Summary
プロトコルを提示大腸菌-lactococcal ・抗菌ペプチド ・ ナイシンに非正規アミノ酸類 (ncAAs) の選択的な圧力の取り込みをベースします。そのプロパティは、定義された成長媒体の目的の ncAAs で組換え発現を介して置換中に変更できます。結果として得られる活性変化は成長阻害アッセイ、蛍光顕微鏡でマップされます。
Abstract
自然には、様々 な個々 のアミノ酸構成ブロックのシーケンスを変更することにより新しいタンパク質機能を作成する可能性があります。ただし、すべてのバリエーションは 20 標準的なアミノ酸 (cAAs) に基づいています。ポリペプチドに追加の物理化学的性質を導入する方法として非正規のアミノ酸類 (ncAAs) の取り込みはますますタンパク質工学で使用されます。彼らの比較的短い長さのため ncAAs による ribosomally 合成とファーストクリーニング変更されたペプチドの変更は特に魅力的です。新しい機能や化学処理は、アミノ酸残基の特定の変更によって生成できます。選択圧定款 (SPI) 方法は、化学的に定義された成長媒体で必須アミノ酸の奪われている栄養要求性ホスト系統を利用します。いくつかの化学的に構造的に類似したアミノ酸アナログ対応するアミノアシル tRNA 合成酵素によってをアクティブにすることができ、残基特異 cAA(s) → ncAA(s) 置換対象のペプチドや蛋白質の配列を提供します。とはいえ、SPI メソッドのコンテキストで ncAAs 組み込まれているホスト プロテオーム組換え遺伝子発現の段階で、セルのリソースの大部分は、ターゲット遺伝子の発現に割り当てられます。これにより効率的な残基特異 ncAAs しばしば変更されたターゲットの多量を伴って定款です。提示された作品は、抗菌ペプチド ナイシン、ラクトコッカス乳酸菌によって生成される自然ランチビオティックに六つのプロリン類縁体の体内取り込みをについて説明します。ナイシンの抗菌特性を変更してその発酵と栄養要求性大腸菌での発現の間にさらに拡大すること定義されている成長媒体の系統。それによって、cAAs ncAAs で特定の残基置換の効果は、抗菌活性と特異性に変更を配信できます。抗菌活性アッセイ、蛍光顕微鏡を使用してグラム陽性ラクトコッカス乳酸菌インジケーターひずみを成長阻害するナイシンの変種をテストします。質量分析法を使用して、生理活性ナイシンの変形 ncAA 定款を確認しました。
Introduction
20 世紀における抗生物質の発見と有効な病原性微生物に対する新規抗菌剤の並行開発は、細菌感染症の治療を対象としました。しかし、メチシリン耐性Staphylococcusaureus (MRSA)、バンコマイシン耐性腸球菌 (VRE) などの多剤耐性の病原体の出現により MDR (多剤耐性)サルモネラファージ型 10 (DT10)、クレブシエラ、緊急新しい抗菌剤1を生成する必要があります。抗菌ペプチド (アンペア) は、物理化学的性質、柔軟性、サイズ、疎水性、およびアクション2のモードのおかげで新薬の開発のための有望な候補者は、汎用性の高い、多くの場合非常に特定の化合物です。アンプは、通常 7 100 アミノ酸からなる小さなペプチドです。多くの場合、逆3の電荷は、対象となる微生物細胞膜と相互作用する正荷電アルギニンとリジンの残余の豊富なカチオン性構造であること。アンプの特定のサブグループは、ribosomally 合成と posttranslationally 変更されたペプチド (RiPPs)4です。これらは菌類の王国と細菌のドメインから多くの生物によって生成されます。最もよく知られた、広く使用されている RiPPs の 1 つは、ナイシン、自然に乳酸菌ラクトコッカス乳酸菌(乳酸菌 l.) によって生成です。グラム陽性菌のパネルに対してアクティブ、ナイシンとして使用されています食品業界で biopreservative その抗菌特性と対象微生物系統5に進化した抵抗の不在のため 50 年以上。研究は、そのナイシンを不安定ベビーブーム、両方のグラム陽性およびグラム陰性の病原体6に対する抗菌活性につながる細菌の細胞膜に孔が生成されますを示しています。脂質 II に結合することにより細菌の細胞壁合成は抑制7です。ナイシンは、リーダーおよびコア ペプチド領域 (図 1) で構成されている線形前駆体ペプチドとして保安院によってエンコードされます。リボソーム合成後 prenisin は最初その脱水酵素によって変更されます。ここでは、prepeptide のコア領域のセリンやスレオニン残基が dehydroalanine (Dha) と dehydrobutyrine (Dhb)8にステータス退避。その後、脱水残渣、ランチオニン リングにシステインと結合 (したがってランチオニン リングを含む抗生物質の名前「ランチビオティック」) 酵素触媒のマイケル付加によって。この翻訳後修飾 (PTM) は、内閣官房酸シクラーゼにより触媒されます。L. 乳酸菌で変更された prenisin でトランスポーター NisT、セルから、運ばれて、リーダーのペプチッドは成熟しており、アクティブなナイシン フォーム9を解放する NisP, プロテイナーゼ切断します。責任あるリーダー ペプチダーゼ NisP は高い基質特異性、効率的にプロセスだけの変更ナイシンをそれ以来10。
一般に、アクティブな RiPPs は、リン酸化やメチル化糖鎖を介して例えば、アセチル化ペプチドの化学の領域を大幅に増やす PTM 酵素 (例えば NisBC) の行動から生じる。複雑さのこのレベルは ncAAs の直接結合によってさらに拡張できます。一方、多くの場合実現可能なアンプの化学合成はその構造の複雑さのための大規模な生産のための挑戦です。たとえば、ランチビオティック lactosin S 71 の反応段階での全化学合成はたった 0.00311,12の粗利回りナイシンの最終利回りは 10% で達成されました。したがって、生物生産は正しい stereocenters と高濃度生成のための現実的な選択肢を提供しています。
今日まで以上 150 ncAAs、例えば、フッ素またはアザイドを含む官能基を有するは、組換えタンパク質に組み込まれている、ncAA 変更アンペアのいくつかの例が報告された13,14をされています。 15,16。NcAAs の導入に伴い、従来の突然変異誘発と比較して新規の物理化学的性質を生成できます。おそらく新規抗生物質につながる既存のペプチドの多様性を増やすことができます。
NcAAs の組換えペプチドへの取り込み方法栄養細菌系統17の使用に基づいて選択的な圧力混入 (SPI) であります。これらの系統は、ncAA の対応する cAA アナログを合成することではありません。方法論は頻繁に観察されたリラックスした基質特異性、多くの自然のアミノアシル tRNA シンテターゼ (Aars)18の機能を使用しています。その自然の cAA 基板から離れて、これらの酵素は認識し目的の ncAA を有効にし、同種の tRNA(s) にそれを充電することができる多い。これは (すなわちcAA → ncAA 置換) 残基特異的ターゲット遺伝子産物に ncAA のリボソームの設立に します。もちろんのみ可能目的の ncAA は構造的に、化学的に標準的なアミノ酸に似ている場合、細胞生理学、翻訳機械およびターゲットのペプチドや蛋白質の配列を容認します。特定の実験のセットアップで栄養要求性ホスト セル置換するネイティブのアミノ酸の限界濃度に付属している培地で培養されます。細胞増殖や cAA 自由な媒体による交換は、cAA の細胞の枯渇に します。次の手順で、ncAA が追加され、ターゲット遺伝子の発現が誘導されます。必然的に、ncAAs 今も組み込まれますしない宿主細胞の他の多くのタンパク質ターゲット遺伝子発現のこの段階で。それにもかかわらず、エシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) ひずみと強力なプロモーターの制御下でターゲット遺伝子を運ぶプラスミッド変換されますので、低レベルで SPI セットアップの毒性がされます (一般競争力の高い T7 プロモーター/RNA ポリメラーゼ システム)19。誘導 (通常時 cAA が使い果たされる)、細胞が成長を停止するホストおよびその細胞質酵素からくり後すぐにプラスミドを用いた対象遺伝子の発現に主に使用されます。サイト指示された突然変異誘発は、ターゲット遺伝子20残基特異 ncAA インストールのサイトを定義する使用できます。
NcAAs の定款モデル ペプチドとしてラダーポリマー アンプ ナイシン A が選ばれました。34 アミノ酸長くがあり、コア ペプチド シーケンス (図 1) にのみ単一のプロリン残基を持ちます。サチライシン、ericin A と S、epidermin 同様ナイシン Z とナイシン Q のようのように活動9,21のために不可欠の保存のプロリンがようです。CAA プロリン プロリン アミド回転および二次構造の安定化に特に重要な役割を果たしています。側鎖の立体構造のリング (exo 遠藤シームパッカ リング/) アミド結合の熱力学的安定化を担当します。折りたたみの安定性、足場の剛性、多くの生物学的構造22の機能 (アントシアン、fluorinations、メチル化) など対象の化学修飾プロリルたたんのしばしば批判的に影響を与えます。したがって、それはもっともらしい Pro→ プロリン アナログ置換が小説と珍しい特性リング B、ナイシンの 2 番目のリングが授けるされますを期待します。
ここでは、プロリン栄養組換えナイシン生産大腸菌の菌株を使用しました。Prepeptide 遺伝子保安院として修飾酵素遺伝子nisBCの式が必要です。遺伝的コード化ペプチド製品は、アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーによる精製の N 末端タグ付きの彼リーダーを運ぶ。活性測定L. 乳酸菌を表現し、NisPT の分泌がエシェリヒア属大腸菌のセル lysates または精製ペプチドのサンプル (図 1) から組換えナイシンのバリエーションを有効に使用されます。成熟したアンプは、NisP によってリーダーの胸の谷間の後解放されます。この寒天平板拡散法でアンプ サンプルは固体成長する媒体に拡散し、グラム陽性菌の成長を抑制することができます。インキュベーション後、これは成長阻害ハローによって視覚的に観察することができます。L. 乳酸菌指標として、ほかの亜種ナイシン腸球菌、セレウス菌、黄色ブドウ球菌乳酸菌摂取に対する抗菌活性を示した21,23。
RiPPs の ncAAs を組み込むことの代替とは異なる実験的メソッドは停止コドン抑制 (SCS)24です。これは、直交 tRNA のアミノアシル tRNA 合成酵素 (aaRS) のペアが対応する ncAA のため必要。理想的には、すべてのこれらの 3 つのコンポーネントは、bioorthogonal、すなわち、彼らは内因性の Trna と Aars と対話しないが。NcAA 固有 aaRS は、変異シンテ25の遺伝子ライブラリのスクリーニングおよび酵素活性部位の修正によって生成できます。さらに、ncAA の導入では、コドンが再割り当てされ、cAA をエンコードしませんが必要です。一般的には、アンバー終止コドンは使用される24,26です。
最近では、SPI は、α chloroacetamide を含むとクリック-化学-互換性の ncAAs の定款の保安院27に設立されました。たとえば、 Nε- alloc リジンはルテニウム触媒を用いたオレフィンメタセシス28 によって部位特異的 (SCS) と残基特異 (SPI) 設立方法とその後変更された体外なげなわペプチド captistruin に編入されました。.SPI と比較して直交 tRNA から SCS メソッドはより複雑/aaRS ペアが共発現します。日には、プロリンの取り込みの o 組は開発29をされているが、我々 の知識の限り、プロリン アナログ定款例は報告されていません。
それは、SPI の手法を使用していないすべての ncAAs を組み込むことができます注意してください。まず、細胞質に ncAAs の取り込みは、大腸菌のようなグラム陰性菌の内膜は、細胞の膜に埋め込まれている輸送蛋白質の多数によって調整されます。通常、大腸菌は構造的に側鎖を有する細胞にアミノ酸酸類縁体の広い範囲を運ぶことができる、標準的なアミノ酸に化学的に類似。第二に、多くの化学反応性や不安定の ncAAs 彼らは有毒な代謝とホストの生理学細胞30細胞成長に向けた阻害剤として動作可能性があります。したがって、吸収および本番ホストの ncAA の毒性は事前テストする必要があります。天然のアミノ酸を組み込む修飾酵素 (例えば、nisBC) に副作用として PTM 機械の不活化を避けるためには、遺伝子の表現を厳密にコントロール セットアップを使用できます、ターゲット遺伝子 (に ncAA例えば、保安院)。これは、特別に設計された SPI プロトコル31に示すように 2 つの異なるプロモーターとターゲット遺伝子発現の誘導を使用して実現できます。上記のとおり、SPI 法は ncAA アクティベーションと同種の tRNA を充電可能にする Aar のリラックスした基質特異性に依存します。その後、tRNA はリボソームのアミド結合形成が続くし、ターゲット (ポリ) ペプチドのフォールディングに配信されます。このプロセスでは、校正と編集のメカニズムが関連する32になることがあります。これらの理由から、それはターゲットが存在する非常に重要なの ncAA cAA に化学的に構造的に似ています。その他の重要なポイントは、十分な安定性 (成長媒体の両方と細胞代謝にさらされて) および ncAA の溶解度。さらに、それは利用可能な商業的または化学的に合成されやすいはずです。
ここでは、SPI、組換え RiPPs に ncAAs の残基特異結合を許可するためのプロトコルについて述べる.特に、異なったプロリン類縁体の抗菌ペプチド ・ ナイシン A に組み込まれているホストの有機体として大腸菌を用いたします。質量分析法はアミノ酸置換を確認する使用され、ペプチド製品を成長阻害アッセイおよび微生物指標菌を使用して蛍光顕微鏡を用いた生体活性の分析します。
定義された ncAAs で成功した組換えナイシン式の基本的な要件が必要です適切なプロリン栄養要求性大腸菌。この栄養要求株、プロアならない機能不全、遺伝子のノックアウトによって例えば達成。細胞内のプロの生合成の細胞が完全に奪われた (すなわち、削除proABC) 安定した欠復帰の可能性なし。広く使われている遺伝子ノックアウト法、ファージ伝達または Datsenko ・ ワナーは33によると単一遺伝子ノックアウトです。さらに、プロアノックアウト系統は Addgene 級将校や慶應義塾コレクションなどの公開リポジトリから入手できます。組換えnisABC式は、T7 の促進者の使用に依存しているので、式のホスト株は T7 RNA ポリメラーゼの誘引可能な遺伝子を運ぶため持っています。これは、たとえば市販のキットを使用して、ホストのゲノムに λDE3 (64) の導入によって実現できます。また、上記のように栄養、BL21(DE3) などの緊張は作成できます。
Protocol
1. クローン作成表現のベクトルと栄養生産ひずみの変容
ここに、ナイシン生合成、すなわちnisABC、遺伝子L. 乳酸菌から撮影され T7 ベース プラスミド発現ベクターに転送。NisABCのフルの dna 塩基配列は、GenBank エントリ X6830734で見つけることができます。前駆体ペプチド (nisA) のための遺伝子は、アンピシリン耐性を付与ペット 3 a ベクトルに配置されています。脱水酵素 (その) および酸シクラーゼ (内閣官房) のための遺伝子は、報告された以前35、カナマイシン耐性を付与するベクトル pRSFDuet-1 に置かれています。
注:保安院リーダーのシーケンスの最後の 4 つのアミノ酸 (aspr 系) のコドンは VSLR36コア ペプチドのプロリン残基をユニークなレンダリングし、適切なプレペプチド NisP によって処理を確保するためのエンコードに変異しました。N 末端のリンカー残基が並ぶヘキサ ヒスチジンの札は浄化目的 (図 1を参照) に追加されました。
図 1.生合成と大腸菌で保安院の PTM の模式図以降活性における乳酸菌 l.インジケーター歪によるリーダー胸の谷間だけでなく。最初のステップで (9 の位置に引出線とユニークなプロリン (ピンク) を含むコア ペプチド領域で構成される)、非アクティブな線形 prenisin によって符号化される保安院が合成されて ribosomally。次に、その触媒として prenisin が dehydroalanine (Dha) と dehydrobutyrine (Dhb) セリンとスレオニン残基の脱水によって変更された posttranslationally。シクラーゼ内閣官房、チオエーテル橋経由でシステインのスルフヒ Dha や Dhb のマイケル付加を形成します。アクティブでない変更された prenisin は、大腸菌から精製され、抗菌活性のテストです。ここでは、グラム陽性菌乳酸菌 l.インジケーターひずみの細胞に運ぶだけです。リーダーは完全にアクティブなナイシンを解放する NisP (矢印によって示されます)、プロテアーゼによる切断します。それは削除された生体外で(*) トリプシン処理によっても可能です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
- 栄養要求性のプロリンを変換するプロトコル標準的な熱衝撃を与える37またはエレクトロポレーション38を使用してプラスミッド ペット 3 a保安院(VSLR) pRSFDuet 1 nisBCと大腸菌の菌株 (上記参照)。
- グルコース 1% (w/v) カナマイシン、アンピシリンを含む寒天培地プレートに変換されたセル中断の 25-100 μ L をピペットします。皿の上に均等にソリューションを広げるためプレート スプレッダやガラス製のビーズを使用します。
- 37 ° C で一晩版を孵化させなさい
- 次の午後は、アンピシリン、カナマイシン 50 mL のフラスコの中の 1% (w/v) グルコースを含む 10 mL の LB 培地に接種するのに単一コロニーを使用します。
- 文化一晩 (12-16 h) 37 ° C、200 rpm で横に振る。
- 250 μ L 滅菌 80% グリセロールと 550 μ L 文化を取る、2 mL チューブで良く混ぜます、80 ° C の凍結細胞ストックとして保存
2. 新しい最小媒体 (NMM) 準備
注: このプロトコルは、化学的に定義された液体細菌成長媒体として NMM20を使用します。また、準備の順序に厳密に従うことをお勧めします。それ以外の場合、沈殿物が発生することが。アミノ酸フォーム材料表 (例えば、塩酸塩) のそれらとは違って、溶解度を確認してください。NMM19 に交換する cAA を除いて 19 のアミノ酸が含まれています (ここでは、プロリン) ncAA アナログで。最終的な成分濃度の表 1 を参照してください。生産に使用される細菌の緊張によって、ビオチン、チアミンがオプション可能性があります。
- アミノ酸混合物の調製
- 0.5 g Phe、Trp と Tyr 100 mL ddH2O を解散まで濃塩酸を数滴加えてを溶かします。
- 残り 16 アミノ酸のそれぞれの 0.5 グラムを重量を量る。22 ml の 1 M KH2PO4 1 M K2HPO448 mL を混ぜます。〜 800 mL に ddH2O を追加します。ソリューションが明確になるまで攪拌します。
- 溶存 Phe、Trp と Tyr を追加し、ddH2o ・ 1 l の溶液の音量を調整します。
- アミノ酸混合物をボトル上部フィルター付け真空ろ過滅菌します。
- NMM19 の原液
- まず、次のコンポーネントの貯蔵液 1 M を準備: (NH4)25 M、MgSO4 K2HPO4KH2PO44在庫塩化ナトリウムです。オートクレーブに入れることによって殺菌しなさい。
- D-グルコース (1 M)、CaCl2 (1 g/L)、した FeCl2 (1 g/L)、チアミン (10 g/L)、ビオチン (10 g/L) と微量元素 ((NH4)2MoO4, MnCl2ZnCl2CuSO4; 1 mg/L の 50 mL の在庫を準備します。).シリンジ フィルター滅菌ろ過によってそれぞれ。
- NMM19 準備
- 7.5 mM (NH4)2の最終的な集中を取得するすべての貯蔵液を混ぜるなど4、1.7 mM の NaCl、22 mM KH2PO4、50 ミリメートル K2HPO4、1 mM MgSO4と 20 mM D-グルコース 50 mg/L アミノ酸ミックス、1 μ g/L CaCl2、1 μ g/L した FeCl2、10 μ g/L のチアミン、ビオチンは 10 mg/L、0.01 μ g/mL の微量元素。
3. SPI によってプロリン類縁体の定款と組換えナイシンの表現
このセクション、プレペプチドの組換え発現で (ここで:保安院) と PTM 遺伝子 (ここで: nisBC) が実行されます。まず、LB 複雑な培地が使用されるので、細胞がすべて cAAs の存在下で成長です。野生型ペプチドの生産につながる可能性がありますそれ以外の場合、背景レベルでターゲット遺伝子の発現を抑制するブドウ糖が追加されます (ここで: ナイシン) プロモーターの水漏れしたためによる。ターゲットの後にのみ cAA (ここで: プロリン) がなくなると、ncAA が追加され、化学的に定義された媒体のターゲット遺伝子発現が誘導されます。曝気 (例えば、 200 rpm で 2 L の三角フラスコ 500 mL) に適したフラスコの液体培養のインキュベーションを行わなければなりません。
- 凍結細胞株式や新鮮な植民地から新鮮な一晩かけて培養を開始滅菌ピペット チップを使用して (手順 1 を参照)。アンピシリン、カナマイシン グルコース 1% (w/v) を含む 25 mL の LB 培地を使用し、37 ° C で一晩 (12-16 h) と 200 rpm を孵化させなさい。
- 10 mL 一晩かけて培養 (1 %v/v) と新鮮な培地滅菌の 1 L を接種して、外径 φ600まで 37 ° C、200 rpm で孵化させなさい = 0.5。
- 4 ° C で 4,500 × g で 15 分間遠心します。
- 上清を注ぎ、20 mL NMM19 (2.3 の手順で準備) 含んでいる抗生物質とグルコース 1% (w/v) ペレットを再懸濁します。4 ° C で 4,500 × g で 10 分間遠心します。
- 同じ媒体の 500 mL の細胞ペレットを再懸濁します、30 ° C と 1 h 200 rpm で孵化させなさい。
注: この手順では、cAA の枯渇 (ここでは、プロリン) は行われます。 - 文化を (各 ncAA の 1 つ) の等しい部分に分割します。1 mM イソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) とそれぞれの文化を誘導し、1 mM プロリン類縁体を供給 (4S/4S、Rfluoroproline/Rヒドロキシプロリンや 4S/Rmethanoproline)。
注: 1 mM プロリン、野生型ペプチド生産の結果をコントロールとして 1 つのカルチャを指定できます。 - 一晩 (12-16 h) 28 ° c、200 rpm を孵化させなさい。
- 5,000 x g に 20 分のための 4 ° C で 50 mL のチューブで文化、上澄みを離れて注ぎ、浄化まで-80 ° C でペレットを格納細胞を遠心します。
4. 分離とナイシンの彼の付けられた類縁体の浄化
ペプチドはグアニジン塩酸塩 (GuHCl)39, 強力なホルマリン条件の変化の下で精製しました。
注意: GuHCl を飲み込んだ、吸入や皮膚、眼に対する重篤な炎症を引き起こす場合有害であります。目の保護と手袋を着用します。
- 250 mL の結合バッファー (5 M GuHCl, 300 mM の NaCl、25 mM トリス、pH 7.4)、洗浄バッファー (300 mM NaCl、25 mM トリス、25 mM のイミダゾール pH 7.4) と溶出バッファー (300 mM NaCl、25 mM トリス、250 mM のイミダゾール pH 7.4) を準備します。これらについては、250 mL 瓶の中に固形物を転送も ddH2O. ミックス 200 mL を埋めるし、7.4 1 M 水酸化ナトリウムと塩酸の pH を調整します。次に、ボトル上部フィルター ユニットを使用してすべての緩衝溶液 ddH2o. フィルター 250 mL を記入します。
- セル換散
ここでは、(200 W 最大の高周波 (HF) 出力) に超音波発生装置が使用されます。他の楽器のセル中断に必要な電源の設定によって異なることに注意してください。氷の上のすべての手順が実行されます。また、化学セル換散、液のホモジェナイザーかフレンチ プレスを使用できます。- (ステップ 3.8) から各遠心分離管に 12 mL の結合バッファーを追加し、ボルテックスによって再懸濁します。
- 細胞懸濁液に超音波発生装置プローブの先端を沈めます。40 %1 のパルス振幅の超音波発生装置をセット s 5/15 分のオフです。
メモ: は、持ち越し効果を回避するサンプル間超音波発生装置先端を清掃します。70% のエタノールと超音波発生装置のプローブを拭いてください。 - 細胞の残骸をペレットに 15,000 × g で 40 分のための 4 ° C で分離細胞懸濁液を遠心します。培養上清を新しい反応管に転送します。
- アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー
固定された金属イオン アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー (IMAC)40(ここで Ni NTA 樹脂充填) 1 mL のカートリッジと蠕動性ポンプまたは FPLC システムを使用できます。バッファーの準備、手順 4.1 を参照してください。
注: 作り出された遺伝子組換えペプチドは、N 末端タグ付きの彼の指導者、リーダー ペプチダーゼ NisP、成熟したナイシンを解放して手順 6 で取り外を運ぶので、IMAC 浄化は可能です。浄化、4 ° C で室温を実行します。IMAC のカートリッジのため、該当する場合に、流量は毎分 1 mL を使用します。- まず、ddH2O ストレージ バッファーを削除する 5 列ボリューム (cv) とカートリッジを洗ってください。
- 10 の平衡結合バッファーの履歴書。
- プロセス細胞ライセート (4.2 ステップ) が注射器、粒子を除去するフィルター、カートリッジに適用を使用してください。
- 15 で洗って特異的な非連結材料を除去するために洗浄バッファーの履歴書。
- 10 溶出溶出バッファーと 1.5 mL チューブの収集 1 mL 分画の cv。短期 (最大 3 日) のための 4 ° c または-20 ° c より長い期間の分数を格納します。
- ストレージ、ウォッシュ 10 カートリッジ ddH2O の cv は続いて 5 20% のエタノールの cv。
5 ナイシン類縁体の LC ESI TOF 質量分析
注: 参照材料表エレクトロ スプレー イオン化飛行時間質量分析 (LC ESI TOF MS) と高速液体クロマトグラフィー用計装など。
- 水 (A) と (B) 両方は 0.1% ギ酸 5 80% B 20 分以上からのグラデーションと補われるアセトニ トリルの移動相を持つ C5 列で 15-20 μ L ペプチド ソリューション (4.3 の手順で準備) の HPLC 分離を実行します。質量分析法 (MS)、5 分後の溶出を使用します。
注: によってペプチド コンテンツと HPLC カラムへの親和性、サンプル ボリュームと分離必要があります最適化。 - 測定質量スペクトルようになりました、異なるペプチド充電状態41を計算する適切なソフトウェアを使用します。CAA → ncAA 置換による変更計算の野生型大量に観測されたペプチド種質量を比較します。線形プレペプチドが posttranslationally 8 dehydrations (-8 H2O) と 5 つの環化反応によって変更されることを考慮 (図 1参照)。
注: は、ナトリウムを含むバッファーを使用して、肯定的なモードで質量分析は付加体のナトリウムを表示できます。これらは追加のピークより高い deconvoluted の固まりとして見えるようになる (それぞれのナトリウム付加体、観測 deconvoluted 質量は 22.99 Da より高い)。これらを削除する付加体、HPLC 精製42または広範な透析43を実行できます。
6. 抗菌活性テスト
- 無菌条件下で GM17 寒天プレートの準備
- (= GM17) インジケーターひずみL. 乳酸菌NZ9000 30 ° c の 1% (w/v) M17 スープ45でプラスミド pNG nisPT44を運ぶグルコースの 5 μ g/mL クロラムフェニ コール一晩文化を準備します。
- 外径600を測定、外径600新鮮培地に接種 = 0.1、外径 φ600までインキュベート = 0.4 0.6。氷にフラスコを配置します。
注: 各外径600測定文化ボリュームが消費されます。寒天プレートごと覚えておいて、1 mL の細菌培養が必要になります。必要な場合は、それに応じて液体培養のボリュームをスケール アップします。 - 1.5% 寒天用ガラス メディア ボトルに 4.5 g の寒天を重量を量る。300 mL ddH2O、ミックス、およびオートクレーブを追加します。
- 300 mL ddH2O およびオートクレーブで、(濃縮 2 倍)、2 の x M17 スープを準備します。
- 25 mL を 10 μ G/ml クロラムフェニ コールと 1 ml ・ l ・乳酸菌の清酒 (4 %v/v) 2% のグルコースを含む 2 x M17 スープをミックスします。
- 25 mL 溶融 1.5% 寒天 (たてオートクレーブまたは電子レンジで加熱) を追加します。
注: これに先立ち、冷ます、ボトル タッチ (約 50 ° C)。L. 乳酸菌は中有機物高温に敏感なので、これは必要です。 - 大型ペトリ皿に溶液を注ぐ。10-15 分のためのドライ プレート。
- 炎でガラス パスツール ピペットの先端を滅菌します。クールダウンするまで待機し、ワイド端を使用して凝固 GM17 寒天で穴を作成します。
- サンプル準備
- 7,000 x g 吸引残りの中にラベル付きの 1.5 mL のチューブで 3 分間遠心 (3.7 のステップで作成した)エシェリヒア属大腸菌式文化の 1 mL をとり、500 μ L で細胞ペレットを再懸濁します Na P (50 mM リン酸ナトリウム緩衝、リン酸二水素ナトリウム 0.5 M と 0.5 M リン酸水素二ナトリウムから作られた pH 7.4)。
- 氷 (比較手順 4.2.2) のサンプルを超音波照射します。細胞懸濁液に超音波発生装置プローブの先端を沈めます。30 %1 のパルス振幅の超音波発生装置をセット s 3 分をオフに、5 s。
- 細胞細胞の残骸をペレットに 13,000 x g で 10 分間のライセートを遠心します。氷の上新しい反応チューブに上清を転送します。
- 希釈し、1 mL 外径600セル抽出上清を正規化 = 0.6 Na P で収穫されたセルを基準にして
- 活動性試験
- インジケーター寒天プレート (図 3) の穴にそれぞれの正規化されたサンプルの 40 μ L を追加します。抗菌制御化合物として 400 μ g/mL にクロラムフェニ コールを使用します。ネガティブ コントロールとして溶出バッファーを使用します。すべてのサンプルは、寒天に拡散されますまで待機します。30 ° C で一晩プレートを孵化させなさい
- フラット ベッド スキャナーまたはデジタル カメラを使用して寒天プレートの写真を撮る。成長阻害のハローのサイズは手で測定や ImageJ46をすることができます。
7. 蛍光顕微鏡
アンプの細菌細胞に及ぼす影響を観察するためには、光と蛍光顕微鏡を使用できます。アクションのナイシン モードが不安定化との細菌膜6孔隙形成に依存することに注意してください。ここでは、ナイルの赤が散乱し、時に集計のセル換散になる細菌の細胞膜を染色する使用されます。
注: 参照材料表などの計測。ペプチド濃度と活性に応じて追加のアンプ液量を調整できます。
- セル準備
- 10 mM ジメチルスルホキシド (DMSO) でナイルの赤い原液を準備します。
- 外径600 l. 乳酸菌インジケーター株を成長ステップ 6.1.1-6.1.2 のように 1.0 を =。
- 4 ° C および 5,000 × g で 3 分の 1 mL 文化を遠心します。
- 上澄みを廃棄、1 mL リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)47で再懸濁します。
- 遠心し、再び再懸濁します。
- 穏やかに混合、1 μ L ナイルレッド原液を追加します。
- 顕微鏡画像の取得
- 520 にエキサイティングしながらカバー スライドのセル準備の 30 μ L を追加 nm。
- 集録時間 0.2 s、キネティック シリーズを設定 0.1 Hz、シリーズ長さ 200 画像。
- 0.3 - を追加 1.5 μ 細胞ライセートや IMAC サンプル (からステップ 6.2.4 または 4.3.5、それぞれ)。IMAC のサンプル、溶出バッファーは、ネガティブ コントロールとして使用できます。
- Λ ≥ 560 で監視および記録の蛍光発光 nm。
- データ分析
- 顕微鏡の映像は、動画ファイル (.avi) として格納されます。1 つの画像は、ImageJ46と分析されます。
Representative Results
このプロトコルは、SPI 法によるプロリン類縁体の残基特異設立に ncAA 変更ナイシンの亜種の生産を有効にすることができます。以前は、24 mg/L の利回りの実現可能性とは、完全に修正された野生型ナイシン39組換え生産の報告されました。SPI メソッドを使用して、ターゲットのペプチド ・ タンパク質の収量はよく良いと野生型生産48に近い量を達することができます。最初の実験として組換え野生型リップ生産は選択した栄養要求性ホストでテスト必要があります。ここ、プロリン栄養要求性大腸菌MG1655 Δ確率:: frt ΔproC:: frt (DE3) が宿主として使用されました。誘導、栽培 ncAAs 定款最大ペプチド収量に向かってタイミングとして培地の組成と温度を最適化できます。
抗菌活性アッセイ
野生型遺伝子組換えナイシン生産および浄化を上記のプロトコルに従う行った。この場合、プロリンはステップ 3.6 で ncAA 誘導体の代わりに使用されました。抗菌活性は、リップの生産を確認し前に、と浄化後の抗菌活性を比較する使用されました。作業の試金のため溶出画分と IMAC フロースルーされ直接使用、グラム陽性菌乳酸菌 l.インジケーター株 (図 2) に対するテストします。この歪みは、NisP を表現、亜種内にエシェリヒア属大腸菌のセル lysates またはペプチド試料をそれぞれ精製ナイシン リーダーのペプチッドの蛋白質分解開裂によってアクティブになります。明らかに、流れを成長阻害活性を示した。これは、IMAC のコラム連結しなくて生理活性物質によって説明できます。すべてのテストの溶出画分は、IMAC で彼の付けられたペプチドの濃度を示す unpurified の例と比べると増加活性を示した.(マイナス コントロール) として溶出バッファーでしたこのアッセイのL. 乳酸菌の成長に影響しないことに注意してください。
図 2.抗菌テストの IMAC 浄化 recombinantly 野生型ナイシンを作り出した後。 L. 乳酸菌インジケーターひずみに溶出画分 5 に 15 と IMAC 浄化の流れ (外径600正規化の希釈) unpurified 細胞ライセートとの比較テストを行いました。成長阻害ハローのサイズは、抗菌活性を示します。クロラムフェニ コール 400 μ G/ml の濃度では、陰性対照として肯定的な制御と IMAC 溶出バッファーとして使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Recombinantly の抗菌活性を証明するために六つの異なったプロリン類縁体を含むバリアント活性アッセイを行ったL. 乳酸菌インジケーターひずみの抑制をテスト ナイシンを生産しました。6 サンプルではプロリンの類似を使用して生産の 5 つの成長抑制を図 3に示します。(ハローのサイズから判断する)、最良の結果が - fluoroproline、(4R) - アナログ (4R) の導入実験の観察されたヒドロキシプロリンと (4S)-methanoproline。野生型ナイシンを成長阻害ハローのサイズを比較する生産し、すべての 3 つのナイシン バリエーションを示した同様阻害強度並列でテストします。ただし、ハローのサイズだけをすることはできませんアンプの濃度を特定できませんでしたのでロバに特定のアクティビティを使用します。したがって、法は質的結果ナイシン亜種の抗菌活性の保持または失われたかどうかのテストだけに利用します。特定のアクティビティを調べるには、ナイシンの亜種の濃度の定量化 (ディスカッションを参照) 必要があります。
図 3.ナイシンの亜種を含むセル lysates の抗菌活性アッセイ生産を介してSPI プロリン アナログ。遺伝子組換えの野生型サンプルとナイシン バリアントを比較。全てのサンプルが OD600-収穫された細胞培養密度基準セル換散後正常化しました。ハローは、インジケーターひずみ成長抑制の形で生物活性を示します。最初の右へ左から行: (4R)-fluoroproline (4R) - ヒドロキシプロリン、(4R) - methanoproline とクロラムフェニ コール (400 μ G/ml; 抗菌肯定的な制御)。2 列目: (4S)-fluoroproline (4S) - ヒドロキシプロリン、(4S) - methanoproline、プロリン (野生型コントロール)。注化学専門語;例えば、(4R) - fluoroproline、別名トランス-4 - fluoroproline。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
LC ESI TOF 質量分析法
IMAC 浄化後 ncAAs のナイシンへの取り込みは、LC ESI TOF 質量分析法によって分析されました。図 4は、ナイシン バリアント (4R) の deconvoluted の質量スペクトルを示しています-fluoroproline。このバリアントは、前述を精製し、その後 LC ESI-飛行時間型質量分析法による分析それはまだリーダーを行うための IMAC だった。図 4Aに主峰 (4R) を含む変更されたナイシンに対応-6883.18 da deconvoluted 質量 fluoroproline (計算される質量 6882.05 Da、計算でプロリンと対応する野生型ペプチドの質量位置 9、6864.06 Da)。低い豊かさと高い質量と 2 つのピークに対応するナトリウム付加体の示される。図 4Bは、デコンボリューション アルゴリズムによって見つけられるように化合物メインの異なる荷電種を示しています。たとえば、1148.11 m/z でピークが 6 倍の荷電粒子に対応 ([M + 6 H]6 +)。
図 4.(4R) を含む組換えナイシンの IMAC 精製変形の LC ESI TOF 質量分析法-fluoroproline。(A)ナイシン変形 (4R) (まだリーダーを運ぶ) の質量分析のクロマト グラムの (左下の縮小) を Deconvoluted-fluoroproline (大衆 (Da) を予想: 【 M + H 】+ = 6882.05 [M+na]+ = 6904.03、[M + 2Na]2 += 6926.02)。(B)複合種 [M + H]+のスペクトルです。大衆 (Da) を予想: 【 M + 5 H 】5 + = 1377.41、[M + 6 H]6 + = 1148.01、【 M + 7 H 】7 + = 984.15、[M + 8 H]8 + = 861.26、【 M + 9 H 】9 + = 765.67、【 M + 10 H 】10 + = 689.21、[M + 11 H]11 + = 626.64、【 M + 12 H 】12 + 574.50 を =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
蛍光顕微鏡
組換えナイシンと ncAA を含むバリアントの抗菌活性は、蛍光顕微鏡を介して L. 乳酸菌インジケーター歪みの直接観察によっても表示できます。ナイルの赤、高疎水性蛍光色素は、細菌の細胞膜を染色する使用されました。図 5は、単一細胞の形態、細胞培養の凝集状態の質的な変化を示しています。細胞は、ナイルの赤に染まった, 顕微鏡カバー スライド上に堆積.上段は、初めに直接セルを示して ときバッファー、組換えの野生型ナイシン、ナイシンを含む (4R)-fluoroproline、または (4R)-ヒドロキシプロリンが追加されました。下のパネルは、インキュベーションの 20 分後に対応するイメージを示しています。
図 5.組換えナイシンに及ぼすグラム陽性細胞の蛍光顕微鏡像。30 μ L L. 乳酸菌インジケーターひずみの顕微鏡画像 (外径600 = 1) ナイル川 (上部パネル) の前に撮影された赤でマークされた後 (下段) 1 μ L バッファー (A)、0.3 μ L 組換え野生型ナイシン (B) 20 min 培養と(4R) を含む 0.6 μ L ナイシン亜種-fluoroproline (C) と (4R)-ヒドロキシプロリン (D)。青い円は、蛍光膜片の拡散を観察できる領域に集計または変形した細胞、青い矢印ポイントを持つ領域をマークします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5Aは観測の 20 分以内のセルの一般的な外観を変更しないように示しています。時間ローズの中に堆積したセルの数だけと細胞の量を大きく、観測地域の 80 μ x 80 μ m 内で表示されます。図 5Bことを示しグラム陽性の細胞出現集計ぼやけて (青い円で示されて) 野生型ナイシンに露出の 20 分後、たとえ低量 (ここで 0.3 μ L の IMAC 溶出) を追加しました。また、軽い素材は、ナイルが付いて赤い膜の断片が (青い矢印で示されます) 期間中に動員されたことを示す、バッファーに細胞から拡散。これらの調査結果は、ナイシン6,49で治療時に発生することが示された、セル換散を示します。同様の効果は、- fluoroproline (図 5C) とナイシン (4R) を含む-(4R) のナイシン バリアント含有培養後観察されたヒドロキシプロリン (図 5D) 両方を示す大規模な歪んだと集計セル コントロールのサンプル (図 5A) と好対照で、20 分後の金額。
| コンポーネント | 濃度 |
| (NH4)2だから4 | 7.5 mM |
| 塩化ナトリウム | 8.5 mM |
| KH2PO4 | 22 mM |
| K2HPO4 | 50 mM |
| MgSO4 | 1 mM |
| D-グルコース | 20 mM |
| すべての標準的なアミノ酸 (交換を除く) |
50 mg/L |
| Ca2 + | 1 μ G/ml |
| Fe2 + | 1 μ G/ml |
| 微量元素 (Cu2 +Zn2 +Mn2 +MoOH2 +) |
0.01 μ g/mL |
| チアミン | 10 μ G/ml |
| ビオチン | 10 μ G/ml |
表 1。手順 2 に従って準備の後 NMM19 化学的に定義された細菌の増殖培地の組成物。
Discussion
プロリン類縁体の挿入の SPI を使用して、ターゲットを絞ったナイシン構造を大幅に変更一意のシーケンスの組み合わせや化学的性質を持つ新規ペプチドのバリアントを作成します。この方法で、20 cAAs の側鎖の化学的性質に制限する、古典的な遺伝子工学の基本制限を回避できます。生体内で化学の多様化ナイシン上記例示としては、自然の Ptm を補完するために、RiPPs の化学空間を劇的に向上させる一般的な方法を示します。アンプの特に偉大な約束を保持自然アミノ酸のレパートリーを拡大すると考えています。タンパク質の立体構造の 20 cAAs の定義された配置で機能の途方もない範囲が実現できます。長さ3にのみ 7 100 aa、cAAs を介してのみこのような構造の機能を実現する方法はアンプの限られたでしょう。それはこうして一般的 RiPPs の形で自然なアンプに広くファーストクリーニング修正4驚くべきことではないです。同じ方法では、代替のビルディング ブロックとして ncAAs は (バウマンら201735および参照をそこに見る)、薬力学及び薬物動態学的パラメーターを改善するために偉大な約束を保持します。
比較的簡単な実験のセットアップ、単純明快な実行と再現性の高いこの仕事の利点で使用される SPI 方法。グローバル置換対象ペプチドにマルチサイトの ncAA の設立も可能です。その一方で、メソッドは、ターゲット遺伝子産物の頻発のアミノ酸置換の適切でないかもしれません。原則として、サイト指示された突然変異誘発、望ましくない位置を変更できますが、これら追加の変更も構造と生物活性を含むいくつかのアンプ プロパティに影響を与える可能性があります。生産の栄養要求性の歪みがあり、一度は、遺伝子レベルの大幅な変更を必要とせずいくつかの ncAAs をテストできます。また、メソッドは栄養要求性大腸菌に限定しない系統しますが、自然な生産のホストを使用して実行できます。たとえば、周らは新規 RiPPs の生産のための SPI もで動作することを示した、当然 Trp auxotroph L. 乳酸菌: メディアを定義を使用して、3 つトリプトファン類縁体は、ナイシン50で 4 つのポジションで組み込まれました。
SPI 法選択のグローバル交換につながるので ncAA によって cAA、それはターゲットのペプチッドおよび蛋白質の広い範囲に一般に適用できます。範囲栄養要求性大腸菌の系統が利用できます (手順 1 を参照)、各 ncAAs で交換をテストするいくつかの cAAs を許可します。メタを使って組み込む類縁体に会った-欠損株 (例えば、 B834(DE3)) 採用が最も一般的。Isostructural Met 類縁体の例では、azidohomoalanine (Aha) と homopropargylglycine (Hpg)、市販の ncAAs 効率的に組み込むことができます。両方は、添付ファイルの互換性のあるアルキンまたはアジ化機能をそれぞれ運ぶ分子の bioorthogonal ハンドルをご紹介します。蛍光染料、またはポリエチレング リコール (PEG) 部分を銅 (I) により取り付けることがたとえば、-51アジ化物アルキンの環化付加反応 (CuAAC) を触媒。
両方遺伝子組換え ncAA 設立方法 (SPI と SCS) 通常十分な目標量を達成するため、対応するペプチッドおよび蛋白質の野生型生産基準利回りは頻繁に減る。純度は、多くの場合生産効率との相関、追加精製ステップ低豊富な種の特に必要かもしれません。組換えナイシン生産のこの特定のケースでセル lysates から選択的濃縮によってリーダーの彼の付けられたシーケンスはリップ浄化を大幅簡素化されます。このプロトコルに示すように精製純度とナイシン、濃度を向上しますが、しばしばアンプ純度収量および特定のアクティビティを決定するのに十分なを生成しません。高速液体クロマトグラフィー、クロマトグラフィー イオン交換 (IEC)、沈殿物、IMAC 以外にも一般的に使用されるアンプの浄化方法が含まれます (などアセトンまたはトリクロロ酢酸 (TCA) を使用して) または混合物 - 多段階浄化方式52 の結果。.注意すべきこと、ポリカチオン自然が IEC の浄化を促進する一般的。凍結乾燥はよく精製されたアンプを格納する使用されます。
理想的には、アンプに組み込むのための ncAAs は手頃な価格で市販する必要があります。 または、簡単にシンプルで再現性のある化学合成プロトコルによって生成されます。SPI 法の均等に重要な前提条件は、ncAA が認識、活性化および内因性や共発現 Aar によって同種の tRNA に充電します。これはテスト体外アミノ酸活性化または tRNA アミノアシル化アッセイ53でできます。簡単な代わりに、緑色蛍光タンパク質 (GFP) などのタンパク質モデルの SPI テスト式の存在の両方を行い ncAA 補充の不在で実行できます。さらに、成長中と細胞透過性と化学的安定性の溶解度は、重要な要因を構成します。
この例では抗菌作用はグラム陽性インジケーターひずみを使用して上映されました。リーダー ペプチダーゼ NisP を表して、ナイシン成熟の最終段階を触媒です。リーダー配列の除去 (彼のタグ付き浄化用) することも行われた体外精製 NisP50またはトリプシン54処理による。この仕事の範囲を超えて病原体と多剤耐性菌テストできます静菌や殺菌を阻害する同様の方法論を使用してアンプで。MRSA、MDR結核菌、VRE、アシネトバクター、肺炎球菌、緑膿菌、肺炎桿菌、臨床的に関連性の高いターゲット種が含まれます。寒天平板拡散ほかアッセイ表示ここでは、成長抑制は細菌種を接種した、アンプと補われた適切な液体のメディアを使用しても実行できます。スープの希釈方法を使用して、最小発育阻止濃度 (MIC) は純粋なペプチド55を使用して決定します。ここで紹介する作業の試金を生物活性と参照化合物、たとえば市販ナイシンを基準にしてアンプを含むソリューションの潜在的能力を推定する使用もできます。
RiPPs 組換え生産は多くの場合実現可能な39、よく PTM 遺伝子の共発現を含むです。生産ひずみが適した ncAA を含む化学的に定義されたまたは合成最小媒体に転送される、すぐに対応する cAA の特定の残基置換が行われます。したがって、組換え生産が可能で、ncAA の定款と PTM が対象製品の十分な量を得られる条件を見つけることができます、他の RiPPs を同じ手法で製作可能します。ホスト細胞プロテオームほかペプチド PTM 機械もなれると ncAA 変更 SPI の中に注意してください。その結果、ターゲット式誘導のタイミングと次の潜伏期間の長さは、最適化を要求できます。NcAA 混入 PTM 酵素に安定性と活動に影響する、ため加工リップの生産原則に影響を受けます。十分な PTM 酵素効果は、MS と生体活性アッセイによって検出された加工プレペプチドの形成によって示されます。PTM を生成するために、上記で紹介した異なる誘導性プロモーターを用いることができる ncAA の存在で続いて前駆体ペプチド遺伝子の誘導の最初 (ncAA の不在) の遺伝子。一般的には、前駆体遺伝子の厳しい弾圧が必要な理由である ncAA の加算の前に cAA を含むターゲット ペプチドの生産を抑制すること。このプロトコルでは、これは成長媒体にグルコースの添加による異化作用の抑圧によって実現されます。組換え生産はまだされていない場合、対応する遺伝子の発現温度とコドン使用が最適化を要求できます prepeptide 処理に必要な PTM 酵素が遺伝的に遠いホストと通常属しますので特に設立。NisBC や NisP は、原則として、プレペプチドの ncAAs の存在に認識とナイシンの場合、PTM の酵素の処理と干渉できます。アンプに ncAA 定款、適切な式の条件および AMP 活性測定法の信頼性を識別するために最初の小規模式実験を行うことはこうして勧めします。
Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
J.H.N.、結核と M.B. は、EU FW7 プログラム (SYNPEPTIDE) によって資金を認めます。F. j. s. およびタスクフォースオニオン連邦教育省 (BMBF プログラム「HSP 2020」、TU WIMIplus プロジェクト SynTUBio) 科学とドイツ研究振興協会 (クラスターのエクセレンス「Unifying 触媒概念」) で資金調達を認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium chloride | Carl Roth, Germany | P029 | |
| guanidine hydrochloride | Carl Roth, Germany | 0035.2 | |
| dipotassium hydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | P749.3 | |
| potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | 3904.3 | |
| sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Carl Roth, Germany | K300.2 | |
| disodium hydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | P030.2 | |
| L-alanine | Carl Roth, Germany | 3076.2 | |
| L-arginine | Carl Roth, Germany | 3144.3 | |
| L-asparagine monohydrate | Carl Roth, Germany | HN23.1 | |
| L-aspartic acid | Carl Roth, Germany | T202.1 | |
| L-cysteine | Carl Roth, Germany | 3467.3 | |
| L-glutamine | Carl Roth, Germany | 3772.1 | |
| L-glutamic acid | Carl Roth, Germany | 3774.1 | |
| L-glycine | Carl Roth, Germany | 3187.3 | |
| L-histidine | Carl Roth, Germany | 3852.3 | |
| L-isoleucine | Carl Roth, Germany | 3922.3 | |
| L-leucine | Carl Roth, Germany | 3984.3 | |
| L-lysine monohydrate | Carl Roth, Germany | 4207.2 | |
| L-methionine | Carl Roth, Germany | 9359.4 | |
| L-phenylalanine | Carl Roth, Germany | 4491.2 | |
| L-proline | Carl Roth, Germany | T205.3 | |
| L-serine | Carl Roth, Germany | 4682.4 | |
| L-threonine | Carl Roth, Germany | T206.2 | |
| L-tryptophan | Carl Roth, Germany | 4858.2 | |
| L-tyrosine | Carl Roth, Germany | T207.2 | |
| L-valine | Carl Roth, Germany | 4879.4 | |
| ammonium sulfate | Carl Roth, Germany | 3746.3 | |
| magnesium sulfate | Carl Roth, Germany | 0261.2 | |
| D-glucose | Carl Roth, Germany | 6780 | prepare a 20% (w/v) solution for addition into molten agar |
| calcium chloride | Carl Roth, Germany | PN93.2 | |
| iron(II) chloride | Sigma-Aldrich, Germany | 372870 | |
| thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Germany | T1270 | |
| biotin | Carl Roth, Germany | 3822.2 | |
| copper(II) sulfate | Merck, Germany | 102792 | |
| manganese(II) chloride | Carl Roth, Germany | KK36.2 | |
| zinc chloride | Merck, Germany | 108816 | |
| immonium orthomolybdate | Sigma-Aldrich, Germany | 277908 | |
| glycerol | Carl Roth, Germany | 7533.3 | |
| isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich, Germany | I6758 | |
| ampicillin sodium salt | Carl Roth, Germany | K029.5 | working concentration 100 µg/mL for E. coli, prepare 100 mg/mL stock in ddH2O |
| kanamycin sulfate | Carl Roth, Germany | T832.2 | working concentration 50 µg/mL for E. coli, prepare 50 mg/mL stock in ddH2O |
| chloramphenicol | Carl Roth, Germany | 3886.1 | working concentration 5 µg/mL for L. lactis, prepare 37 mg/mL stock in ethanol |
| (4S)-fluoroproline | Bachem, Switzerland | F-3970 | |
| (4R)-fluoroproline | Bachem, Switzerland | F-3975 | |
| (4S)-hydroxyproline | Bachem, Switzerland | F-1395 | |
| (4R)-hydroxyproline | Bachem, Switzerland | F-2980 | |
| (4S)-methanoproline | chemically synthesized | ||
| (4R)-methanoproline | chemically synthesized | ||
| hydrochloric acid (HCl) | Carl Roth, Germany | P074.4 | |
| ethanol | VWR, Germany | 20825.324 | |
| M17-broth | Sigmal-Aldrich, Germany | 56156 | commercial product, see Terzaghi BE & Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13 for contents and preparation |
| agar-agar | Carl Roth, Germany | 5210.5 | |
| Nisin from Lactococcus lactis | Sigma-Aldrich, Germany | N5764 | commercial product, can be used as reference for bioactivity |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Carl Roth, Germany | A994.1 | |
| imidazole | Carl Roth, Germany | 3899.3 | |
| 1.5 mL autosampler vial for LC-MS | Sigma-Aldrich, Germany | Supelco 854165 | |
| acetonitrile | VWR, Germany | HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 | LC-MS grade required |
| formic acid | VWR, Germany | HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 | LC-MS grade required |
| 1 mL Ni-NTA IMAC column, e.g. HisTrap FF Crude | GE Healthcare, UK | 29-0486-31 | different manufacturers and resins available for IMAC |
| 0.45 µm bottle top filter unit | VWR, Germany | 10040-470 | sterile filtration of solutions using a vacuum pump |
| 0.45 µm syringe filter PVDF membrane | Carl Roth, Germany | CCY1.1 | sterile filtration of solutions using a syringe and to remove particles from cell lysates |
| luer-lock syringe, PP, 50 ml | Carl Roth, Germany | T552.2 | sterile filtration of solutions |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf, Germany | 30120086 | |
| petri dishes (polystyrene, sterile) | Carl Roth, Germany | TA19 | |
| Nile red | Sigma-Aldrich, Germany | 72485 | |
| E. coli ΔproA strain | CGSC, Keio collection | JW0233-2 | proline-auxotrophic E. coli K-12 strain |
| E. coli B834(DE3) | Novagen (Merck), Germany | 69041 | methionine-auxotrophic E. coli B strain |
| λDE3 Lysogenization Kit | Novagen (Merck), Germany | 69734-3 | |
| Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT | bacterial indicator strain, see Khusainov R & Kuipers OP, PLoS One, 8 (9), e74890 | ||
| benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf, Germany | 5427 R | |
| peristaltic pump | GE Healthcare, UK | P1 | |
| FPLC system | GE Healthcare, UK | Äkta Purifier 10 or the like | |
| inverted microscope | Nikon | TI Eclipse wide-field fluorescence microscope with 100x (N.A. 1.4) objective and Mercury Lamp | example setup for fluorescence microscopy |
| electron multiplying CCD (EMCCD) camera | Andor Technologies, UK | Andor Luca | example setup for fluorescence microscopy |
| fluorescence excitation filter | Thorlabs, USA | Dichroic cube (TLV-U-MF2-TRITC) | example setup for fluorescence microscopy |
| fluorescence emission filter | AHF Analysentechnik, Germany | T 560 LPXR | example setup for fluorescence microscopy |
| cover slip 24 x 60 mm | Carl Roth, Germany | LH26.1 | example setup for fluorescence microscopy |
| Immersion Oil | Carl Zeiss, Germany | Immersol 518 F | example setup for fluorescence microscopy |
| probe sonicator | Bandelin, Germany | Sonopuls HD3200 with sonotrode MS-72 | 200 W maximum HF output |
| C5 HPLC column (2.1x100 mm, 3 µm particle size) | Sigma-Aldrich, Germany | 567227-U | example setup for mass spectrometry |
| ESI-TOF coupled to HPLC system | Agilent, USA | Agilent 6530 Accurate Mass QTOF with 1260 HPLC | example setup for mass spectrometry |
References
- Ferri, M., Ranucci, E., Romagnoli, P., Giaccone, V. Antimicrobial resistance: A global emerging threat to public health systems. Crit Rev Food Sci Nutr. 57 (13), 2857-2876 (2017).
- Bahar, A. A., Ren, D. Antimicrobial peptides. Pharmaceuticals. 6 (12), 1543-1575 (2013).
- Ageitos, J. M., Sánchez-Pérez, A., Calo-Mata, P., Villa, T. G. Antimicrobial peptides (AMPs): Ancient compounds that represent novel weapons in the fight against bacteria. Biochem Pharmacol. 133, 117-138 (2017).
- Arnison, P. G., et al. Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide natural products: overview and recommendations for a universal nomenclature. Nat Prod Rep. 30 (1), 108-160 (2013).
- Lubelski, J., Rink, R., Khusainov, R., Moll, G. N., Kuipers, O. P. Biosynthesis, immunity, regulation, mode of action and engineering of the model lantibiotic nisin. Cell Mol Life Sci. 65 (3), 455-476 (2008).
- Shin, J. M., Gwak, J. W., Kamarajan, P., Fenno, J. C., Rickard, A. H., Kapila, Y. L. Biomedical applications of nisin. J Appl Microbiol. 120 (6), 1449-1465 (2016).
- Scherer, K. M., Spille, J. -H., Sahl, H. -G., Grein, F., Kubitscheck, U. The lantibiotic nisin induces lipid II aggregation, causing membrane instability and vesicle budding. Biophys J. 108 (5), 1114-1124 (2015).
- Jung, G. Lantibiotica - ribosomal synthetisierte Polypeptidwirkstoffe mit Sulfidbrücken und α,β-Didehydroaminosäuren. Angew Chemie. 103 (9), 1067-1084 (1991).
- Rink, R., et al. Lantibiotic structures as guidelines for the design of peptides that can be modified by lantibiotic enzymes. Biochemistry. 44 (24), 8873-8882 (2005).
- Lagedroste, M., Smits, S. H. J., Schmitt, L. Substrate Specificity of the Secreted Nisin Leader Peptidase NisP. Biochemistry. 56 (30), 4005-4014 (2017).
- Ross, A. C., Liu, H., Pattabiraman, V. R., Vederas, J. C. Synthesis of the lantibiotic lactocin S using peptide cyclizations on solid phase. J Am Chem Soc. 132 (2), 462-463 (2010).
- Fukase, K., et al. Synthetic Study on Peptide Antibiotic Nisin. V. Total Synthesis of Nisin. Bull Chem Soc Jpn. 65 (8), 2227-2240 (1992).
- Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology. Chem Sci. 6 (1), 50-69 (2015).
- Kuthning, A., Durkin, P., Oehm, S., Hoesl, M. G., Budisa, N., Süssmuth, R. D. Towards Biocontained Cell Factories: An Evolutionarily Adapted Escherichia coli Strain Produces a New-to-nature Bioactive Lantibiotic Containing Thienopyrrole-Alanine. Sci Rep. 6, 33447 (2016).
- Piscotta, F. J., Tharp, J. M., Liu, W. R., Link, A. J. Expanding the chemical diversity of lasso peptide MccJ25 with genetically encoded noncanonical amino acids. Chem Commun (Camb). 51 (2), 409-412 (2015).
- Hartman, M. C. T., Josephson, K., Lin, C. -W., Szostak, J. W. An expanded set of amino acid analogs for the ribosomal translation of unnatural peptides. PLoS One. 2 (10), 972 (2007).
- Johnson, J. A., Lu, Y. Y., Van Deventer, J. A., Tirrell, D. A. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids into proteins: recent developments and applications. Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 774-780 (2010).
- Ibba, M., Söll, D. Aminoacyl-tRNAs: setting the limits of the genetic code. Genes Dev. 18 (7), 731-738 (2004).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
- Budisa, N., Steipe, B., Demange, P., Eckerskorn, C., Kellermann, J., Huber, R. High-level biosynthetic substitution of methionine in proteins by its analogs 2-aminohexanoic acid, selenomethionine, telluromethionine and ethionine in Escherichia coli. Eur J Biochem. 230 (2), 788-796 (1995).
- Rink, R., et al. Dissection and modulation of the four distinct activities of nisin by mutagenesis of rings A and B and by C-terminal truncation. Appl Environ Microbiol. 73 (18), 5809-5816 (2007).
- Kubyshkin, V., Durkin, P., Budisa, N. Energetic contribution to both acidity and conformational stability in peptide models. New J Chem. 40 (6), 5209-5220 (2016).
- Molloy, E. M., Field, D., O'Connor, P. M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Saturation mutagenesis of lysine 12 leads to the identification of derivatives of nisin A with enhanced antimicrobial activity. PLoS One. 8 (3), 58530 (2013).
- Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
- Anderson, J. C., Wu, N., Santoro, S. W., Lakshman, V., King, D. S., Schultz, P. G. An expanded genetic code with a functional quadruplet codon. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (20), 7566-7571 (2004).
- Zambaldo, C., Luo, X., Mehta, A. P., Schultz, P. G. Recombinant macrocyclic lanthipeptides incorporating non-canonical amino acids. J Am Chem Soc. 139 (34), 11646-11649 (2017).
- Al Toma, R. S., et al. Site-directed and global incorporation of orthogonal and isostructural noncanonical amino acids into the ribosomal lasso peptide capistruin. Chembiochem. 16 (3), 503-509 (2015).
- Chatterjee, A., Xiao, H., Schultz, P. G. Evolution of multiple, mutually orthogonal prolyl-tRNA synthetase/tRNA pairs for unnatural amino acid mutagenesis in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (37), 14841-14846 (2012).
- Budisa, N., Pal, P. P. Designing novel spectral classes of proteins with a tryptophan-expanded genetic code. Biol Chem. 385 (10), 893-904 (2004).
- Voller, J. -s, Thi To, T. M., Biava, H., Koksch, B., Budisa, N. Global substitution of hemeproteins with noncanonical amino acids in Escherichia coli with intact cofactor maturation machinery. Enzyme Microb Technol. 106, 55-59 (2017).
- Moghal, A., Hwang, L., Faull, K., Ibba, M. Multiple Quality Control Pathways Limit Non-protein Amino Acid Use by Yeast Cytoplasmic Phenylalanyl-tRNA Synthetase. J Biol Chem. 291 (30), 15796-15805 (2016).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Engelke, G., Gutowski-Eckel, Z., Hammelmann, M., Entian, K. D. Biosynthesis of the lantibiotic nisin: genomic organization and membrane localization of the NisB protein. Appl Environ Microbiol. 58 (11), 3730-3743 (1992).
- Baumann, T., Nickling, J. H., Bartholomae, M., Buivydas, A., Kuipers, O. P., Budisa, N. Prospects of In vivo Incorporation of Non-canonical Amino Acids for the Chemical Diversification of Antimicrobial Peptides. Front Microbiol. 8, 124 (2017).
- Plat, A., Kluskens, L. D., Kuipers, A., Rink, R., Moll, G. N. Requirements of the engineered leader peptide of nisin for inducing modification, export, and cleavage. Appl Environ Microbiol. 77 (2), 604-611 (2011).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. J Vis Exp. , (2017).
- Shi, Y., Yang, X., Garg, N., van der Donk, W. A. Production of lantipeptides in Escherichia coli. J Am Chem Soc. 133 (8), 2338-2341 (2011).
- Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. Nat Biotechnol. 6 (11), 1321-1325 (1988).
- Zhang, Z., Marshall, A. G. A universal algorithm for fast and automated charge state deconvolution of electrospray mass-to-charge ratio spectra. J Am Soc Mass Spectrom. 9 (3), 225-233 (1998).
- JoVE Science Education Database. High-Performance Liquid Chromatography (HPLC). J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Dialysis: Diffusion Based Separation. J Vis Exp. , (2017).
- Khusainov, R., Kuipers, O. P. The presence of modifiable residues in the core peptide part of precursor nisin is not crucial for precursor nisin interactions with NisB- and NisC. PLoS One. 8 (9), 74890 (2013).
- Terzaghi, B. E., Sandine, W. E. Improved medium for lactic streptococci and their bacteriophages. Appl Microbiol. 29 (6), 807-813 (1975).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82 (7-8), 518-529 (2015).
- Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
- van Hest, J. C. M., Tirrell, D. A. Efficient introduction of alkene functionality into proteins in vivo. Febs Lett. 428 (1-2), 68-70 (1998).
- Prince, A., et al. Lipid-II Independent Antimicrobial Mechanism of Nisin Depends On Its Crowding And Degree Of Oligomerization. Sci Rep. 6 (1), 37908 (2016).
- Zhou, L., et al. Incorporation of tryptophan analogues into the lantibiotic nisin. Amino Acids. 48 (5), 1309-1318 (2016).
- Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Curr Protoc Chem Biol. 3 (4), 153-162 (2011).
- Abts, A., et al. Easy and rapid purification of highly active nisin. Int J Pept. 2011, 175145 (2011).
- Francklyn, C. S., First, E. A., Perona, J. J., Hou, Y. -M. Methods for kinetic and thermodynamic analysis of aminoacyl-tRNA synthetases. Methods. 44 (2), 100-118 (2008).
- van Heel, A. J., et al. Production and Modification of Five Novel Lantibiotics Using the Promiscuous Nisin Modification Machinery. ACS Synth Biol. 5 (10), 1146-1154 (2016).
- Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).
