Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

بروتوكول نفطة شفط لدراسة الخلية تي البشرية استدعاء الاستجابات في فيفو

Published: August 11, 2018 doi: 10.3791/57554
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1, 2,3, 1, 4, 1
1Department of Infectious Disease Immunology, Center for Vaccine Research, Statens Serum Institut, 2Department of Infectious Diseases, Hvidovre Hospital, 3Institute of Clinical Medicine, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 4Division of Infection and Immunity, University College London

Summary

هنا، نحن نقدم تظاهرة نموذج استدعاء الجلدي نفطة شفط. النموذج يسمح وصول بسيطة لدراسة الإنسان في فيفو الاستجابات المناعية التكيفية، على سبيل المثال في سياق تطوير اللقاحات.

Abstract

مستضد الجلدي-أذكر النماذج تسمح للدراسات المتعلقة بالذاكرة البشرية الردود فيفو. عندما جنبا إلى جنب مع الجلد التعريفي نفطة الشفط (SB)، يوفر هذا النموذج إمكانية الوصول إلى السكان نادرة محددة مستضد خلايا تي الممثل لاستجابة الذاكرة الخلوية، فضلا عن سيتوكين المكروية في الموقع.

ويصف هذا التقرير الإجراء العملي لأذكر جلدي، تحريض SB، وحصاد من خلايا تي حدة مستضد. لتجسيد الأسلوب، يستخدم الجلد واختبار السلين لنذكر مولده في الأفراد الذين، قبل هذه الدراسة، وخضع لقاح السل تطعيم ضد التهاب مع متفطره. وأخيراً، ترد أمثلة لمتعدد وتدفق سيتوميتريك تحاليل العينات SB، توضح عالية وأجزاء محددة مستضد بوليفونكشونال CD4 + T-الخلايا المتوفرة بهذا الأسلوب أخذ العينات بالمقارنة مع الخلايا المعزولة من الدم.

الأسلوب الموصوفة هنا آمنة وكسبها، ويوفر فرصة فريدة لدراسة كل الاستجابات المناعية الفطرية والتكيف في فيفو، وقد تكون مفيدة لمجتمع واسع من الباحثين العاملين مع الخلية بوساطة الحصانة والإنسان الذاكرة الردود، في سياق تطوير اللقاحات.

Introduction

SB جلد هو نفطة المستحثة اصطناعياً، مما يسمح لحصاد الخلايا والسوائل مباشرة من الجلد. تقنية رفع SBs بفراغ أداة معروفة جيدا في مجال الأمراض الجلدية المستخدمة لدراسة علم المناعة البشرة في الصحة والمرض1،2،3،،من45، 6 , 7 , 8-يوضح هذا التقرير كيف يمكن أن توفر تقنية SB جنبا إلى جنب مع استدعاء مستضدي الجلدية (SB الجلدي استدعاء الأسلوب) رؤى مباشرة في الاستجابات المناعية التكيفية في فيفو.

المبدأ الكامن وراء تحريض SB بسيط: فراغ خفيفة يتم تطبيقها على منطقة صغيرة من الجلد. في نهاية المطاف سيفرض الضغط السلبي على البشرة لفصل من باطن الجلد، إنشاء نفطة محلية مليئة بالسوائل والخلايا2،،من19. يمكن أن تحصد السائل نفطة مطمح إبرة دقيقة ويمكن استخدام المحتوى لمواصلة الدراسة في المختبر.

في السنوات الأخيرة، كان هناك اهتمام متزايد في أسلوب بينالي الشارقة للدراسة في فيفو الاستجابات المناعية عدا أمراض يقتصر على10،الجلد11. دراسة مناعة التكيفية في البشر محدود بحقيقة أن الخلايا والسيتوكينات من الاهتمام هي عينات من الدم المحيطي لأنه قد يكون أخذ عينات الغازية من العقدة الليمفاوية أو الأنسجة المخاطية المعدية المعوية غير مقبول وغير أخلاقي. على سبيل مثال هو دراسة استجابات الذاكرة البشرية المعمرة تي خلية بعد التطعيم12. في مثل هذه المحاكمات، أخذ عينات خلايا تي ذات الصلة يمكن أن يكون تحديا كبيرا، نظراً لأن السكان ذات الصلة للخلايا التي تتوسط الحصانة يتواجد في الأنسجة اللمفاوية، وتعمم إلا عدد محدود جداً من خلايا T معينة في الدم المحيطي.

الأسلوب SB يوفر فرصة فريدة لدراسة الذاكرة خلايا تي وغيرهم من السكان خلية محددة. عقب التطعيم الجلدي من مستضد، محددة خلايا تي للمستضد يعينون من مكامنها اللمفاوية بهم على الجلد ويمكن بسهولة أن عينات من بينالي الشارقة. ووصفت التطبيقات المنهجية والبحوث من هذا الطراز الجلدي نذكر أكبر et al. في2من عام 2013. مستضد استخداماً يتذكر الجلد هو المشتقة المتاحة تجارياً البروتين المنقاة (PPD) للبكتيريا المستخدمة لإجراء اختبار الجلد (TST) السلين13، حيث يتم حقن PPD في طبقة الجلد للجلد. في الأفراد مع ذاكرة مناعية القائمة نحو PPD [مثلاً، الأفراد المصابين بعدوى بكتريا السل (Mtb) أو تطعيم عصيات لقاح السل (BCG) سابقة]، يؤدي ترسب مستضد أذكر استجابة مع الهجرة للجلد و في فيفو الاستنساخ توسيع نطاق خلايا CD4 + تي-PPD الخاصة2،11،،من1415. نتيجة لذلك الكسور عالية من بوليفونكشونال محددة PPD CD4 + T-الخلايا تتراكم في الجلد جاهزة لأخذ العينات س. ب. T-الخلايا التي يتم جمعها بهذه الطريقة قد ثبت أن تكون قوية ووفيرة بما فيه الكفاية تتسم بمجموعة من تحديدكم والمدى الطويل في المختبر ثقافة15. وهكذا، قد يكون النموذج نذكر الجلدي والتعريفي SB وسيلة قيمة لدراسة الاستجابات في فيفو تي خلية السابقين فيفو تحليلات، وزيادة المعرفة بهذا النهج قد يستفيد الباحثون مع مصالح في علم المناعة الخلوية واللقاحات.

يقدم هذا التقرير أول دليل تدريجي عن كيفية حمل جلد الإنسان شفط بثور في الجلد حقن PPD. ويتجلى النموذج نذكر مستضد الجلدية استخدام تجارة الرقيق عبر الأطلسي في تطعيم ضد السل المتطوعين. أخيرا، هو تحليل الصلة السابقين فيفو الخلايا والسيتوكينات تم عزلة بواسطة SB يتجلى. الخصائص الشكلية والفنية لخلايا تي PPD المحددة التي تم الحصول عليها بواسطة الأسلوب SB بدقة في أماكن أخرى ووصف2،،من1011،،من1617، 18 , 19-ويهدف هذا التقرير مناقشة الجوانب العملية والمناعية لمنهجية لتسهيل تطبيق هذا الأسلوب من المجموعات البحثية الأخرى.

Protocol

جميع الأساليب المذكورة أدناه، بما في ذلك استخدام متطوعين من البشر، أقرتها "اللجنة الدانمركية" في أخلاقيات البحوث الصحية (H-15002988)، والوكالة الدانمركية لحماية البيانات (jr.nr-2015-57-تغ). يجب أن تكون PPD منتج معتمد المعتمدة للاستخدام البشري وتدار داخل الجرعة الصحيحة التي توفرها الشركة المصنعة. أي انحراف في الجرعة أو الإدارة قد تتطلب اعتمادات إضافية الأخلاقية والمتطوعين يجب أن تعطي الموافقة المستنيرة.

1-اختبار الجلد السلين

  1. الحصول على الموافقة المستنيرة الشفوية والخطية من المتطوعين. قبل الحقن، ضمان أن المتطوع تفهم وتقبل الإجراء بما في ذلك الآثار الضارة المحتملة.
    ملاحظة: هي معايير الاشتمال محددة لهذا البروتوكول سن 18 سنة > وتطعيم ضد السل موثقة. قد تختلف معايير إدراج السؤال البحثي (أي، يمكن أن تكون معياراً إضافيا إدراج أدلة إيجابية تجارة الرقيق عبر الأطلسي).
  2. استخدام أحد حلول جاهزة من PPD للاستخدام البشري [20 السلين/mL وحدات (تو)]. تطهير الغطاء المطاطي لقنينة استخدام مسحه الكحول.
  3. إعداد موقع الحقن
    1. حدد موقع موقع الحقن في الجانب البطني من الساعد المتطوعين.
    2. ضع الذراع النخيل الهاتفي على سطح عادي واختيار منطقة في ثلث الساعد، حوالي 5-10 سم من الكوع الأعلى. البقاء واضحة من ندوب أو الأوردة، أو تلف الجلد.
    3. تطهير المنطقة باستخدام مسحه كحولية.
  4. إعداد PPD-الحل
    1. استخدم 1 مل عقيمة حقنه مع ز 27-30/قصيرة (مثلاً، 12 مم) الثابتة الإبرة.
    2. بلطف المزيج وتطمح 0.1 مل الحل PPD. تأكد من أنه لا يوجد أي فقاعات مرئية.
  5. الأدمة PPD حقن
    ملاحظة: هذه الخطوة توضح كيفية القيام ترسب PPD واحد، لكن من الممكن عدة إفادات PPD في الذراع نفسه. ومع ذلك، قد يتطلب موافقة أخلاقية محددة.
    1. تمدد الجلد وأشر الإبرة بزاوية 5-15 درجة مئوية إلى الجلد مع المجسم مشطوف الحواف التي تواجه صعودا.
    2. إدراج غيض الإبرة في الطبقة الجلدية في الجلد وتأكد من التلميح مرئياً تقريبا عن طريق البشرة.
    3. ببطء بحقن 0.1 مل من محلول PPD.
      ملاحظة: إذا كانت تدار بشكل صحيح، سوف تظهر حطاطة بالي من 6-10 مم فورا. حطاطة يختفي بعد حوالي 10 دقيقة.
    4. عند تقديم إفادات اثنين أو أكثر، وتهدف لفصل الحد أقصى (5-10 سم) لمواقع حقن مع الحفاظ على مسافة جيدة من ناحية الكوع والمعصم.
      ملاحظة: هذا يمنع التقاء محتملة لاستجابة اختبار الجلد ويسمح تحديد المواقع دون انقطاع من دائرتين شفط.

2-تقييم رد فعل الجلد--يوم 3

  1. بعد 48-72 ساعة، ملاحظة حجم رد فعل الجلد. قياس الرص (التورم) و لا الحمامي (الإحمرار) رد فعل.
  2. جس الثابت تورم استخدام الأصابع وثم وضع علامة حواف الرص استخدام قلم حبر جاف. استخدم مسطرة لقياس القطر متصلبة ولاحظ النتيجة في مم.
    ملاحظة: قراءة لحجم متصلبة قد دليل اختيار قطر الفوهة للدائرة بالشفط.

3-شفط التعريفي نفطة-اليوم السابع

  1. تجميع وحدة جهاز الشفط.
    ملاحظة: وحدات جهاز الشفط مضخات التفريغ مع الدوائر المرفقة لتحريض نفطة شفط. الجهاز المستخدم في هذه التظاهرة مخصص، ولكن وحدات جهاز الشفط أيضا متوفرة تجارياً. المضخة يحتاج إلى قابل للتعديل ضمن النطاق من-20 إلى-40 كيلو باسكال وتوفير ضغط سلبي ثابت وموثوق بها. ينبغي الحصول على الموافقة الأخلاقية الإقليمية قبل إجراء تجارب باستخدام هذا الأسلوب.
    1. أولاً، إعداد قاعة الشفط عن طريق تجميع لوحة أسفل الفوهة ولوحة نافذة مع الدائرة وخرطوم توصيل. إرفاق خرطوم توصيل دائرة محكم بمضخة فراغ.
      ملاحظة: ينبغي أن تشمل الدوائر أسفل لوحة مع وجود ثقب لتحريض نفطة، التي ينبغي أن تكون مناسبة للاتصال بجلد الإنسان، ولوحة العلوية مع نافذة، مما يسمح للرصد البصري لنفطه.
  2. تحديد قطر الفوهة الأمثل لصفيحة الفوهة بالنسبة لحجم رد فعل الجلد؛ كلما كبر حجم الفوهة، كلما كبرت الفقاعات.
  3. تطهير لوحة الفوهة والجلد للمتطوعين باستخدام مسحات الكحول.
  4. إرفاق الدائرة شفط للجلد.
    1. تأكد من أن هو يستريح الذراع للمتطوعين بشكل مريح.
    2. تأكد من أن الثقب الموجود في أسفل لوحة الدائرة شفط يقع على مدى رد فعل PPD حيث يكون وسط رد فعل الجلد مرئياً.
    3. تأمين قاعة فضفاضة باستخدام الأشرطة: عندما يتم تطبيق الضغط السلبي، الدائرة ستلتزم بالجلد، وتحافظ على موقفها.
  5. تشغيل جهاز الشفط وضبط الضغط للجيش الشعبي الكوري-20.
  6. وبعد 30 دقيقة، يزداد الضغط السلبي للجيش الشعبي الكوري-25.
  7. بعد 60 دقيقة، زيادة الضغط السلبي للجيش الشعبي الكوري-30.
  8. إبقاء الضغط على الجيش الشعبي الكوري-30 حتى يتم تشكيل نفطة تماما. التأكد من وجود الضغوط السلبية المنصوص عليها في هذا البروتوكول الخاصة بأداة مخصصة. قد يكون من الضروري لضبط الضغط قليلاً عند تطبيق البروتوكول في إعدادات أخرى.
    ملاحظة: المرحلة التعريفي نفطة يتراوح من 60 إلى 180 دقيقة (1-3 ح) مع تشكيل نفطة الفعلية التي تحدث داخل دقيقة 30 الأخيرة بليستيرينج وكثيراً ما يرتبط مع إحساس حكة. قد تحدث البثور بثور دمج مفرد أو متعدد. إذا كان يحدث تمزق نفطة أو نزيف، فإنه ينصح بإنهاء التعريفي نفطة ببطء الإفراج عن الضغط.
  9. بعد أن يتم تشكيل الفقاعات تماما، الإفراج عن الضغط، وإزالة بعناية الدائرة شفط من الجلد دون تمزيق نفطة.
  10. تطبيق خلع ملابس ناعمة في منطقة الجلد المحيطة ومكان قبعة الثابت (مثلاً، من أنبوب بلاستيكي 50 مل) أكثر من نفطة.
  11. تأمين الحد الأقصى مع الشريط الجراحي غير مسبب للحساسية تليها ضمادة بسط ناعمة.
  12. إرشاد المتطوعين لتجنب إجهاد المادية المفرطة في منطقة نفطة من أجل ح 12-24 القادمة.

4-حصاد نفطة السائل-يوم 8

  1. في اليومال 8 بلطف إزالة الملابس الواقية وتعقيمها ونفطه برذاذ تطهير الجلد.
  2. استخدام المحاقن معقمة 2 مل بإبرة ز 23 حصاد محتوى نفطة. أدخل الإبرة في الجانب العلوي/الجانبي من سقف نفطة ونضح السوائل ببطء. تجنب ملامسة أرض التجويف ولكن تأكد من حصاد جميع السائل.
  3. تطبيق خلع ملابس على نفطة المنهار.
  4. نقل نفطة السائل إلى أنبوب عقيمة. لاحظ وحدة التخزين.
  5. زيادة ونقصان السائل نفطة إلى أسفل في 600 x ز استخدام أجهزة الطرد مركزي منضدية لمدة 4 دقائق.
  6. نقل المادة طافية إلى أنبوب آخر وريسوسبيند بيليه الخلية في 500 ميليلتر من الخلية المتوسطة.
    ملاحظة: الخلايا جاهزة الآن للعد وكذلك التحليل. ويمكن تخزين supernatants في-20 إلى-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

5-تحليلات لشفط نفطة الخلايا والسوائل

ملاحظة: توفير إرشادات للتحليل الخلايا والسوائل التي تم الحصول عليها من بثور شفط الجلد ليس ضمن نطاق هذا البروتوكول. ومع ذلك، بغية توفير نتائج تمثيلية لهذا التقرير، أجريت وصمة عار داخل الخلايا التدفق الخلوي ومتعدد التحليلات. المنهجية التي توصف بإيجاز أدناه.

  1. التدفق الخلوي
    1. حفز المعلقات 1 × 105 خلايا جديدة معزولة عن بثور شفط من متطوع تم تطعيمهم BCG مع 10 ميكروغرام/مل من PPD واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2- تشمل الخلايا unstimulated لتفريخ التوازي.
    2. حفز المعلقات 1 × 106 ببمكس التي تم الحصول عليها من متطوع تم تطعيمهم BCG مع 10 ميكروغرام/مل من PPD واحتضان المخلوط في 37 درجة مئوية و 5% CO2- تشمل الخلايا unstimulated لتفريخ التوازي.
    3. بعد ح 2، يعامل جميع الخلايا بألف بريفالدين ومونينسين واحتضانها لهم ح 6 عند 37 درجة مئوية.
    4. وصمة عار في الخلايا مع فريق لايف/قتلى-وصمة عار-BV510 ومكافحة-CD4--AF780 والمضادة-CD3-BV421، المضادة-CD8-بيركب-Cy5.5، مكافحة--CCR7--PE، مكافحة--CD45RA-BV786، المضادة-IFN-γ-AF700، المضادة-تنف-α-PE-Cy7 ومكافحة--إيل-2-فيتك.
    5. وتشمل الضوابط FMO في لوحة ببمك.
    6. إجراء تحليل تدفق سيتوميتريك مع سيتوميتير تدفق وتحليل النتائج باستخدام البرمجيات ذات الصلة.
    7. بوابة على إنتاج سيتوكين CD3 + CD4 + CD8-المجموعات باستخدام استراتيجية النابضة التالية: نوع--> CD3 قابلة للتطبيق +--> CD4 + CD8----> IFN-γ +، تنف-α +، أو إيل-2 +.
    8. بوابة على السكان خلية ذاكرة المستجيب باستخدام استراتيجية النابضة التالية: نوع--> CD3 قابلة للتطبيق +-> CD4 + CD8----> CCR7-CD45RA-.
    9. حساب الملامح سيتوكين الفردية باستخدام النابضة منطقية.
  2. سيتوكين الإفراج عن المظاهرات
    1. لمظاهرة سيتوكين الإفراج في فيفو، استخدم إجراء تحليل متعدد لقياس مستويات إيل-2، IFN-γ، تنف-α، إيل-10، وايل-13 في المذابة نفطة شفط السوائل التي تم الحصول عليها من المتطوعين 4.
    2. لتظاهرة إفراج سيتوكين الخلايا التي تم الحصول عليها من شفط بثور السابقين فيفو، استخدام الطازجة نفطة شفط الخلايا وببمكس التي تم الحصول عليها من متطوع تطعيم ضد السل.
    3. تصيب في ببمك وشفط الخلايا نفطة مع الوحدات المكونة للمستعمرة 100 (زيمبابوي) من H37Rv المواضيع المتميزة واحتضانها لهم لمدة 4 أيام.
    4. استخدام إجراء تحليل متعدد لقياس مستويات إيل-2، IFN-γ، تنف-α، وايل-10، وايل-13 في كل ثقافة سوبيرناتانتس.
    5. ضبط القياسات أعلاه نطاق حساب المقايسة إلى الحد الأعلى من حساب.

Representative Results

ثمانية من المتطوعين البالغين صحية (متوسط العمر: تتراوح من 30 عاماً،: 26-43 سنة) مع تطعيم ضد السل سابقة موثقة (متوسط الوقت من التلقيح ضد السل: 5.5 سنة، تتراوح: 1-30 سنة) أدرجت. المشاركون طعن intradermally مع تو 2 من PPD متبوعاً بتقييم تجارة الرقيق عبر الأطلسي في اليوم 3. SBs المستحث في يوم 7 وتحصد في يوم 8، وأثيرت بثور جميع استخدام الدوائر نفطة شفط مع أقطار الفوهة 10 ملم. سبعة أفراد أعطيت 2 تطعيم PPD منفصلة في نفس الوقت في نفس الذراع تليها 2 الحث SB موازية (يرجى الرجوع إلى المذكرة المتعلقة بإفادات PPD متعددة أدناه الخطوة 1.4 في البروتوكول). في يوم 7 البلازما وعزل ببمكس رسمها الكثافة المتدرجة الطرد المركزي الدم المحيطي. سوبيرناتانتس البلازما والسوائل من SBs كانت مخزنة في-20 درجة مئوية. أحصى الطازجة SB الخلايا (SBCs) باستخدام نيجروسيني وصمة عار والفحص المجهري.

ويعرض السريرية TST الردود والغلة أمانة اتفاقية بازل في الشكل 1. متوسط حجم إيندوريشنز تجارة الرقيق عبر الأطلسي كانت مم 10.25 (النطاق: 0-20 مم) وكان عدد متوسط الخلية الواحدة نفطة 50,000 (النطاق: الخلايا 15,000-210,000، وعدد بثور: 15). اثنين من المتطوعين قد لا توجد استجابة سريرية في أي من تستس 2 وعائد انخفاض مجموع خلية مقابلة من الخلايا 15,000/نفطة. العائد خلية ارتبط يعني الاستجابة السريرية لتجارة الرقيق عبر الأطلسي (سبيرمان 's r = 0.643، ف = 0.094).

Figure 1
الشكل 1 : شفط نفطة خلية الغلة. () هذا الفريق يظهر ممثل وآثار الفحص المجهري الملون نيجروسيني الخلايا المعزولة من SBs 7 أيام بوست-تجارة الرقيق عبر الأطلسي. (ب) هذا الفريق توضح العلاقات بين متصلبة TST يعني (مم) وخلية متوسط العائد (/blisterن) في 8 من متطوعي تطعيم ضد السل (عدد بثور = 15). وتمثل النقاط يعني في القياسات. يرجى ملاحظة أن النقاط 2 هي متداخلة المتطوعين 2 على حد سواء كان الرص TST مم 0 وعائد خلية 15000. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

إظهار وصف سيتوميتريك SB التدفق، SBCs تم الحصول عليها من متطوعة عمرها 43 عاماً الذين تم تطعيمهم BCG قبل 30 عاماً وقد لا التعرض المعروفة إلى Mtb. SBCs كانت معزولة بعد الحث نفطة واحدة ( الرص: 1.4 ملم/100,000 SBCs). ويبين الشكل 2 قطع تمثيلية لتلطيخ سيتوكين داخل الخلايا SBCs مقابل ببمكس.

في هذا المتطوع، جزء صغير من CD3 + CD4 + CD8-SBCs زادت من 67% في الخلايا unstimulated > 90% عند PPD في المختبر ريستيموليشن، بينما ثابتاً جزء صغير من CD3 + CD4 + CD8-ببمكس (~ 51%، الشكل 2). ما يزيد على 92 في المائة من في المختبر PPD-فضلا عن unstimulated CD3 + CD4 + CD8-SBCs، كانت من نوع ذاكرة المستجيب (CCR7-CD45RA-، المعطيات غير معروضة). كسور CD3 + CD4 + CD8-خلايا معينة الناجمين عن طريق تحفيز PPD عموما كانت أعلى في SBCs مقارنة ببمكس (33.1 مقابل. 0.2 ٪، أونستيمولاتيد عينات مطروحاً). في ببمكس، كانت كسور بوليفونكشونال محددة PPD CD3 + CD4 + CD8-خلايا جميع < 0.05%.

Figure 2
الشكل 2 : الممثل التدفق الخلوي قطع SBCs مقابل ببمكس- لوحات و ب إظهار كثافة الممثل أونستيمولاتيد المؤامرات للسكان CD8 + و CD4 + في () مقابل. المؤامرات حفزت PPD ببمكس ولوحات (ج) SBCs. ب د بطيئة من سيتوكين داخل الخلايا تلطيخ في حفز PPD CD3 + CD4 + CD8-خلايا (ب) ببمكس و (د) SBCs. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر نسخة من هذا الرقم-

كما هو متوقع، كانت CD3 + CD4 + CD8-SBCs المنشط في فيفو، يتضح من نسبة عالية من الخلايا تلطيخ السيتوكينات upregulated (12 في المائة)، مع السيتوكينات الغالبة التي تنف-α و IFN-γ. بيد على PPD-التحفيز، تحولت سيتوكين إفراز الخلايا نحو الثلاثي-أو مزدوجة-إيجابي IFN-γ + تنف-α + إيل-2 + (17 في المائة) و IFN-γ + تنف-α + (15 ٪) الشخصية (الشكل 3b، الملامح ببمك من الجهة المانحة نفسها مدرجة للمقارنة في الشكل 3a). ملامح التعبير سيتوكين لحفز PPD المستجيب الذاكرة CD4 + تي خلية فرعية (CD3 + CD4 + CD8-CCR7-CD45RA-) كانت مماثلة ل CD3 + CD4 + CD8-السكان في الأرقام 2 و 3 (البيانات لا تظهر).

Figure 3
الشكل 3: مواصفات سيتوكين SBCs حفز خلايا CD4 + PPD وأونستيمولاتيد مقابل ببمكس-  هذه اللوحات إظهار الملامح الفردية لإنتاج سيتوكين () CD3 + CD4 + CD8-ببمكس الخلايا و (ب) CD3 + CD4 + CD8-SBCs. الأشرطة تمثل كسور ملامح محددة مستضد سيتوكين في الخلايا أونستيمولاتيد (أشرطة بيضاء) وعند تحفيز في المختبر مع PPD (أشرطة ملونة).

لاستكشاف السائل SB كمصدر للمعلومات عن المكروية سيتوكين في موقع اختبار الجلد، قيست مستويات سيتوكين في السائل المقطوع من SBs المستحث 7 أيام بوست-تجارة الرقيق عبر الأطلسي (الشكل 4 أ). كان متوسط مستويات تنف-α, IFN-γ وايل-2 339 بيكوغرام/مل و 19 بيكوغرام/مل و 1 بيكوغرام/مل، على التوالي (n = 6). وكانت مستويات البلازما منخفضة جداً بصفة عامة. إنتاج خلايا معزولة من SBs مستويات عالية من السيتوكينات الالتهابية للمحترفين السابقين فيفو (الشكل 4 باء). كانت مثقف المعايرة SBCs من متطوع لمدة 4 أيام حضور ضراوة السل م ± ببمكس الذاتي. وكانت مستويات IFN-γ > 30-fold أعلى في الثقافات التي تتضمن SBCs، بغض النظر عن وجود ببمكس.

Figure 4
الشكل 4 : مستويات سيتوكين في بينالي الشارقة السائل، والبلازما، و المواضيع المتميزة --إصابة supernatants ثقافة. () هذا الفريق يبين مستويات سيتوكين في supernatants SB السوائل والبلازما من 6 متطوعين تطعيم ضد السل. الأشرطة تمثل مستويات سيتوكين الوسيط؛ أشرطة الخطأ تمثل النطاق. (ب) هذا الفريق يبين مستويات سيتوكين في supernatants من 4 موازية 600 ميليلتر السابقين فيفو 4 أيام ثقافات 1 × 106 ببمكس (أشرطة سوداء)، 1.75 × 105 SBCs (أشرطة بيضاء)، و 1 × 106 ببمكس ارتفعت مع 0.5 أو 1.75 x 10 5 SBCs (القضبان الرمادية) مصاب المواضيع المتميزة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

ويصف هذه المخطوطة إجراء عملي لدراسة الذاكرة المناعية البشرية الردود في فيفو، استخدام مستضد الجلدية نذكر وخلية الحصاد بالاستقراء نفطة شفط. تجارة الرقيق عبر الأطلسي كمثال لترسب مستضد الأدمة ونذكر لقاح بي سي جي. وأخيراً، كان مثال لتوصيف العينة SB بتحليل تدفق سيتوكين سيتوميتريك ومتعدد المقدمة، تبين أن حوالي ثلث الخلايا SB كانت محددة مستضد بوليفونكشونال الخلايا التائية من النمط الظاهري الذاكرة المستجيب.

وتشمل الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول تقنية حقن داخل الأدمة واستحثاث نفطة شفط ثقب نفطة. أولاً، يتطلب ترسب الأدمة صحيح الموظفين المدربين. يمكن أن يؤدي ترسب غير صحيحة إلى نتائج دون المستوى الأمثل. PPD عموما مستضد جلدية المعروفة والآمنة، ولكن قد تختلف تركيبته بين المصنعين، يحد من إمكانية المقارنة بين13،20. ويقدم هذا التقرير التعليمات المتعلقة ترسب داخل الأدمة واحد تو 2، وترسبات موازية اختيارياً اثنين (2 × 2 تو)، التي قد تتطلب الموافقة الأخلاقية إضافية. غير أن دراسات أخرى استخدمت تو 10، التي تزيد من احتمال رد فعل الجلد قوية10،21. أثناء الخطوة التعريفي SB، زيادات تدريجية صغيرة في الضغط السلبي سوف يقلل خطر تمزق نزيف ونفطه. وهناك احتمالات التلوث مع خلايا الدم الحمراء أو leucocytes من مجرى الدم منخفضة بصفة عامة2. تقنية ثقب معقمة تمنع التلوث الميكروبي وتجنب الاتصال بين ثقب الإبرة والكلمة نفطة عن طريق الجلد يقلل من الشوائب من الحطام أو خلايا الجلد المقيمين. ومع ذلك، تفضل بعض الباحثين حصاد SB السوائل عن طريق تطبيق ضغط متداول إلى نفطة ثقب10. وقد يكون من الضروري على ثقب سيتا داخل الفقاعات. تقنية SB نفسها مينيملي؛ SBs المنهار تشفي دون ندبات والتهابات نادرة جداً. 2 ولكن قد يحدث قدر من هيبو-تصبغ وربما ينبغي تجنبها SB التعريفي في الناس مع تاريخ من تندب غروانيه.

وتشمل القيود التقنية الخلية إجمالي انخفاض غلة المحاصيل وخيارات محدودة وبالتالي للتخزين على المدى الطويل. وكانت العلاقات بين الغلة leucocyte السريرية TST الردود، وحجم نفطة، والتلوث بكرات الدم الحمراء ووصف دقيق في مكان آخر2،10. في بي سي جي-نذكر التجارب المعروضة هنا (الشكل 1)، كان متوسط العائد الإجمالي من نفطة كل 50,000، مما يعني ضمناً مجموعة تجريبية صغيرة الحجم باستخدام هذه الخلايا، لا سيما إذا كانت SBCs وحدها درس15. ومع ذلك، يتجاوز السكان تي خلية محددة في نموذج SB معظمهم ما هو موجود في عينات ببمك في كلتا الحالتين الخلية النسبي والمطلق. في المثال قدم في الشكل 2، كان عدد الثلاثي-إيجابية PPD المحددة خلايا-تي في عينة خلايا SB 100,000 أكثر من 2 × أكبر من رقم تم العثور عليها في 1 × 106 ببمكس من نفس الجهة المانحة (البيانات لا تظهر). سجل مرئي لرد فعل تجارة الرقيق عبر الأطلسي هو الأسلوب السريرية الأكثر شيوعاً لتقييم الذاكرة السل م . من المذكرة، لا ذروة رد فعل مناعية تكيفية الكامنة في نفس الوقت كرد فعل الجلد السريرية2،21. ليس كل تطعيم ضد السل أو المواضيع المتميزة-سوف تضع الأفراد المعرضين تجارة الرقيق عبر الأطلسي ردود فعل قوية واستراتيجيات للتصنيف، ومناولة العينات من غير تجارة الرقيق عبر الأطلسي المستجيبين، فضلا عن توعية المتفطرات الموجودة مسبقاً في جمهرة الدراسة، يلزم النظر فيها قبل الشروع في محاكمة التذكير باستخدام هذا الأسلوب. أيضا، في كل من بينالي الشارقة أخذ العينات والتسجيل المرئي، هناك احتمال لوجود تحيز نظرية في الأفراد مع الردود انخفاض الجلد نظراً لعالمية أو المتصلة بالجلد ضعف الحصانة كما يتضح، على سبيل المثال، في الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية وبعض الفئات العمرية2، 13،،من1820. وبالإضافة إلى ذلك، تعزيز المناعية لرد فعل تجارة الرقيق عبر الأطلسي مع التجارب المتكررة هو معروف20،22. بيد أن تعمل الخلية SB تظل ثابتة بدلاً من ذلك عندما يتم تستس المتكررة10. وتدعم هذه الملاحظة دور يذكر س. ب في الدراسات الطولية للاستجابات المناعية الخلوية.

للذيفان تي خلية، يسمح نذكر بينالي الشارقة للحصاد للكسور عالية من خلايا محددة مستضد. توقيت بينالي الشارقة لأخذ عينات من PPD شهادة غير حاسمة لتكوين الخلوية والمكرويه سيتوكين تتغير بمرور الوقت. في هذا البروتوكول، بثور كانت المستحث 7 أيام بعد انتهاء التحدي والخلايا المعزولة كانت أساسا المستجيب الذاكرة CD4 + تي الخلايا بما في ذلك الكسور عالية من الخلايا باستخدام تعبير المشارك تنف-α, IFN-γ وايل-2. هذه الملاحظات بما يتفق مع الدراسات السابقة التي تصف كيفية حدوث تي خلية التنشيط وانتشارها، والتمايز في الجلد معبي PPD2،،من1521. دراسات SB الحركية في PPD توعية الأفراد توحي بأن استجابة البشرة المبكر جداً غير محدد؛ بيد فعلا خلال الأيام الأولى التي أعقبت PPD-التحدي، يصبح تهيمن الاستجابة خلايا CD4 + تي الخلايا (كلا تعمل وسط الذاكرة في الذاكرة والمستجيب قد وصف) و، بعد 3 أيام، الرد يهيمن الكسور عالية من سيتوكين PPD الخاصة المنتجة لخلايا CD4 + الخلايا التائية2،،من810،15،21. وتظل هذه الاستجابة التكيفية سيتوكين يمكن كشفها لأكثر من 2 أسابيع2،،من810،23. بوست يوم 7-تجارة الرقيق عبر الأطلسي، على ما يبدو، نقطة الوقت الأكثر الأمثل لجمع سيتوكين إنتاج الخلايا التائية الذاكرة CD4 +2. ومع ذلك، النقاط مرة أخرى بطبيعة الحال، يمكن ذات الصلة اعتماداً على مستضد واستجابة للاهتمام. من المذكرة، في دراسة واحدة، أبلغ PPD الاستجابة التكيفية ذروة قليلاً في وقت سابق مع انخفاض في إفراز سيتوكين برو الملتهبة بالفعل في 5 أيام بوست-تجارة الرقيق عبر الأطلسي10.

السائل س. ب يحتوي على مستويات عالية من السيتوكينات الموالية التحريضية والبروتينات الأخرى تبين أن الممثل الجلد المكروية15،24. وقد أظهرت الدراسات الحركية أن تنف-α و IFN-γ المستويات في ذروة SB السوائل بعد 3 أيام بينما إيل-2 مستويات الذروة بعد 7 أيام2،10، ربما يعكس هيمنة استجابات التكيف في هذه المرحلة بعد. لأن الخلايا SB قد تم تفعيلها في فيفو، هم يعرضون إطلاق سراح سيتوكين عفوية عالية، فضلا عن احتمال إطلاق سراح محددة عند ريستيموليشن (الشكل 3 و 4).

ويركز هذا التقرير على الحصانة CD4 + تي خلية. كما يتبين في الشكل 2، وكانت غالبية تي-الخلايا المعزولة في الواقع خلايا CD4 +، بينما كانت هناك تقريبا لا CD8 + الخلايا التائية في الشفط نفطة السائل. وهذا ما يتفق مع دراسات أخرى نذكر SB PPD الإبلاغ عن نسب منخفضة وقدرة المهاجرة أقل شأنا من CD8 + تي الخلايا CD4 + "تي" الخلايا2،،من810،23بالمقارنة. وصف مزيد من مساهمة CD8 + سيكون من الأفضل؛ ومع ذلك، هذا خارج نطاق هذا التقرير.

خلايا تي تعتبر أساسية لمراقبة محصنة من المواضيع المتميزة؛ ومع ذلك، كان من الصعب التعرف ربط موثوقة لحماية يتجلى في الاستجابة المناعية التكيفية من25،الدم26. هذا الحاجز شدة يعرقل تطوير لقاحات السل الجديدة، كما أن هناك حاليا أي بديل لفعالية كبيرة ومكلفة للغاية محاكمات27. تحديد مطوري لقاح السل لقاح الاستمناع بتقييم التغييرات الصغيرة وعابر في السكان تي خلية خاصة باللقاح في28،الدم29. ومع ذلك، من المشكوك فيه ما إذا كان جزء صغير من تعميم محددة مستضد خلايا تي في الدم الصلة (أي، قادرة على الانتقال إلى موقع الإصابة والممثل لمراقبة المكروية T الخلية-الغنية المواضيع المتميزة) 27 , 30 , 31 .

استناداً إلى الدراسات السابقة والبيانات المقدمة في هذه الوثيقة، نموذج استدعاء الجلدي SB يمثل بإمكانيات غير مستغلة لدراسة الخلايا التائية الخاصة باللقاحات. ليس فقط تمكين النموذج أذكر منذ عقود اللقاحات الاستجابة التي تم إنشاؤها، كما يسمح تقييم الذاكرة الحقيقية المحتملة في سياق الخاص بالانسجة15،18،،من1921. الرواية، واختبارات الجلد المحددة، التي تشمل المستضدات تتألف أيضا من المرشح فرعية للقاحات السل، تشير إلى فرص جديدة لتقييم اللقاحات باستخدام هذا النموذج28،32. علاوة على ذلك، توحي التحليلات ترانسكريبتوميك أن الخلية – mediated استجابة المناعية المتولدة في الجلد PPD، تحدي مشابه للرد في المواضيع المتميزة-إصابة الرئة18.

بينما خزعات الجلد لكمه أيضا السماح لحصاد خلية من الجلد وتوفير المعلومات المكانية، بالمقارنة مع أخذ العينات بينالي الشارقة، الأسلوب أكثر الغازية ويتطلب المعالجة الانزيمية أو ميكانيكي لإعداد تعليق خلية واحدة33. قياسات علامات السيتوكينات وخلية قابلة للمقارنة بين أسلوبي2،10.

فعلا طبق طريقة الشفط نفطة في العديد من مجالات البحوث الطبية إلى جانب الأمراض الجلدية، أما وحدها أو في تركيبة مع تحدي جلد الجهازية أو المحلية. وتشمل الأمثلة الدراسات الانتان والأمراض المرتبطة بفيروس ابشتاين-بار ليمفاوية، واعتلال الأعصاب السكري، جلوكوكورتيكويد تناول الآثار والتجارب البشرية اختبار الأجسام المضادة العلاجية أو نماذج للعلاجات تي-الخلية المستهدفة10 ،34،35،36،،من3738.

من وجهة نظر علاجية، يقدم الأسلوب نذكر الجلدي SB مزايا فريدة من نوعها لدراسة الذاكرة تي خلية وسط المحتملة ومن كلا بيولوجية والتقنية الجلد من وجهة نظر، ويبدو أن توفير حجرة عينات ذات صلة2، 15،18،،من1921. على وجه الخصوص، بالمقارنة مع أخذ العينات التقليدية السلبية، وتعميم ببمكس، الأسلوب نذكر الجلدي SB يسمح لدراسة الخلايا التائية التي أثبتت قدرة على ترحيل من العقدة الليمفاوية ردا على مستضد ذات الصلة بهم، وإكمال المحلي التوسع والتمايز في الأنسجة على حدة في فيفو سياق15،18،،من1921.

وفي الختام، أظهر النموذج هنا يمكن أن تكون ذات صلة للباحثين داخل ميدان الإنسان مناعة التكيفية وتي خلية استهداف عملاء (أي، في بحوث اللقاحات أو سرطان الأمراض المعدية). تجارة الرقيق عبر الأطلسي النموذج المطبق في هذا البروتوكول، بطبيعة الحال، ذات أهمية خاصة في مجال اللقاحات السل. بيد أن المفهوم الأساسي لهذا النموذج ينطبق عاليا في ميادين أخرى من البحوث.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

نود أن نشكر مادس ينسن رادمير على نصيحته العملية والأكاديمية؛ ليندكفيست لاو وكان سفيجستروب لتوفير الخبرة التقنية؛ هيلين Bæk Juel وجوناثان فيلسكوف سيغنه ت. شميت سولفيج Harpøth الأمريكي للمساعدة التقنية؛ الموظفون في العيادة الخارجية "تنويع السل" لتدريبهم في PPD الإدارة؛ وجميع المتطوعين للمشاركة في الدراسة. هذا المشروع ممول من قبل برنامج "أفق 2020" اللجنة الأوروبية [رقم المنحة TBVAC2020 643381]، ونود أن نشكر الشركاء في الائتلاف للمناقشات المثمرة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gloves for laboratory use Imtex, Denmark 1013
Desinfection spray  Apotek, Denmark 82% alcohol, with glycerin, for human skin 
Alcohol swaps Mediq, Denmark 1131892
PPD RT 23 "SSI" (2 T.U./0.1ml) AJ Vaccines
 Myjector syringe with fixed needle  Terumo A236 1 ml/29G/12mm
Ruler  not relevant  for skin reaction evaluation
Ballpoint pen not relevant  for skin reaction evaluation
Portable Lung Suction Unit Laerdal Medical, Denmark 78000011 NOTE.  Modified for ranges below -40kPa and supplied with pressure gauge  (ref. 1031107) by the Technical Dept. , Hvidovre Hospital
Negative Pressure Chamber Assembly, unheated with connecting tubing Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA
Orifice Plate, 47mm, 10mm Hole Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA
Negative Pressure Instrument Seal Kit Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA
Negative pressure Chamber Strap  Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA 12 inches
Micropore Surgical tape  3M 1533-1 2.5cm x 9.1m
Cap from 15ml plastic tube Sarstedt, Germany 62,547,254
Tubigrip bandage Mölnlycke Health Care, Sweden 1443
Cosmopor steril adhesive dressing Hartmann 9008337 7.2 x 5 cm
2ml Syringe Concentric Luer Slip  Becton Dickinson  300185
Microlance 23G/30mm needle Becton Dickinson 300700
Safe-Lock microcentrifuge tubes (autoclaved) Eppendorf  0030120086 Autoclaved
Minispin plus centrifuge Eppendorf 5453000011
Gibco AIM V Medium Life Technologies 12055-091

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kiistala, U. Suction blister device for separation of viable epidermis from dermis. Journal of Investigative Dermatology. 50 (2), 129-137 (1968).
  2. Akbar, A. N., et al. Investigation of the cutaneous response to recall antigen in humans in vivo. Clinical & Experimental Immunology. 173 (2), 163-172 (2013).
  3. Hatje, L. K., Richter, C., Blume-Peytavi, U., Kottner, J. Blistering time as a parameter for the strength of dermoepidermal adhesion: a systematic review and meta-analysis. British Journal of Dermatology. 172 (2), 323-330 (2015).
  4. Smith, T. J., Wilson, M. A., Young, A. J., Montain, S. J. A suction blister model reliably assesses skin barrier restoration and immune response. Journal of Immunological Methods. 417, 124-130 (2015).
  5. Maranda, E. L., et al. Surgical management of leukoderma after burn: A review. Burns: Journal of the International Society of Burn Injuries. 44 (2), 256-262 (2017).
  6. Wilhelm, K. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. Models of wound healing: an emphasis on clinical studiea. Skin Research and Technology: Official Journal of the International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) and the International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) and the International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).
  7. Maini, A. A., et al. A Comparison of Human Neutrophils Acquired from Four Experimental Models of Inflammation. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
  8. Kenney, R. T., Rangdaeng, S., Scollard, D. M. Skin blister immunocytology. A new method to quantify cellular kinetics in vivo. Journal of Immunological Methods. 97 (1), 101-110 (1987).
  9. Carvalho, J. C. O., Palero, J. A., Jurna, M. Real-time imaging of suction blistering in human skin using optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 6 (12), 4790-4795 (2015).
  10. Belson, A., et al. Characterisation of the clinical and activated T cell response to repeat delayed-type hypersensitivity skin challenges in human subjects, with KLH and PPD, as a potential model to test T cell-targeted therapies. Inflammation Research: Official Journal of the European Histamine Research Society ... [et al.]. 65 (5), 389-404 (2016).
  11. Vukmanovic-Stejic, M., Reed, J. R., Lacy, K. E., Rustin, M. H. A., Akbar, A. N. Mantoux Test as a model for a secondary immune response in humans. Immunology Letters. 107 (2), 93-101 (2006).
  12. Thakur, A., Pedersen, L. E., Jungersen, G. Immune markers and correlates of protection for vaccine induced immune responses. Vaccine. 30 (33), 4907-4920 (2012).
  13. CDC. TB | Fact Sheets - Tuberculin Skin Testing for TB. , https://www.cdc.gov/tb/publications/factsheets/testing/skintesting.htm (2018).
  14. Vukmanovic-Stejic, M., et al. Varicella Zoster-Specific CD4+Foxp3+ T Cells Accumulate after Cutaneous Antigen Challenge in Humans. The Journal of Immunology. 190 (3), 977-986 (2013).
  15. Reed, J. R., et al. Telomere erosion in memory T cells induced by telomerase inhibition at the site of antigenic challenge in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 199 (10), 1433-1443 (2004).
  16. Tatovic, D., Young, P., Kochba, E., Levin, Y., Wong, F. S., Dayan, C. M. Fine-Needle Aspiration Biopsy of the Lymph Node: A Novel Tool for the Monitoring of Immune Responses after Skin Antigen Delivery. The Journal of Immunology. 195 (1), 386-392 (2015).
  17. Bond, E., et al. Plasmacytoid dendritic cells infiltrate the skin in positive tuberculin skin test indurations. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 114-123 (2012).
  18. Bell, L. C. K., et al. In Vivo Molecular Dissection of the Effects of HIV-1 in Active Tuberculosis. PLoS Pathogens. 12 (3), e1005469 (2016).
  19. Tomlinson, G. S., et al. Transcriptional profiling of innate and adaptive human immune responses to mycobacteria in the tuberculin skin test. European Journal of Immunology. 41 (11), 3253-3260 (2011).
  20. Nayak, S., Acharjya, B. Mantoux test and its interpretation. Indian Dermatology Online Journal. 3 (1), 2-6 (2012).
  21. Vukmanovic-Stejic, M., Reed, J. R., Lacy, K. E., Rustin, M. H. A., Akbar, A. N. Mantoux Test as a model for a secondary immune response in humans. Immunology Letters. 107 (2), 93-101 (2006).
  22. Menzies, D. Interpretation of Repeated Tuberculin Tests. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (1), 15-21 (1999).
  23. Pitzalis, C., et al. Selective migration of the human helper-inducer memory T cell subset: confirmation by in vivo cellular kinetic studies. European Journal of Immunology. 21 (2), 369-376 (1991).
  24. Kool, J., et al. Suction blister fluid as potential body fluid for biomarker proteins. Proteomics. 7 (20), 3638-3650 (2007).
  25. Flynn, J. L., Chan, J. Immunology of tuberculosis. Annual Review of Immunology. 19, 93-129 (2001).
  26. Kagina, B. M. N., et al. Specific T cell frequency and cytokine expression profile do not correlate with protection against tuberculosis after bacillus Calmette-Guérin vaccination of newborns. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (8), 1073-1079 (2010).
  27. García-Basteiro, A. L., Ruhwald, M., Lange, C. Design of tuberculosis vaccine trials under financial constraints. Expert Review of Vaccines. 15 (7), 799-801 (2016).
  28. Luabeya, A. K. K., et al. First-in-human trial of the post-exposure tuberculosis vaccine H56:IC31 in Mycobacterium tuberculosis infected and non-infected healthy adults. Vaccine. 33 (33), 4130-4140 (2015).
  29. Tameris, M., et al. The candidate TB vaccine, MVA85A, induces highly durable Th1 responses. PloS One. 9 (2), e87340 (2014).
  30. Woodworth, J. S., et al. Subunit vaccine H56/CAF01 induces a population of circulating CD4 T cells that traffic into the Mycobacterium tuberculosis-infected lung. Mucosal Immunology. 10 (2), 555-564 (2016).
  31. Gideon, H. P., et al. Variability in tuberculosis granuloma T cell responses exists, but a balance of pro- and anti-inflammatory cytokines is associated with sterilization. PLoS Pathogens. 11 (1), e1004603 (2015).
  32. Ruhwald, M., et al. Safety and efficacy of the C-Tb skin test to diagnose Mycobacterium tuberculosis infection, compared with an interferon γ release assay and the tuberculin skin test: a phase 3, double-blind, randomised, controlled trial. The Lancet Respiratory Medicine. 5 (4), 259-268 (2017).
  33. He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. P. N. Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (110), e52564 (2016).
  34. Koskela, M., et al. Blister fluid and serum cytokine levels in severe sepsis in humans reflect skin dysfunction. Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 61 (1), 53-61 (2017).
  35. Wada, T., et al. Characterization of skin blister fluids from children with Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease. The Journal of Dermatology. 45 (4), 444-449 (2018).
  36. Andersson, C., Rajala, T., Särkkä, A. Hierarchical models for epidermal nerve fiber data. Statistics in Medicine. 37 (3), 357-374 (2018).
  37. Ramshanker, N., et al. Effects of Prednisolone on Serum and Tissue Fluid IGF-I Receptor Activation and Post-Receptor Signaling in Humans. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 102 (11), 4031-4040 (2017).
  38. Bouma, G., et al. CCL20 neutralization by a monoclonal antibody in healthy subjects selectively inhibits recruitment of CCR6+ cells in an experimental suction blister. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (9), 1976-1990 (2017).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 138، شفط نفطة، علم المناعة، نتذكر، تحد الجلد، الجلد مستضد، تي خلية، ذاكرة السلين تي خلية، PPD، اختبار، اللقاحات، فيفو في الاستجابة، والسل
بروتوكول نفطة شفط لدراسة الخلية تي البشرية استدعاء الاستجابات <em>في فيفو</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holm, L. L., Vukmanovic-Stejic, M.,… More

Holm, L. L., Vukmanovic-Stejic, M., Blauenfeldt, T., Benfield, T., Andersen, P., Akbar, A. N., Ruhwald, M. A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo. J. Vis. Exp. (138), e57554, doi:10.3791/57554 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter