Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Всасывания блистер протокол для изучения человеческий Т-клеточный вспомнить ответы в естественных условиях

Published: August 11, 2018 doi: 10.3791/57554
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1, 2,3, 1, 4, 1
1Department of Infectious Disease Immunology, Center for Vaccine Research, Statens Serum Institut, 2Department of Infectious Diseases, Hvidovre Hospital, 3Institute of Clinical Medicine, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 4Division of Infection and Immunity, University College London

Summary

Здесь мы предоставляем демонстрация модели кожный отозвания всасывания волдыря. Модель позволяет простой доступ для изучения человека в естественных условиях адаптивного иммунного ответа, например в контексте разработки вакцины.

Abstract

Кожный антиген напомнить модели позволяют исследования человеческой памяти ответы в естественных условиях. В сочетании с кожей всасывания блистер (SB) индукции, эта модель предлагает доступности населению редких антиген специфические Т-клетки представителя ответ клеточной памяти, а также цитокина микроокружения в situ.

Этот доклад описывает практические процедуры кожный отозвания, SB индукции и урожай антиген специфические Т-клеток. Чтобы проиллюстрировать метод, туберкулиновой пробы кожи используется для антигенной отозвания отдельных лиц, которые до этого исследования, подвергся Bacillus Кальметта-Герена вакцинации против инфекции с микобактерии. Наконец приводятся примеры мультиплекс и потока гранулярных анализы образцов SB, иллюстрирующие высокой доли антиген специфические полифункциональных CD4 + Т-клеток доступны этим методом выборки, по сравнению с клетками, изолированных от крови.

Метод, описанный здесь является безопасным и минимально инвазивной, предоставляет уникальную возможность для изучения обоих врожденного и адаптивного иммунного ответа в естественных условияхи может быть полезной для широкого сообщества исследователей, работающих с клеточный иммунитет и человека памяти ответы, в контексте разработки вакцины.

Introduction

SB кожи является искусственно индуцированных волдырь, который позволяет для урожая клеток и жидкости непосредственно из кожи. Метод повышения SBs вакуум является известный инструмент в области дерматологии, используется для изучения кожи иммунологии в здоровье и болезни1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8. Настоящий доклад показывает, как техника SB, в сочетании с кожный антигенной отзыва (SB кожный отозвания метод) может обеспечить прямое понимание адаптивного иммунного ответа в vivo.

Принцип, лежащий в SB индукции прост: легкий вакуум применяется на небольшом участке кожи. Отрицательное давление в конце концов заставит эпидермис отделить от дермы, создание местных блистер заполнены жидкости и клетки1,2,9. В блистере жидкости могут быть собраны путем аспирации тонкой иглой и содержание могут быть использованы для дальнейшего изучения в пробирке.

В последние годы наблюдается растущий интерес к метод SB для изучения в естественных условиях иммунные реакции, за исключением заболеваний, ограничивается кожи10,11. Изучение адаптивного иммунитета в организме человека ограничивается тот факт, что клетки и цитокины интерес отбираются из периферической крови потому что инвазивные выборки лимфатических узлов или желудочно-кишечные слизистых тканей может быть неприемлемым и неэтично. Примером является исследование долгоживущих человеческой памяти Т-клеток ответов после вакцинации12. В таких испытаний отбора соответствующих Т-клетки может быть большой проблемой, потому что соответствующие популяция клеток, которые посредником иммунитет проживает в лимфоидной ткани, и распространить лишь весьма ограниченное число конкретных Т-клеток в периферической крови.

SB техника предлагает уникальную возможность для изучения памяти Т-клеток и других конкретных клеточных популяций. После кожные прививки антигена Т-клеток конкретных для антигена набираются из их лимфоидных убежищ на кожу и легко могут отбираться из SB. Методологии и исследований применения этой модели кожный отзыва были описаны Акбар и др. в 20132. Часто используемые антигена для отозвания кожи является производной коммерчески доступных очищенный протеин (PPD) микобактерий, используемый для выполнения туберкулиновой пробы кожи (TST)13, где PPD впрыскивается в дермальный слой кожи. В людях с существующей иммунологической памяти к PPD [например, лица с микобактериями туберкулеза (Mtb) инфекции или предварительного вакцинации Bacillus Кальметта-Герена (БЦЖ)], антиген осаждения приводит к вспомнить ответ с миграцией на кожу и в естественных условиях клоновых расширения PPD-специфичные CD4 + T-клетки2,11,14,15. В результате высокой доли PPD-конкретных полифункциональных CD4 + T-клетки накапливаются в кожа готова для SB выборки. Т-клетки, собранные этим методом зарекомендовали себя надежной и достаточно обильные характеризуется ряд иммуноанализа и долгосрочный в vitro культуры15. Таким образом модель кожный отзыва и индукции SB может оказаться ценный метод для изучения в естественных условиях Т-клеток ответов ex vivo анализами, и расширение знаний о такой подход может пользу исследователей с интересами в клеточного иммунологии и вакцинологии.

Этот доклад содержит первое пошаговое руководство о том, как побудить всасывания волдыри кожи человека в PPD-Литьевая кожа. Кожный антигена отозвания модель подтверждается с помощью TST в прививки БЦЖ добровольцев. Наконец анализ соответствующих ex vivo клеток и цитокинов, изолированные SB это свидетельствует. Фенотипические и функциональные характеристики PPD-специфических Т-клеток, полученных методом SB, подробно описанных в других2,10,11,16,17, 18 , 19. Настоящий доклад призван обсудить практические и иммунологические аспекты методологии для облегчения применения этой методики в других исследовательских групп.

Protocol

Все методы, описанные ниже, включая использование добровольцах, были одобрены датского Комитета по вопросам этики медицинских исследований (H-15002988) и Датского агентства по охране данных (jr.nr. 2015-57-0102). PPD-файл должен быть сертифицированный продукт одобрен для использования человеком и управлением в рамках правильную дозировку, предоставляемых производителем. Любое отклонение в дозировке или администрация может потребовать дополнительные утверждения этических и добровольцы должны дать осознанное согласие.

1. туберкулиновой пробы кожи

  1. Получить устное и письменное согласие от добровольцев. До инъекции убедитесь, что доброволец понимает и принимает процедуры, включая возможные негативные последствия.
    Примечание: Критерии включения, относящиеся к настоящему Протоколу являются возраст > 18 лет и документально БЦЖ. Критерии включения могут варьироваться в зависимости от исследования вопрос (т.е., дополнительного включения критерия может быть свидетельством положительных TST).
  2. Используйте готовое решение PPD для использования человеком [20 туберкулин единиц (ту) / мл]. Продезинфицируйте резиновый колпачок флакона с помощью спиртом.
  3. Подготовьте место инъекции
    1. Найдите место инъекции на вентральной стороне предплечья добровольцев.
    2. Поместите ладонь вверх руку на ровную поверхность и выбрать область на верхней трети предплечья, примерно 5-10 см от локтевого сустава. Держитесь подальше от шрамов, вен или поврежденную кожу.
    3. Лечить области с использованием спиртовым тампоном.
  4. Подготовить PPD-решение
    1. Используйте 1 мл стерильные шприц с 27-30G/короткие (например, 12 мм) фиксированная иглы.
    2. Аккуратно перемешать и стремятся 0,1 мл раствора PPD. Убедитесь, что есть нет видимых пузыри.
  5. Внутрикожные инъекции PPD
    Примечание: Этот шаг описывается выполнение одного осаждения PPD, но возможно несколько показаний ППД в той же руке. Однако это может потребовать конкретные этические утверждения.
    1. Натяните кожу и точку иглу под углом 5-15° к коже с наклонной вверх.
    2. Вставьте кончик иглы в дермальный слой кожи и убедитесь, что кончик почти виден через эпидермис.
    3. Медленно вводить 0,1 мл раствора ППД.
      Примечание: Если правильно, бледно Папула 6-10 мм появятся немедленно. Папула исчезает после примерно 10 минут.
    4. При двух или более осаждений, цель для максимального разделения (5-10 см) инъекции сайтов сохраняя хорошее расстояние от локтя и запястья.
      Примечание: Это предотвращает потенциального слияния ответа теста кожи и позволяет непрерывное позиционирование двух палат всасывания.

2. Оценка реакции кожи - день 3

  1. После 48-72 ч Обратите внимание на размер реакции кожи. Измерить уплотнения (отек) и не эритема (покраснение) реакции.
  2. Ощупывайте жесткий опухоль с помощью пальцев и пометьте кромки уплотнения, используя шариковой ручкой. Используйте линейку измерить диаметр уплотнения и заметить результат в мм.
    Примечание: Чтение размера уплотнения могут руководствоваться при выборе диаметра отверстия для всасывания камеры.

3. всасывание блистер индукции - день 7

  1. Соберите единица всасывания устройства.
    Примечание: Всасывающие устройства единиц являются вакуумных насосов с прилагаемой камер для всасывания блистер индукции. Устройство, используемое в этой демонстрации пользовательские сделал, но устройство всасывания единиц доступны также коммерчески. Насос должен быть регулируемая в диапазоне от -20 до-40 кПа и обеспечить устойчивый и надежный отрицательное давление. Региональные этические утверждения должны быть получены до проведения экспериментов с использованием этого метода.
    1. Во-первых Подготовьте Камера всасывания, монтажные отверстия нижней пластины и окна пластины с палатой и соединительный шланг. Плотно Подсоедините шланг к камере подключение для вакуумного насоса.
      Примечание: Камеры должна включать нижнюю крышку с отверстием для индукции волдыря, которые должны быть пригодны для контакта с человеческой кожей, и Верхняя пластина с окном, позволяя для визуального контроля волдыря.
  2. Определить оптимальный отверстие диаметр диафрагма относительно размера реакции кожи; чем больше размер отверстия, тем больше волдыря.
  3. Лечить диафрагма и кожи добровольцев с помощью алкоголя тампоны.
  4. Прикрепите Камера всасывания к коже.
    1. Убедитесь, что доброволец рука покоится комфортно.
    2. Убедитесь, что отверстие в днище камеры всасывания расположен над PPD реакции, так, что виден центр реакции кожи.
    3. Палата, свободно использовать ремни безопасности: когда применяется отрицательное давление, палата будет придерживаться кожи и сохранить свою позицию.
  5. Включите устройство всасывания и отрегулировать давление-20 кПа.
  6. После 30 мин увеличьте отрицательное давление, кПа-25.
  7. После 60 мин дальнейшего увеличения отрицательное давление в кПа-30.
  8. Держите давление-30 кПа, до тех пор, пока полностью формируется волдырь. Убедитесь, что отрицательное давление в этом протоколе не предусмотрено являются специфическими для настраиваемого инструмента. Это может быть необходимо отрегулировать давление слегка при применении протокола в других настройках.
    Примечание: Фаза индукции блистер колеблется от 60 до 180 мин (1-3 ч) с образованием фактических волдыря, происходящих в течение последних 30 минут, что Blistering часто ассоциируется с зуд ощущение. Пузыри могут возникнуть как одиночные или множественные слияния волдырей. Если разрыв блистерной или кровоизлияние происходит, рекомендуется прекратить всасывание блистер, медленно выпуская давление.
  9. После того, как полностью формируется волдырь, давление и осторожно извлеките Камера всасывания из кожи без разрыва волдыря.
  10. Применять мягкие Туалетная в окрестностях кожи и место жесткий крышкой (например, от 50 мл пластиковые трубки) над волдырь.
  11. Закрепите крышку с неаллергенным хирургическая лента, следуют мягкий эластичный бандаж.
  12. Попросите добровольцев, чтобы избежать чрезмерной физической нагрузки на области волдыря для следующего 12-24 ч.

4. урожай блистер жидкости - день 8

  1. На 8-й день осторожно удалите Защитные повязки и продезинфицируйте блистер с спрей дезинфекции кожи.
  2. Используйте стерильные шприц 2 мл с иглой 23G урожая блистер содержимого. Вставить иглу в верхней/боковой стороне волдыря крыши и медленно аспирационная жидкости. Не прикасайтесь к полу полости, но не забудьте собрать все жидкости.
  3. Примените повязки на свернутой волдыря.
  4. Трансфер блистер жидкости в стерильную пробирку. Обратите внимание на объем.
  5. Спиновые блистер жидкости вниз на 600 x g с помощью настольной центрифуги для 4 мин.
  6. Супернатант передать другой трубки и Ресуспензируйте Пелле клеток в 500 мкл средних клеток.
    Примечание: Клетки теперь готовы для подсчета и дальнейшего анализа. Supernatants может храниться в от -20 до-80 ° C до использования.

5. анализ всасывание блистер клетки и жидкости

Примечание: Инструкции для анализа клеток и жидкости, полученные от всасывания волдыри кожи не является в пределах сферы применения данного протокола. Однако для того, чтобы обеспечить представительный результаты для этого отчета, внутриклеточный пятно потока цитометрии и мультиплекс анализы. Методология вкратце описано ниже.

  1. Проточная цитометрия
    1. Стимулировать суспензий клеток 1 х 105 свежие изолированы от всасывания волдыри от 1 прививки БЦЖ доброволец с 10 мкг/мл ППД и инкубации клеток при 37 ° C и 5% CO2. Включать кератоз ячейки для параллельной инкубации.
    2. Стимулировать суспензий, 1 x 10-6 получения полученные от 1 прививки БЦЖ доброволец с 10 мкг/мл ППД и инкубировать смесь при 37 ° C и 5% CO2. Включать кератоз ячейки для параллельной инкубации.
    3. Через 2 ч лечить все ячейки с Brefaldin и монензином и инкубировать их в течение 6 часов при 37° C.
    4. Пятно клетки с панелью Live/Dead пятно BV510, анти CD4-AF780, анти CD3-BV421, анти CD8-PerCP-Cy5.5, анти CCR7-PE, анти CD45RA-BV786, анти IFN-γ-AF700, анти ФНО α-PE-Cy7 и анти Ил-2-FITC.
    5. Включать FMO элементы управления в панели КСДОР.
    6. Выполнить анализ гранулярных потока с проточный цитометр и анализировать результаты, используя соответствующее программное обеспечение.
    7. Ворота на производство цитокинов CD3 + CD4 + CD8-подмножеств, используя следующие стробирования стратегию: фуфайки - > жизнеспособных CD3 + - > CD4 + CD8 - - > ИФН-γ +, ФНО-α +, или Ил-2 +.
    8. Ворота на эффекторные памяти клеточных популяций с использованием следующих стробирования стратегии: фуфайки - > жизнеспособных CD3 + - > CD4 + CD8 - - > CCR7 - CD45RA-.
    9. Расчет отдельных цитокинов профили с помощью Boolean стробирования.
  2. Cytokine выпуске демонстрации
    1. Для демонстрации цитокина релиз в естественных условиях, использовать мультиплекс анализ для количественного определения уровня Ил-2, ИФН γ, ФНО α, Ил-10 и Ил-13 в талой всасывания блистер жидкости, полученных из 4 добровольцев.
    2. Для демонстрации освобождения цитокинов клетками полученные от всасывания блистера ex vivo, используйте свежие всасывания блистер клетки и получения полученные от 1 доброволец, вакцинированных БЦЖ.
    3. Заразить КСДОР и всасывание блистер клетки с 100 образуя колонии единиц (CFU) Mtb H37Rv и инкубировать их в течение 4 дней.
    4. Используйте мультиплекс анализ для количественного определения уровня Ил-2, ИФН γ, ФНО α, Ил-10 и Ил-13 в всех supernatants культуры.
    5. Измените значения выше пробирного вычисления диапазона до предела верхней вычисления.

Representative Results

Восемь здоровых взрослых добровольцев (средний возраст: 30 лет, диапазон: 26-43 лет) с документально предыдущей вакцинации БЦЖ (медиана времени от вакцинации БЦЖ: 5,5 лет, диапазон: 1-30 лет) были включены. Участники были оспорены intradermally с 2 ту PPD, следуют TST оценки на 3 день. SBs были наведены на 7 день и собирают на 8 день, и все пузыри были подняты с помощью камеры всасывания блистер с отверстием диаметром 10 мм. Семь человек были даны 2 отдельных PPD прививок одновременно в той же руке, следуют 2 параллельных SB индукции (см. Примечание относительно нескольких PPD осаждений ниже шаг 1.4 в протокол). Периферической крови было обращено на 7 день для плазмы и получения изоляции плотность градиентного центрифугирования. Плазме и жидкости supernatants с SBs хранились при-20 ° C. Свежий SB клетки (SBCs) были подсчитаны с помощью nigrosine пятно и микроскопии.

Клинической реакции TST и SBC доходность представлены на рисунке 1. Средний размер TST гнойными составил 10,25 мм (диапазон: 0 - 20 мм) и средний мобильный номер в блистере 50 000 (диапазон: 15 000-210 000 клеток, Количество блистеров: 15). Два из добровольцев было не клинический ответ в любой из 2 TSTs и соответствующий урожайности низкой общей ячейки 15 000 клеток/блистер. Ячейка урожай был связан с средняя клинической реакции TST (Спирмена r = 0.643, p = 0.094).

Figure 1
Рисунок 1 : Всасывание блистер клеток доходность. () Эта группа показывает представитель микроскопии nigrosine окрашенных клеток, изолированных от SBs поднял пост TST 7 дней. (b) Эта группа показывает отношения между среднее уплотнение TST (мм) и урожайность Средняя ячейка (n/blister) в 8 добровольцев, вакцинированных БЦЖ (Количество блистеров = 15). Точки представляют собой отдельные означает измерения. Пожалуйста, обратите внимание, что 2 точки являются перекрывающимися, как 2 добровольцев обеих TST уплотнение 0 мм и клетки доходность 15 000. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Для демонстрации характеристик потока гранулярных SB, одноплатные компьютеры были получены из 43-летнего добровольцев, которые были вакцинированы БЦЖ 30 лет назад и было не известно подверженности Mtb. одноплатные компьютеры были изолированы после индукции одного блистер ( уплотнение: 1,4 мм/100000 SBCs). Рисунок 2 показывает представитель участков внутриклеточных цитокинов окрашивание SBCs против получения.

В этом добровольцев, фракция CD3 + CD4 + CD8-SBCs увеличилась с 67%, в клетках кератоз > 90% при ППД в vitro рестимуляции, в то время как доля CD3 + CD4 + CD8-получения оставалась неизменной (~ 51%, рис. 2). Свыше 92% в vitro PPD-, а также кератоз CD3 + CD4 + CD8-SBC, были эффекторные типа памяти (CCR7 - CD45RA-, данные не показаны). Общая фракциях клеток конкретных CD3 + CD4 + CD8-индуцированных PPD-стимуляции были выше в SBC, по сравнению с получения (33.1 против. 0,2%, кератоз образцы вычитается). В репликацию фракций полифункциональных PPD-специфичные CD3 + CD4 + CD8-клетки были все < 0,05%.

Figure 2
Рисунок 2 : Представитель потока цитометрии участков SBCs по сравнению с Получения. Панели и b показать представителя плотности участков CD8 + и CD4 + населения в () кератоз vs. PPD-стимулирует репликацию и (c) SBCs. панелей b и d медленные участки внутриклеточных цитокинов, пятнать в PPD-стимулирует CD3 + CD4 + CD8-клетки для (b) получения и (d) SBCs. пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть больше версия этой фигуры.

Как и ожидалось, CD3 + CD4 + CD8-одноплатные компьютеры были активированные в естественных условиях, свидетельствует высокая доля клеток, пятнать для upregulated цитокинов (12%), с преобладающим цитокины ФНО α и ИФН γ. Однако, после PPD-стимуляции, цитокинов, делая клетки секретным смещается к Одноместный - или двойной положительное ИФН γ + ФНО α, Ил-2 + (17%) и ИФН γ + ФНО-α + (15%) профиль (рис. 3Б, КСДОР профили из тот же донор включены для сравнения в Рисунок 3a). Профили выражение cytokine для PPD-стимулирует эффекторных памяти CD4 + Т-клеток подмножеств (CD3 + CD4 + CD8-CCR7 - CD45RA-), были сопоставимы с CD3 + CD4 + CD8-населения, представлены на рисунках 2 и 3 (данные не показаны).

Figure 3
Рисунок 3: цитокинового профиля для CD4 + PPD-стимулирует и кератоз SBCs против получения.  Эти панели показывают отдельные профили для производства цитокина () CD3 + CD4 + CD8-получения клеток и (b) CD3 + CD4 + CD8-SBC. Бары представляют дроби антиген специфические цитокинового профиля в клетках кератоз (Белый баров) и после стимуляции в пробирке с PPD (цветные полосы).

Чтобы исследовать SB жидкости как источник информации на цитокина микроокружения на сайте тестирования кожи, уровни цитокина были измерены в жидкости, собранные SBs индуцированных 7 дней пост TST (рисунок 4a). Медианный уровень и ИФН γ, ФНО α, Ил-2 были 339 пг/мл, 19 пг/мл и 1 пг/мл, соответственно (n = 6). Плазмы были вообще очень низкими. Клетки изолированы от SBs производятся высокий уровень провоспалительных цитокинов ex vivo (рис. 4В). Титрование пограничные контроллеры сеансов от 1 доброволец были культивированный на 4 дня в присутствии вирулентные микобактерий туберкулеза ± аутологичной репликацию. ИФН γ уровни были > кратный выше в культурах, содержащих однобайтовой кодировки, независимо от наличия репликацию.

Figure 4
Рисунок 4 : Уровни цитокина в SB жидкости, плазмы, и MTB -инфицированных supernatants культуры. () Эта группа показывает уровни цитокина в жидкости supernatants SB и плазмы от 6 добровольцев, вакцинированных БЦЖ. Бары представляют средний цитокинов уровни; планки погрешностей представляют диапазон. (b) Эта группа показывает уровни цитокина в supernatants 4 параллельных 600 мкл ex vivo 4-дневный культур 1 х 106 репликацию (черные полосы), 1,75 x 105 однобайтовой кодировки (Белый Барс) и 1 x 10-6 получения шипами с 0,5 или 1,75 x 10 5 SBCs (серые полосы) инфицированных Mtb. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Эта рукопись описывает практические процедуры для изучения человеческой иммунной памяти ответы в естественных условиях, кожный антигена напомнить и ячейка урожай с помощью индукции всасывания волдыря. TST была использована в качестве примера внутрикожные антигена осаждения и вакцины БЦЖ отозвания. Наконец пример SB образец характеристика потока гранулярных и мультиплекс цитокина анализа была предоставлена, демонстрируя, что примерно треть SB клетки были антиген специфические полифункциональных Т-клетки памяти фенотипа эффекторные.

Важнейшие шаги настоящего Протокола включают в себя метод внутрикожного введения, всасывания блистер индукции и проколов блистер. Во-первых правильно внутрикожные осаждения требует квалифицированного персонала. Неправильный осаждения может привести к оптимальным результатам. PPD, как правило, хорошо известных и безопасной кожный антигена, но ее состав может варьироваться между производителями, ограничивая сопоставимости13,20. Этот доклад содержит инструкции для один внутрикожного осаждения 2 ту и при необходимости два параллельных осаждения (2 x 2 Вт), которые могут потребовать дополнительных этические утверждения. Однако другие исследования использовали 10 Вт, которые повышают вероятность сильной кожи реакции10,21. Во время этапа индукционная SB малых поэтапное увеличение отрицательного давления уменьшит риск кровотечений и блистер разрыва. Шансы загрязнения с эритроцитов и лейкоцитов из крови, как правило, низкий2. Асептический Пункционным методом предотвращает контаминацию и избегая контакта между прокола иглой и полом кожного волдыря уменьшает примесей мусора или клетки кожи-резидентов. Однако некоторые исследователи предпочитают урожай SB жидкости путем применения скользящего давления в Проколотые блистер10. Это может быть необходимо прокол перегородки внутри блистер. Сама техника SB минимально инвазивной; свернутые SBs исцелить без рубцов и инфекции очень редки. 2 однако, некоторой степени гиперпигментация может произойти и вероятно SB индукции следует избегать людей с историей коллоидных рубцов.

Технические ограничения включают в себя низкий ячейке урожайности и соответственно ограниченные возможности для долгосрочного хранения. Отношения между лейкоцитарной урожайности, клинической реакции TST, блистер размер и эритроцитов загрязнение было подробно описано в других разделах2,10. В БЦЖ напомнить экспериментов представленные здесь (рис. 1) 50 000, подразумевая мелкомасштабных экспериментальных настройки, используя эти клетки, особенно если SBC изучали только15. Средний общая доходность от каждого блистер Однако конкретные населения Т-клеток в образце SB основном превышает то, что находится в пробах КСДОР в относительных и абсолютных клеток. В этом примере представлен на рисунке 2количество тройной позитивных PPD-специфических Т-клеток в образце 100000 клеток SB были более чем 2 x больше, чем число найденных в 1 x 106 получения от тот же донор (данные не показаны). Визуального скоринга TST реакции является наиболее распространенных клинический метод для оценки памяти микобактерий туберкулеза . Следует отметить основной адаптивной иммунологической реакции не пик в то же время как клинические кожи реакции2,21. Не все прививки БЦЖ или Mtb-облучаемых лиц будет развивать сильные TST реакции и стратегии для классификации и обработки проб из номера TST-ответчиков, а также существовавшие ранее микобактериальной сенсибилизация в исследуемой популяции, необходимо рассмотреть до начала пробу напомнить, с помощью этого метода. Кроме того в обоих SB выборки и визуальные скоринга, существует потенциал для теоретической уклоном в лица с ответами сокращение кожи из-за глобального или кожи, связанных с нарушениями иммунитета, как видно, например, ВИЧ инфекции и определенных возрастных групп2, 13,18,20. Кроме того иммунологические повышение TST реакции с повторное тестирование является хорошо известна в20,22. Однако фенотипы SB клеток остаются довольно постоянными при TSTs являются неоднократные10. Это наблюдение поддерживает роль SB вспоминают в продольных исследований сотовых иммунных реакций.

Для Т-клеток иммунологов SB отзыва позволяет урожай высокой долей антиген специфические клетки. Однако сроки SB для отбора проб из PPD-осаждения является критическим, как клеточного состава и цитокина микроокружения меняться с течением времени. В этом протоколе, пузыри были индуцированных 7-дневный пост вызов и изолированных клеток были главным образом эффекторных памяти CD4 + Т-клеток включая высокой доли клеток с одним выражением и ИФН γ, ФНО α, Ил-2. Эти наблюдения согласуются с предыдущих исследований, описывающих, как активация, пролиферации и дифференцировки Т-клеток происходит в PPD-загрунтовать кожи2,15,21. Кинетические исследования SB в PPD-сенсибилизированных лиц предполагают, что очень раннего реагирования кожи является неспецифической; Однако, уже в течение первых дней после PPD-задача, ответ становится доминируют CD4 + Т-клеток (оба Центральной фенотипов памяти памяти и эффекторных были описаны) и, после 3 дней, ответ доминируют высокие доли PPD-конкретных цитокина производства CD4 + Т-клетки2,8,10,15,21. Этот адаптивный цитокинового ответа остается обнаруживаемыми для более чем 2 недели2,8,10,23. 7 день пост TST, по-видимому, наиболее оптимальный момент для коллекции цитокина производства памяти CD4 + Т-клетки2. Однако другие моменты времени, конечно, возможно, соответствующие зависимости от антигена и ответ интерес. Следует отметить, в одном исследовании адаптивный ответ PPD сообщалось до пика немного раньше со снижением секреции провоспалительных цитокинов уже в пост TST 5 дней10.

SB жидкость содержит высокий уровень провоспалительных цитокинов и другие белки, показано, что представитель микроокружения кожи,15,,24. Кинетика исследования показали, что TNF-α и ИФН γ уровнях в SB жидкости пик после 3 дней во время пиковых уровней IL-2 после 7 дней2,10, вероятно, отражая преобладание адаптационного реагирования на этой поздней стадии. Потому что SB клетки были активированные в естественных условиях, они демонстрируют высокий спонтанное цитокина выпуска, а также потенциал для конкретного выпуска после рестимуляции (рис. 3 и 4).

Этот доклад посвящен CD4 + Т-клеточного иммунитета. Как показали на рисунке 2действительно были большинство изолированные Т-клеток CD4 +, в то время как там были почти не CD8 + Т-клеток в всасывание блистер жидкости. Это согласуется с другими SB PPD-напомнить исследований низких пропорциях и уступает мигрирующих количество CD8 + Т-клеток, по сравнению с числом CD4 + T клетки2,8,10,23. Дальнейшее характеристика вклада CD8 + бы предпочтительно; Однако это выходит за рамки настоящего доклада.

T-клетки являются важными для иммунного контроля Mtb; Однако было трудно определить надежный коррелируют защиты, отражено в адаптивной иммунной реакции от крови25,26. Этот блокпост серьезно препятствует развитию новых ТБ вакцин, как в настоящее время нет альтернативы для больших и очень дорогостоящие эффективности испытаний27. ТБ вакцины разработчики определяют иммуногенность вакцины путем оценки малых и временные изменения в популяциях Т-клеток конкретных вакцин в крови28,29. Однако сомнительно, актуальна ли малую часть циркулирующих антиген специфические Т-клеток в крови (т.е., способный переход на сайт инфекции и представитель Т-клеток богатые микроокружения контроллинга МТБ) 27 , 30 , 31 .

Основываясь на предыдущих исследований и данных, представленных в настоящем документе, кожный напомнить модель SB представляет нереализованный потенциал для изучения конкретных вакцин Т-клеток. Не только модель позволяет напомнить вакцины ответ генерируется несколько десятилетий назад, он также позволяет оценки реальной памяти потенциал в ткани-контекст,15,18,19,21. Роман, определенные тесты кожи, которые включают антигены также входят Субблок ТБ вакцин, предложить новые возможности для оценки вакцин, используя эту модель28,32. Кроме того, транскриптомики анализа позволяют предположить, что клетки – опосредованным иммунный ответ генерируется в PPD-вызов коже похож на ответ в МТБ-инфицированных легких18.

В то время как удар биопсия кожи также позволяют на урожай клетки с поверхности кожи и обеспечивают пространственной информации, по сравнению с SB выборки, метод более инвазивных и требует обработки ферментативной или механик подготовить сингл клеточной суспензии33. Измерение cytokines и ячейки маркеры являются сопоставимыми между двумя методами2,10.

Метод всасывания блистер уже применяется во многих областях медицинских исследований помимо дерматологии, отдельно или в сочетании с задачей системного или местные кожи. Примеры включают в себя исследования сепсиса, вирус Эпштейна Барр связанные лимфопролиферативных заболеваний, диабетической невропатии, потребление эффекты глюкокортикоидов и человеческих испытаний, испытания терапевтических антител или модели для Т-клеток целевой терапии10 ,34,,3536,,3738.

С терапевтической точки зрения, метод кожной напомнить SB предлагает уникальные преимущества для изучения Центральной Т-клеточной памяти потенциальных и -от обоих биологических и технической точки зрения кожа кажется представить соответствующие выборки отсек2, 15,18,19,21. В частности по сравнению с традиционной, пассивных проб циркулирующих репликацию, SB кожный напомнить метод позволяет для изучения Т-клеток, которые доказали свою способность мигрировать из лимфатических узлов в ответ на их соответствующих антигена и завершить местных расширение и дифференциации в ткани конкретных в vivo контексте15,18,19,21.

В заключение модель продемонстрировала, здесь может быть актуально для исследователей в области человеческого адаптивного иммунитета и Т-клеток таргетинга агентов (т.е., в вакцинологии или рак исследований инфекционных заболеваний). TST модель применяется в настоящем Протоколе является, конечно же, особое значение в области ТБ вакцинологии. Однако основная концепция этой модели весьма применима в других областях исследований.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Мадс Радмер Jensen за его практическим и научным советом; Лау Линдквист и Кааре Svejstrup для предоставления технических знаний; Helene Bæk Juel, Джонатан Filskov, Сигне т. Шмидт и Solveig W. Harpøth для их технической помощи; сотрудники амбулатории Гентофте ТБ для их обучения в УКП администрации; и всех добровольцев для участия в исследовании. Этот проект финансируется Программой Европейской Комиссии H2020 [номер гранта TBVAC2020 643381], и мы хотели бы поблагодарить партнеров консорциума для плодотворных обсуждений.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gloves for laboratory use Imtex, Denmark 1013
Desinfection spray  Apotek, Denmark 82% alcohol, with glycerin, for human skin 
Alcohol swaps Mediq, Denmark 1131892
PPD RT 23 "SSI" (2 T.U./0.1ml) AJ Vaccines
 Myjector syringe with fixed needle  Terumo A236 1 ml/29G/12mm
Ruler  not relevant  for skin reaction evaluation
Ballpoint pen not relevant  for skin reaction evaluation
Portable Lung Suction Unit Laerdal Medical, Denmark 78000011 NOTE.  Modified for ranges below -40kPa and supplied with pressure gauge  (ref. 1031107) by the Technical Dept. , Hvidovre Hospital
Negative Pressure Chamber Assembly, unheated with connecting tubing Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA
Orifice Plate, 47mm, 10mm Hole Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA
Negative Pressure Instrument Seal Kit Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA
Negative pressure Chamber Strap  Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA 12 inches
Micropore Surgical tape  3M 1533-1 2.5cm x 9.1m
Cap from 15ml plastic tube Sarstedt, Germany 62,547,254
Tubigrip bandage Mölnlycke Health Care, Sweden 1443
Cosmopor steril adhesive dressing Hartmann 9008337 7.2 x 5 cm
2ml Syringe Concentric Luer Slip  Becton Dickinson  300185
Microlance 23G/30mm needle Becton Dickinson 300700
Safe-Lock microcentrifuge tubes (autoclaved) Eppendorf  0030120086 Autoclaved
Minispin plus centrifuge Eppendorf 5453000011
Gibco AIM V Medium Life Technologies 12055-091

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kiistala, U. Suction blister device for separation of viable epidermis from dermis. Journal of Investigative Dermatology. 50 (2), 129-137 (1968).
  2. Akbar, A. N., et al. Investigation of the cutaneous response to recall antigen in humans in vivo. Clinical & Experimental Immunology. 173 (2), 163-172 (2013).
  3. Hatje, L. K., Richter, C., Blume-Peytavi, U., Kottner, J. Blistering time as a parameter for the strength of dermoepidermal adhesion: a systematic review and meta-analysis. British Journal of Dermatology. 172 (2), 323-330 (2015).
  4. Smith, T. J., Wilson, M. A., Young, A. J., Montain, S. J. A suction blister model reliably assesses skin barrier restoration and immune response. Journal of Immunological Methods. 417, 124-130 (2015).
  5. Maranda, E. L., et al. Surgical management of leukoderma after burn: A review. Burns: Journal of the International Society of Burn Injuries. 44 (2), 256-262 (2017).
  6. Wilhelm, K. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. Models of wound healing: an emphasis on clinical studiea. Skin Research and Technology: Official Journal of the International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) and the International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) and the International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).
  7. Maini, A. A., et al. A Comparison of Human Neutrophils Acquired from Four Experimental Models of Inflammation. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
  8. Kenney, R. T., Rangdaeng, S., Scollard, D. M. Skin blister immunocytology. A new method to quantify cellular kinetics in vivo. Journal of Immunological Methods. 97 (1), 101-110 (1987).
  9. Carvalho, J. C. O., Palero, J. A., Jurna, M. Real-time imaging of suction blistering in human skin using optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 6 (12), 4790-4795 (2015).
  10. Belson, A., et al. Characterisation of the clinical and activated T cell response to repeat delayed-type hypersensitivity skin challenges in human subjects, with KLH and PPD, as a potential model to test T cell-targeted therapies. Inflammation Research: Official Journal of the European Histamine Research Society ... [et al.]. 65 (5), 389-404 (2016).
  11. Vukmanovic-Stejic, M., Reed, J. R., Lacy, K. E., Rustin, M. H. A., Akbar, A. N. Mantoux Test as a model for a secondary immune response in humans. Immunology Letters. 107 (2), 93-101 (2006).
  12. Thakur, A., Pedersen, L. E., Jungersen, G. Immune markers and correlates of protection for vaccine induced immune responses. Vaccine. 30 (33), 4907-4920 (2012).
  13. CDC. TB | Fact Sheets - Tuberculin Skin Testing for TB. , https://www.cdc.gov/tb/publications/factsheets/testing/skintesting.htm (2018).
  14. Vukmanovic-Stejic, M., et al. Varicella Zoster-Specific CD4+Foxp3+ T Cells Accumulate after Cutaneous Antigen Challenge in Humans. The Journal of Immunology. 190 (3), 977-986 (2013).
  15. Reed, J. R., et al. Telomere erosion in memory T cells induced by telomerase inhibition at the site of antigenic challenge in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 199 (10), 1433-1443 (2004).
  16. Tatovic, D., Young, P., Kochba, E., Levin, Y., Wong, F. S., Dayan, C. M. Fine-Needle Aspiration Biopsy of the Lymph Node: A Novel Tool for the Monitoring of Immune Responses after Skin Antigen Delivery. The Journal of Immunology. 195 (1), 386-392 (2015).
  17. Bond, E., et al. Plasmacytoid dendritic cells infiltrate the skin in positive tuberculin skin test indurations. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 114-123 (2012).
  18. Bell, L. C. K., et al. In Vivo Molecular Dissection of the Effects of HIV-1 in Active Tuberculosis. PLoS Pathogens. 12 (3), e1005469 (2016).
  19. Tomlinson, G. S., et al. Transcriptional profiling of innate and adaptive human immune responses to mycobacteria in the tuberculin skin test. European Journal of Immunology. 41 (11), 3253-3260 (2011).
  20. Nayak, S., Acharjya, B. Mantoux test and its interpretation. Indian Dermatology Online Journal. 3 (1), 2-6 (2012).
  21. Vukmanovic-Stejic, M., Reed, J. R., Lacy, K. E., Rustin, M. H. A., Akbar, A. N. Mantoux Test as a model for a secondary immune response in humans. Immunology Letters. 107 (2), 93-101 (2006).
  22. Menzies, D. Interpretation of Repeated Tuberculin Tests. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (1), 15-21 (1999).
  23. Pitzalis, C., et al. Selective migration of the human helper-inducer memory T cell subset: confirmation by in vivo cellular kinetic studies. European Journal of Immunology. 21 (2), 369-376 (1991).
  24. Kool, J., et al. Suction blister fluid as potential body fluid for biomarker proteins. Proteomics. 7 (20), 3638-3650 (2007).
  25. Flynn, J. L., Chan, J. Immunology of tuberculosis. Annual Review of Immunology. 19, 93-129 (2001).
  26. Kagina, B. M. N., et al. Specific T cell frequency and cytokine expression profile do not correlate with protection against tuberculosis after bacillus Calmette-Guérin vaccination of newborns. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (8), 1073-1079 (2010).
  27. García-Basteiro, A. L., Ruhwald, M., Lange, C. Design of tuberculosis vaccine trials under financial constraints. Expert Review of Vaccines. 15 (7), 799-801 (2016).
  28. Luabeya, A. K. K., et al. First-in-human trial of the post-exposure tuberculosis vaccine H56:IC31 in Mycobacterium tuberculosis infected and non-infected healthy adults. Vaccine. 33 (33), 4130-4140 (2015).
  29. Tameris, M., et al. The candidate TB vaccine, MVA85A, induces highly durable Th1 responses. PloS One. 9 (2), e87340 (2014).
  30. Woodworth, J. S., et al. Subunit vaccine H56/CAF01 induces a population of circulating CD4 T cells that traffic into the Mycobacterium tuberculosis-infected lung. Mucosal Immunology. 10 (2), 555-564 (2016).
  31. Gideon, H. P., et al. Variability in tuberculosis granuloma T cell responses exists, but a balance of pro- and anti-inflammatory cytokines is associated with sterilization. PLoS Pathogens. 11 (1), e1004603 (2015).
  32. Ruhwald, M., et al. Safety and efficacy of the C-Tb skin test to diagnose Mycobacterium tuberculosis infection, compared with an interferon γ release assay and the tuberculin skin test: a phase 3, double-blind, randomised, controlled trial. The Lancet Respiratory Medicine. 5 (4), 259-268 (2017).
  33. He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. P. N. Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (110), e52564 (2016).
  34. Koskela, M., et al. Blister fluid and serum cytokine levels in severe sepsis in humans reflect skin dysfunction. Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 61 (1), 53-61 (2017).
  35. Wada, T., et al. Characterization of skin blister fluids from children with Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease. The Journal of Dermatology. 45 (4), 444-449 (2018).
  36. Andersson, C., Rajala, T., Särkkä, A. Hierarchical models for epidermal nerve fiber data. Statistics in Medicine. 37 (3), 357-374 (2018).
  37. Ramshanker, N., et al. Effects of Prednisolone on Serum and Tissue Fluid IGF-I Receptor Activation and Post-Receptor Signaling in Humans. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 102 (11), 4031-4040 (2017).
  38. Bouma, G., et al. CCL20 neutralization by a monoclonal antibody in healthy subjects selectively inhibits recruitment of CCR6+ cells in an experimental suction blister. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (9), 1976-1990 (2017).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 138 всасывание блистер иммунологии Напомним проблемы кожи антиген Т-клеток памяти Т-клеток PPD туберкулин кожи тест вакцин ответ в vivo туберкулез
Всасывания блистер протокол для изучения человеческий Т-клеточный вспомнить ответы <em>в естественных условиях</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holm, L. L., Vukmanovic-Stejic, M.,… More

Holm, L. L., Vukmanovic-Stejic, M., Blauenfeldt, T., Benfield, T., Andersen, P., Akbar, A. N., Ruhwald, M. A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo. J. Vis. Exp. (138), e57554, doi:10.3791/57554 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter