Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Antimikrobielle peptider produseres av seleksjonspress innlemmelse av ikke-kanoniske aminosyrer

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57551
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 3, 2, 1
1Department of Biocatalysis, Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin, 2Department of Bioenergetics, Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin, 3Molecular Genetics Group, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, Department of Molecular Genetics, University of Groningen
* These authors contributed equally

Summary

Protokollen presenterer Escherichia coli-basert seleksjonspress innlemmelse av ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) i lactococcal antimikrobielle peptid nisin. Egenskaper kan endres under rekombinant uttrykk via substitusjon med ønsket ncAAs i definerte vekst medier. Resulterende endringer i bioactivity tilordnes av vekst hemming analyser og fluorescens mikroskopi.

Abstract

Naturen har en rekke muligheter til å opprette nye protein funksjoner ved å endre rekkefølgen på individuelle aminosyre byggesteinene. Men er alle varianter basert på 20 kanoniske aminosyrer (cAAs). Som en måte å innføre flere mekanisk-egenskaper i polypeptides, brukes stadig inkorporering av ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) i protein engineering. På grunn av deres relativt kort lengden er endring av ribosomally syntetisert og post-translationally endret peptider ved ncAAs spesielt attraktivt. Nye funksjoner og kjemiske håndtak kan genereres ved endringer av personlige rester. Metoden seleksjonspress inkorporering (SPI) benytter auxotrophic vert stammer som er fratatt en essensiell aminosyre i kjemisk definerte vekst medier. Flere strukturelt og kjemisk ligner aminosyre analogs kan deretter aktiveres av det tilsvarende aminoacyl-tRNA-synthetase og gi rester-spesifikke cAA(s) → ncAA(s) erstatninger i målet peptid eller protein sekvensen. Selv om, i forbindelse med metoden SPI, ncAAs er også innlemmet i det vert proteom i fasen av rekombinant genuttrykk, er flertallet av cellens ressursene tildelt uttrykk for målet genet. Dette kan effektiv rester-spesifikke innlemmelse av ncAAs ofte ledsaget av store mengder endret mål. Presentert arbeidet beskriver i vivo kommisjonsforordning av seks proline analogs antimikrobielle peptid nisin, en lantibiotic naturlig produsert av Lactococcus lactis. Antimikrobielle egenskapene til nisin kan endres og utvidet under sin gjæring og uttrykk i auxotrophic Escherichia coli stammer i definerte vekst medier. Dermed levere effekten av rester-spesifikke utskifting av cAAs med ncAAs endringer i antimikrobielle aktivitet og spesifisitet. Antimikrobiell aktivitet analyser og fluorescens mikroskopi brukes til å teste de nye nisin variantene for vekst hemming Gram-positive Lactococcus lactis indikator belastning. Masse spectroscopy brukes til å bekrefte ncAA innlemmelse i bioaktive nisin varianter.

Introduction

Oppdagelsen av antibiotika i det tyvende århundre og parallell utvikling av nye antimikrobielle forbindelser mot sykdomsfremkallende mikroorganismer aktivert målrettet behandling av bakterielle infeksjoner. Men på grunn av fremveksten av multidrug-resistente patogener som meticillinresistente Staphylococcusaureus (MRSA), vancomycin-resistente enterokokker (VRE), MDR (multidrug-resistente) Salmonella typhimurium phage type 10 (DT10 ), og Klebsiella pneumoniae, det er presserende nødvendig å generere nye antimikrobielle midler1. Antimikrobielle peptider (ampere) er allsidig, ofte svært spesifikke forbindelser som er lovende kandidater for utvikling av nye medisiner takket være deres mekanisk-egenskaper, fleksibilitet, størrelse, hydrophobicity og modus handling2. Forsterkere er små peptider som vanligvis består av 7-100 aminosyrer. Ofte, har de en kationisk struktur rik på positivt ladede arginin og lysin rester, som samhandle med målrettet mikrobiell cellemembranen, som belastes oppositely3. En bestemt undergruppe av forsterkere er ribosomally syntetisert og posttranslationally endret peptider (RiPPs)4. Disse er produsert av mange organismer fra kongedømmet sopp og domenet til bakterier. En av de mest kjente og brukte RiPPs er nisin, naturlig produsert av melkesyre bakterien Lactococcus lactis (L. lactis). Aktiv mot et panel av Gram-positive bakteriene, nisin har blitt brukt som en biopreservative i næringsmiddelindustrien for mer enn 50 år egenskapene antimikrobielle og fravær av utviklet motstand i målrettede mikrobiell stammer5. Studier har vist at nisin destabilizes og genererer porene i bakteriell cellemembraner fører til antimikrobielle aktivitet mot både Gram-positive og Gram-negative patogener6. Ved binding til lipid II er bakteriell cellevegg syntese hemmet7. Nisin er kodet av nisA som lineær forløper peptid, som består av en leder og en kjerne peptid region (figur 1). Etter ribosomal syntese endres først prenisin av dehydratase NisB. Her er serine og threonin rester i regionen prepeptide kjernen dehydrert dehydroalanine (Dha) og dehydrobutyrine (Dhb)8. Deretter dehydrert rester er kombinert med cystein til skjemaet lanthionine ringer (derav navnet "lantibiotic" for lanthionine ring inneholder antibiotika) av et enzym-katalysert Michael tillegg. Denne posttranslational endringen (PTM) er katalysert av cyclase NisC. Den endrede prenisin transporteres deretter ut av cellen av transporter NisT L. lactis, og leder peptid er kløyvde av proteinasen NisP å løslate moden og aktive nisin form9. Ansvarlig leder peptidase NisP har en høy substrat spesifisitet, siden det bare prosesser endret nisin effektivt10.

Vanligvis resultatet aktive RiPPs av PTM enzymer (for eksempel NisBC), som drastisk øker kjemiske løpet av kort peptider, f.eks via acetylation, glykosylering, metylering eller fosforylering. Dette nivået av kompleksitet kan videre bli utvidet med direkte inkorporering av ncAAs. Mens ofte mulig, er syntese av forsterkere en utfordring for storskala produksjon på grunn av strukturelle kompleksitet. For eksempel ble den totale syntesen av lantibiotic lactosin S i 71 reaksjon meter oppnådd med en siste avkastning på 10% og at av nisin med en grov avkastning bare 0.003%11,12. Derfor gir biologiske produksjon et levedyktig alternativ, på grunn av generasjonen av riktig stereocenters og høy produktkvalitet konsentrasjon.

Fram til i dag, mer enn 150 ncAAs, f.eks har funksjonelle grupper som inneholder fluor eller azides, har blitt innlemmet i rekombinante proteiner, og flere eksempler på ncAA-endret forsterkere har vært rapportert13,14, 15,16. Med innføringen av ncAAs, kan romanen mekanisk-egenskaper genereres sammenlignet med konvensjonelle mutagenese. Mangfoldet av eksisterende peptider kan økes, muligens fører til romanen antibiotika.

En metode for inkorporering av ncAAs rekombinant peptider er seleksjonspress inkorporering (SPI) basert på bruk av auxotrophic bakteriell stammer17. Disse stammer kan ikke syntetisere den tilsvarende cAA analoge i ncAA. Metodikken bruker ofte observert avslappet substrat spesifisitet, en funksjon i mange naturlige aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs)18. Bortsett fra deres naturlige cAA underlag er disse enzymene ofte i stand til å gjenkjenne og aktivere ønsket ncAA og lade den på deres beslektet tRNA(s). Dette fører til ribosomal innlemmelse av ncAA i målet gene produktet på en rest-spesifikk måte (dvs. cAA → ncAA substitusjon). Dette er selvfølgelig bare mulig når ønsket ncAA er strukturelt og kjemisk lik den kanoniske aminosyren tolerert av cellen fysiologi, oversettelse maskiner og målet peptid eller protein sekvensen. I en bestemt eksperimentelle oppsett, er auxotrophic verten cellene kultivert i definerte medium leveres med en begrensende konsentrasjon av den opprinnelige aminosyren skal erstattes. Av mobilnettet vekst eller utveksling av cAA-fri medium fører til intracellulær uttømming av cAA. I neste trinn ncAA legges og genuttrykk målet er indusert. Uunngåelig, ncAAs er nå også innlemmet i mange andre proteiner i vert cellen i denne fasen av målet genuttrykk. Likevel toksisitet av SPI holdes på et lavt nivå siden Escherichia coli (E. coli) belastningen er forvandlet en plasmider bærer målet genet under kontroll av en sterk pådriver (vanligvis svært konkurransedyktige T7 promoter / RNA polymerase system)19. Umiddelbart etter induksjon (vanligvis når Luftfartstilsynet er oppbrukt), verten cellene slutte å vokse og deres cytoplasma enzymatisk machineries brukes hovedsakelig for uttrykket av plasmider-baserte målet genet. Nettstedet-rettet mutagenese kan brukes til å definere steder rester-spesifikke ncAA installasjon i målet genet20.

Som modell peptid inkorporering av ncAAs, ble pentacyclic AMP nisin A valgt. Det er 34 aminosyrer lang og har bare en enkelt proline rester i kjernen peptid sekvensen (figur 1). Som subtilisin, ericin A og S og epidermin samt nisin Z og nisin Q synes den bevart proline å være avgjørende for aktivitet9,21. CAA proline spiller en særdeles viktig rolle i peptidyl-prolyl amid rotasjon og sekundær stabilisering. Siden kjeden ring konformasjonen (exo / endo puckers) er ansvarlig for en termodynamisk stabilisering av amid bånd. Målrettet kjemiske modifikasjoner (for eksempel hydroxylations, fluorinations, methylations) av prolyl puckers påvirker ofte kritisk folding stabilitet, stillaset stivhet og funksjoner av mange biologiske strukturer22. Det er derfor sannsynlig å forvente at Pro→ proline analoge erstatninger vil gi gave til ringen B, den andre ringen av nisin, med romanen og uvanlige egenskaper.

Her, en proline-auxotrophic E. coli belastningen ble brukt for rekombinant nisin produksjon. Dette krever uttrykket av prepeptide genet nisA samt endring enzym gener nisBC. Genetisk kodet peptid produktet bærer en N-terminalt hans-merket leder for rensing via affinitet kromatografi. For aktivitet besluttsomhet brukes L. lactis uttrykke og sekresjon NisPT til å aktivere varianter av rekombinant nisin fra E. coli celle lysates eller renset peptid prøver (figur 1). Eldre AMP er utgitt etter spalting av leder av NisP. I denne agar diffusjon metoden, AMP prøven diffunderer til solid vekst medium og kan hemme veksten av de Gram-positive mikroorganismen. Etter inkubasjon kan dette observeres visuelt av vekst hemming glorier. I tillegg til L. lactis som en indikator, endret nisin varianter viste antimikrobielle aktivitet mot Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, og Lactobacillus johnsonii 21,23.

En alternativ og eksperimentelt forskjellig metode for å inkludere ncAAs i RiPPs er stop codon undertrykkelse (SCS)24. For dette, en ortogonale tRNA / aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) paret er nødvendig for tilsvarende ncAA. Ideelt sett, alle disse tre komponentene er bioorthogonal, dvs. de ikke samhandle med endogene tRNAs og aaRSs. En ncAA-spesifikke aaRS kan genereres ved endring av enzymet aktive området og screening av genetisk biblioteker av muterte synthetases25. Videre krever innføring av en ncAA en codon som tildeles og som ikke koder for cAA. Gul stopp codon er vanligvis brukt24,26.

Nylig ble SPI etablert for inkorporering av α-chloroacetamide-som inneholder og klikk-kjemi-kompatible ncAAs NisA27. For eksempel ble Nε- alloc-lysine innlemmet i lasso peptid captistruin med områdespesifikke (SCS), rester-spesifikke (SPI) inkorporering metoder og senere endret i vitro av selskapets-katalysert metathesis28 . I forhold til SPI, metoden SCS er mer komplisert siden en ortogonale tRNA / aaRS par må være co uttrykt. Hittil, o-par for proline innlemmelse vært utviklet29, men beste av vår kunnskap, ingen eksempel proline analoge selskap har blitt rapportert.

Det bør bemerkes at ikke alle ncAAs kan inkluderes ved hjelp av SPI-metode. Først er opptaket av ncAAs i cytoplasma regulert av en rekke transport proteiner som er innebygd i cytoplasmatiske membran, som er den indre membranen for Gram-negative bakterier som E. coli. Normalt er E. coli i stand til å transportere en rekke aminosyre analogs i cellen med siden kjeder strukturelt og kjemisk ligner kanoniske aminosyrer. Andre, mange kjemisk reaktivere eller ustabil ncAAs kan fungere som en hemmer mot mobilnettet vekst, som de er giftige for metabolisme og fysiologi av verten celle30. Derfor bør opptak og toksisitet av ncAA for produksjon verten testes på forhånd. For å unngå inaktivering av PTM maskiner som en bivirkning, en strengt kontrollert uttrykk oppsett av ansvarlig genene kan brukes å innlemme naturlige aminosyren i endring enzymer (f.eks nisBC) og svømming i målet genet ( f.eks nisA). Dette kan gjøres ved hjelp av to ulike arrangører og induksjon av målet genuttrykk, som vist i spesialdesignet SPI protokoller31. Som beskrevet ovenfor, bruker metoden SPI avslappet substrat spesifisiteten av aaRS, som gjør at ncAA aktivisering og beslektet tRNA lading. Senere, leveres tRNA til ribosom etterfulgt av amid bond dannelse og folding av målet (poly) peptid. I denne prosesser, kan korrekturlesing og redigering mekanismer bli aktuelle32. For disse grunner, er det av stor betydning for har et mål ncAA strukturelt og kjemisk lik cAA. Andre viktige punkter er tilstrekkelig stabilitet (både i vekst media og utsatt for mobilnettet stoffskiftet) og Løseligheten av ncAA. I tillegg bør det være enten kommersielt tilgjengelig eller lett å være syntetisk kjemisk.

Her beskriver vi en protokoll for SPI, slik at rester-spesifikke inkorporering av ncAAs rekombinant RiPPs. Spesielt, ulike proline analogs er innlemmet i antimikrobielle peptid nisin A med E. coli som vert organisme. Massespektrometri brukes til å bekrefte aminosyren erstatning og peptid produkter er analysert for bioactivity vekst hemming analyser og fluorescens mikroskopi bruker mikrobiell indikator stammer.

Det grunnleggende kravet for vellykket rekombinant nisin uttrykk med definerte ncAAs krever en egnet proline auxotrophic E. coli belastning. For dette auxotrophy, proA må være dysfunksjonelle, for eksempel oppnådd av genomisk knockout. Celler fullt fratatt intracellulær Pro biosyntesen (dvs. sletting av proABC) uten mulighet for hjemfall er stabil auxotrophs. Brukte genet knockout metoder er phage signaltransduksjon eller single-genet knockout etter Datsenko & Wanner33. Videre kan proA knockout stammer fås fra offentlige repositories som Addgene, CGSC eller samlingen Keio. Siden rekombinant nisABC uttrykket vises her, avhengig av bruk av T7 arrangører, har uttrykk vert belastningen å bære en induserbart genet for T7 RNA polymerase. Dette kan oppnås ved innføring av λDE3 prophage i vert genomet, for eksempel ved hjelp av kommersielle kit. Belastninger BL21(DE3) kan eventuelt gjøres auxotrophic som beskrevet ovenfor.

Protocol

1. kloning av uttrykket vektorer og transformasjon av en auxotrophic produksjon belastning

Her, har genene for nisin biosyntesen, nemlig nisABC, blitt tatt fra L. lactis og overført til T7-baserte plasmider uttrykk vektorer. Full DNA-sekvenser av nisABC kan bli funnet i GenBank posten X6830734. Genet for forløper peptid (nisA) er plassert på en pET-3a vektor som gir ampicillin motstand. Gener for dehydratase (nisB) og cyclase (nisC) har blitt plassert på vektor pRSFDuet-1, som rapportert tidligere35, som gir kanamycin motstand.

Merk: For nisA, kodon av de fire siste aminosyrene (ASPR) av leder sekvensen ble mutert for å kode VSLR36 gjengi proline rester i kjernen peptid unike og sikre riktig prepeptide behandling av NisP. På N-terminus, ble en hexa-histidin kode flankert av koblingsfunksjonalitet rester lagt for rensing formål (se figur 1).

Figure 1
Figur 1 . Skjematisk fremstilling av biosyntesen og PTM av NisA i E. coli og leder spalting av L. lactis indikator belastningen i en etterfølgende aktivitet analysen. I det første trinnet, den inaktive lineær prenisin (består av en leder og en kjerne peptid regionen inneholder en unik proline (rosa) på posisjon 9) kodet av nisA er ribosomally syntetisert. Deretter endres prenisin posttranslationally av dehydrering av serine og threonin rester dehydroalanine (Dha) og dehydrobutyrine (Dhb) som katalysert av NisB. Cyclase NisC danner den thioether broer via Michael tillegg cystein sulfhydryl grupper med Dha eller Dhb. Den inaktive modifisert prenisin renset fra E. coli og testet for antimikrobielle aktivitet. Her, transporteres den inn i cellen av Gram-positive L. lactis indikator belastningen. Lederen er kløyvde av protease NisP (som angitt av pilspiss) for å frigjøre fullt aktive nisin. Det kan også være fjernet i vitro av behandling med trypsin (*). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Bruk standard varme-shock protokollen37 eller electroporation38 transformere proline auxotrophic E. coli belastning (se ovenfor) med plasmider pET-3a nisA(VSLR) og pRSFDuet-1 nisBC.
  2. Pipetter 25-100 µL av transformert celle suspensjon på agar plater som inneholder ampicillin, kanamycin og 1% (w/v) glukose. Bruke en plate sprederen eller glassperler for å spre løsningen jevnt på platene.
  3. Inkuber plater overnatting på 37 ° C.
  4. Følgende ettermiddagen, bruk en enkelt koloni for å vaksinere 10 mL LB medium som inneholder ampicillin, kanamycin og 1% (w/v) glukose i en 50 mL kolbe.
  5. Riste kultur over natten (12-16 h) på 37 ° C og 200 rpm.
  6. Ta 250 µL sterilt 80% glyserol og 550 µL kultur, bland godt i en 2 mL tube og lagre som frosne celle lager på 80 ° C.

2. nytt minimal medium (NMM) forberedelse

Merk: Denne protokollen bruker NMM20 som kjemisk definerte flytende bakterievekst medium. Det anbefales også følger forberedelse strengt. Ellers kan nedbør oppstå. Hvis aminosyre former enn de som er nevnt i tabellen materiale (f.eks hydrochlorides), kan du se oppløselighet. NMM19 inneholder 19 aminosyrer unntatt cAA byttes (her, proline) av ncAA analog. Se tabell 1 for de siste ingrediens konsentrasjonene. Avhengig av bakterielle belastningen brukes til produksjon, kan biotin og Thiamin være valgfritt.

  1. Utarbeidelse av aminosyre blandingen
    1. Oppløse 0,5 g Phe, Trp og Tyr i 100 mL ddH2O med tillegg av noen dråper av konsentrert HCl til oppløsning.
    2. Veie ut 0,5 g av hver av de resterende 16 aminosyrene. Bland med 22 mL 1 M KH2PO4 og 48 mL 1 M K2HPO4. Legge til ddH2O ~ 800 mL. Rør til løsningen blir klart.
    3. Tilsett oppløst Phe, Trp og Tyr, og justere volumet av løsningen 1 L med ddH2O.
    4. Sterilisere aminosyre blandingen av vakuum filtrering med en flaske topp filter enhet.
  2. Lager løsninger for NMM19
    1. Først forberede 1 M lager løsninger av følgende komponenter: (NH4)2så4, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4 og en 5 M lager løsning av NaCl. Sterilisere av autoklavering.
    2. Forberede 50 mL aksjer D-glukose (1 M) CaCl2 (1 g/L), FeCl2 (1 g/L), Thiamin (10 g/L), biotin (10 g/L) og sporstoffer (CuSO4, ZnCl2, MnCl2, (NH4)2MoO4, 1 mg/L ). Sterilisere hver av filtrering med en sprøyte filter.
  3. NMM19 forberedelse
    1. Bland alle lager løsninger for å få en endelig konsentrasjon av 7,5 mM (NH4)2SO4, 1,7 mM NaCl, 22 mM KH2PO4, 50 mM K2HPO4, 1 mM MgSO4 og 20 mM D-glukose, 50 mg/L aminosyre Bland, 1 µg/L CaCl2, 1 µg/L FeCl2, 10 µg/L Thiamin, 10 mg/L biotin og 0,01 µg/mL sporstoffer.

3. uttrykk av rekombinant Nisin med innlemmelse av Proline Analogs av SPI

I denne delen, rekombinant uttrykk for prepeptide (her: nisA) og PTM gener (her: nisBC) er utført. Først er celler dyrket i nærvær av alle cAAs, siden LB komplekse mediet brukes. Glukose legges til undertrykke genet Måluttrykket på bakgrunnen nivå, som ellers kan føre til produksjon av vill-type peptid (her: nisin) på grunn av leakiness av arrangørene. Etter målet cAA (her: proline) er oppbrukt, ncAA legges og målet genuttrykk er indusert i kjemisk definerte medium. Inkubasjon av flytende kulturer skal utføres i egnet flasker med lufting (f.eks 500 mL i en 2 L Erlenmeyer kolbe 200 RPM).

  1. Bruke et sterilt pipette tips, starte en frisk natten kultur fra frosne celle lager eller frisk koloni (se trinn 1). Bruke 25 mL LB mediet som inneholder ampicillin, kanamycin og 1% (w/v) glukose og ruge overnatting (12-16 h) på 37 ° C og 200 rpm.
  2. Vaksinere 1 L sterilt frisk medium med 10 mL natten kultur (1% v/v) og Inkuber på 37 ° C og 200 rpm til OD600 = 0,5.
  3. Sentrifuger på 4 ° C i 15 min 4500 x g.
  4. Hell av nedbryting og resuspend pellets med 20 mL NMM19 (forberedt i trinn 2.3) som inneholder antibiotika og 1% (w/v) glukose. Sentrifuger på 4 ° C i 10 min 4500 x g.
  5. Resuspend celle pellet i 500 mL av samme medium og ruge på 30 ° C og 200 rpm 1t.
    Merk: Dette trinnet cAA uttømming (her, proline) foregår.
  6. Del kulturen i like deler (én for hver ncAA). Indusere hver kultur med 1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) og levere 1 mM proline analogs (4S/R- fluoroproline, 4S/R- hydroksyprolin eller 4S/R- methanoproline).
    Merk: Som kontroll, en kultur kan leveres med 1 mM proline, noe som resulterer i vill-type peptid produksjon.
  7. Inkuber overnatting (12-16 h) på 28 ° C og 200 rpm.
  8. Sentrifuge cellen kulturer i 50 mL rør på 4 ° C etter 20 min på 5000 x g. hell av nedbryting og lagre pellets ved-80 ° C til rensing.

4. isolering og rensing av hans-merket Nisin Analogs

Peptider er renset under denaturing forhold med guanidine hydroklorid (GuHCl)39, en sterk denaturant.

Forsiktig: GuHCl er skadelig hvis svelging eller inhalert og fører til huden og alvorlig øyeirritasjon. Bruk vernebriller og hansker.

  1. Forberede 250 mL bindende buffer (5 M GuHCl, 300 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7.4), vaskebuffer (300 mM NaCl, 25 mM Tris, 25 mM imidazole, pH 7.4) og elueringsbufferen (300 mM NaCl, 25 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.4). For disse overføre faste stoffer til en 250 mL flaske og fylle opp til 200 mL med ddH2O. Mix også og justere pH 7,4 med 1 M NaOH eller HCl. Deretter Fyll opp til 250 mL med ddH2O. Filter alle buffer løsninger ved hjelp av en flaske topp filter enhet.
  2. Cellen lysis
    Her brukes en sonicator (med 200 W maksimalt høy frekvens (HF) utgang). Merk at strøminnstillinger nødvendig for celle avbrudd kan variere for andre instrumenter. Alle trinnene utføres på is. Alternativt, kjemiske celle lyse, en flytende homogenizer eller en fransk trykk kan brukes.
    1. Legg til 12 mL bindende buffer til hver sentrifuge tube (fra trinn 3.8) og resuspend av vortexing.
    2. Senk spissen av sonden sonicator i celle suspensjon. Angi sonicator på 40% amplituden med puls 1 s på / 5 s av 15 min.
      Merk: Rengjør sonicator spissen mellom prøver å unngå carryover. Tørk sonicator sonde med 70% etanol.
    3. Sentrifuge lysed celle suspensjon ved 4 ° C i 40 minutter til 15.000 x g til pellets celle rusk. Overføring av supernatants til en ny reaksjon tube.
  3. Affinitet kromatografi
    For immobilisert metall ion affinitet kromatografi (IMAC)40, kan en peristaltiske pumpe eller et FPLC system brukes med en 1 mL kassett (her fylt med Ni-NTA harpiks). For utarbeidelse av buffere, kan du se trinn 4.1.
    Merk: IMAC rensing er mulig siden den produsert rekombinant peptid bærer en N-terminalt hans-merket lederen, som er fjernet i trinn 6 av leder peptidase NisP, slippe eldre nisin. Utføre rensing ved romtemperatur eller 4 ° C. Bruk en strømningshastighet på 1 mL per minutt eventuelt for IMAC kassetten.
    1. Først vaske kassetten med 5 kolonnen volum (cv) ddH2O fjerne lagringsplass buffer.
    2. Equilibrate med 10 cv bindende bufferen.
    3. Prosessen celle lysate (trinn 4.2) bruker en sprøyte filter for å fjerne partikler, så gjelder kassetten.
    4. Vask med 15 cv av vaskebuffer for å fjerne uspesifikke og ubundet materiale.
    5. Elute med 10 cv elueringsbufferen og samle 1 mL brøker i 1,5 mL rør. Lagre fraksjoner på 4 ° C kort sikt (opp til 3 dager) eller på 20 ° C for lengre søkeord.
    6. For lagring, vaske kassetten med 10 cv ddH2O etterfulgt av 5 cv av 20% etanol.

5. LC-ESI-TOF masse Spectrometric analyse av Nisin Analogs

Merk: Se materialer tabell for eksempel instrumentering for flytende kromatografi kombinert med electrospray ionization tid-av-flight massespektrometri (LC-ESI-TOF-MS).

  1. Utføre HPLC separasjon av 15-20 µL peptid løsning (forberedt i trinn 4.3) på en C5-kolonne med en mobil fase (A) og acetonitrile (B) begge supplert med 0,1% maursyre og gradering fra 5-80% B over 20 min. Massespektrometri (MS), bruke elueringsrør etter 5 min.
    Merk: Avhengig av peptid innhold og affinitet til kolonnen HPLC, prøve volumer og separasjon må optimalisering.
  2. Bruk passende deconvolute til målt masse spectra og beregne ulike peptid tillegget sier41. Sammenligne observerte peptid arter massen til beregnede vill-type massen endres av cAA → ncAA substitusjon. Ta i betraktning at den lineære prepeptide er posttranslationally endret av åtte dehydrations (-8 H2O) og fem cyclizations (se figur 1).
    Merk: Bruker natrium inneholder buffere, kan MS analyse i positiv modus vise natrium addukter. Disse bli synlig som flere topper med høyere deconvoluted masse (for hver natrium adduct, observerte deconvoluted massen er 22,99 Da høyere). Hvis du vil fjerne disse addukter, HPLC rensing42 eller omfattende dialyse43 kan utføres.

6. antimikrobielle aktivitet Test

  1. Utarbeidelse av GM17-agar plater under sterile forhold
    1. Forberede en overnatting kultur indikator belastning L. lactis NZ9000 bærer plasmider pNG nisPT44 på 30 ° C i M17 kjøttkraft45 med 1% (w/v) glukose (= GM17) og 5 µg/mL chloramphenicol.
    2. Måle OD600, vaksinere frisk medium OD600 = 0,1 og ruge til OD600 = 0,4-0.6. Plass kolbe på is.
      Merk: Hver OD600 måling vil forbruke kultur volum. Husk at for hver analysen agar plate, 1 mL bakteriell kultur vil være nødvendig. Om nødvendig skalere opp væske kultur tilsvarende.
    3. For 1,5% agar, veie ut 4.5 g agar i en glassflaske media. Legge til 300 mL ddH2O, mix og autoclave.
    4. Forberede 2 x M17 kjøttkraft (bedrar konsentrert) i 300 mL ddH2O og autoclave.
    5. Bland 25 mL 2 x M17 kjøttkraft inneholder 10 µg/mL chloramphenicol og 2% glukose med 1 mL L. lactis preculture (4% v/v).
    6. Legg til 25 mL smeltet 1,5% agar (fersk autoklaveres eller oppvarmet i en mikrobølgeovn).
      Merk: Før dette la flaske avkjøles å ta (rundt 50 ° C). Dette er nødvendig fordi L. lactis er en mesophilic organisme følsomme for høye temperaturer.
    7. Hell løsningen i en stor Petriskål. Tørr plater for 10-15 min.
    8. Sterilisere endene av et glass Pasteur pipette av flammen. Vent til det å kjøle ned, deretter bruke den vide enden lage hull i den befestet GM17-agar.
  2. Eksempel forberedelse
    1. Ta 1 mL av E. coli uttrykk kulturer (opprettet i trinn 3.7) i en merket 1,5 mL rør og sentrifuge for 3 min på 7000 x g. leveringstanken gjenværende mediet og resuspend celle pellet i 500 µL Na-P (50 mM natrium fosfatbuffer pH 7.4 laget av 0,5 M natrium dihydrogen fosfat og 0,5 M disodium hydrogen fosfat).
    2. Sonicate prøvene på is (sammenlign trinn 4.2.2). Senk spissen av sonden sonicator i celle suspensjon. Angi sonicator på 30% amplituden med puls 1 s på og 5 s av 3 min.
    3. Sentrifuge cellen lysate i 10 min 13 000 x g til pellets celle rusk. Overføre nedbryting slik ny reaksjon på is.
    4. Fortynne og normalisere celle pakke supernatants 1 mL OD600 = 0,6, i forhold til den høstet celle tettheten, Na-P.
  3. Aktivitet test
    1. Legge til 40 µL av hver normalisert prøve i hull av indikator agar plate (Figur 3). Bruk chloramphenicol på 400 µg/mL som antibakterielle kontroll sammensatte. Bruke elueringsbufferen som en negativ kontroll. Vent til alle prøvene er diffust agar. Inkuber platen overnatting på 30 ° C.
    2. Ta bilder av agar platene hjelp en planskanner eller digitalkamera. Vekst hemming halo størrelser kan måles for hånd eller bruke ImageJ46.

7. fluorescens mikroskopi

For å observere effekten av forsterkere på bakterielle celler, kan lys og fluorescens mikroskopi brukes. Merk at nisin virkemåte avhengig destabilisering og dannelse av porene i bakteriell membraner6. Her brukes Nilen røde stain bakteriell cellemembranen, som blir spredt og samlet på cellen lysis.

Merk: Se materialer tabell for eksempel instrumentering. Mengder lagt AMP løsning kan justeres avhengig av peptid konsentrasjon og bioactivity.

  1. Cellen forberedelse
    1. Forberede 10 mM Nilen røde lagerløsning i dimethyl sulfoxide (DMSO).
    2. Vokse L. lactis indikator belastning OD600 = 1.0 som steg 6.1.1-6.1.2.
    3. Sentrifuge 1 mL kultur i 3 minutter på 4 ° C og 5000 x g.
    4. Forkaste nedbryting, resuspend 1 mL fosfat-bufret saltvann (PBS)47.
    5. Sentrifuger og resuspend igjen.
    6. Legg 1 µL Nilen røde lagerløsning, bland forsiktig.
  2. Mikroskopiske bildeopptak
    1. Legge til 30 µL av cellen forberedelse på et dekke lysbilde mens spennende på 520 nm.
    2. Angi oppkjøpet tid 0,2 s, kinetic-serien 0,1 Hz, serien lengde 200 bilder.
    3. Legge til 0.3 - 1,5 µL av celle lysate eller IMAC prøve (fra trinn 6.2.4 eller 4.3.5, henholdsvis). For IMAC prøver, kan elueringsbufferen brukes som en negativ kontroll.
    4. Overvåke og registrere fluorescens utslipp på λ ≥ 560 nm.
  3. Dataanalyse
    1. Mikroskopi bildesekvenser lagres som videofiler (AVI). Enkeltbilder analyseres med ImageJ46.

Representative Results

Denne protokollen er utformet slik at produksjon av ncAA endret nisin varianter med rester-spesifikke innlemmelse av proline analogs av SPI-metoden. Tidligere ble gjennomførbarhet og avkastning på 24 mg/L rapportert for rekombinant produksjon av fullstendig endret vill-type nisin39. Med metoden SPI målet peptid/protein gir gode ofte og kan nå mengder nær vill-type produksjon48. Som første eksperimenter, bør rekombinant vill-type RiPP produksjonen testes i valgt auxotrophic verten. Her, den proline-auxotrophic E. coli MG1655 ΔproBA:: frt ΔproC:: frt (DE3) ble brukt som vert belastning. Inkorporering av ncAAs, dyrking og induksjon kan timing samt middels sammensetning og temperatur optimaliseres mot maksimal peptid avkastning.

Antimikrobiell aktivitet analysen
Vill-type rekombinant nisin produksjon og rensing ble utført etter protokollen ovenfor. I dette tilfellet ble proline brukt i stedet for ncAA derivater på trinn 3.6. Antimikrobielle aktivitet analysen ble brukt til å bekrefte RiPP produksjon og sammenligne den antimikrobielle aktiviteten før og etter rensing. For aktivitet analysen, ble elueringsrør brøker og IMAC gjennomflytsenhet brukt direkte og testet mot Gram-positive L. lactis indikator belastningen (figur 2). Denne belastningen uttrykker NisP, varianter av nisin i E. coli celle lysates eller renset peptid prøver, henholdsvis, bli aktivert av proteolytisk spalting av leder peptid. Tydeligvis gjennomflytsenhet viste vokse-hemmende aktivitet. Dette kan forklares av bioaktive materiale ikke bindende kolonnen IMAC. Testet elueringsrør fraksjoner alle viste økt aktivitet i forhold til urenset prøven, som viser en konsentrasjon av hans-merket peptid av IMAC. Merk at elueringsbufferen (som negativ kontroll) ikke påvirke veksten av L. lactis i denne analysen.

Figure 2
Figur 2 . Antimikrobiell aktivitet test etter IMAC rensing av recombinantly produsert vill-type nisin. Tilsettes fraksjoner 5 til 15 og informasjonsflyten gjennom IMAC rensing ble testet med urenset cellen lysate (utvannet for OD600 normalisering) mot L. lactis indikator belastningen. Størrelsen på vekst hemming halos angir antimikrobielle aktivitet. Chloramphenicol i en konsentrasjon av 400 µg/mL ble brukt som en positiv kontroll og IMAC elueringsrør bufferen som negativ kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

For å bevise den antimikrobielle aktiviteten av recombinantly produsert nisin varianter som inneholder seks forskjellige proline analogs, aktivitet analysen ble utført for å teste hemming av L. lactis indikator belastningen. Figur 3 viser vekst hemming for fem av seks utvalgene produsert ved hjelp av proline analogs. De beste resultatene (som dømmes fra halo størrelser) ble observert for inkorporering eksperimenter av analog (4R) - fluoroproline, (4R) - hydroksyprolin og (4S)-methanoproline. Sammenligne vekst hemming halo størrelsen til vill-type nisin produsert og testet i parallell, alle tre nisin varianter viste lignende hemming styrke. Men halo størrelsen alene kan ikke brukes til esler en bestemt aktivitet, siden konsentrasjonen av AMP ikke ble fastsatt. Derfor tjener analyser kun for å teste kvalitativt om den antimikrobielle aktiviteten av resulterende nisin variantene er bevart eller mistet. For å avgjøre til aktiviteten, må konsentrasjonen av varianter av nisin være kvantifisert (se diskusjon).

Figure 3
Figur 3 . Antimikrobiell aktivitet analysen av celle lysates som inneholder nisin varianter produsert via SPI med proline analogs. Sammenligning av nisin varianter rekombinant vill-type utvalg. Alle prøvene var OD600-normalisert etter celle lysis i forhold til høstet celle kultur tetthet. Glorier viser bioactivity i form av indikator belastning vekst hemming. 1.p fra venstre til høyre: (4R)-fluoroproline, (4R) - hydroksyprolin, (4R) - methanoproline og chloramphenicol (400 µg/mL, antimikrobielle positiv kontroll). Andre rad: (4S)-fluoroproline, (4S) - hydroksyprolin, (4S) - methanoproline og proline (vill-type kontroll). Merk den kjemiske nomenklaturen; f.eks (4R) - fluoroproline er også referert til som trans-4 - fluoroproline. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

LC-ESI-TOF massespektrometri
Etter IMAC rensing, ble inkorporering av ncAAs nisin analysert av LC-ESI-TOF massespektrometri. Figur 4 viser de deconvoluted masse spektra av en nisin variant som inneholder (4R)-fluoroproline. Denne varianten var IMAC renset som beskrevet ovenfor og etterpå analysert av LC-ESI-TOF massespektrometri, slik det fortsatt gjennomført leder. Den største høydepunkt i Figur 4A tilsvarer den endrede nisin som inneholder (4R)-fluoroproline med en deconvoluted masse 6883.18 Da (beregnet masse 6882.05 Da, beregnet masse den tilsvarende vill-type peptid med proline på 9 er 6864.06 Da). De to toppene med lavere overflod og høyere masse tilsvarer natrium addukter som angitt. Figur 4 B viser forskjellig ladet arter av sammensatte som funnet av deconvolution algoritmen. For eksempel en topp på 1148.11 m/z tilsvarer seks ganger ladet arter ([M + 6H]6 +).

Figure 4
Figur 4 . LC-ESI-TOF massespektrometri IMAC-renset rekombinant nisin varianter som inneholder (4R)-fluoroproline. (A) Deconvoluted massespektrometri chromatogram (zoomet ut i rammemargen) for nisin varianten (fremdeles bærer leder) med (4R)-fluoroproline (forventet massene (Da): [M + H]+ = 6882.05, [M + Na]+ = 6904.03, [M + 2Na]2 + = 6926.02). (B) sammensatte spectra for arter [M + H]+. Forventet massene (Da): [M + 5H]5 + = 1377.41, [M + 6 H]6 + = 1148.01, [M + 7 H]7 + = 984.15, [M + 8 H]8 + = 861.26, [M + 9 H]9 + = 765.67, [M + 10 H]10 + = 689.21, [M + 11 H]11 + = 626.64, [M + 12 H] 12 + = 574.50. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fluorescens mikroskopi
Antimikrobiell aktivitet av rekombinant nisin og variantene ncAA inneholder kan også vises i direkte observasjon av L. lactis indikator belastning via fluorescens mikroskopi. Nilen rød, en svært hydrofobe fluorescerende farge, ble brukt stain bakteriell cellemembranen. Figur 5 viser kvalitativ endringen av aggregering cellekultur og enkelt celle morfologi. Celler var farget med Nile rød og avsatt på et mikroskopi dekke lysbilde. Den øverste raden viser cellene direkte i begynnelsen når bufferen, rekombinant vill-type nisin, eller nisin som inneholder (4R)-fluoroproline, eller (4R)-hydroksyprolin ble lagt. Nedre panel viser tilsvarende bildene etter 20 minutter med inkubering.

Figure 5
Figur 5 . Fluorescens mikroskopi rekombinant nisin effekter på Gram-positive celler. Mikroskopiske bilder av 30 µL L. lactis indikator belastning (OD600 = 1) merket med Nile røde ble tatt før (øvre panel) og etter (nedre panel) 20 min incubation med 1 µL buffer (A), 0,3 µL rekombinant vill-type nisin (B) og 0,6 µL nisin varianter som inneholder (4R)-fluoroproline (C) og (4R)-hydroksyprolin (D). Blå sirkler merke regioner med aggregert eller deformert celler, blå piler peker til områder der spredning av fluorescerende membranen kan observeres. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5 En viser at det generelle utseendet av cellene ikke endre innen 20 minutter av observasjon. Så mange celler som satt under tiden rose, og derfor et større antall celler er synlig 80 µm x 80 µm i regionen observert. Figur 5 B viser at Gram-positive cellene dukket opp samlet og uklart (merket med blå sirkler) etter 20 minutter av eksponering for vill-type nisin, ble selv når lave mengder (her, 0,3 µL IMAC elueringsrør) lagt. I tillegg diffust lys materiale fra celler i bufferen, indikerer at membran fragmenter merket med Nile røde ble mobilisert i tidsrammen (merket av blå piler). Disse funnene tyder celle lysis som det oppstår ved behandling med nisin6,49. Liknende effekter ble observert etter inkubasjon med nisin variant inneholder (4R) - fluoroproline (figur 5C) og nisin som inneholder (4R) - hydroksyprolin (figur 5D) både vise store mengder forvrengt og aggregert celler etter 20 minutter, i markert kontrast til kontroll prøven (figur 5et).

Komponent Konsentrasjon
(NH4) 2 SÅ4  7.5 mM
NaCl 8,5 mM
KH2PO4 22 mM
K2HPO4 50 mM
MgSO4 1 mM
D-glukose 20 mM
Alle kanoniske aminosyrer
(bortsett fra den ene erstatte)		 50 mg/L
Ca2 + 1 µg/mL
Fe2 + 1 µg/mL
Sporstoffer
(Cu2 +, Zn2 +, Mn2 +, MoOH2 +)		 0,01 µg/mL
Thiamin 10 µg/mL
Biotin 10 µg/mL

Tabell 1. Sammensetning av NMM19 kjemisk definerte bakterievekst medium etter forberedelse etter trinn 2.

Discussion

Bruker SPI for innsetting av proline analogs, kan målrettet nisin strukturer vesentlig endre, opprette romanen peptid varianter med unik bokstavkombinasjon kombinasjoner og kjemiske egenskaper. Dette kan grunnleggende grensen på klassisk genteknologi omgås, og som er begrenset til side kjede kjemikalier av de 20 cAAs. I vivo kjemiske diversifisering av nisin som eksemplifisert ovenfor viser en generell tilnærming å utfylle naturlig PTMs og dramatisk forbedre kjemiske løpet av RiPPs. Vi tror at utvide repertoaret av naturlige aminosyrer har store løftet spesielt for forsterkere. I proteiner, kan et enormt utvalg av funksjonaliteten realiseres gjennom en definert arrangement av de 20 cAAs i tredimensjonale strukturer. Med bare 7-100 aa i lengden3være måter å oppnå strukturelle funksjoner bare gjennom cAAs begrenset for forsterkere. Det er derfor ikke overraskende at naturlig forsterkere i form av RiPPs er vanligvis mye post-translationally endret4. På samme måte, ncAAs som alternative byggeklosser holde store løftet å forbedre deres Farmakodynamiske og farmakokinetiske parametere (se Baumann et al. 201735 og referanser der).

SPI-metodene som er brukt i dette arbeidet fordeler en relativt enkelt eksperimentelle oppsett og grei kjøring av høy reproduserbarhet. På grunn av global substitusjon er multisite ncAA inkorporering målet peptider også mulig. På den annen side, kan metoden ikke være tilstrekkelig for utskifting av aminosyrer som ofte forekommer i målet gene produktet. I prinsippet, uønskede posisjoner kan endres av området-rettet mutagenese, men disse endringer kan også påvirke flere AMP egenskaper inkludert struktur og bioactivity. Når en auxotrophic belastning for produksjon er tilgjengelig, kan flere ncAAs testes uten omfattende endringer på genetisk nivå. Videre metoden er ikke begrenset til auxotrophic E. coli stammer, men kan også utføres ved hjelp av naturlig vanillin verten. For eksempel Zhou et al. viste at SPI for produksjon av romanen RiPPs fungerer også i den naturlig Trp-auxotroph L. lactis: bruker definert medier, tre tryptofan analogs ble innlemmet i fire posisjoner i nisin50.

Siden SPI metoden fører til global utskifting av utvalgte cAA av ncAA, er det generelt gjelder for et bredt spekter av målet peptider og proteiner. Et utvalg av auxotrophic E. coli stammer er tilgjengelig (se trinn 1), slik at flere cAAs hver skal testes for utskifting av ncAAs. Møtte analogs innlemmet bruke metA-mangelfull stammer (f.eks B834(DE3)) er vanligvis ansatt. Eksempler på isostructural Met analoger er azidohomoalanine (Aha) og homopropargylglycine (Hpg), kommersielt tilgjengelig ncAAs som kan innlemmes effektivt. Begge introdusere bioorthogonal håndtak som tillater vedlegg molekyler bærer en kompatibel alkyne eller azide funksjonalitet, henholdsvis. For eksempel fluorescerende fargestoffer eller polyetylenglykol (PEG) moieties kan festes av kobber (I)-katalysert azide alkyne cycloaddition (CuAAC)51.

Selv om begge rekombinant ncAA innlemmelse metoder (SPI og SCS) vanligvis oppnå tilstrekkelig målet antall, gir ofte redusert i forhold til vill-type produksjon av tilsvarende peptider og proteiner. Som purities korrelerer ofte med produksjonseffektivitet, kan ekstra rensing trinnene være nødvendig, særlig for lav-rikelig arter. I dette tilfellet av rekombinant nisin produksjon forenkler hans-merket leder sekvensen RiPP rensing av selektiv berikelse fra celle lysates. Rensing i denne protokollen forbedrer renhet og konsentrasjonen av nisin, men ofte gir ikke AMP purities nok å finne avkastningen og aktiviteten. I tillegg IMAC, brukte AMP rensing metoder omfatter HPLC, ionebytte kromatografi (IEC) og nedbør (f.eks. med aceton eller Trekloredikksyre (TCA)) eller kombinasjoner av disse - som resulterer i en må rensing ordningen52 . Det bør bemerkes at deres ofte polycationic natur kan rette IEC rensing. Frysetørring brukes ofte til å lagre renset forsterkere.

Ideelt sett ncAAs for inkorporering forsterkere skal være kommersielt tilgjengelig til rimelige priser eller produsert enkelt av enkel og reproduserbar syntese protokoller. En like viktig forutsetning for metoden SPI er at ncAA er anerkjent, aktivert og belastet på beslektet tRNA av endogene eller co uttrykt aaRS. Dette kan være testet i vitro av aminosyre aktivisering eller tRNA aminoacylation analysen53. Som et enkelt alternativ, SPI test uttrykk for modell proteiner som grønne fluorescerende protein (GFP) utført både tilstedeværelse og i fravær av ncAA tilskudd kan utføres. Videre oppløselighet i vekst medium og celle permeabilitet samt kjemiske stabilitet utgjør viktige faktorer.

I dette eksemplet ble antimikrobielle aktiviteten vist ved hjelp av en Gram-positive indikator belastning. Som den uttrykker leder peptidase NisP, er det siste trinnet i nisin modning katalysert. Fjerning av leder sekvensen (hans-merket for rensing formål) kan også være utført i vitro av behandling med renset NisP50 eller trypsin54. Utenfor omfanget av dette arbeidet, kan sykdomsfremkallende organismer og multidrug resistente stammer deretter bli testet for bakteriostatisk eller bakteriedrepende hemming av forsterkere bruker en lignende metode. Klinisk relevante mål arter omfatter MRSA, MDR Mycobacterium tuberculosis, VRE, Acinetobacter baumannii, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa og Klebsiella pneumoniae. Foruten agar plate spredningen analysen presenteres her, vekst hemming kan også utføres ved hjelp av flytende mediefil inokulert med bakteriell arter og supplert med AMP. Bruke kjøttkraft fortynning metoder, kan minimal inhibitoriske konsentrasjon (MIC) bestemmes ren peptider55. Aktivitet analysen presenteres her kan også brukes til å beregne bioactivity og styrke av AMP inneholder løsninger i forhold til referanse forbindelser, for eksempel kommersielt tilgjengelige nisin.

Rekombinant produksjon av RiPPs er ofte mulig39, som vanligvis inkluderer co uttrykk for PTM gener. Så snart produksjon belastningen er overført til en kjemisk definert eller syntetiske minimal medium som inneholder en egnet ncAA, foregår rest-spesifikke utskifting av tilhørende cAA. Dermed kan andre RiPPs bli produsert av samme metodikken, forutsatt at rekombinant produksjonen er mulig og forhold kan finnes der ncAA innlemmelse og PTM gir tilstrekkelig mengder mål produktet. Merk at i tillegg til verten celle proteom peptid PTM maskiner kan også bli ncAA endret under SPI. Følgelig kan tidspunktet for målet uttrykk induksjon og lengden på følgende inkubasjonstiden kreve optimalisering. Siden ncAA inkorporering PTM enzymene kan påvirke deres stabilitet og aktivitet, kan produksjon av behandlet RiPP i prinsippet påvirkes. Tilstrekkelig PTM enzym effekt angis med dannelsen av behandlet prepeptide, som oppdaget av MS og bioactivity analyser. Som introdusert ovenfor, forskjellige induserbart arrangører kan brukes for å produsere PTM gener (i fravær av ncAA) etterfulgt av induksjon av forløperen peptid genet i nærvær av ncAA. Generelt, må produksjon av cAA inneholder mål peptid undertrykkes før tillegg av ncAA, derfor tett undertrykkelse av forløperen genet er nødvendig. I denne protokollen oppnås dette av katabolske undertrykkelse gjennom tillegg av glukose til vekst medium. Spesielt siden de PTM enzymene kreves for prepeptide behandling kommer vanligvis fra en genetisk Fjern vert, kan uttrykk temperatur og codon bruk av tilsvarende genene kreve optimalisering om rekombinant produksjon ennå ikke er etablert. I prinsippet kan tilstedeværelsen av ncAAs i i prepeptide påvirke gjenkjennelse og behandling av PTM enzymer, ved nisin NisBC og NisP. For ncAA inkorporering forsterkere anbefales det derfor å utføre småskala uttrykk eksperimenter først å identifisere egnet expression forhold og pålitelighet av AMP aktivitet analysen.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

J.H.N., TB og MB erkjenner finansiering i EU FW7 programmet (SYNPEPTIDE). F.-js og T.F. erkjenner finansiering av Federal Utdannings og vitenskap (BMBF Program "HSP 2020", TU-WIMIplus prosjektet SynTUBio) og tysk Research Foundation (Cluster of Excellence "Unifying konsepter i katalyse").

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sodium chloride Carl Roth, Germany P029
guanidine hydrochloride Carl Roth, Germany 0035.2
dipotassium hydrogen phosphate Carl Roth, Germany P749.3
potassium dihydrogen phosphate Carl Roth, Germany 3904.3
sodium dihydrogen phosphate monohydrate Carl Roth, Germany K300.2
disodium hydrogen phosphate Carl Roth, Germany P030.2
L-alanine Carl Roth, Germany 3076.2
L-arginine Carl Roth, Germany 3144.3
L-asparagine monohydrate Carl Roth, Germany HN23.1
L-aspartic acid Carl Roth, Germany T202.1
L-cysteine Carl Roth, Germany 3467.3
L-glutamine Carl Roth, Germany 3772.1
L-glutamic acid Carl Roth, Germany 3774.1
L-glycine Carl Roth, Germany 3187.3
L-histidine Carl Roth, Germany 3852.3
L-isoleucine Carl Roth, Germany 3922.3
L-leucine Carl Roth, Germany 3984.3
L-lysine monohydrate Carl Roth, Germany 4207.2
L-methionine Carl Roth, Germany 9359.4
L-phenylalanine Carl Roth, Germany 4491.2
L-proline Carl Roth, Germany T205.3
L-serine Carl Roth, Germany 4682.4
L-threonine Carl Roth, Germany T206.2
L-tryptophan Carl Roth, Germany 4858.2
L-tyrosine Carl Roth, Germany T207.2
L-valine Carl Roth, Germany 4879.4
ammonium sulfate Carl Roth, Germany 3746.3
magnesium sulfate Carl Roth, Germany 0261.2
D-glucose Carl Roth, Germany 6780 prepare a 20% (w/v) solution for addition into molten agar
calcium chloride Carl Roth, Germany PN93.2
iron(II) chloride Sigma-Aldrich, Germany 372870
thiamine hydrochloride Sigma-Aldrich, Germany T1270
biotin Carl Roth, Germany 3822.2
copper(II) sulfate Merck, Germany 102792
manganese(II) chloride Carl Roth, Germany KK36.2
zinc chloride Merck, Germany 108816
immonium orthomolybdate Sigma-Aldrich, Germany 277908
glycerol Carl Roth, Germany 7533.3
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Sigma-Aldrich, Germany I6758
ampicillin sodium salt Carl Roth, Germany K029.5 working concentration 100 µg/mL for E. coli, prepare 100 mg/mL stock in ddH2O
kanamycin sulfate Carl Roth, Germany T832.2 working concentration 50 µg/mL for E. coli, prepare 50 mg/mL stock in ddH2O
chloramphenicol Carl Roth, Germany 3886.1 working concentration 5 µg/mL for L. lactis, prepare 37 mg/mL stock in ethanol
(4S)-fluoroproline Bachem, Switzerland F-3970
(4R)-fluoroproline Bachem, Switzerland F-3975
(4S)-hydroxyproline Bachem, Switzerland F-1395
(4R)-hydroxyproline Bachem, Switzerland F-2980
(4S)-methanoproline chemically synthesized
(4R)-methanoproline chemically synthesized
hydrochloric acid (HCl) Carl Roth, Germany P074.4
ethanol VWR, Germany 20825.324
M17-broth Sigmal-Aldrich, Germany 56156 commercial product, see Terzaghi BE & Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13 for contents and preparation
agar-agar Carl Roth, Germany 5210.5
Nisin from Lactococcus lactis  Sigma-Aldrich, Germany N5764 commercial product, can be used as reference for bioactivity
dimethyl sulfoxide (DMSO) Carl Roth, Germany A994.1
imidazole Carl Roth, Germany 3899.3
1.5 mL autosampler vial for LC-MS Sigma-Aldrich, Germany Supelco 854165
acetonitrile VWR, Germany HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 LC-MS grade required
formic acid VWR, Germany HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 LC-MS grade required
1 mL Ni-NTA IMAC column, e.g. HisTrap FF Crude GE Healthcare, UK 29-0486-31 different manufacturers and resins available for IMAC
0.45 µm bottle top filter unit VWR, Germany 10040-470 sterile filtration of solutions using a vacuum pump
0.45 µm syringe filter PVDF membrane Carl Roth, Germany CCY1.1 sterile filtration of solutions using a syringe and to remove particles from cell lysates
luer-lock syringe, PP, 50 ml Carl Roth, Germany T552.2 sterile filtration of solutions  
1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf, Germany 30120086
petri dishes (polystyrene, sterile) Carl Roth, Germany TA19
Nile red Sigma-Aldrich, Germany 72485
E. coli ΔproA strain CGSC, Keio collection JW0233-2 proline-auxotrophic E. coli K-12 strain
E. coli B834(DE3) Novagen (Merck), Germany 69041 methionine-auxotrophic E. coli B strain
λDE3 Lysogenization Kit Novagen (Merck), Germany 69734-3
Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT bacterial indicator strain, see Khusainov R & Kuipers OP, PLoS One, 8 (9), e74890
benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf, Germany 5427 R
peristaltic pump GE Healthcare, UK P1
FPLC system GE Healthcare, UK Äkta Purifier 10 or the like
inverted microscope Nikon TI Eclipse wide-field fluorescence microscope  with 100x (N.A. 1.4) objective and Mercury Lamp example setup for fluorescence microscopy
electron multiplying CCD (EMCCD) camera Andor Technologies, UK Andor Luca  example setup for fluorescence microscopy
fluorescence excitation filter Thorlabs, USA Dichroic cube (TLV-U-MF2-TRITC) example setup for fluorescence microscopy
fluorescence emission filter AHF Analysentechnik, Germany T 560 LPXR example setup for fluorescence microscopy
cover slip 24 x 60 mm Carl Roth, Germany LH26.1 example setup for fluorescence microscopy
Immersion Oil Carl Zeiss, Germany Immersol 518 F example setup for fluorescence microscopy
probe sonicator Bandelin, Germany Sonopuls HD3200 with sonotrode MS-72 200 W maximum HF output
C5 HPLC column (2.1x100 mm, 3 µm particle size) Sigma-Aldrich, Germany 567227-U example setup for mass spectrometry
ESI-TOF coupled to HPLC system Agilent, USA Agilent 6530 Accurate Mass QTOF with 1260 HPLC example setup for mass spectrometry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferri, M., Ranucci, E., Romagnoli, P., Giaccone, V. Antimicrobial resistance: A global emerging threat to public health systems. Crit Rev Food Sci Nutr. 57 (13), 2857-2876 (2017).
  2. Bahar, A. A., Ren, D. Antimicrobial peptides. Pharmaceuticals. 6 (12), 1543-1575 (2013).
  3. Ageitos, J. M., Sánchez-Pérez, A., Calo-Mata, P., Villa, T. G. Antimicrobial peptides (AMPs): Ancient compounds that represent novel weapons in the fight against bacteria. Biochem Pharmacol. 133, 117-138 (2017).
  4. Arnison, P. G., et al. Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide natural products: overview and recommendations for a universal nomenclature. Nat Prod Rep. 30 (1), 108-160 (2013).
  5. Lubelski, J., Rink, R., Khusainov, R., Moll, G. N., Kuipers, O. P. Biosynthesis, immunity, regulation, mode of action and engineering of the model lantibiotic nisin. Cell Mol Life Sci. 65 (3), 455-476 (2008).
  6. Shin, J. M., Gwak, J. W., Kamarajan, P., Fenno, J. C., Rickard, A. H., Kapila, Y. L. Biomedical applications of nisin. J Appl Microbiol. 120 (6), 1449-1465 (2016).
  7. Scherer, K. M., Spille, J. -H., Sahl, H. -G., Grein, F., Kubitscheck, U. The lantibiotic nisin induces lipid II aggregation, causing membrane instability and vesicle budding. Biophys J. 108 (5), 1114-1124 (2015).
  8. Jung, G. Lantibiotica - ribosomal synthetisierte Polypeptidwirkstoffe mit Sulfidbrücken und α,β-Didehydroaminosäuren. Angew Chemie. 103 (9), 1067-1084 (1991).
  9. Rink, R., et al. Lantibiotic structures as guidelines for the design of peptides that can be modified by lantibiotic enzymes. Biochemistry. 44 (24), 8873-8882 (2005).
  10. Lagedroste, M., Smits, S. H. J., Schmitt, L. Substrate Specificity of the Secreted Nisin Leader Peptidase NisP. Biochemistry. 56 (30), 4005-4014 (2017).
  11. Ross, A. C., Liu, H., Pattabiraman, V. R., Vederas, J. C. Synthesis of the lantibiotic lactocin S using peptide cyclizations on solid phase. J Am Chem Soc. 132 (2), 462-463 (2010).
  12. Fukase, K., et al. Synthetic Study on Peptide Antibiotic Nisin. V. Total Synthesis of Nisin. Bull Chem Soc Jpn. 65 (8), 2227-2240 (1992).
  13. Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology. Chem Sci. 6 (1), 50-69 (2015).
  14. Kuthning, A., Durkin, P., Oehm, S., Hoesl, M. G., Budisa, N., Süssmuth, R. D. Towards Biocontained Cell Factories: An Evolutionarily Adapted Escherichia coli Strain Produces a New-to-nature Bioactive Lantibiotic Containing Thienopyrrole-Alanine. Sci Rep. 6, 33447 (2016).
  15. Piscotta, F. J., Tharp, J. M., Liu, W. R., Link, A. J. Expanding the chemical diversity of lasso peptide MccJ25 with genetically encoded noncanonical amino acids. Chem Commun (Camb). 51 (2), 409-412 (2015).
  16. Hartman, M. C. T., Josephson, K., Lin, C. -W., Szostak, J. W. An expanded set of amino acid analogs for the ribosomal translation of unnatural peptides. PLoS One. 2 (10), 972 (2007).
  17. Johnson, J. A., Lu, Y. Y., Van Deventer, J. A., Tirrell, D. A. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids into proteins: recent developments and applications. Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 774-780 (2010).
  18. Ibba, M., Söll, D. Aminoacyl-tRNAs: setting the limits of the genetic code. Genes Dev. 18 (7), 731-738 (2004).
  19. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
  20. Budisa, N., Steipe, B., Demange, P., Eckerskorn, C., Kellermann, J., Huber, R. High-level biosynthetic substitution of methionine in proteins by its analogs 2-aminohexanoic acid, selenomethionine, telluromethionine and ethionine in Escherichia coli. Eur J Biochem. 230 (2), 788-796 (1995).
  21. Rink, R., et al. Dissection and modulation of the four distinct activities of nisin by mutagenesis of rings A and B and by C-terminal truncation. Appl Environ Microbiol. 73 (18), 5809-5816 (2007).
  22. Kubyshkin, V., Durkin, P., Budisa, N. Energetic contribution to both acidity and conformational stability in peptide models. New J Chem. 40 (6), 5209-5220 (2016).
  23. Molloy, E. M., Field, D., O'Connor, P. M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Saturation mutagenesis of lysine 12 leads to the identification of derivatives of nisin A with enhanced antimicrobial activity. PLoS One. 8 (3), 58530 (2013).
  24. Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
  25. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  26. Anderson, J. C., Wu, N., Santoro, S. W., Lakshman, V., King, D. S., Schultz, P. G. An expanded genetic code with a functional quadruplet codon. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (20), 7566-7571 (2004).
  27. Zambaldo, C., Luo, X., Mehta, A. P., Schultz, P. G. Recombinant macrocyclic lanthipeptides incorporating non-canonical amino acids. J Am Chem Soc. 139 (34), 11646-11649 (2017).
  28. Al Toma, R. S., et al. Site-directed and global incorporation of orthogonal and isostructural noncanonical amino acids into the ribosomal lasso peptide capistruin. Chembiochem. 16 (3), 503-509 (2015).
  29. Chatterjee, A., Xiao, H., Schultz, P. G. Evolution of multiple, mutually orthogonal prolyl-tRNA synthetase/tRNA pairs for unnatural amino acid mutagenesis in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (37), 14841-14846 (2012).
  30. Budisa, N., Pal, P. P. Designing novel spectral classes of proteins with a tryptophan-expanded genetic code. Biol Chem. 385 (10), 893-904 (2004).
  31. Voller, J. -s, Thi To, T. M., Biava, H., Koksch, B., Budisa, N. Global substitution of hemeproteins with noncanonical amino acids in Escherichia coli with intact cofactor maturation machinery. Enzyme Microb Technol. 106, 55-59 (2017).
  32. Moghal, A., Hwang, L., Faull, K., Ibba, M. Multiple Quality Control Pathways Limit Non-protein Amino Acid Use by Yeast Cytoplasmic Phenylalanyl-tRNA Synthetase. J Biol Chem. 291 (30), 15796-15805 (2016).
  33. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  34. Engelke, G., Gutowski-Eckel, Z., Hammelmann, M., Entian, K. D. Biosynthesis of the lantibiotic nisin: genomic organization and membrane localization of the NisB protein. Appl Environ Microbiol. 58 (11), 3730-3743 (1992).
  35. Baumann, T., Nickling, J. H., Bartholomae, M., Buivydas, A., Kuipers, O. P., Budisa, N. Prospects of In vivo Incorporation of Non-canonical Amino Acids for the Chemical Diversification of Antimicrobial Peptides. Front Microbiol. 8, 124 (2017).
  36. Plat, A., Kluskens, L. D., Kuipers, A., Rink, R., Moll, G. N. Requirements of the engineered leader peptide of nisin for inducing modification, export, and cleavage. Appl Environ Microbiol. 77 (2), 604-611 (2011).
  37. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. J Vis Exp. , (2017).
  38. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. J Vis Exp. , (2017).
  39. Shi, Y., Yang, X., Garg, N., van der Donk, W. A. Production of lantipeptides in Escherichia coli. J Am Chem Soc. 133 (8), 2338-2341 (2011).
  40. Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. Nat Biotechnol. 6 (11), 1321-1325 (1988).
  41. Zhang, Z., Marshall, A. G. A universal algorithm for fast and automated charge state deconvolution of electrospray mass-to-charge ratio spectra. J Am Soc Mass Spectrom. 9 (3), 225-233 (1998).
  42. JoVE Science Education Database. High-Performance Liquid Chromatography (HPLC). J Vis Exp. , (2017).
  43. JoVE Science Education Database. Dialysis: Diffusion Based Separation. J Vis Exp. , (2017).
  44. Khusainov, R., Kuipers, O. P. The presence of modifiable residues in the core peptide part of precursor nisin is not crucial for precursor nisin interactions with NisB- and NisC. PLoS One. 8 (9), 74890 (2013).
  45. Terzaghi, B. E., Sandine, W. E. Improved medium for lactic streptococci and their bacteriophages. Appl Microbiol. 29 (6), 807-813 (1975).
  46. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  47. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
  48. van Hest, J. C. M., Tirrell, D. A. Efficient introduction of alkene functionality into proteins in vivo. Febs Lett. 428 (1-2), 68-70 (1998).
  49. Prince, A., et al. Lipid-II Independent Antimicrobial Mechanism of Nisin Depends On Its Crowding And Degree Of Oligomerization. Sci Rep. 6 (1), 37908 (2016).
  50. Zhou, L., et al. Incorporation of tryptophan analogues into the lantibiotic nisin. Amino Acids. 48 (5), 1309-1318 (2016).
  51. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Curr Protoc Chem Biol. 3 (4), 153-162 (2011).
  52. Abts, A., et al. Easy and rapid purification of highly active nisin. Int J Pept. 2011, 175145 (2011).
  53. Francklyn, C. S., First, E. A., Perona, J. J., Hou, Y. -M. Methods for kinetic and thermodynamic analysis of aminoacyl-tRNA synthetases. Methods. 44 (2), 100-118 (2008).
  54. van Heel, A. J., et al. Production and Modification of Five Novel Lantibiotics Using the Promiscuous Nisin Modification Machinery. ACS Synth Biol. 5 (10), 1146-1154 (2016).
  55. Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).

Tags

Bioteknologi problemet 135 Nisin RiPPs forsterkere ncAAs lantibiotic proline analog romanen antibiotika aktivitet analysen Gram-positive bakteriene rekombinant produksjon posttranslational endring syntetisk biologi
Antimikrobielle peptider produseres av seleksjonspress innlemmelse av ikke-kanoniske aminosyrer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nickling, J. H., Baumann, T.,… More

Nickling, J. H., Baumann, T., Schmitt, F. J., Bartholomae, M., Kuipers, O. P., Friedrich, T., Budisa, N. Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids. J. Vis. Exp. (135), e57551, doi:10.3791/57551 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter