationer (exo / endo puckers) ansvarar för en termodynamisk stabilisering av Amid obligationen. Riktade kemiska modifieringar (till exempel hydroxylations, fluorinations, methylations) av prolyl puckers påverkar ofta kritiskt fällbara stabilitet, byggnadsställning styvhet och funktioner av många biologiska strukturer22. Därför är det rimligt att förvänta sig att Pro→ proline analoga substitutioner kommer förse ring B, den andra ringen av nisin, med romanen och ovanliga egenskaper.

Här, en proline-auxotrophic E. coli stam användes för rekombinant nisin produktion. Detta kräver ett uttryck för prepeptide gen nisA samt den modifiering enzym gener nisBC. Genetiskt kodade peptid produkten bär en N-terminalt hans-taggade ledare för rening via affinitetskromatografi. Aktivitet beslutsamhet, används L. lactis uttrycka och utsöndrar NisPT för att aktivera rekombinant nisin varianter från E. coli cell lysates eller renat peptid prover (figur 1). Den mogna AMP frigörs efter klyvning av ledare genom NisP. I denna agar diffusion metod, AMP provet diffunderar in i solid odlingsmedium och kan hämma tillväxten av grampositiva mikroorganism. Efter inkubation, kan detta observeras visuellt av tillväxt hämning glorior. Utöver L. lactis som indikator, modified nisin varianter visade antimikrobiell aktivitet mot Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus , Bacillus cereusoch Lactobacillus johnsonii 21,23.

En alternativ och experimentellt olika metod att införliva ncAAs i RiPPs är stop kodon suppression (SCS)24. För detta, en ortogonal tRNA / aminoacyl-tRNA Synthetasen (aaRS) par krävs för motsvarande ncAA. Helst är alla dessa tre komponenter bioorthogonal, dvs de inte interagerar med den endogena tRNAs och aaRSs. En ncAA-specifika aaRS kan genereras genom ändring av den enzym aktiva platsen och screening av genetiska bibliotek av muterade synthetases25. Införandet av en ncAA kräver dessutom en codon som tilldelas och som inte koda för Luftfartsverket. Vanligen, är den gula stop kodon används24,26.

Nyligen inrättades SPI för införlivandet av α-chloroacetamide-innehållande och klick-kemi-kompatibla ncAAs i NisA27. Till exempel införlivades Nε- alloc-lysin den lasso peptid captistruin med platsspecifika (SCS) och rester-specifika (SPI) införlivandet metoder och därefter ändrade in vitro genom rutenium-katalyseras metates28 . I jämförelse med SPI, metoden SCS är mer komplicerat eftersom en ortogonal tRNA / aaRS par måste vara co uttryckt. O-par för proline införlivandet har hittills varit utvecklade29, men till bäst av vår kunskap, inget exempel proline analoga stiftelseurkunden har rapporterats.

Det bör noteras att inte alla ncAAs kan införlivas med metoden som SPI. Först, upptaget av ncAAs in i cytoplasman är reglerad av en mängd transportproteiner som är inbäddade i cytoplasmic membranet, vilket är det inre membranet för gramnegativa bakterier som E. coli. Normalt är E. coli kan transportera ett brett utbud av aminosyra analoger in i cellen med sida kedjor strukturellt och kemiskt liknar kanoniska aminosyror. Andra, många Kemiskt reaktiva eller instabil ncAAs kan fungera som en hämmare mot cellulära tillväxt, eftersom de är giftiga för metabolism och fysiologi i mottagande cellen30. Således bör det upptag och toxicitet av ncAA för produktion värden testas i förväg. För att undvika inaktivering av PTM maskinen som en bieffekt, en strängt kontrollerade uttryck inställning av de ansvariga generna kan användas för att införliva den naturliga aminosyran i ändring enzymer (t.ex. nisBC) och ncAA i målgenen ( t.ex. nisA). Detta kan åstadkommas med två olika initiativtagare och induktion av målet genuttryck, vilket framgår i specialdesignade SPI protokoll31. Enligt ovan, bygger metoden SPI på avslappnad substrat specificiteten av de årliga verksamhetsrapporterna, vilket möjliggör ncAA aktivering och cognate tRNA laddning. Därefter levereras tRNAen till Ribosomen följt av Amid bond bildandet och vikning av mål (poly) peptiden. I denna processer, kan korrekturläsning och redigering mekanismer bli relevanta32. Av dessa skäl är det av stor vikt att ha ett mål ncAA som strukturellt och kemiskt liknar Luftfartsverket. Andra viktiga punkter är tillräcklig stabilitet (både i tillväxt medier och utsätts för cellulära metabolismen) och löslighet i ncAA. Dessutom bör man antingen kommersiellt tillgänglig eller lätt att syntetiseras kemiskt.

Här beskriver vi ett protokoll för SPI, så att rester-specifika införlivande av ncAAs i rekombinant RiPPs. Särskilt olika proline analoger införlivas i den antimikrobiella peptid nisin A med E. coli som värdorganism. Masspektrometri används för att verifiera aminosyra ersättning och peptid produkter analyseras för bioaktivitet använder tillväxt hämning analyser och fluorescensmikroskopi använder mikrobiell indikator stammar.

Grundkravet för framgångsrika rekombinant nisin uttryck med definierade ncAAs kräver en lämplig proline auxotrophic E. coli -stam. För detta auxotrophy, proA måste vara dysfunktionella, exempelvis uppnås genom genomisk knockout. Celler helt berövas intracellulära Pro biosyntes (dvs borttagande av proABC) utan möjligheten för återgång är stabila auxotrophs. Utbredda gen knockout metoder är phage transduktion eller singel-gen knockout enligt Datsenko & Wanner33. ProA knockout stammar kan dessutom erhållas från offentliga databaser såsom Addgene, CGSC eller samlingen Keio. Eftersom uttrycket rekombinant nisABC som visas här är beroende av användningen av T7 initiativtagare, har uttryck värd stammen att bära en inducerbara genen för T7 RNA-polymeras. Detta kan uppnås genom införandet av den λDE3 profagen i värd genomet, till exempel hjälp av kommersiella kit. Alternativt, stammar såsom BL21(DE3) kan göras auxotrophic som beskrivs ovan.

Protocol

1. kloning av uttrycket vektorer och omvandling av en auxotrophic produktion stam

Häri, har gener för nisin biosyntes, nämligen nisABC, tagits från L. lactis och överförts till T7-baserade plasmid uttryck vektorer. Fullständiga DNA-sekvenser av nisABC kan hittas i GenBank inträde X6830734. Genen för föregångare peptiden (nisA) har placerats på en pET-3a vektor som ger ampicillin-resistens. Gener för dehydratase (nisB) och guanylatcyklas (nisC) har placerats på vektor pRSFDuet-1, som rapporterade tidigare35, som ger kanamycin resistens.

Obs: För nisA, var codons av de sista fyra aminosyrorna (ASPR) av sekvensen ledare muterat för att koda VSLR36 att återge proline återstoden i core peptiden unika och säkerställa korrekt prepeptide bearbetning av NisP. Vid N-terminalen lades en hexa-histidin tagg flankerad av linker rester av rening (se figur 1).

Figure 1
Figur 1 . Schematisk framställning av biosyntes och PTM av NisA i E. coli samt ledare klyvning av L. lactis indikator stammen i en efterföljande aktivitet assay. I det första steget, den inaktiva linjär prenisin (bestående av en ledare och en core peptid region som innehåller en unik prolin (rosa) på position 9) kodas av nisA syntetiseras ribosomally. Nästa, prenisin posttranslationally modifieras genom dehydratisering av serine och treonin rester till dehydroalanine (Dha) och dehydrobutyrine (Dhb) som katalyseras av NisB. Cyclase NisC bildar den thioether broar via Michael tillägg av cystein sulfhydryl grupper med Dha eller Dhb. Den inaktiva modifierade prenisin renas från E. coli och testade för antimikrobiell aktivitet. Här, transporteras det in i cellen av grampositiva L. lactis indikator stammen. Ledare är klyvs av proteashämmare NisP (vilket anges av en pilspets) för att släppa fullt aktiv nisin. Det kan också vara borttagna i vitro genom behandling med trypsin (*). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Använd standard heat-shock protokoll37 eller elektroporation38 för att omvandla prolin auxotrophic E. coli -stam (se ovan) med plasmider pET-3a nisA(VSLR) och pRSFDuet-1 nisBC.
  2. Pipettera 25-100 µL av omvandlade cellsuspension på agarplattor som innehåller ampicillin, kanamycin och 1% (w/v) glukos. Använd en tallrik spridare eller glaspärlor för att sprida lösningen jämnt på plattorna.
  3. Inkubera plattorna över natten vid 37 ° C.
  4. Följande eftermiddagen, använda en enda koloni för att Inokulera 10 mL LB medium innehållande ampicillin, kanamycin och 1% (w/v) glukos i en 50 mL mätkolv.
  5. Skaka kultur över natten (12-16 h) vid 37 ° C och 200 rpm.
  6. Ta 250 µL sterilt 80% glycerol och 550 µL kultur, blanda väl i en 2 mL tub och lagra som frysta cell lager vid 80 ° C.

2. nya minimalmedium (NMM) förberedelse

Obs: Detta protokoll använder NMM20 som kemiskt definierade flytande bakterietillväxt medium. Också, det rekommenderas att följa ordningen för beredning strängt. Annars kan nederbörd inträffa. Aminosyra former skiljer sig från de som anges i tabellen material (t.ex. hydrochlorides), kontrollera löslighet. NMM19 innehåller 19 aminosyror utom Luftfartsverket bytas (här, prolin) av ncAA analog. Se tabell 1 för slutliga ingrediens koncentrationer. Beroende på den bakteriestam som används för produktion, kan biotin och tiamin vara frivillig.

  1. Beredning av aminosyra blandningen
    1. Lös 0,5 g Phe, Trp och Tyr i 100 mL ddH2O med tillägg av några droppar koncentrerad HCl tills upplösning.
    2. Väg upp 0,5 g var och en av de återstående 16 aminosyrorna. Blanda med 22 mL 1 M KH2PO4 och 48 mL 1 M K2HPO4. Lägga till ddH2O ~ 800 mL. Rör tills lösningen blir klar.
    3. Tillsätt upplöst Phe, Trp och Tyr och justera volymen av lösningen till 1 L med ddH2O.
    4. Sterilisera aminosyra blandningen av dammsugarfilter med en flaska topp filterenhet.
  2. Stamlösningar för NMM19
    1. Först förbereda 1 M stamlösningar av följande komponenter: (NH4)2så4, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4 och en 5 M stamlösning av NaCl. Sterilisera i autoklav.
    2. Förbereda 50 mL bestånden av D-glukos (1 M), CaCl2 (1 g/L), FeCl2 (1 g/L), tiamin (10 g/L), biotin (10 g/L) och spårelement (CuSO4, ZnCl2, MnCl2, (NH4)2MoO4, 1 mg/L ). Sterilisera varje genom filtrering med spruta filter.
  3. NMM19 beredning
    1. Blanda alla lager lösningar för att få en slutlig koncentration av 7.5 mM (NH4)2SO4, 1,7 mM NaCl, 22 mM KH2PO4, 50 mM K2HPO4, 1 mM MgSO4 och 20 mM D-glukos, 50 mg/L aminosyra blanda, 1 µg/L CaCl2, 1 µg/L FeCl2, 10 µg/L tiamin, 10 mg/L biotin och 0.01 µg/mL spårämnen.

3. uttryck för rekombinant Nisin med inkorporeringen av prolin analoger av SPI

I detta avsnitt, rekombinant uttryck för prepeptide (här: nisA) och PTM gener (här: nisBC) utförs. Det första odlas celler i närvaro av alla cAAs, eftersom LB komplexa medium används. Glukos tillförs förtränga det mål genuttrycket på bakgrundsnivån, vilket annars kan leda till produktion av vildtyp peptid (här: nisin) på grund av leakiness av initiativtagarna. Endast efter målet cAA (här: prolin) är utarmat, ncAA läggs och målet genuttryck induceras i kemiskt definierade medium. Inkubering av flytande kulturer bör utföras i lämplig kolvar med luftning (t.ex. 500 mL i en 2 L Erlenmeyerkolv på 200 rpm).

  1. Med hjälp av en steril pipettspetsen, starta en färsk övernattning kultur från frysta cell lager eller färsk koloni (se steg 1). Använda 25 mL LB medium innehållande ampicillin, kanamycin och 1% (w/v) glukos och inkubera över natten (12-16 h) vid 37 ° C och 200 rpm.
  2. Inokulera 1 L av sterila färskt medium med 10 mL övernattning kultur (1% v/v) och inkubera vid 37 ° C och 200 rpm till OD600 = 0,5.
  3. Centrifugera vid 4 ° C under 15 minuter vid 4 500 x g.
  4. Häll av supernatanten och återsuspendera pelleten med 20 mL NMM19 (bereddes i steg 2,3) innehållande antibiotika och 1% (w/v) glukos. Centrifugera vid 4 ° C under 10 minuter vid 4 500 x g.
  5. Återsuspendera cellpelleten i 500 mL av samma medium och inkubera vid 30 ° C och 200 rpm för 1 h.
    Observera: I detta steg, cAA utarmning (här, prolin) sker.
  6. Dela in kulturen i lika delar (en för varje ncAA). Inducera varje kultur med 1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) och leverera 1 mM proline analoger (4S/R- fluoroproline, 4S/R- hydroxiprolin eller 4S/R- methanoproline).
    Obs: Som kontroll, en kultur kan levereras med 1 mM proline, vilket resulterar i vildtyp peptid produktion.
  7. Inkubera över natten (12-16 h) vid 28 ° C och 200 rpm.
  8. Centrifugera cellen kulturer i 50 mL rör vid 4 ° C i 20 min på 5 000 x g. Häll av supernatanten och lagra pellets vid-80 ° C tills rening.

4. isolering och rening av hans-taggade Nisin analoger

Peptider renas under denatureringen villkor med guanidin hydroklorid (GuHCl)39, en stark denatureringsmedel.

Varning: GuHCl är skadligt vid förtäring eller inandning och orsakar hud och allvarlig ögonirritation. Använd skyddsglasögon och skyddshandskar.

  1. Bereda 250 mL bindande buffert (5 M GuHCl, 300 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7,4), tvättbuffert (300 mM NaCl, 25 mM Tris, 25 mM Imidazol, pH 7,4) och eluering buffert (300 mM NaCl, 25 mM Tris, 250 mM Imidazol, pH 7,4). För dessa, överför fasta ämnen till en 250 mL-flaska och fylla upp till 200 mL med ddH2O. Mix väl och justera pH till 7,4 med 1 M NaOH eller HCl. Fyll sedan upp till 250 mL med ddH2O. Filter alla buffertlösningar med hjälp av en flaska topp filterenhet.
  2. Cellys
    Här används en någon sonikator (med 200 W maximal högfrekventa (HF) uteffekt); Observera att power inställningar behövs för cell störningar kan variera för andra instrument. Alla åtgärder utförs på is. Alternativt, kemiska cellys, en flytande Homogenisatorer eller en fransk press kan användas.
    1. Lägga till 12 mL bindande buffert i varje centrifugrör (från steg 3.8) och resuspendera av vortexa.
    2. Doppa spetsen av någon sonikator sonden in cellsuspension. Ange någon sonikator på 40% amplitud med puls 1 s på / 5 s off för 15 min.
      Obs: Ren någon sonikator spetsen mellan prover att undvika överföring. Torka den någon sonikator sonden med 70% etanol.
    3. Centrifugera lyserat cellsuspension vid 4 ° C i 40 min vid 15 000 x g till pellet cellfragment. Överföra supernatanterna till en ny reaktionsröret.
  3. Affinitetskromatografi
    För immobiliserade metall Jon affinitet kromatografi (IMAC)40, kan en Peristaltisk pump eller FPLC system användas med en 1 mL patron (här fylld med Ni-NTA harts). För beredning av buffertar, se steg 4.1.
    Obs: IMAC rening är genomförbart eftersom den producerade rekombinanta peptiden bär en N-terminalt hans-taggade ledare, som tas bort i steg 6 av leader-hämmare NisP, släppa mogen nisin. Utföra rening i rumstemperatur eller vid 4 ° C. Använda en flödeshastighet av 1 mL per minut om tillämpligt för IMAC patronen.
    1. Först tvätta patronen med 5 kolumn volymer (cv) av ddH2O ta bort lagring buffert.
    2. Jämvikta med 10 cv bindande buffert.
    3. Processen cell lysate (steg 4,2) använda en spruta filtrera för att ta bort partiklar, applicera sedan i patronen.
    4. Tvätta med 15 cv av tvättlösning för att ta bort ospecifik och obundna material.
    5. Eluera med 10 cv eluering buffert och samla 1 mL fraktioner i 1,5 mL rör. Lagra fraktionerna vid 4 ° C på kort sikt (upp till 3 dagar) eller vid-20 ° C för längre löptider.
    6. Förvaring, Tvätta patronen med 10 cv ddH2O följt av 5 cv 20% etanol.

5. LC-ESI-TOF massa spektrometriska analys av Nisin analoger

Obs: Se material tabell exempelvis instrumentering för vätskekromatografi tillsammans med elektrospray jonisering time-of-flight masspektrometri (LC-ESI-TOF-MS).

  1. Utför HPLC separation av 15-20 µL peptid lösning (beredd enligt steg 4,3) på en C5 kolumn med en mobil fas av vatten (A) och acetonitril (B) båda kompletteras med 0,1% myrsyra och en gradient från 5-80% B över 20 min. För masspektrometri (MS), använda eluering efter 5 min.
    Obs: Beroende på peptid innehåll och affinitet till i HPLC-kolonnen, provvolymer och separation kan behöva optimering.
  2. Använd lämplig programvara för att deconvolute de uppmätta masspektra och beräkna olika peptid avgiften anges41. Jämföra observerade peptid arter massan till beräknade vildtyp massan förändras av cAA → ncAA substitution. Beakta att den linjära prepeptide posttranslationally modifierats av åtta uttorkningar (-8 H2O) och fem cyclizations (se figur 1).
    Obs: Natrium-innehållande buffertar, MS analys i positivt läge kan visa natrium addukter. Dessa blir synlig som ytterligare toppar med högre deconvoluted massa (för varje natrium addukt, observerade deconvoluted massan är 22.99 Da högre). För att ta bort dessa addukter, HPLC rening42 eller omfattande dialys43 kan utföras.

6. Antimikrobiella aktivitet Test

  1. Beredning av GM17-agar plattor under sterila förhållanden
    1. Förbereda en övernattning kultur av indikator stam L. lactis NZ9000 transporterar plasmid pNG nisPT44 vid 30 ° C i M17 buljong45 med 1% (w/v) glukos (= GM17) och 5 µg/mL kloramfenikol.
    2. Mäta OD600, Inokulera färskt medium till OD600 = 0,1 och inkubera tills OD600 = 0,4-0,6. Sedan placera kolven på is.
      Obs: Varje OD600 mätning kommer att konsumera kultur volym. Tänk på att för varje analys agarplatta, 1 mL bakterieodling kommer att behövas. Om så krävs, skala upp flytande kultur volymen med detta.
    3. För 1,5% agar, väga ut 4,5 g agar i en glasflaska för media. Lägg till 300 mL ddH2O, mix och autoklav.
    4. Förbered 2 x M17 buljong (dubbelt koncentrerad) i 300 mL ddH2O och autoklav.
    5. Blanda 25 mL 2 x M17 buljong som innehåller 10 µg/mL kloramfenikol och 2% glukos med 1 mL L. lactis preculture (4% v/v).
    6. Tillsätt 25 mL smält 1,5% agar (nymalen autoklaveras eller uppvärmd i en mikrovågsugn).
      Obs: Före detta, låt flaskan svalna vid beröring (cirka 50 ° C). Detta är nödvändigt eftersom L. lactis är en innehåll organism känsliga för höga temperaturer.
    7. Häll lösningen i en stor petriskål. Torra plattor för 10-15 min.
    8. Sterilisera ändarna av ett glas Pasteur-pipett i lågan. Vänta tills den svalnat och sedan använda den breda änden för att skapa hål i den stelnade GM17-agar.
  2. Provberedning
    1. Ta 1 mL av E. coli uttryck kulturerna (skapade i steg 3,7) i en märkt 1,5 mL rör och Centrifugera under 3 minuter vid 7000 x g. Aspirera återstående medlet och återsuspendera cellpelleten i 500 µL Na-P (50 mM natriumfosfat buffert pH 7,4 tillverkad av 0,5 M natriumdivätefosfat och 0,5 M dinatriumvätefosfat).
    2. Sonikera proverna på is (jämför steg 4.2.2). Doppa spetsen av någon sonikator sonden in cellsuspension. Ange någon sonikator på 30% amplitud med puls 1 s på och 5 s off för 3 min.
    3. Centrifugera cellen lysate för 10 min vid 13 000 x g till pellet cellfragment. Överför supernatanten till en ny reaktionsröret på is.
    4. Späd och normalisera cell extrakt supernatanterna till 1 mL OD600 = 0,6, i förhållande till skördade cell densiteten, med Na-P.
  3. Aktivitetstestet
    1. Tillsätt 40 µL av varje normaliserade prov i ett hål av indikator agarplattan (figur 3). Använd kloramfenikol på 400 µg/mL som antibakteriella kontroll förening. Använda eluering buffert som en negativ kontroll. Vänta tills alla prover sprids till ägarn. Inkubera plattan över natten vid 30 ° C.
    2. Ta bilder av de agarplattor använder en flatbäddsskanner eller digital kamera. Tillväxt hämning halo storlekar kan vara uppmätta för hand eller med ImageJ46.

7. fluorescensmikroskopi

För att observera effekten av ampere på bakterieceller, kan ljus och fluorescence mikroskopi användas. Observera att nisin verkningsmekanismen är beroende av en destabilisering och bildandet av porer i bakteriell membran6. Här används Nile rött färga bakteriell cellmembranet, som blir utspridda och aggregerade vid cellys.

Obs: Se material tabell exempelvis instrumentering. Mängder av extra AMP lösning kan justeras beroende på peptid koncentration och bioaktivitet.

  1. Cell förberedelse
    1. Förbereda 10 mM Nile röd stamlösning i dimetyl sulfoxid (DMSO).
    2. Växa L. lactis indikator stam till OD600 = 1.0 som i steg 6.1.1-6.1.2.
    3. Centrifugera 1 mL kultur under 3 minuter vid 4 ° C och 5 000 x g.
    4. Kassera supernatanten, Återsuspendera i 1 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS)47.
    5. Centrifugera och resuspendera igen.
    6. Lägg 1 µL Nile röd stamlösning, blanda försiktigt.
  2. Mikroskopisk bild förvärv
    1. Tillsätt 30 µL av cell förberedelse på en cover bild medan spännande på 520 nm.
    2. Ställ in förvärv tid 0,2 s, kinetic-serien 0,1 Hz, serie längd 200 bilder.
    3. Lägga till 0,3 - 1,5 µL cell lysate eller IMAC prov (från steg 6.2.4 eller 4.3.5, respektive). För IMAC prover, kan eluering bufferten användas som en negativ kontroll.
    4. Övervaka och registrera fluorescens utsläpp vid λ ≥ 560 nm.
  3. Analys av data
    1. Mikroskopi bildsekvenser lagras som filmfiler (.avi). Enstaka bilder analyseras med ImageJ46.

Representative Results

Detta protokoll syftar till att möjliggöra produktion av ncAA-modifierade nisin varianter med rester-specifika inkorporering av prolin analoger av metoden SPI. Tidigare rapporterades genomförbarheten och avkastningen på 24 mg/L för rekombinant framställning av fullt modifierade vildtyp nisin39. Använder metoden SPI mål peptid och protein avkastning är ofta bra och kan nå kvantiteter nära vildtyp produktion48. Som första experiment, bör rekombinant vildtyp RiPP produktion testas i den valda auxotrophic mottagande. Här, den proline-auxotrophic E. coli MG1655 ΔProbo:: frt ΔproC:: frt (DE3) användes som värd stam. För införlivandet av ncAAs, odling och induktion kan timing samt medelstora sammansättning och temperatur optimeras mot maximal peptid avkastning.

Antimikrobiella aktivitet assay
Vildtyp rekombinant nisin produktion och rening utfördes efter protokollet ovan. I det här fallet användes proline istället för dess ncAA derivat vid steg 3.6. En antimikrobiell aktivitet assay användes att verifiera RiPP produktion och att jämföra antimikrobiella aktivitet före och efter rening. För aktivitet analysen, eluering fraktioner och IMAC genomflöde användes direkt och testats mot grampositiva L. lactis indikator stammen (figur 2). Som denna stam uttrycker NisP, varianter av nisin som ingår i E. coli cell lysates eller renat peptid prover, respektive aktiveras genom proteolytisk klyvning av ledare peptiden. Tydligen, genomströmmande visade tillväxt-hämmande aktivitet. Detta kan förklaras av bioaktiva material inte bindande till kolumnen IMAC. De testa eluering fraktionerna alla visade ökad aktivitet jämfört med orenat provet, vilket indikerar en koncentration av hans-taggade peptiden av IMAC. Observera att eluering bufferten (som negativ kontroll) inte påverkade tillväxten av L. lactis i denna analys.

Figure 2
Figur 2 . Antimikrobiella aktivitet testa efter IMAC rening av recombinantly producerade vildtyp nisin. Eluering fraktioner 5 till 15 och flödet genom IMAC rening testades i jämförelse med den orenat cell lysate (utspädd för OD600 normalisering) mot L. lactis indikator stammen. Storleken på tillväxt hämning glorior anger antimikrobiell aktivitet. Kloramfenikol vid en koncentration på 400 µg/mL användes som en positiv kontroll och IMAC eluering bufferten som negativ kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För att bevisa den antimikrobiella aktiviteten av recombinantly produceras nisin varianter som innehåller sex olika proline analoger, en aktivitet assay utfördes för att testa hämning av L. lactis indikator stammen. Figur 3 visar tillväxthämning för fem av de sex prover som produceras med hjälp av prolin analoger. De bästa resultaten (som bedöms från halo storlekar) observerades för inkorporeringen experiment av analog (4R) - fluoroproline, (4R) - hydroxiprolin och 4S-methanoproline. Jämföra tillväxt hämning halo storleken till den vildtyp nisin tillverkas och testas parallellt, alla tre nisin varianter visade liknande hämning styrka. Halo storlek ensam kan emellertid inte används för att bedöma en specifik aktivitet, eftersom koncentrationen av AMP inte fastställdes. Därför tjäna analyserna bara för att testa kvalitativt om antimikrobiella aktivitet av de resulterande nisin varianterna är bevarade eller förlorat. För att bestämma den specifika aktiviteten, måste koncentrationen av varianter av nisin vara kvantifierade (se diskussion).

Figure 3
Figur 3 . Antimikrobiella aktivitet haltbestämning av cell lysates innehållande nisin varianter produceras via SPI med proline analoger. Jämförelse av nisin varianter med rekombinant vildtyps-prover. Alla prover var OD600-normaliseras efter cell lysis i förhållande till den skördade celldensitet kultur. Glorior ange bioaktivitet i form av indikator stam tillväxthämning. Första raden från vänster till höger: (4R)-fluoroproline, (4R) - hydroxiprolin, (4R) - methanoproline och kloramfenikol (400 µg/mL; antimikrobiella positiv kontroll). Andra raden: (4S)-fluoroproline, (4S) - hydroxiprolin, (4S) - methanoproline och prolin (vildtyp kontroll). Observera den kemiska nomenklaturen. t.ex. (4R) - fluoroproline är också kallad trans-4 - fluoroproline. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

LC-ESI-TOF masspektrometri
Efter IMAC rening analyserades införlivandet av ncAAs i nisin med LC-ESI-TOF masspektrometri. Figur 4 visar de deconvoluted masspektra av en nisin variant som innehåller (4R)-fluoroproline. Denna variant var IMAC renas enligt ovan och därefter analyseras av LC-ESI-TOF masspektrometri, så det bar fortfarande ledare. Den största toppen i figur 4A motsvarar den modifierade nisin som innehåller (4R)-fluoroproline med en deconvoluted massa 6883.18 Da (beräknade massan 6882.05 Da, beräknas massan av motsvarande vildtyp peptiden med proline på position 9 är 6864.06 Da). De två topparna med lägre överflöd och högre massa motsvarar natrium addukter som anges. Figur 4 B visar olikt laddade arter av huvudsakligt förening som finns av deconvolution algoritmen. Till exempel toppen vid 1148.11 m/z motsvarar sex gånger laddade arten ([M + 6H]6 +).

Figure 4
Figur 4 . LC-ESI-TOF masspektrometri av IMAC-renat rekombinant nisin varianter innehållande (4R)-fluoroproline. (A) Deconvoluted masspektrometri kromatogrammet (utzoomad i infällt) för nisin varianten (fortfarande bär ledaren) med (4R)-fluoroproline (förväntat massorna (Da): [M + H]+ = 6882.05, [M + Na]+ = 6904.03, [M + 2Na]2 + = 6926.02). (B) sammansatta spectra för arter [M + H]+. Förväntat massorna (Da): [M + 5H]5 + = 1377.41, [M + 6 H]6 + = 1148.01, [M + 7 H]7 + = 984.15, [M + 8 H]8 + = 861.26, [M + 9 H]9 + = 765.67, [M + 10 H]10 + = 689.21, [M + 11 H]11 + = 626.64, [M + 12 H] 12 + = 574.50. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Fluorescensmikroskopi
Antimikrobiell aktivitet av rekombinant nisin och dess ncAA-innehållande varianter kan också visas genom direkt observation av de L. lactis indikator stam via fluorescensmikroskopi. Nile röd, ett starkt hydrofoba fluorescerande färgämne, användes för att färga bakteriell cellmembranet. Figur 5 visar den kvalitativa förändringen av tillståndet aggregering av cellodling och enda cellmorfologi. Cellerna var fläckade av Nile röd och deponeras på en mikroskopi cover bild. Den övre raden visar cellerna direkt i början när buffert, rekombinant vildtyp nisin eller nisin innehåller (4R)-fluoroproline, eller (4R)-hydroxiprolin lades till. Den nedre panelen visar motsvarande bilder efter 20 minuters inkubation.

Figure 5
Figur 5 . Fluorescensmikroskopi av rekombinant nisin effekt på grampositiva celler. Mikroskopiska bilder av 30 µL L. lactis indikator stam (OD600 = 1) märkt med Nile röd togs innan (övre panelen) och efter (nedre panelen) 20 min inkubation med 1 µL buffert (A), 0,3 µL rekombinant vildtyp nisin (B) och 0.6 µL nisin varianter innehållande (4R)-fluoroproline (C) och (4R)-hydroxiprolin (D). Blå cirklar Markera regioner med aggregerade eller deformerade celler, blå pilarna pekar till regioner där diffusion av fluorescerande membran fragment kan observeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5 A visar att det allmänna utseendet på cellerna inte ändrade inom 20 minuter för observation. Endast antalet celler som sätts in under den tid Rosen och därmed en större mängd celler är synlig inom den 80 µm x 80 µm i regionen observerade. Figur 5 B visar att grampositiva cellerna medverkade aggregerade och suddiga (markerad med blå cirklar) efter 20 minuters exponering för vildtyp nisin, även när låga belopp (här, 0,3 µL IMAC eluering) lades till. Dessutom sprids lätt material från celler in i bufferten, vilket indikerar att membranet fragment markerade med Nile röd var mobiliserade under tidsramen (markerad med blå pilar). Dessa fynd tyder cellys som det visades att inträffa vid behandling med nisin6,49. Liknande effekter observerades efter inkubation med den nisin variant som innehåller (4R) - fluoroproline (bild 5C) och nisin som innehåller (4R) - hydroxiprolin (figur 5D) båda visar stora mängder av förvrängd och aggregerade celler efter 20 minuter, i bjärt kontrast till stickprov (figur 5A).

Komponent Koncentration
(NH4) 2 SÅ4  7.5 mM
NaCl 8.5 mM
KH2PO4 22 mM
K2HPO4 50 mM
MgSO4 1 mM
D-glukos 20 mM
Alla kanoniska aminosyror
(utom den att ersätta)		 50 mg/L
Ca2 + 1 µg/mL
FE2 + 1 µg/mL
Spårämnen
(Cu2 +, Zn2 +, Mn2 +, MoOH2 +)		 0.01 µg/mL
Tiamin 10 µg/mL
Biotin 10 µg/mL

Tabell 1. Sammansättning av NMM19 kemiskt definierade bakterietillväxt medium efter beredning enligt steg 2.

Discussion

Genom att använda SPI för införande av prolin analoger, kan riktade nisin strukturer väsentligen ändras, skapa nya peptid varianter med unik teckensekvens kombinationer och kemiska egenskaper. På detta sätt kan grundläggande gränsen av klassiskt gentekniken kringgås, som begränsas till de side chain kemiska sammansättningar av de 20 cAAs. In vivo kemiska diversifiering av nisin som exemplifieras ovan visar en allmän riktlinje att komplettera naturliga PTMs och dramatiskt förbättra det kemiska utrymmet av RiPPs. Vi tror att utöka repertoaren av de naturliga aminosyrorna innehar stort löfte särskilt för ampere. I proteiner, kan ett enormt utbud av funktioner realiseras genom en definierad arrangemang av de 20 cAAs i tredimensionella strukturer. Med bara 7-100 aa i längd3, skulle sätt att uppnå sådana strukturella funktioner endast genom cAAs begränsas för ampere. Det är således inte förvånande att naturliga förstärkare i form av RiPPs är vanligen i stor utsträckning post-translationally modifierade4. På samma sätt håller ncAAs som alternativa byggstenar stort löfte att förbättra deras farmakodynamiska och farmakokinetiska parametrar (se Baumann et al. 201735 och referenser däri).

Den SPI-metod som använts i detta arbete fördelarna från en relativt lätt experiment, okomplicerad utförande och hög reproducerbarhet. På grund av globala substitution är multisite ncAA införlivande i målet peptider också möjligt. Däremot, kan metoden inte vara tillräcklig för byte av aminosyror som ofta uppstår i mål genen produkten. I princip, oönskad positioner kan ändras av webbplats riktad mutagenes, men dessa ytterligare ändringar kan också påverka flera AMP egenskaper inklusive struktur och bioaktivitet. När en auxotrophic stam för produktion är tillgänglig, kan flera ncAAs testas utan att kräva omfattande förändringar på genetisk nivå. Metoden är inte heller begränsad till auxotrophic E. coli stammar, men kan även utföras med naturliga produktion värden. Zhou et al. visade till exempel att SPI för produktion av romanen RiPPs fungerar även den naturligt Trp-auxotroph L. lactis: med hjälp av fastställda media, tre tryptofan analoger införlivades på fyra positioner i nisin50.

Eftersom metoden SPI leder till globala ersättare valda cAA av ncAA, det gäller generellt för ett brett spektrum av mål peptider och proteiner. Ett utbud av auxotrophic E. coli stammar är tillgängliga (se steg 1), vilket gör att flera cAAs varje testas för byte av ncAAs. Träffade analoger införlivas med metA-bristfällig stammar (t.ex. B834(DE3)) är oftast anställda. Exempel på isostructural Met analoger är azidohomoalanine (Aha) och homopropargylglycine (Hpg), kommersiellt tillgängliga ncAAs som effektivt kan införlivas. Både införa bioorthogonal handtag som tillåter fastsättning av molekyler som bär kompatibel alkynen eller natriumazid funktionalitet, respektive. Till exempel fluorescerande färgämnen eller polyetylenglykol (PEG) delarna kan fästas av koppar (I)-katalyseras natriumazid alkynen cykloadditionen (CuAAC)51.

Även om båda rekombinant ncAA inkorporering metoder (SPI och SCS) brukar uppnå tillräckliga mål mängder, avkastningen är ofta reduceras i förhållande till vildtyp produktionen av motsvarande peptider och proteiner. Som föroreningar ofta korrelerar med produktionseffektivitet, kan ytterligare reningssteg krävas, särskilt för låg-rikliga arter. I detta fall av rekombinant nisin produktion förenklar hans-taggade ledare sekvensen RiPP rening av selektiv anrikning från den cell lysates. Den rening som visas i detta protokoll förbättrar renhet och koncentration av nisin, men ofta ger inte AMP med tillräcklig för att fastställa avkastningen och specifik aktivitet. Vanligen används AMP reningsmetoder ingår förutom IMAC, HPLC, jonbyteskromatografi (IEC) och nederbörd (e.g.. med aceton eller triklorättiksyra (TCA)) eller kombinationer av dessa - vilket resulterar i ett utgångsämnet rening system52 . Det bör noteras att deras vanligen polycationic natur kan underlätta IEC rening. Frystorkning är ofta används för att lagra renat ampere.

Helst ncAAs för iblandning i ampere ska vara kommersiellt tillgänglig till överkomliga priser eller produceras enkelt av enkla och reproducerbara kemisk syntes protokoll. En lika viktig förutsättning för SPI-metoden är att ncAA är erkända, aktiveras och debiteras på den cognate tRNAen av de årliga verksamhetsrapporterna endogen eller samtidig uttryckt. Detta kan vara testade i vitro av aminosyra som aktivering eller tRNA aminoacylation assay53. Som ett lätt alternativ, SPI test uttryck av modell proteiner såsom grönt fluorescerande protein (GFP) bedrivs både i närvaro och i frånvaro av ncAA tillskott kan utföras. Dessutom löslighet i den tillväxt medium och cell permeabilitet samt kemisk stabilitet utgör viktiga faktorer.

I det här exemplet visades antimikrobiell aktivitet använder en grampositiva indikator stam. Som det uttrycker den leader-hämmare NisP, catalyzeds det sista steget av nisin mognad. Borttagning av sekvensen ledare (hans-märkta för rening ändamål) kan också vara utförda i vitro genom behandling med renat NisP50 eller trypsin54. Utanför ramen för detta arbete, patogena organismer och multiläkemedels resistenta stammar kan sedan testas för bakteriostatiska eller bakteriedödande hämning av AMPs använder en liknande metod. Kliniskt relevanta målarter inkluderar MRSA, MDR Mycobacterium tuberculosis, VRE, Acinetobacter baumannii, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa och Klebsiella pneumoniae. Förutom agar plattan diffusion assay presenteras här, tillväxt hämning kan också utföras med lämpliga flytande media inokuleras med bakteriearter och kompletteras med AMP. Med buljong utspädning metoder, kan den minsta hämmande koncentrationen (MIC) bestämmas med pure peptider55. Aktivitet analysen presenteras här kan också användas för att uppskatta bioaktivitet och styrkan av AMP-innehållande lösningar i förhållande till referens föreningar, till exempel kommersiellt tillgängliga nisin.

Rekombinant produktionen av RiPPs är ofta genomförbart39, som vanligen omfattar samtidig uttryck av PTM gener. Så snart produktionen stammen övergår i ett kemiskt definierade eller syntetiska minimal medium innehållande ett passande ncAA, sker rester-specifika byte av motsvarande Luftfartsverket. Således kan andra RiPPs produceras av samma metod, förutsatt att deras rekombinanta produktion är genomförbart och villkor kan hittas där ncAA införlivandet och PTM ge tillräckliga mängder målet produkt. Observera att förutom det mottagande cellen proteomet, peptid PTM maskiner kan också bli ncAA-modifierade under SPI. Tidpunkten för målet uttryck induktion och längden på följande inkubationstiden kan följaktligen kräver optimering. Eftersom ncAA införlivande PTM enzymer kan påverka deras stabilitet och verksamhet, kan produktion av den bearbetade RiPP i princip påverkas. Tillräcklig PTM enzym effekt indikeras av bildandet av bearbetade prepeptide, som upptäckts av MS och bioaktivitet analyser. Som infördes ovan, olika inducerbara initiativtagare kan användas för att producera PTM gener först (i frånvaro av ncAA) följt av induktion av föregångare peptid genen i närvaro av ncAA. I allmänhet måste produktionen av cAA-innehållande mål peptid undertryckas före tillsats av ncAA, varför snäva förtryck av föregångare genen är nödvändiga. Inom detta protokoll uppnås detta genom katabola förtryck genom tillsats av glukos till odlingsmedium. Särskilt eftersom de PTM enzymer som krävs för prepeptide bearbetning härstammar oftast från en genetiskt avlägsen värd, kan uttryck temperatur och kodon användning av motsvarande gener kräva optimering om rekombinant produktion har ännu inte etablerade. I princip, kan förekomsten av ncAAs i prepeptide störa erkännande och bearbetning av PTM enzymer, när det gäller nisin NisBC och NisP. För ncAA iblandning i ampere rekommenderas det således att utföra småskaliga uttryck experiment först för att identifiera lämpliga uttryck villkor och tillförlitlighet av AMP verksamhet analysen.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

J.H.N., T.B. och M.B. godkänner finansieringen av programmet EU FW7 (SYNPEPTIDE). F.-J.S. och T.F. godkänner finansieringen av det federala ministeriet för utbildning och vetenskap (BMBF Program ”HSP 2020”, TU-WIMIplus projekt SynTUBio) och den tyska forskningsfondens (Cluster of Excellence ”Unifying begrepp i katalys”).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sodium chloride Carl Roth, Germany P029
guanidine hydrochloride Carl Roth, Germany 0035.2
dipotassium hydrogen phosphate Carl Roth, Germany P749.3
potassium dihydrogen phosphate Carl Roth, Germany 3904.3
sodium dihydrogen phosphate monohydrate Carl Roth, Germany K300.2
disodium hydrogen phosphate Carl Roth, Germany P030.2
L-alanine Carl Roth, Germany 3076.2
L-arginine Carl Roth, Germany 3144.3
L-asparagine monohydrate Carl Roth, Germany HN23.1
L-aspartic acid Carl Roth, Germany T202.1
L-cysteine Carl Roth, Germany 3467.3
L-glutamine Carl Roth, Germany 3772.1
L-glutamic acid Carl Roth, Germany 3774.1
L-glycine Carl Roth, Germany 3187.3
L-histidine Carl Roth, Germany 3852.3
L-isoleucine Carl Roth, Germany 3922.3
L-leucine Carl Roth, Germany 3984.3
L-lysine monohydrate Carl Roth, Germany 4207.2
L-methionine Carl Roth, Germany 9359.4
L-phenylalanine Carl Roth, Germany 4491.2
L-proline Carl Roth, Germany T205.3
L-serine Carl Roth, Germany 4682.4
L-threonine Carl Roth, Germany T206.2
L-tryptophan Carl Roth, Germany 4858.2
L-tyrosine Carl Roth, Germany T207.2
L-valine Carl Roth, Germany 4879.4
ammonium sulfate Carl Roth, Germany 3746.3
magnesium sulfate Carl Roth, Germany 0261.2
D-glucose Carl Roth, Germany 6780 prepare a 20% (w/v) solution for addition into molten agar
calcium chloride Carl Roth, Germany PN93.2
iron(II) chloride Sigma-Aldrich, Germany 372870
thiamine hydrochloride Sigma-Aldrich, Germany T1270
biotin Carl Roth, Germany 3822.2
copper(II) sulfate Merck, Germany 102792
manganese(II) chloride Carl Roth, Germany KK36.2
zinc chloride Merck, Germany 108816
immonium orthomolybdate Sigma-Aldrich, Germany 277908
glycerol Carl Roth, Germany 7533.3
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Sigma-Aldrich, Germany I6758
ampicillin sodium salt Carl Roth, Germany K029.5 working concentration 100 µg/mL for E. coli, prepare 100 mg/mL stock in ddH2O
kanamycin sulfate Carl Roth, Germany T832.2 working concentration 50 µg/mL for E. coli, prepare 50 mg/mL stock in ddH2O
chloramphenicol Carl Roth, Germany 3886.1 working concentration 5 µg/mL for L. lactis, prepare 37 mg/mL stock in ethanol
(4S)-fluoroproline Bachem, Switzerland F-3970
(4R)-fluoroproline Bachem, Switzerland F-3975
(4S)-hydroxyproline Bachem, Switzerland F-1395
(4R)-hydroxyproline Bachem, Switzerland F-2980
(4S)-methanoproline chemically synthesized
(4R)-methanoproline chemically synthesized
hydrochloric acid (HCl) Carl Roth, Germany P074.4
ethanol VWR, Germany 20825.324
M17-broth Sigmal-Aldrich, Germany 56156 commercial product, see Terzaghi BE & Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13 for contents and preparation
agar-agar Carl Roth, Germany 5210.5
Nisin from Lactococcus lactis  Sigma-Aldrich, Germany N5764 commercial product, can be used as reference for bioactivity
dimethyl sulfoxide (DMSO) Carl Roth, Germany A994.1
imidazole Carl Roth, Germany 3899.3
1.5 mL autosampler vial for LC-MS Sigma-Aldrich, Germany Supelco 854165
acetonitrile VWR, Germany HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 LC-MS grade required
formic acid VWR, Germany HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 LC-MS grade required
1 mL Ni-NTA IMAC column, e.g. HisTrap FF Crude GE Healthcare, UK 29-0486-31 different manufacturers and resins available for IMAC
0.45 µm bottle top filter unit VWR, Germany 10040-470 sterile filtration of solutions using a vacuum pump
0.45 µm syringe filter PVDF membrane Carl Roth, Germany CCY1.1 sterile filtration of solutions using a syringe and to remove particles from cell lysates
luer-lock syringe, PP, 50 ml Carl Roth, Germany T552.2 sterile filtration of solutions  
1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf, Germany 30120086
petri dishes (polystyrene, sterile) Carl Roth, Germany TA19
Nile red Sigma-Aldrich, Germany 72485
E. coli ΔproA strain CGSC, Keio collection JW0233-2 proline-auxotrophic E. coli K-12 strain
E. coli B834(DE3) Novagen (Merck), Germany 69041 methionine-auxotrophic E. coli B strain
λDE3 Lysogenization Kit Novagen (Merck), Germany 69734-3
Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT bacterial indicator strain, see Khusainov R & Kuipers OP, PLoS One, 8 (9), e74890
benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf, Germany 5427 R
peristaltic pump GE Healthcare, UK P1
FPLC system GE Healthcare, UK Äkta Purifier 10 or the like
inverted microscope Nikon TI Eclipse wide-field fluorescence microscope  with 100x (N.A. 1.4) objective and Mercury Lamp example setup for fluorescence microscopy
electron multiplying CCD (EMCCD) camera Andor Technologies, UK Andor Luca  example setup for fluorescence microscopy
fluorescence excitation filter Thorlabs, USA Dichroic cube (TLV-U-MF2-TRITC) example setup for fluorescence microscopy
fluorescence emission filter AHF Analysentechnik, Germany T 560 LPXR example setup for fluorescence microscopy
cover slip 24 x 60 mm Carl Roth, Germany LH26.1 example setup for fluorescence microscopy
Immersion Oil Carl Zeiss, Germany Immersol 518 F example setup for fluorescence microscopy
probe sonicator Bandelin, Germany Sonopuls HD3200 with sonotrode MS-72 200 W maximum HF output
C5 HPLC column (2.1x100 mm, 3 µm particle size) Sigma-Aldrich, Germany 567227-U example setup for mass spectrometry
ESI-TOF coupled to HPLC system Agilent, USA Agilent 6530 Accurate Mass QTOF with 1260 HPLC example setup for mass spectrometry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferri, M., Ranucci, E., Romagnoli, P., Giaccone, V. Antimicrobial resistance: A global emerging threat to public health systems. Crit Rev Food Sci Nutr. 57 (13), 2857-2876 (2017).
  2. Bahar, A. A., Ren, D. Antimicrobial peptides. Pharmaceuticals. 6 (12), 1543-1575 (2013).
  3. Ageitos, J. M., Sánchez-Pérez, A., Calo-Mata, P., Villa, T. G. Antimicrobial peptides (AMPs): Ancient compounds that represent novel weapons in the fight against bacteria. Biochem Pharmacol. 133, 117-138 (2017).
  4. Arnison, P. G., et al. Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide natural products: overview and recommendations for a universal nomenclature. Nat Prod Rep. 30 (1), 108-160 (2013).
  5. Lubelski, J., Rink, R., Khusainov, R., Moll, G. N., Kuipers, O. P. Biosynthesis, immunity, regulation, mode of action and engineering of the model lantibiotic nisin. Cell Mol Life Sci. 65 (3), 455-476 (2008).
  6. Shin, J. M., Gwak, J. W., Kamarajan, P., Fenno, J. C., Rickard, A. H., Kapila, Y. L. Biomedical applications of nisin. J Appl Microbiol. 120 (6), 1449-1465 (2016).
  7. Scherer, K. M., Spille, J. -H., Sahl, H. -G., Grein, F., Kubitscheck, U. The lantibiotic nisin induces lipid II aggregation, causing membrane instability and vesicle budding. Biophys J. 108 (5), 1114-1124 (2015).
  8. Jung, G. Lantibiotica - ribosomal synthetisierte Polypeptidwirkstoffe mit Sulfidbrücken und α,β-Didehydroaminosäuren. Angew Chemie. 103 (9), 1067-1084 (1991).
  9. Rink, R., et al. Lantibiotic structures as guidelines for the design of peptides that can be modified by lantibiotic enzymes. Biochemistry. 44 (24), 8873-8882 (2005).
  10. Lagedroste, M., Smits, S. H. J., Schmitt, L. Substrate Specificity of the Secreted Nisin Leader Peptidase NisP. Biochemistry. 56 (30), 4005-4014 (2017).
  11. Ross, A. C., Liu, H., Pattabiraman, V. R., Vederas, J. C. Synthesis of the lantibiotic lactocin S using peptide cyclizations on solid phase. J Am Chem Soc. 132 (2), 462-463 (2010).
  12. Fukase, K., et al. Synthetic Study on Peptide Antibiotic Nisin. V. Total Synthesis of Nisin. Bull Chem Soc Jpn. 65 (8), 2227-2240 (1992).
  13. Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology. Chem Sci. 6 (1), 50-69 (2015).
  14. Kuthning, A., Durkin, P., Oehm, S., Hoesl, M. G., Budisa, N., Süssmuth, R. D. Towards Biocontained Cell Factories: An Evolutionarily Adapted Escherichia coli Strain Produces a New-to-nature Bioactive Lantibiotic Containing Thienopyrrole-Alanine. Sci Rep. 6, 33447 (2016).
  15. Piscotta, F. J., Tharp, J. M., Liu, W. R., Link, A. J. Expanding the chemical diversity of lasso peptide MccJ25 with genetically encoded noncanonical amino acids. Chem Commun (Camb). 51 (2), 409-412 (2015).
  16. Hartman, M. C. T., Josephson, K., Lin, C. -W., Szostak, J. W. An expanded set of amino acid analogs for the ribosomal translation of unnatural peptides. PLoS One. 2 (10), 972 (2007).
  17. Johnson, J. A., Lu, Y. Y., Van Deventer, J. A., Tirrell, D. A. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids into proteins: recent developments and applications. Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 774-780 (2010).
  18. Ibba, M., Söll, D. Aminoacyl-tRNAs: setting the limits of the genetic code. Genes Dev. 18 (7), 731-738 (2004).
  19. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
  20. Budisa, N., Steipe, B., Demange, P., Eckerskorn, C., Kellermann, J., Huber, R. High-level biosynthetic substitution of methionine in proteins by its analogs 2-aminohexanoic acid, selenomethionine, telluromethionine and ethionine in Escherichia coli. Eur J Biochem. 230 (2), 788-796 (1995).
  21. Rink, R., et al. Dissection and modulation of the four distinct activities of nisin by mutagenesis of rings A and B and by C-terminal truncation. Appl Environ Microbiol. 73 (18), 5809-5816 (2007).
  22. Kubyshkin, V., Durkin, P., Budisa, N. Energetic contribution to both acidity and conformational stability in peptide models. New J Chem. 40 (6), 5209-5220 (2016).
  23. Molloy, E. M., Field, D., O'Connor, P. M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Saturation mutagenesis of lysine 12 leads to the identification of derivatives of nisin A with enhanced antimicrobial activity. PLoS One. 8 (3), 58530 (2013).
  24. Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
  25. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  26. Anderson, J. C., Wu, N., Santoro, S. W., Lakshman, V., King, D. S., Schultz, P. G. An expanded genetic code with a functional quadruplet codon. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (20), 7566-7571 (2004).
  27. Zambaldo, C., Luo, X., Mehta, A. P., Schultz, P. G. Recombinant macrocyclic lanthipeptides incorporating non-canonical amino acids. J Am Chem Soc. 139 (34), 11646-11649 (2017).
  28. Al Toma, R. S., et al. Site-directed and global incorporation of orthogonal and isostructural noncanonical amino acids into the ribosomal lasso peptide capistruin. Chembiochem. 16 (3), 503-509 (2015).
  29. Chatterjee, A., Xiao, H., Schultz, P. G. Evolution of multiple, mutually orthogonal prolyl-tRNA synthetase/tRNA pairs for unnatural amino acid mutagenesis in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (37), 14841-14846 (2012).
  30. Budisa, N., Pal, P. P. Designing novel spectral classes of proteins with a tryptophan-expanded genetic code. Biol Chem. 385 (10), 893-904 (2004).
  31. Voller, J. -s, Thi To, T. M., Biava, H., Koksch, B., Budisa, N. Global substitution of hemeproteins with noncanonical amino acids in Escherichia coli with intact cofactor maturation machinery. Enzyme Microb Technol. 106, 55-59 (2017).
  32. Moghal, A., Hwang, L., Faull, K., Ibba, M. Multiple Quality Control Pathways Limit Non-protein Amino Acid Use by Yeast Cytoplasmic Phenylalanyl-tRNA Synthetase. J Biol Chem. 291 (30), 15796-15805 (2016).
  33. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  34. Engelke, G., Gutowski-Eckel, Z., Hammelmann, M., Entian, K. D. Biosynthesis of the lantibiotic nisin: genomic organization and membrane localization of the NisB protein. Appl Environ Microbiol. 58 (11), 3730-3743 (1992).
  35. Baumann, T., Nickling, J. H., Bartholomae, M., Buivydas, A., Kuipers, O. P., Budisa, N. Prospects of In vivo Incorporation of Non-canonical Amino Acids for the Chemical Diversification of Antimicrobial Peptides. Front Microbiol. 8, 124 (2017).
  36. Plat, A., Kluskens, L. D., Kuipers, A., Rink, R., Moll, G. N. Requirements of the engineered leader peptide of nisin for inducing modification, export, and cleavage. Appl Environ Microbiol. 77 (2), 604-611 (2011).
  37. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. J Vis Exp. , (2017).
  38. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. J Vis Exp. , (2017).
  39. Shi, Y., Yang, X., Garg, N., van der Donk, W. A. Production of lantipeptides in Escherichia coli. J Am Chem Soc. 133 (8), 2338-2341 (2011).
  40. Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. Nat Biotechnol. 6 (11), 1321-1325 (1988).
  41. Zhang, Z., Marshall, A. G. A universal algorithm for fast and automated charge state deconvolution of electrospray mass-to-charge ratio spectra. J Am Soc Mass Spectrom. 9 (3), 225-233 (1998).
  42. JoVE Science Education Database. High-Performance Liquid Chromatography (HPLC). J Vis Exp. , (2017).
  43. JoVE Science Education Database. Dialysis: Diffusion Based Separation. J Vis Exp. , (2017).
  44. Khusainov, R., Kuipers, O. P. The presence of modifiable residues in the core peptide part of precursor nisin is not crucial for precursor nisin interactions with NisB- and NisC. PLoS One. 8 (9), 74890 (2013).
  45. Terzaghi, B. E., Sandine, W. E. Improved medium for lactic streptococci and their bacteriophages. Appl Microbiol. 29 (6), 807-813 (1975).
  46. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  47. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
  48. van Hest, J. C. M., Tirrell, D. A. Efficient introduction of alkene functionality into proteins in vivo. Febs Lett. 428 (1-2), 68-70 (1998).
  49. Prince, A., et al. Lipid-II Independent Antimicrobial Mechanism of Nisin Depends On Its Crowding And Degree Of Oligomerization. Sci Rep. 6 (1), 37908 (2016).
  50. Zhou, L., et al. Incorporation of tryptophan analogues into the lantibiotic nisin. Amino Acids. 48 (5), 1309-1318 (2016).
  51. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Curr Protoc Chem Biol. 3 (4), 153-162 (2011).
  52. Abts, A., et al. Easy and rapid purification of highly active nisin. Int J Pept. 2011, 175145 (2011).
  53. Francklyn, C. S., First, E. A., Perona, J. J., Hou, Y. -M. Methods for kinetic and thermodynamic analysis of aminoacyl-tRNA synthetases. Methods. 44 (2), 100-118 (2008).
  54. van Heel, A. J., et al. Production and Modification of Five Novel Lantibiotics Using the Promiscuous Nisin Modification Machinery. ACS Synth Biol. 5 (10), 1146-1154 (2016).
  55. Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).

Tags

Bioteknik fråga 135 Nisin RiPPs ampere ncAAs lantibiotic prolin analog romanen antibiotika aktivitet assay grampositiva bakterier rekombinant produktion posttranslationell modifiering syntetisk biologi
Antimikrobiella peptider produceras av selektionstryck införlivandet av icke-kanoniska aminosyror
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nickling, J. H., Baumann, T.,… More

Nickling, J. H., Baumann, T., Schmitt, F. J., Bartholomae, M., Kuipers, O. P., Friedrich, T., Budisa, N. Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids. J. Vis. Exp. (135), e57551, doi:10.3791/57551 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter