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Bioengineering

Antimikrobielle Peptide produziert durch Selektionsdruck Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57551
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 3, 2, 1
1Department of Biocatalysis, Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin, 2Department of Bioenergetics, Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin, 3Molecular Genetics Group, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, Department of Molecular Genetics, University of Groningen
* These authors contributed equally

Summary

Das Protokoll stellt die Escherichia coli-basierte Selektionsdruck Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs) in Lactococcal antimikrobiellen Peptid Nisin. Während rekombinante Expression über Substitution mit gewünschten NcAAs in definierten Wachstumsmedien können seine Eigenschaften geändert werden. Daraus resultierenden Veränderungen in Bioaktivität werden durch Wachstum Hemmung Assays und Fluoreszenz-Mikroskopie zugeordnet.

Abstract

Die Natur hat eine Vielzahl von Möglichkeiten, um neue Proteinfunktionen zu erstellen, indem Sie ändern die Reihenfolge der einzelnen Aminosäuren-Bausteine. Alle Varianten basieren jedoch auf die 20 kanonischen Aminosäuren (cAAs). Als eine Möglichkeit, zusätzliche physikalisch-chemischen Eigenschaften in Polypeptide einzuführen ist die Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs) zunehmend in Protein-Engineering eingesetzt. Wegen ihrer relativ kurzen Länge ist die Änderung der ribosomally synthetisiert und posttranslational modifizierte Peptide von NcAAs besonders attraktiv. Neue Funktionalitäten und chemische Griffe können durch gezielte Modifikationen der einzelnen Rückstände erzeugt werden. Die Selektionsdruck Aufnahme (SPI) Methode nutzt auxotrophe Host-Stämme, die eine essentielle Aminosäure in chemisch definierten Wachstumsmedien beraubt werden. Mehreren chemisch und strukturell ähnliche Aminosäure-Analoga können dann durch die entsprechende Aminoacyl-tRNA synthestase aktiviert werden und bieten Rückstände-spezifische cAA(s) → ncAA(s) Substitutionen in der Zielsequenz Peptid oder Protein. Obwohl im Rahmen der SPI-Methode, NcAAs auch in das Host-Proteom während der Phase der rekombinanten Genexpression aufgenommen wurden, sind der Ausdruck des Zielgens der Großteil der Zelle Mittel zugewiesen. Dies ermöglicht effiziente Rückstände-spezifischen Einbeziehung der NcAAs oft mit hohen Mengen an veränderte Ziel begleitet. Das vorgestellte Werk beschreibt die in Vivo Einbindung der sechs Prolin Analoga in der antimikrobiellen Peptid Nisin, eine Lantibiotic, die natürlich von Lactococcus Lactisproduziert. Antimikrobielle Eigenschaften von Nisin können verändert und erweitert während der Gärung und Ausdruck in auxotrophe Escherichia-coli -Stämme in definierten Wachstumsmedium. Dabei können die Auswirkungen der Rückstände-spezifischen Ersatz der cAAs mit NcAAs Änderungen in antimikrobielle Wirksamkeit und Spezifität liefern. Antimikrobielle Aktivität Assays und Fluoreszenz-Mikroskopie werden verwendet, um die neuen Nisin-Varianten für Wachstumshemmung von eine grampositiven Lactococcus Lactis Indikator Belastung zu testen. Massenspektroskopie dient zum ncAA Einbindung in bioaktiven Nisin Varianten zu bestätigen.

Introduction

Die Entdeckung der Antibiotika im 20. Jahrhundert und die parallele Entwicklung neuer antimikrobieller Wirkstoffe gegen pathogene Mikroorganismen aktiviert gezielte Behandlung von bakteriellen Infektionen. Jedoch durch das Aufkommen von multiresistenten Erregern wie z. B. Methicillin-resistenten Staphylococcusaureus (MRSA), Vancomycin-resistenten Enterokokken (VRE), MDR (multiresistente) Salmonella Typhimurium Phagen Typ 10 (DT10 ), und Klebsiella Pneumoniae, es ist dringend notwendig, um neue antimikrobielle Wirkstoffe1erzeugen. Antimikrobielle Peptide (AMPs) sind vielseitig, häufig in hohem Grade spezifischen Verbindungen, die viel versprechende Kandidaten für die Entwicklung neuer Medikamente Dank ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften, Flexibilität, Größe, Hydrophobie und Modus der Aktion2. Verstärker sind kleine Peptide, die in der Regel bestehend aus 7-100 Aminosäuren. Oft haben sie eine kationische Struktur reich an positiv geladenen Arginin und Lysin Rückstände, die Interaktion mit der gezielten mikrobielle Zellmembran, die entgegengesetzt3 geladenen ist. Eine bestimmte Untergruppe von AMPs sind ribosomally synthetisiert und posttrans-modifizierte Peptide (RiPPs)4. Diese werden von vielen Organismen aus dem Reich der Pilze und der Domäne der Bakterien hergestellt. Eines der bekanntesten und am weitesten verbreiteten RiPPs ist Nisin natürlicherweise durch die Milchsäure-Bakterium Lactococcus Lactis (L. Lactis). Aktiv gegen eine Jury grampositiven Bakterien, wurde Nisin als eine Biopreservative in der Lebensmittelindustrie seit mehr als 50 Jahren aufgrund seiner antimikrobiellen Eigenschaften und das Fehlen von weiterentwickelten Widerstand in der gezielten mikrobielle Stämme5eingesetzt. Studien haben gezeigt, dass Nisin destabilisiert und Poren in der bakteriellen Zellmembran führt zu antimikrobielle Aktivität gegen beide grampositive und gramnegative Erreger6erzeugt. Durch die Bindung an Lipid II ist die bakterielle Zellwand-Synthese gehemmt7. Nisin wird von NisA als eine lineare Vorläufer-Peptid kodiert, bestehend aus einem Führer und eine Kernregion Peptid (Abbildung 1) ist. Nach der ribosomalen Synthese ist Prenisin zuerst durch die Dehydratase NisB geändert. Hier sind Serin und Threonin Rückstände in der prepeptide Kernregion dehydriert, Dehydroalanine (Dha) und Dehydrobutyrine (Dhb)8. Anschließend die entwässerten Rückstände mit Cystein in Form Lanthionine Ringe gekoppelt sind (daher der Name "Lantibiotic" für Lanthionine Ring-haltigen Antibiotika) durch einen Enzym-katalysierte Michael Zusatz. Diese posttranslationale Modifikation (PTM) ist durch die Cyclase NisC katalysiert. In L. Lactisdie modifizierte Prenisin wird dann aus der Zelle durch Transporter NisT transportiert und das Leader-Peptid ist gespalten von Proteinase NisP, die Reife und aktive Nisin Form9freizugeben. Der Verantwortliche Leiter Peptidase NisP hat eine hohe Substratspezifität, da es nur Prozesse modifiziert Nisin effizient10.

Im allgemeinen führen aktive RiPPs durch die Aktion des PTM Enzyme (z. B. NisBC), die den chemischen Raum kurze Peptide, z.B. durch Acetylierung, Glykosylierung, Methylierung oder Phosphorylierung drastisch zu erhöhen. Dieses Maß an Komplexität kann durch die direkte Einbindung von NcAAs weiter ausgebaut werden. Während oft möglich, ist chemische Synthese von AMPs eine Herausforderung für die Großserie aufgrund ihrer strukturellen Komplexität. Beispielsweise wurde die chemische Synthese von Lantibiotic Lactosin S in 71 Reaktionsschritte mit einer endgültigen Rendite von 10 % und die der Nisin mit einer groben Ausbeute von nur 0,003 %11,12erreicht. Biologische Produktion bietet daher eine echte Alternative, durch die Erzeugung von korrekten Stereozentren und hohe Konzentration.

Bis heute wurden mehr als 150 NcAAs, z. B. mit funktionellen Gruppen mit Fluor oder Azides, in rekombinanten Proteinen aufgenommen, und mehrere Beispiele der ncAA-modifizierte AMPs wurden gemeldeten13,14, 15,16. Mit der Einführung des NcAAs können neuartige physikalisch-chemischen Eigenschaften im Vergleich zu konventionellen Mutagenese erzeugt werden. Die Vielfalt der bestehenden Peptide kann erhöht werden, um neuartige Antibiotika führen.

Eine Methode für die Einbindung der NcAAs in rekombinanten Peptide ist Selektionsdruck Aufnahme (SPI) basiert auf der Verwendung von auxotrophe Bakterienstämme17. Diese Stämme sind nicht in der Lage, zur Synthese der entsprechenden cAA-Analog der ncAA. Die Methode verwendet die häufig beobachtete entspannt Substratspezifität kennzeichnend für viele natürliche Aminoacyl-tRNA-synthetasen (AaRSs)-18. Abgesehen von ihrer natürlichen cAA-Substrate sind oft diese Enzyme in der Lage zu erkennen und aktivieren Sie die gewünschten ncAA und laden Sie es auf ihre Verwandten tRNA(s). Dies führt zu ribosomale Einbeziehung der ncAA in das Ziel-Genprodukt Rückstände-spezifisch (d.h., cAA → ncAA "Vertretung"). Dies ist natürlich nur möglich, wenn der gewünschte ncAA strukturell und chemisch ähnlich wie die kanonische Aminosäure ist und von der Zellphysiologie, der übersetzungsmaschinerie und die Zielsequenz Peptid oder Protein toleriert. In einem bestimmten Versuchsaufbau sind auxotrophe Wirtszellen in definierten Mediums im Lieferumfang einer begrenzenden Konzentration der native Aminosäure ersetzt werden kultiviert. Das Zellwachstum oder Austausch von cAA-freies Medium führt zu intrazellulären Abbau der cAA. Im nächsten Schritt der ncAA wird hinzugefügt und die Ziel-Genexpression induziert wird. Es ist unvermeidlich, NcAAs jetzt auch in vielen anderen Proteinen in der Wirtszelle in dieser Phase der Ziel-gen-Expression fließen. Dennoch ist die Toxizität der SPI-Einrichtung auf einem niedrigen Niveau gehalten, da Escherichia coli (E. Coli)-Stamm mit einem Plasmid trägt das Zielgen unter Kontrolle eines starken Promotors umgewandelt wird (häufig der hart umkämpften T7-Promoter / RNA-Polymerase-System)19. Unmittelbar nach Induktion (in der Regel, wenn die cAA erschöpft ist), der Gastgeber, die Zellen nicht mehr wachsen und ihre zytoplasmatischen enzymatischen Maschinen dienen hauptsächlich für Expression des Zielgens Plasmid-basierte. Site-verwiesene Mutagenese lässt sich die Webseite(n) Rückstände-spezifische ncAA-Installation in den Ziel-gen20definieren.

Als ein Modell Peptid für die Einbeziehung von NcAAs wurde die Pentacyclic AMP Nisin A gewählt. Es ist 34 Aminosäuren lang und hat nur einen einzigen Prolin Rückstand im Kern Peptidsequenz (Abbildung 1). Wie Subtilisin, Ericin A und S und Epidermin ebenso wie Nisin Z und Nisin Q scheint die konservierte Prolin für Aktivität9,21. Die cAA-Prolin spielt eine besonders wichtige Rolle bei der Peptidyl-Prolyl Amid Drehung und Sekundärstruktur Stabilisierung. Der Side-Chain ring Konformationen (Exo / Endo Falten) sind verantwortlich für eine thermodynamische Stabilisierung der Amid-Bindung. Gezielte chemische Modifikationen (z. B. Hydroxylations, Fluorinations, Methylations) der Prolyl-sized beeinflussen oft kritisch die klappbare Stabilität, Gerüst Steifigkeit und Funktionen von vielen biologischen Strukturen22. So ist es plausibel anzunehmen, dass die Pro→ Prolin analoge Ersetzungen Ring B, der zweite Ring von Nisin, mit neuartigen und ungewöhnlichen Eigenschaften verleihen werden.

Hier, eine Prolin-auxotrophe E. Coli -Stamm wurde für die Produktion von rekombinanten Nisin verwendet. Dies erfordert die Expression von prepeptide gen NisA sowie die Änderung Enzym Gene NisBC. Die genetisch kodierte Peptid-Produkt trägt einen N-Terminal sein-tagged Führer für Reinigung über Affinitätschromatographie. Zur Bestimmung der Aktivität ist L. Lactis auszudrücken und Sekretion von NisPT verwendet, um die rekombinante Nisin Varianten von E. Coli Zelle Lysates oder gereinigte Peptid Proben (Abbildung 1) zu aktivieren. Die Reifen AMP wird nach der Spaltung des Führers durch NisP freigegeben. In dieser Agar-Diffusion-Methode die AMP-Probe diffundiert in das solide Wachstumsmedium und kann hemmen das Wachstum von Gram-positive Mikroorganismen. Nach der Inkubation kann dies visuell durch Wachstum Hemmung Lichthöfe beobachtet werden. Neben L. Lactis als Indikator modifiziert zeigte antimikrobielle Aktivität gegen Lactobacillus Johnsonii , Staphylococcus Aureus und Bacillus Cereus, Enterococcus FaecalisNisin-Varianten 21,23.

Eine alternative und experimentell verschiedene Methode, NcAAs in RiPPs zu integrieren ist Stopp-Codon Unterdrückung (SCS)24. Hierzu eine orthogonale tRNA / Aminoacyl-tRNA synthestase (AaRS) Paar für die entsprechenden ncAA erforderlich ist. Idealerweise sind diese drei Komponenten Bioorthogonal, d. h. , die sie nicht mit den endogenen tRNAs und AaRSs interagieren. Eine ncAA-spezifische AaRS kann durch Änderung der aktiven Seite Enzym und Screening von genetischen Bibliotheken von mutierten synthetasen25erzeugt werden. Darüber hinaus erfordert die Einführung einer ncAA ein Codon, zugewiesen wird und die ist nicht für die cAA kodieren. Im Allgemeinen ist der Bernstein Stopcodon verwendeten24,26.

Vor kurzem wurde SPI für die Einbeziehung der α-Chloracetamid-haltigen und Klick-Chemie-kompatible NcAAs in NisA27gegründet. Zum Beispiel wurde Nε- Alloc-Lysin in der Lasso-Peptid-Captistruin mit ortsspezifischen (SCS) und Rückstände-spezifische (SPI) Aufnahme Methoden und nachträglich geänderte in Vitro von Ruthenium-katalysierte Metathese28 eingegliedert. . Im Vergleich zu SPI die SCS-Methode ist seit einer orthogonalen tRNA komplizierter / AaRS paar Co ausgedrückt werden muss. O-Paare für Prolin Einarbeitung haben bisher entwickelten29, aber nach bestem Wissen und gewissen, ist kein Beispiel für Prolin analoge Aufnahme berichtet worden.

Es sei darauf hingewiesen, dass nicht alle NcAAs mit der SPI-Methodik integriert werden können. Erstens unterliegt die Aufnahme von NcAAs in das Zytoplasma durch eine Vielzahl von Transport-Proteine, die in der zytoplasmatischen Membran eingebettet sind, ist die innere Membran für Gramnegative Bakterien wie E. Coli. E. Coli ist normalerweise in der Lage, eine Vielzahl von Aminosäure-Analoga in der Zelle mit Seitenketten strukturell zu transportieren und kanonischen Aminosäuren chemisch ähnlich. Zweitens viele chemisch reaktiv oder instabilen NcAAs könnte als Inhibitor für Zellwachstum, handeln, da sie giftig sind für den Stoffwechsel und die Physiologie des Wirtes30 Zelle. Daher sollte die Aufnahme und die Toxizität von der ncAA für die Produktions-Server vorher getestet werden. Zur Inaktivierung der PTM Maschinen als Nebenwirkung zu vermeiden, kann eine streng kontrollierten Ausdruck Setup der verantwortlichen Gene verwendet werden, um die natürliche Aminosäure in der Modifikation Enzyme (z. B. NisBC) zu integrieren und der ncAA in das Zielgen ( z. B. NisA). Dies kann erreicht werden, mit zwei verschiedenen Promotoren und Induktion der Genexpression Ziel, wie in speziell entwickelten SPI Protokolle31gezeigt. Wie oben beschrieben, setzt die SPI-Methode auf die entspannte Substratspezifität der AaRS, die ncAA-Aktivierung und cognate tRNA aufladen ermöglicht. Anschließend wird die tRNA an das Ribosom gefolgt von Amid Bindung Bildung und Faltung des Peptids Ziel (Poly) geliefert. In dieser Prozesse können Korrekturlesen und redigieren Mechanismen relevanten32geworden. Aus diesen Gründen ist es von großer Bedeutung, ein Ziel zu haben ncAA, die strukturell und chemisch ähnlich der cAA. Weitere Kernpunkte sind ausreichende Stabilität (sowohl in den Wachstumsmedien und des Zellstoffwechsels ausgesetzt) und Löslichkeit der ncAA. Darüber hinaus sollte es entweder kommerziell verfügbar oder einfach chemisch synthetisiert werden.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für SPI, wodurch Rückstände-spezifische Einbindung der NcAAs in rekombinanten RiPPs. Vor allem, verschiedene Prolin Analoga fließen in die antimikrobiellen Peptid Nisin A mit E. Coli als Wirtsorganismus. Massenspektrometrie wird verwendet, um die Aminosäure Ersatz zu überprüfen und Peptid-Produkte sind für die Bioaktivität mit Wachstum Hemmung Assays und Fluoreszenz-Mikroskopie mit mikrobiellen Indikator Stämme analysiert.

Die Grundvoraussetzung für erfolgreiche rekombinante Nisin Ausdruck mit definierten NcAAs erfordert eine geeignete Prolin auxotrophe E. Coli -Stamm. Dafür muss auxotrophien, ProA dysfunktionalen, zum Beispiel durch genomische Knockout erzielt. Zellen vollständig entzogen, der intrazellulären Pro Biosynthese (d. h. Löschen von proABC) ohne Möglichkeit zur Umkehr sind stabile Auxotrophs. Weit verbreitete gen Knockout Methoden sind Phagen Transduktion oder Single-gen Knockout nach Datsenko & Wanner33. Darüber hinaus erhalten Sie bei öffentlichen Repositories wie Addgene, CGSC oder der Keio-Sammlung ProA ko-Stämme. Da der rekombinanten NisABC Ausdruck hier gezeigten stützt sich auf die Verwendung von T7-Promoter, hat der Ausdruck Host Stamm ein induzierbaren T7-RNA-Polymerase-Gen tragen. Dies kann durch Einführung des λDE3 Prophage in das wirtsgenom, zum Beispiel mit dem kommerziellen Kit erreicht werden. Alternativ können Stämme wie BL21(DE3) auxotrophe wie oben beschrieben erfolgen.

Protocol

1. Klonen Expressionsvektoren und Umwandlung der einen auxotrophe Produktionsstamm

Hierin wurden die Gene für Nisin Biosynthese, nämlich NisABC, L. Lactis entnommen und in T7-basierte Plasmid Expressionsvektoren übertragen. GenBank-Eintrag X6830734finden Sie vollständige DNA-Sequenzen von NisABC . Das Gen für das Vorläufer-Peptid (NisA) wurde auf ein Haustier-3a-Vektor gelegt, die Ampicillin-Resistenz verleiht. Gene für die Dehydratase (NisB) und Cyclase (NisC) haben auf Vektor pRSFDuet-1, als gemeldete früher35, Kanamycin-Resistenz verleiht gelegt.

Hinweis: Für NisA, waren die Codons der letzten vier Aminosäuren (ASPR) von der Leader-Sequenz mutiert, um VSLR36 den Prolin-Rückstand in der Kern-Peptid einzigartig machen und richtige Prepeptide Verarbeitung durch NisP kodieren. Am N-Terminus wurde ein Hexa-Histidin-Tag, flankiert von Linker Rückstände für Reinigung Zwecke hinzugefügt (siehe Abbildung 1).

Figure 1
Abbildung 1 . Schematische Darstellung der Biosynthese und PTM NisA in E. Coli sowie Führer Spaltung durch die L. Lactis Indikator Dehnung in eine nachfolgende Aktivität Assay. In einem ersten Schritt die inaktiven lineare Prenisin (bestehend aus einem Führer und eine Kernregion Peptid enthält eine einzigartige Prolin (rosa) auf Position 9) kodiert durch NisA ribosomally synthetisiert wird. Als nächstes wird Prenisin posttrans-durch Austrocknung der Serin und Threonin Rückstände an Dehydroalanine (Dha) und Dehydrobutyrine (Dhb) geändert, wie durch NisB katalysiert. Cyclase NisC bildet der Thioether Brücken über Michael Zugabe von Cystein Sulfhydryl Gruppen mit Dha oder Dhb. Die inaktiven modifizierte Prenisin aus E. Coli gereinigt und getestet für antimikrobielle Aktivität. Hier wird es in der Zelle der gram-positiven L. Lactis Indikator Belastung transportiert. Der Führer ist durch Protease NisP (wie durch eine Pfeilspitze angezeigt) abgespalten, um vollaktives Nisin freizugeben. Es werden auch entfernt in Vitro durch Behandlung mit Trypsin (*). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

  1. Verwenden Sie standard Hitzeschock Protokoll37 oder Elektroporation38 auxotrophe Prolin zu verwandeln E. Coli -Stamm (siehe oben) mit der Plasmide Haustier-3a NisA(VSLR) und pRSFDuet-1 NisBC.
  2. Pipette 25-100 µL der transformierten Zellsuspension auf Agarplatten mit Ampicillin, Kanamycin und 1 % (w/V) Glukose. Verwenden Sie eine Platte Streuer oder Glasperlen, um die Lösung gleichmäßig auf den Platten zu verbreiten.
  3. Platten über Nacht bei 37 ° c inkubieren
  4. Verwenden Sie am folgenden Nachmittag, eine einzige Kolonie 10 mL LB-Medium mit Ampicillin, Kanamycin und 1 % (w/V) Glukose in ein 50 mL Fläschchen zu impfen.
  5. Schütteln Sie Kultur über Nacht (12-16 h) bei 37 ° C und 200 u/min.
  6. Nehmen Sie 250 µL steriler 80 % Glycerin und 550 µL Kultur, mischen Sie gut in eine 2 mL-Tube und speichern Sie als gefrorene Zelle bestand bei 80 ° C.

2. neue minimaler Medium (NMM) Vorbereitung

Hinweis: Dieses Protokoll verwendet NMM20 als Medium chemisch definierten flüssigen Bakterienwachstum. Außerdem ist es ratsam, die Reihenfolge der Zubereitung streng zu folgen. Andernfalls kann Niederschläge auftreten. Aminosäure-Formen in der Materialtabelle (z. B. Hydrochlorides) aufgeführten abweicht finden Sie in der Löslichkeit. NMM19 enthält 19 Aminosäuren mit Ausnahme der cAA ersetzt werden (hier: Prolin) von der ncAA Analog. Siehe Tabelle 1 für die letzte Zutat-Konzentrationen. Je nach den Bakterienstamm verwendet für die Produktion können Biotin und Thiamin optional sein.

  1. Vorbereitung der Aminosäure-Mischung
    1. Lösen Sie 0,5 g Phe, Trp und Tyr in 100 mL DdH2O mit der Zugabe von ein paar Tropfen konzentrierter HCl bis zur Auflösung.
    2. Je der restlichen 16 Aminosäuren 0,5 g abwiegen. Mit 22 mL 1 M KH2PO4 und 48 mL 1 M K2HPO4mischen. ~ 800 mL DdH2O hinzufügen. Rühren Sie, bis die Lösung klar wird.
    3. Fügen Sie die gelösten Phe, Trp und Tyr und stellen Sie die Lautstärke auf 1 L-Lösung mit DdH2O.
    4. Die Aminosäure-Gemisch durch Vakuumfiltration mit einer Flasche Top Filteranlage zu sterilisieren.
  2. Lagerlösungen für NMM19
    1. Zuerst bereiten Sie 1 M Stammlösungen aus den folgenden Komponenten: (NH4)2SO4, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4 und 5 M NaCl Lösung auf Lager. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren.
    2. Bereiten Sie 50 mL Bestände von D-Glucose (1 M), CaCl2 (1 g/L), FeCl2 (1 g/L), Thiamin (10 g/L), Biotin (10 g/L) und Spurenelemente (CuSO4, ZnCl2, MnCl2, (NH4)2MoO4; 1 mg/L ). Sterilisieren Sie jeweils durch Filtration mit einer Spritze-Filter.
  3. NMM19 Vorbereitung
    1. Mischen Sie alle Stammlösungen um eine Endkonzentration von 7,5 mM (NH4)2zu erhalten SO4, 1,7 mM NaCl, 22 mM KH2PO4, 50 mM K2HPO4, 1 mM MgSO4 und 20 mM D-Glucose, 50 mg/L-Aminosäure Mischen Sie, 1 µg/L CaCl2, 1 µg/L FeCl2, 10 µg/L Thiamin, Biotin 10 mg/L und 0,01 µg/mL Spurenelemente.

3. Ausdruck der rekombinanten Nisin mit Gründung der Proline-Analoga von SPI

In diesem Abschnitt, rekombinante Expression von der Prepeptide (hier: NisA) und PTM Gene (hier: NisBC) erfolgt. Erstens sind Zellen im Beisein aller cAAs angebaut, da komplexe LB-Medium verwendet wird. Glukose wird hinzugefügt, um die Ziel-gen-Expression auf Hintergrund-Ebene, zu unterdrücken, die sonst für die Produktion von Wildtyp Peptid führen könnten (hier: Nisin) wegen Undichtigkeit der Promotoren. Nur nach dem Ziel cAA (hier: Prolin) ist erschöpft, der ncAA wird hinzugefügt und Ziel-gen-Expression in chemisch definiertes Medium induziert wird. Inkubation von flüssigen Kulturen sollten in geeignete Flaschen mit Luft (z. B. 500 mL in einem 2 L-Erlenmeyer-Kolben bei 200 u/min) durchgeführt werden.

  1. Mit einer sterilen PIPETTENSPITZE starten eine frische Nacht Kultur von gefrorenen Zelle Lager oder frische Kolonie (siehe Schritt 1). Verwenden Sie 25 mL LB-Medium mit Ampicillin, Kanamycin und 1 % (w/V) Glukose und inkubieren Sie Übernachtung (12-16 h) bei 37 ° C und 200 u/min.
  2. 1 L des sterilen frisches Medium mit 10 mL über Nacht Kultur (1 % V/V) zu impfen und Inkubation bei 37 ° C und 200 u/min bis OD600 = 0,5.
  3. Zentrifuge bei 4 ° C für 15 min bei 4.500 x g.
  4. Der Überstand abgießen und das Pellet mit 20 mL NMM19 (vorbereitet in Schritt 2.3) mit Antibiotika und 1 % (w/V) Glucose Aufschwemmen. Zentrifuge bei 4 ° C für 10 min bei 4.500 x g.
  5. Aufschwemmen Sie Zelle Pellet in 500 mL des gleichen Mediums und inkubieren Sie bei 30 ° C und 200 u/min für 1 h.
    Hinweis: Bei diesem Schritt findet die cAA Erschöpfung (hier: Prolin) statt.
  6. Teilen Sie die Kultur in gleiche Teile (eine für jede ncAA). Jede Kultur mit 1 mM Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG) induzieren und liefern 1 mM Proline Analoga (4S/R- Fluoroproline, 4S/R- Hydroxyprolin oder 4S/R- Methanoproline).
    Hinweis: Als Kontrolle, eine Kultur mit 1 mM Prolin, wodurch Wildtyp Peptid-Produktion versorgt werden kann.
  7. Inkubieren Sie Übernachtung (12-16 h) bei 28 ° C und 200 u/min.
  8. Zentrifugieren der Zelle Kulturen in 50 mL Röhrchen bei 4 ° C für 20 min bei 5.000 x g. überstand abgießen und Pellets bei-80 ° C bis zur Reinigung zu lagern.

4. Isolierung und Reinigung der sein-tagged Nisin Analoga

Peptide sind unter denaturierenden Bedingungen mit Guanidin-Hydrochlorid (GuHCl)39, eine starke Vergällungsmittel gereinigt.

Achtung: GuHCl ist schädlich, wenn es verschluckt oder eingeatmet und bewirkt, dass Haut und schwere Augenreizung. Tragen Sie Schutzbrille und Handschuhe.

  1. Bereiten Sie 250 mL Puffer (5 M GuHCl, 300 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7,4), Waschpuffer (300 mM NaCl, 25 mM Tris, 25 mM Imidazol, pH 7,4) und Elution Buffer (300 mM NaCl, 25 mM Tris, 250 mM Imidazol, pH 7,4) zu binden. Für diese übertragen die Feststoffe in eine 250 mL Flasche und füllen Sie bis zu 200 mL mit DdH2O. Mix gut und Anpassen des pH-Werts 7,4 mit 1 M NaOH oder HCl. Dann füllen Sie bis zu 250 mL mit DdH2O. Filter alle Pufferlösungen mit einer Flasche Top Filter-Einheit.
  2. Zell-Lyse
    Hier dient ein sonikator (mit 200 W maximale Hochfrequenz (HF) Ausgabe); Beachten Sie, dass die Energieeinstellungen für Zellaufschluss benötigt für andere Instrumente unterscheiden können. Alle Schritte werden auf Eis durchgeführt. Alternativ kann chemische Zelle Lyse, eine flüssige Homogenisator oder eine französische Presse verwendet werden.
    1. Jede Zentrifugenröhrchen (aus Schritt 3,8) 12 mL Bindung Puffer hinzu und Aufschwemmen durch aufschütteln.
    2. Tauchen Sie die Spitze der Sonde sonikator in der Zellsuspension. Set sonikator bei 40 % Amplitude mit Puls der 1 s / 5 s aus für 15 min.
      Hinweis: Reinigen Sie die sonikator Spitze zwischen Proben um Verschleppung zu vermeiden. Wischen Sie die sonikator-Sonde mit 70 % Ethanol.
    3. Zentrifugieren der lysierten Zellsuspension bei 4 ° C für 40 min. bei 15.000 x g, pellet-zellenrückstand. Übertragen Sie die Überstände auf ein neues Reaktionsgefäß.
  3. Affinitätschromatographie
    Für stillgestellte Metallionen Affinität Chromatographie (IMAC)40kann eine Peristaltische Pumpe oder FPLC System mit einer 1 mL-Kartusche (hier gefüllt mit Ni-NTA-Harz) verwendet werden. Für Vorbereitung der Puffer siehe Punkt 4.1.
    Hinweis: IMAC Reinigung ist möglich, da der hergestellte rekombinante Peptid trägt eine N-Terminal sein-tagged Führer, die in Schritt 6 durch Führer Peptidase NisP, Veröffentlichung Reife Nisin entfernt wird. Führen Sie die Reinigung bei Raumtemperatur oder bei 4 ° c Verwenden Sie ggf. einen Durchfluss von 1 mL pro Minute für die IMAC-Patrone.
    1. Erstens, waschen Sie die Kartusche mit 5 Spalte Volumen (cv) von DdH2O Puffer speichern entfernen.
    2. Equilibrate mit 10 cv Bindung Puffer.
    3. Prozesses Zelle lysate (Schritt 4.2) mit eine Spritze filtern, um Partikel zu entfernen, dann gelten für die Patrone.
    4. Waschen mit 15 cv Waschpuffer um unspezifische und ungebundenes Material zu entfernen.
    5. Eluieren mit 10 cv Elution Buffer und sammle 1 mL Fraktionen in 1,5 mL-Tuben. Speichern Sie die Brüche bei 4 ° C für kurze Zeit (bis zu 3 Tage) oder bei-20 ° C für längere Laufzeiten.
    6. Für die Lagerung, waschen Sie die Kartusche mit 10 cv DdH2O gefolgt von 5 cv von 20 % Ethanol.

5. LC-ESI-TOF massenspektrometrische Analyse von Nisin Analoga

Hinweis: Siehe Materialtabelle z. B. Instrumentierung für Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Electrospray Ionisierung Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-ESI-TOF-MS).

  1. Führen Sie HPLC-Trennung von 15-20 µL peptidlösung (vorbereitet in Schritt 4.3) auf eine C5-Spalte mit einer mobilen Phase von Wasser (A) und Acetonitril (B) beide mit 0,1 % Ameisensäure und einer Steigung von 5-80 % B mehr als 20 min ergänzt. Verwenden Sie für die Massenspektrometrie (MS) Elution nach 5 min.
    Hinweis: Je nachdem peptidgehalt und Affinität für die HPLC-Säule, Probenvolumen und Trennung Optimierung benötigen.
  2. Verwenden Sie entsprechenden Software deconvolute die gemessenen Massenspektren zu berechnen, dass die verschiedenen Peptid-Ladung41Staaten. Vergleichen Sie die beobachteten Peptid Arten Masse der berechneten Wildtyp Masse durch die cAA → ncAA Substitution verändert. Berücksichtigen, dass die lineare Prepeptide posttrans-durch acht ungekühltes (-8 H2O) und fünf Cyclizations geändert wird (siehe Abbildung 1).
    Hinweis: Natrium-haltige Puffer verwenden, kann MS-Analyse im positiven Modus zeigen, dass Natrium Addukte. Diese werden als zusätzliche Spitzen mit höheren deconvoluted Masse sichtbar (für jedes Natrium Addukt, die beobachteten deconvoluted Masse 22.99 Da höher ist). Um diese zu entfernen Addukte, HPLC-Reinigung-42 oder umfangreiche Dialyse43 durchgeführt werden kann.

(6) antimikrobielle Aktivitätstest

  1. Vorbereitung der GM17 Agarplatten unter sterilen Bedingungen
    1. Bereiten Sie eine Übernachtung Kultur der Indikator Stamm L. Lactis NZ9000 tragen Plasmid pNG NisPT44 bei 30 ° C in M17 Brühe45 mit 1 % (w/V) Glukose (= GM17) und 5 µg/mL Chloramphenicol.
    2. Messen OD600, impfen frisches Medium OD600 = 0,1 und inkubieren Sie bis OD600 = 0,4-0,6. Dann legen Sie den Kolben auf Eis.
      Hinweis: Jeder OD600 Messung wird kulturvolumen verbrauchen. Denken Sie daran, dass für jedes Assay nährbodenplatte 1 mL Bakterienkultur benötigt werden. Bei Bedarf die Lautstärke nur Flüssigkultur entsprechend skalieren.
    3. Für 1,5 % Agar 4,5 g Agar in einer Glasflasche Medien abwiegen. 300 mL DdH2O, Mischung und Autoklaven hinzufügen.
    4. Bereiten Sie 2 x M17 Brühe (zweifacher konzentrierte) in 300 mL DdH2O und Autoklaven.
    5. Mischen Sie 25 mL 2 x M17 Brühe mit 10 µg/mL Chloramphenicol und 2 % Glukose mit 1 mL L. Lactis Vorkultur (4 % V/V).
    6. 25 mL geschmolzene 1,5 % Agar (frisch autoklaviert oder in der Mikrowelle erhitzte) hinzufügen.
      Hinweis: Davor, lassen Sie die Flasche auf den Touch (ca. 50 ° C) abkühlen. Dies ist notwendig, da L. Lactis eine mesophile Organismus empfindlich auf hohe Temperaturen ist.
    7. Gießen Sie die Lösung in einer großen Petrischale. Trockenplatten für 10-15 Minuten.
    8. Sterilisieren Sie die Enden eines Glases Pasteurpipette durch Flamme. Warten Sie, bis sie sich abgekühlt hat, dann verwenden Sie das breite Ende, um Löcher in die erstarrten GM17-Agar zu schaffen.
  2. Vorbereitung der Probe
    1. 1 mL der E. Coli Ausdruck Kulturen (erstellt in Schritt 3,7) in einem gekennzeichneten 1,5 mL-Tube und Zentrifuge für 3 min bei 7.000 x g. Aspirat die verbleibenden Mittel einnehmen und die Zelle Pellet in 500 µL Aufschwemmen Na-P (50 mM-Natrium-Phosphat-Puffer pH 7.4 aus Natriumphosphat Dihydrogen 0,5 M und 0,5 M binatrium Wasserstoff Phosphat hergestellt).
    2. Beschallen Sie die Proben auf Eis (vgl. Schritt 4.2.2). Tauchen Sie die Spitze der Sonde sonikator in der Zellsuspension. Set sonikator bei 30 % Amplitude mit Puls der 1 s ein und 5 s ab 3 Minuten lang.
    3. Zentrifugieren der Zelle lysate für 10 min bei 13.000 x g, pellet-zellenrückstand. Übertragen Sie den überstand auf Eis auf ein neues Reaktionsgefäß.
    4. Verdünnen und normalisieren die Zelle Extrakt Überstände auf 1 mL OD600 = 0,6, bezogen auf die geerntete Zelldichte mit Na-P.
  3. Aktivitätstest
    1. Fügen Sie 40 µL jeder normalisierten Probe in ein Loch der Indikator-Agar-Platte (Abbildung 3). Verwenden Sie Chloramphenicol bei 400 µg/mL als antibakteriell zusammengesetzte Steuerelement. Verwenden Sie Elution Puffer als Negativkontrolle. Warten Sie, bis alle Proben in den Agar verbreitet sind. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 30 ° C.
    2. Die Agarplatten mit einem Flachbett-Scanner oder Digitalkamera fotografieren. Wachstum Hemmung Halo Größen können gemessene per hand oder mit ImageJ46sein.

(7) Fluoreszenz-Mikroskopie

Um die Wirkung des AMPs auf bakterielle Zellen zu beobachten, kann Licht und Fluoreszenz-Mikroskopie verwendet werden. Beachten Sie, dass die Nisin Wirkungsweise stützt sich auf die Destabilisierung und die Bildung von Poren in bakteriellen Membranen6. Hier ist Nil rot verwendet, um der bakteriellen Zellmembran, färben die verstreuten und aggregierte auf Zelle Lyse wird.

Hinweis: Siehe Materialtabelle z. B. Instrumentierung. Mengen an zusätzlichen AMP Lösung können je nach Peptid-Konzentration und Bioaktivität eingestellt werden.

  1. Handy-Vorbereitung
    1. 10 mM Nil rot-Stammlösung in Dimethyl Sulfoxid (DMSO) vorzubereiten.
    2. L. Lactis Indikator Stamm wachsen, um OD600 = 1.0 wie in Schritt 6.1.1-6.1.2.
    3. Zentrifugieren Sie 1 mL Kultur für 3 min bei 4 ° C und 5.000 x g.
    4. Entsorgen Sie überstand, in 1 mL Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)47aufzuwirbeln.
    5. Zentrifuge und wieder aufzuwirbeln.
    6. Fügen Sie 1 µL Nil rot-Stammlösung, mischen Sie vorsichtig.
  2. Mikroskopischen Bildaufnahme
    1. Fügen Sie 30 µL der Zelle Vorbereitung auf ein Titeldia während spannend bei 520 nm.
    2. Erwerb mal 0,2 s, kinetische Serie Set 0,1 Hz, Serie Länge 200 Bilder.
    3. Hinzufügen von 0,3 - 1,5 µL Zelle lysate oder IMAC Probe (aus Schritt 6.2.4 oder 4.3.5, beziehungsweise). Für IMAC Proben kann Elution Puffer als Negativkontrolle verwendet werden.
    4. Überwachen und aufzeichnen-Fluoreszenz-Emission bei λ ≥ 560 nm.
  3. Datenanalyse
    1. Mikroskopie-Bildsequenzen werden als Filmdateien (AVI) gespeichert. Einzelne Bilder werden mit ImageJ46analysiert.

Representative Results

Dieses Protokoll soll die Produktion von Nisin ncAA-modifizierte Varianten mit Rückstände-spezifische Gründung der Proline Analoga zu ermöglichen, von der SPI-Methode. Zuvor waren die Machbarkeit und Renditen von 24 mg/L für rekombinante Herstellung von völlig veränderten Wildtyp Nisin39berichtet worden. Mit der SPI-Methode, Ziel-Peptid/Protein-Erträge sind häufig gut und Mengen in der Nähe von Wildtyp Produktion48erreichen. Als erste Experimente sollten rekombinante Wildtyp RiPP-Produktion in der gewählten auxotrophe Host getestet werden. Hier, die Prolin-auxotrophe E. Coli MG1655 ΔProBA:: Frt ΔProC:: Frt (DE3) diente als Host Stamm. Für den Einbau von NcAAs, Anbau und Induktion können Timing sowie mittlerer Zusammensetzung und Temperatur in Richtung maximale Peptid Ertrag optimiert werden.

Antimikrobielle Aktivität assay
Wildtyp rekombinante Nisin Herstellung und Reinigung wurden nach der oben genannten Protokolls durchgeführt. In diesem Fall wurde Prolin statt seine ncAA-Derivate bei Schritt 3.6 verwendet. Ein antimikrobielle Aktivität Assay diente, RiPP-Produktion zu überprüfen und die antimikrobielle Aktivität vor und nach der Reinigung zu vergleichen. Für die Aktivität-Assay waren Elution Brüche und IMAC durchströmten direkt verwendet und getestet gegen Gram-positive L. Lactis Indikator Stamm (Abbildung 2). Wie diese Sorte NisP ausdrückt, Nisin Varianten enthalten in E. Coli Zelle Lysates oder Peptid Proben bzw. gereinigt durch proteolytische Spaltung von der Leader-Peptid aktiviert werden. Offenbar zeigte der durchströmten Wachstum hemmende Aktivität. Dies lässt sich durch bioaktive Material der IMAC-Spalte nicht bindend. Alle getesteten Elution Fraktionen zeigten erhöhten Aktivität im Vergleich zu den ungereinigten Probe zeigt eine Konzentration des His-Tags Peptids vom IMAC. Beachten Sie, dass der Elution Puffer (als Negativkontrolle) keinen auf das Wachstum von L. Lactis in diesem Test Einfluss.

Figure 2
Abbildung 2 . Antimikrobielle Aktivität testen nachdem IMAC Reinigung von Wildtyp Nisin rekombinant hergestellt. Elution Brüche 5 bis 15 und die Durchströmung der IMAC Reinigung wurden im Vergleich zu den ungereinigten Zelle lysate (verdünnt für die OD600 Normalisierung) gegen die L. Lactis Indikator Belastung getestet. Die Größe der Wachstum Hemmung Halos zeigt antimikrobielle Aktivität. Chloramphenicol in einer Konzentration von 400 µg/mL wurde als Positivkontrolle und der IMAC Elution Buffer als Negativkontrolle verwendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Um zu beweisen, die antimikrobielle Aktivität des rekombinant hergestellt Nisin Varianten mit sechs verschiedenen Prolin-Analoga, ein Aktivität-Assay durchgeführt wurde, um die Hemmung der L. Lactis Indikator Belastung zu testen. Abbildung 3 zeigt Wachstumshemmung für fünf der sechs Proben mit Prolin Analoga hergestellt. Die besten Ergebnisse (wie von Halo Größen beurteilt) beobachtet wurden, für die Einbeziehung Experimente Analog (4R) - Fluoroproline, (4R) - Hydroxyprolin und (4S)-Methanoproline. Vergleicht man die Vergrößerung Hemmung Halo um den Wildtyp Nisin produziert und getestet parallel, alle drei Nisin Varianten zeigten ähnliche Hemmung Stärke. Die Halo-Größe allein ist aber nicht verwendet, um Esel eine bestimmte Aktivität, da die Konzentration der AMP nicht ermittelt wurde. Daher dienen die Assays nur qualitativ zu testen, ob die antimikrobielle Aktivität der daraus resultierenden Nisin Varianten erhalten oder verloren ist. Um die spezifische Aktivität zu bestimmen, muss die Konzentration der Nisin Varianten quantifizierten (siehe Diskussion).

Figure 3
Abbildung 3 . Antimikrobielle Aktivität Assay der Zelle Lysates mit Nisin Varianten produziert über SPI mit Prolin Analoga. Vergleich von Nisin Varianten mit rekombinanten Wildtyp Proben. Alle Proben waren OD600-normalisiert nach Lyse der Zelle im Verhältnis zu den geernteten Zelldichte Kultur. Lichthöfe zeigen Bioaktivität in Form von Indikator Stamm Wachstumshemmung. Erste Reihe von links nach rechts: (4R)-Fluoroproline, (4R) - Hydroxyprolin, (4R) - Methanoproline und Chloramphenicol (400 µg/mL; antimikrobielle Positivkontrolle). Zweite Reihe: (4S)-Fluoroproline, (4S) - Hydroxyprolin, (4S) - Methanoproline und Prolin (Wildtyp Kontrolle). Kenntnis der chemischen Nomenklatur; z. B. (4R) - Fluoroproline wird auch bezeichnet als Trans-4 - Fluoroproline. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

LC-ESI-TOF-Massenspektrometrie
Im Anschluss an die Reinigung von IMAC wurde die Einbindung der NcAAs in Nisin LC-ESI-TOF-Massenspektrometrie analysiert. Abbildung 4 zeigt die deconvoluted Massenspektren von Nisin Variant, enthält (4R)-Fluoroproline. Diese Variante wurde IMAC wie oben beschrieben gereinigt und danach von LC-ESI-TOF-Massenspektrometrie analysiert, so dass es immer noch den Führer durchgeführt. Der Hauptgipfel in Abbildung 4A entspricht der modifizierten Nisin mit (R4)-Fluoroproline mit einer deconvoluted Masse von 6883.18 Da (berechnete Masse 6882.05 Da, berechnet Masse des entsprechenden Wildtyp Peptids mit Prolin bei Position 9 ist 6864.06 Da). Die beiden Gipfel mit niedrigeren und höheren Masse entsprechen Natrium Addukte wie angegeben. Abbildung 4 B zeigt unterschiedlich geladene Spezies der wichtigsten Verbindung als vom Dekonvolution Algorithmus gefunden. Beispielsweise entspricht der Peak bei 1148.11 m/Z die Sechsfache geladene Spezies ([M + 6H]6 +).

Figure 4
Abbildung 4 . LC-ESI-TOF-Massenspektrometrie von IMAC-gereinigte rekombinante Nisin Varianten mit (R4)-Fluoroproline. (A) Deconvoluted Massenspektrometrie Chromatogramm (verkleinert im Einschub) für die Nisin Variante (immer noch mit dem Führer) mit (4R)-Fluoroproline (erwartet Massen (Da): [M + H]+ = 6882.05, [M + Na]+ = 6904.03, [M + 2Na]2 + = 6926.02). (B) Compound Spektren für Arten [M + H]+. Massen (Da) zu erwarten: [M + 5H]5 + = 1377.41, [M + 6 H]6 + = 1148.01, [M + 7 H]7 + = 984.15, [M + 8 H]8 + = 861.26, [M + 9 H]9 + = 765.67, [M + 10 H]10 + = 689.21, [M + 11 H]11 + 626.64, = [M + 12 H] 12 + = 574.50. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Fluoreszenz-Mikroskopie
Antimikrobielle Aktivität des rekombinanten Nisin und seine ncAA-haltigen Varianten kann auch durch direkte Beobachtung von L. Lactis Indikator Stamm über fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen gezeigt werden. Nil rot, einem sehr hydrophoben Fluoreszenzfarbstoff diente, der bakteriellen Zellmembran zu beflecken. Abbildung 5 zeigt die qualitative Veränderung der Aggregatzustand der Zellkultur und einzelne Zelle Morphologie. Zellen wurden mit Nil-rot gefärbt und auf einer Mikroskopie Abdeckung Folie hinterlegt. Die obere Zeile zeigt die Zellen direkt am Anfang Wenn Puffer, rekombinante Wildtyp Nisin oder Nisin enthalten (4R)-Fluoroproline, oder 4R-Hydroxyprolin wurden hinzugefügt. Der untere Bereich zeigt die entsprechenden Bilder nach 20 Minuten der Inkubation.

Figure 5
Abbildung 5 . Fluoreszenz-Mikroskopie des rekombinanten Nisin Auswirkungen auf gram-positiven Zellen. Mikroskopische Aufnahmen von 30 µL L. Lactis Indikator Stamm (OD600 = 1) markiert mit Nil rot wurden vor (obere Abdeckung) und nach (untere Leiste) 20 min Inkubation mit 1 µL Puffer (A), 0,3 µL rekombinante Wildtyp Nisin (B) und 0,6 µL Nisin Varianten mit (R4)-Fluoroproline (C) und 4R-Hydroxyprolin (D). Blaue Kreise markieren Sie Regionen mit aggregierten oder verformte Zellen, blaue Pfeile Punkt in Regionen wo Diffusion von fluoreszierenden Membran Fragmente beobachtet werden kann. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5 A zeigt, dass das allgemeine Aussehen der Zellen innerhalb von 20 Minuten der Beobachtung nicht geändert haben. Nur die Anzahl der Zellen, die während der Zeit Rose hinterlegt und damit eine größere Menge von Zellen ist innerhalb der 80 µm X 80 µm der beobachteten Region sichtbar. Abbildung 5 B zeigt, dass die gram-positiven Zellen aggregierten erschien und verschwommen (durch blaue Kreise gekennzeichnet) nach 20 Minuten der Exposition gegenüber Wildtyp Nisin, wurden auch bei geringen Mengen (hier: 0,3 µL IMAC Elution) hinzugefügt. Darüber hinaus verbreitet leichtes Material aus den Zellen in den Puffer, der darauf hinweist, dass die Membran Fragmente mit Nil rot markierten Zeitraum (gekennzeichnet durch blaue Pfeile) mobilisiert wurden. Diese Ergebnisse zeigen Lyse der Zelle, wie es gezeigt wurde, bei der Behandlung mit Nisin6,49auftreten. Ähnliche Effekte wurden beobachtet, nach der Inkubation mit dem Nisin Variante (4R) - Fluoroproline (Abbildung 5C) und Nisin mit (R4) - Hydroxyprolin (Abbildung 5D) beide mit großen Mengen von verzerrten und aggregierte Zellen nach 20 Minuten, in scharfem Gegensatz zu der Kontrollprobe (Abb. 5A).

Komponente Konzentration
(NH4) 2 SO4  7,5 mM
NaCl 8,5 mM
KH2PO4 22 mM
K2HPO4 50 mM
MgSO4 1 mM
D-Glucose 20 mM
Alle kanonischen Aminosäuren
(mit Ausnahme der zu ersetzen)		 50 mg/L
Ca2 + 1 µg/mL
FE2 + 1 µg/mL
Spurenelemente
(Cu2 +, Zn2 +, Mn2 +, MoOH2 +)		 0,01 µg/mL
Thiamin 10 µg/mL
Biotin 10 µg/mL

Tabelle 1. Zusammensetzung der NMM19 chemisch definierten Bakterienwachstum Medium nach Zubereitung nach Schritt 2.

Discussion

Mithilfe von SPI zum Einsetzen von Prolin Analoga können die gezielte Nisin Strukturen grundlegend geändert werden neuartige Peptid-Varianten mit einzigartigen Sequenz Kombinationen und chemischen Eigenschaften zu schaffen. Auf diese Weise kann die grundlegende Begrenzung der klassischen Gentechnik umgangen werden, die ist auf der Seite Kette Chemikalien von den 20 cAAs beschränkt. In Vivo chemische Diversifizierung von Nisin oben beispielhaft zeigt eine allgemeine Ausrichtung, natürliche PTMs ergänzen und chemischen Bereich RiPPs dramatisch zu verbessern. Wir glauben, dass die Erweiterung des Repertoires der natürlichen Aminosäuren großes Versprechen vor allem für AMPs hält. In den Proteinen kann eine enorme Bandbreite an Funktionalitäten durch eine definierte Anordnung von 20 cAAs in dreidimensionalen Strukturen realisiert werden. Mit nur 7-100 aa Länge3beschränkt Wege zu solchen strukturellen Eigenschaften nur durch cAAs für AMPs. So verwundert es nicht, dass natürliche Verstärker in Form von RiPPs häufig ausgiebig posttranslational modifizierte4sind. In der gleichen Weise halten NcAAs als alternative Bausteine großes Versprechen, ihre pharmakodynamische und pharmakokinetische Parameter zu verbessern (siehe Baumann Et Al. 201735 und Hinweise darin).

Die SPI-Methodik in dieser Arbeit profitiert von einer relativ einfachen Versuchsaufbau, einfache Ausführung und hohe Reproduzierbarkeit. Aufgrund der globalen Substitution ist multisite ncAA Einbindung in Ziel-Peptide auch machbar. Auf der anderen Seite kann die Methode nicht ausreichend für den Austausch von Aminosäuren, die häufig auftretende in das Zielprodukt gen sein. In der Regel unerwünschte Positionen vom Site-verwiesene Mutagenese geändert werden können, aber diese zusätzlichen Änderungen könnte auch Auswirkungen auf mehrere AMP Eigenschaften einschließlich Struktur und Bioaktivität. Sobald eine auxotrophe Belastung für die Produktion zur Verfügung steht, können mehrere NcAAs getestet werden, ohne dass umfangreiche Änderungen auf der genetischen Ebene. Die Methode ist darüber hinaus nicht zu auxotrophe E. Coli -Stämme, sondern können auch mit der natürlichen Produktion Host durchgeführt werden. Z. B. Zhou Et Al. zeigten, dass SPI für die Produktion von neuartigen RiPPs auch in funktioniert der natürlich Trp-Auxotroph L. Lactis: mit Medien definiert, drei Tryptophan Analoga wurden an vier Positionen im Nisin50aufgenommen.

Da die SPI-Methode zu globalen Ersatz des gewählten führt cAA von der ncAA, gilt in der Regel zu einer breiten Palette von Ziel-Peptiden und Proteinen. Eine Reihe von auxotrophe E. Coli Stämme steht zur Verfügung (siehe Schritt 1), so dass jeder für den Ersatz von NcAAs getestet werden mehrere cAAs. Erfüllt Analoga integriert mit MetA-mangelhaft Stämme (z. B. B834(DE3)) werden am häufigsten eingesetzt. Beispiele für isostrukturellen Met Analoga sind Azidohomoalanine (Aha) und Homopropargylglycine (Hpg), im Handel erhältlichen NcAAs die effizient eingearbeitet werden können. Beide führen ein Bioorthogonal Griffe, die Anlage von Molekülen mit einem kompatiblen Alkinen oder azid Funktionalität bzw. ermöglichen. Beispielsweise können fluoreszierende Farbstoffe oder Polyethylenglykol (PEG) Moieties vom Kupfer (I) angebracht werden-azid Alkinen Cycloaddition (CuAAC)51katalysiert.

Obwohl beide rekombinante ncAA Aufnahme Methoden (SPI und SCS) zu erreichen in der Regel ausreichend Sollmengen, Erträge sind oft reduziert im Vergleich zu Wildtyp Produktion der entsprechenden Peptide und Proteine. Wie die Reinheiten oft mit Produktions-Leistungsfähigkeit korrelieren, möglicherweise zusätzliche Reinigungsschritte erforderlich, vor allem für Low-reiche Arten. In diesem speziellen Fall der rekombinanten Nisin Produktion wird sein-tagged Leader-Sequenz durch selektive Anreicherung von der Zelle Lysates RiPP Reinigung erheblich vereinfacht. Die Reinigung gezeigt in diesem Protokoll verbessert die Reinheit und Konzentration von Nisin, aber oft nicht ausreichen, um den Ertrag und die spezifische Aktivität bestimmen AMP Reinheiten Ausbeute. Neben der IMAC, enthalten häufig verwendete AMP Reinigungsverfahren HPLC, Ionenaustausch-Chromatographie (IEC) und Niederschlag (z. B.. mit Aceton oder Trichloressigsäure Säure (TCA)) oder Kombinationen davon - was in einem mehrstufigen Reinigung Schema52 . Es sei darauf hingewiesen, ihre häufig Polycationic Natur IEC Reinigung erleichtern kann. Gefriertrocknung wird häufig verwendet, um gereinigte AMPs zu speichern.

Im Idealfall sollte NcAAs für den Einbau in Ampere zu erschwinglichen Preisen im Handel erhältlich oder einfach durch einfache und reproduzierbare chemische Synthese Protokolle hergestellt. Eine ebenso wichtige Voraussetzung für die SPI-Methode ist, dass der ncAA erkannt, aktiviert und auf die verwandten tRNA von endogenen oder Co ausgedrückt AaRS erhoben. Dies kann getestet in Vitro durch Aminosäure-Aktivierung oder tRNA Aminoacylation Assay53sein. Als Alternative einfach SPI Test Ausdrücke Modell Proteine wie grün fluoreszierendes Protein (GFP) sowohl in Anwesenheit durchgeführt und in Abwesenheit der ncAA-Supplementierung durchgeführt werden können. Ferner Löslichkeit in der Durchlässigkeit von Medium und Zelle Wachstum sowie chemische Stabilität wichtige Faktoren darstellen.

In diesem Beispiel wurde die antimikrobielle Aktivität gezeigt mit einem gram-positiven Indikator Stamm. Wie es der Führer Peptidase NisP ausdrückt, ist der letzte Schritt der Nisin Reifung katalysiert. Entfernung von der Leader-Sequenz (His-Tags für Reinigung Zwecke) durchgeführten in-vitro- Behandlung mit gereinigtem NisP50 oder Trypsin54auch sein können. Über den Rahmen dieser Arbeit hinaus können pathogene Organismen und multiresistenten Stämme dann für bakteriostatisch oder Bakterizid Hemmung von AMPs mit einer ähnlichen Methode getestet werden. Klinisch relevante Zielarten sind MRSA, MDR Mycobacterium Tuberculosis, VRE, Acinetobacter Baumannii, Streptococcus Pneumoniae, Pseudomonas Aeruginosa und Klebsiella Pneumoniae. Neben der Agar-Platte-Diffusion Test vorgestellten Wachstum Hemmung kann auch mit entsprechenden Flüssigmedien inokuliert mit der Bakterienart und ergänzt mit AMP durchgeführt werden. Mit Brühe Verdünnung Methoden kann die minimalen inhibitorische Konzentration (MIC) mit reinen Peptide55ermittelt werden. Hier vorgestellten Aktivitäten-Assay kann auch zur Schätzung der Bioaktivität und Potenz der AMP-haltigen Lösungen relativ Referenzverbindungen, zum Beispiel im Handel erhältlichen Nisin verwendet werden.

Rekombinante Herstellung von RiPPs ist oft möglich39, die häufig Co Ausdruck des PTM Gene enthält. Sobald die Produktionsstamm in chemisch definierten oder synthetische minimal-haltigem Medium geeignet ncAA übertragen wird, findet Rückstände-spezifischen Ersatz des entsprechenden cAA. So können andere RiPPs durch die gleiche Methode hergestellt werden, vorausgesetzt, dass ihre rekombinanten Herstellung machbar ist und Bedingungen finden Sie wo ncAA Einarbeitung und PTM ausreichende Mengen an Zielprodukt ergeben. Beachten Sie, dass neben den Host Zelle Proteom, Peptid-PTM-Maschinen kann auch ncAA geändert während der SPI. Daher können das Timing der Ziel Ausdruck Induktion und Länge der folgenden Inkubationszeit Optimierung erforderlich. Da ncAA Einbindung in die PTM Enzyme ihre Aktivität und Stabilität beeinflussen kann, kann die Produktion von verarbeiteten RiPP grundsätzlich beeinträchtigt werden. Ausreichende PTM Enzym Wirksamkeit wird durch die Bildung von verarbeiteten Prepeptide, wie von MS und Bioaktivität Assays erkannt. Da oben eingeführt, könnte verschiedene induzierbare Promotoren eingesetzt werden, um die PTM produzieren Gene zuerst (in Abwesenheit der ncAA) gefolgt von Induktion des Vorläufer-Peptid-Gens in Anwesenheit der ncAA. Im Allgemeinen muss die Produktion von cAA-haltigen Ziel Peptid vor Zugabe der ncAA, unterdrückt werden, weshalb engen Unterdrückung des Gens Vorläufer erforderlich ist. Innerhalb dieses Protokolls ist dies durch katabole Repression durch die Zugabe von Glukose, das Wachstumsmedium. Zumal die PTM-Enzyme, die für prepeptide Verarbeitung benötigt in der Regel von einem genetisch entfernte Host stammen, kann Ausdruck Temperatur und Codon Usage der entsprechenden Gene Optimierung erfordern, wenn rekombinante Produktion nicht bisher gegründet. Im Prinzip kann das Vorhandensein von NcAAs in die Prepeptide Erkennung und Verarbeitung von PTM Enzyme, im Falle von Nisin NisBC und NisP stören. Für die ncAA Einbindung in Ampere empfiehlt es so kleine Ausdruck zuerst zur Identifikation geeigneten Ausdruck Bedingungen und Zuverlässigkeit des AMP Aktivität Assays Experimente.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Acknowledgments

J.H.N., T.B. und m.b. anerkennen, Finanzierung durch die EU FW7-Programm (SYNPEPTIDE). F.-j. S. und T.F anerkennen Finanzierung durch das Bundesministerium für Bildung und Wissenschaft (BMBF-Programm "HSP 2020", TU-WIMIplus Projekt SynTUBio) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Exzellenzcluster "Unifying Concepts in Catalysis").

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sodium chloride Carl Roth, Germany P029
guanidine hydrochloride Carl Roth, Germany 0035.2
dipotassium hydrogen phosphate Carl Roth, Germany P749.3
potassium dihydrogen phosphate Carl Roth, Germany 3904.3
sodium dihydrogen phosphate monohydrate Carl Roth, Germany K300.2
disodium hydrogen phosphate Carl Roth, Germany P030.2
L-alanine Carl Roth, Germany 3076.2
L-arginine Carl Roth, Germany 3144.3
L-asparagine monohydrate Carl Roth, Germany HN23.1
L-aspartic acid Carl Roth, Germany T202.1
L-cysteine Carl Roth, Germany 3467.3
L-glutamine Carl Roth, Germany 3772.1
L-glutamic acid Carl Roth, Germany 3774.1
L-glycine Carl Roth, Germany 3187.3
L-histidine Carl Roth, Germany 3852.3
L-isoleucine Carl Roth, Germany 3922.3
L-leucine Carl Roth, Germany 3984.3
L-lysine monohydrate Carl Roth, Germany 4207.2
L-methionine Carl Roth, Germany 9359.4
L-phenylalanine Carl Roth, Germany 4491.2
L-proline Carl Roth, Germany T205.3
L-serine Carl Roth, Germany 4682.4
L-threonine Carl Roth, Germany T206.2
L-tryptophan Carl Roth, Germany 4858.2
L-tyrosine Carl Roth, Germany T207.2
L-valine Carl Roth, Germany 4879.4
ammonium sulfate Carl Roth, Germany 3746.3
magnesium sulfate Carl Roth, Germany 0261.2
D-glucose Carl Roth, Germany 6780 prepare a 20% (w/v) solution for addition into molten agar
calcium chloride Carl Roth, Germany PN93.2
iron(II) chloride Sigma-Aldrich, Germany 372870
thiamine hydrochloride Sigma-Aldrich, Germany T1270
biotin Carl Roth, Germany 3822.2
copper(II) sulfate Merck, Germany 102792
manganese(II) chloride Carl Roth, Germany KK36.2
zinc chloride Merck, Germany 108816
immonium orthomolybdate Sigma-Aldrich, Germany 277908
glycerol Carl Roth, Germany 7533.3
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Sigma-Aldrich, Germany I6758
ampicillin sodium salt Carl Roth, Germany K029.5 working concentration 100 µg/mL for E. coli, prepare 100 mg/mL stock in ddH2O
kanamycin sulfate Carl Roth, Germany T832.2 working concentration 50 µg/mL for E. coli, prepare 50 mg/mL stock in ddH2O
chloramphenicol Carl Roth, Germany 3886.1 working concentration 5 µg/mL for L. lactis, prepare 37 mg/mL stock in ethanol
(4S)-fluoroproline Bachem, Switzerland F-3970
(4R)-fluoroproline Bachem, Switzerland F-3975
(4S)-hydroxyproline Bachem, Switzerland F-1395
(4R)-hydroxyproline Bachem, Switzerland F-2980
(4S)-methanoproline chemically synthesized
(4R)-methanoproline chemically synthesized
hydrochloric acid (HCl) Carl Roth, Germany P074.4
ethanol VWR, Germany 20825.324
M17-broth Sigmal-Aldrich, Germany 56156 commercial product, see Terzaghi BE & Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13 for contents and preparation
agar-agar Carl Roth, Germany 5210.5
Nisin from Lactococcus lactis  Sigma-Aldrich, Germany N5764 commercial product, can be used as reference for bioactivity
dimethyl sulfoxide (DMSO) Carl Roth, Germany A994.1
imidazole Carl Roth, Germany 3899.3
1.5 mL autosampler vial for LC-MS Sigma-Aldrich, Germany Supelco 854165
acetonitrile VWR, Germany HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 LC-MS grade required
formic acid VWR, Germany HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 LC-MS grade required
1 mL Ni-NTA IMAC column, e.g. HisTrap FF Crude GE Healthcare, UK 29-0486-31 different manufacturers and resins available for IMAC
0.45 µm bottle top filter unit VWR, Germany 10040-470 sterile filtration of solutions using a vacuum pump
0.45 µm syringe filter PVDF membrane Carl Roth, Germany CCY1.1 sterile filtration of solutions using a syringe and to remove particles from cell lysates
luer-lock syringe, PP, 50 ml Carl Roth, Germany T552.2 sterile filtration of solutions  
1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf, Germany 30120086
petri dishes (polystyrene, sterile) Carl Roth, Germany TA19
Nile red Sigma-Aldrich, Germany 72485
E. coli ΔproA strain CGSC, Keio collection JW0233-2 proline-auxotrophic E. coli K-12 strain
E. coli B834(DE3) Novagen (Merck), Germany 69041 methionine-auxotrophic E. coli B strain
λDE3 Lysogenization Kit Novagen (Merck), Germany 69734-3
Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT bacterial indicator strain, see Khusainov R & Kuipers OP, PLoS One, 8 (9), e74890
benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf, Germany 5427 R
peristaltic pump GE Healthcare, UK P1
FPLC system GE Healthcare, UK Äkta Purifier 10 or the like
inverted microscope Nikon TI Eclipse wide-field fluorescence microscope  with 100x (N.A. 1.4) objective and Mercury Lamp example setup for fluorescence microscopy
electron multiplying CCD (EMCCD) camera Andor Technologies, UK Andor Luca  example setup for fluorescence microscopy
fluorescence excitation filter Thorlabs, USA Dichroic cube (TLV-U-MF2-TRITC) example setup for fluorescence microscopy
fluorescence emission filter AHF Analysentechnik, Germany T 560 LPXR example setup for fluorescence microscopy
cover slip 24 x 60 mm Carl Roth, Germany LH26.1 example setup for fluorescence microscopy
Immersion Oil Carl Zeiss, Germany Immersol 518 F example setup for fluorescence microscopy
probe sonicator Bandelin, Germany Sonopuls HD3200 with sonotrode MS-72 200 W maximum HF output
C5 HPLC column (2.1x100 mm, 3 µm particle size) Sigma-Aldrich, Germany 567227-U example setup for mass spectrometry
ESI-TOF coupled to HPLC system Agilent, USA Agilent 6530 Accurate Mass QTOF with 1260 HPLC example setup for mass spectrometry

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References

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Antimikrobielle Peptide produziert durch Selektionsdruck Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren
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