Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以生成一个人肝嵌合体小鼠家庭高胆固醇血症使用人诱导的多潜能干细胞源性肝细胞模型。这是一个有价值的模型来测试新的治疗高胆固醇血症。
Abstract
家族性高胆固醇血症 (FH) 主要是由低密度脂蛋白受体 (LDLR) 突变引起的, 由于血液中 ldl 胆固醇 (ldl C) 明显升高, 导致早期心血管疾病的风险增加。他汀类药物是治疗 FH 和其他类型高胆固醇血症的第一行降脂药, 但是新的方法正在出现, 特别是 PCSK9 抗体, 现在正在临床试验中进行测试。为了探索一种新的治疗方法的 FH, 无论是新药或新剂型, 我们需要适当的体内模型。然而, 与人类相比, 脂代谢剖面的差异是可利用的 FH 动物模型的关键问题.为了解决这个问题, 我们用跳频诱导多能干细胞 (iPSC) 衍生的肝细胞 (iHeps) 生成了一种人肝嵌合小鼠模型。我们使用Ldlr-//Rag2///Il2rg (LRG) 小鼠, 以避免对移植的人类细胞免疫排斥, 并评估 Ldlr 缺乏 iHeps 在 Ldlr 空背景下的效果。移植的 FH iHeps 可以在人白蛋白染色的基础上重新填充5-10% 的 LRG 小鼠肝脏。此外, 嫁接 iHeps 反应降脂药物和概括临床观察, 提高疗效的 PCSK9 抗体相比, 他汀。因此, 我们的人肝嵌合体模型可用于新疗法对 FH 的临床前试验。使用相同的协议, 类似的人肝嵌合体小鼠的其他 FH 遗传变异, 或突变相对应的其他遗传性肝病, 也可能产生。
Introduction
低密度脂蛋白受体 (LDLR) 在血液中捕获 ldl 胆固醇 (ldl C) 来调节肝脏中的胆固醇合成。LDLR 基因突变是家族性高胆固醇血症 (FH)1的最常见病因。他汀类药物历来是治疗 FH 和其他类型的高胆固醇血症 (遗传性或后天) 的第一行药。他汀类药物抑制 3-羟基 3-methylglutaryl 辅酶 A 还原酶, 降低胆固醇合成在肝脏2。此外, 他汀类药物增加了肝细胞表面的 LDLR 水平, 促进血浆 LDL-C 清除。然而, 对他汀类药物治疗的一个主要告诫是, 它们同时诱发 proprotein convertase 枯草杆菌/合心 9 (PCSK9) 的表达, 这种酶结合 LDLR 促进其降解3。这一效应是对许多患者所观察到的对他汀类药物的反应不足甚至无效的原因。研究这种机制出人意料地导致发现一种治疗高胆固醇血症的替代方法。FDA 最近批准的 PCSK9 抗体目前正在临床试验中使用, 表现出更高的疗效和耐受性优于他汀类药物4。PCSK9 抗体的成功也意味着可能有其他的治疗可能性来调节 LDLR 降解通路 (除了 PCSK9) 在高胆固醇血症患者。同样, 有兴趣开发新的抑制剂 PCSK9 除抗体以外, 例如, siRNA 寡核苷酸5。
为了测试 FH 和一般其他类型的高胆固醇血症的新疗法, 适当的体内模型是必要的。当前体内模型的一个主要问题, 主要是老鼠6和兔子7, 是他们与人类的生理差异。关键的是, 这些问题包括不同的脂代谢剖面。人类肝脏嵌合动物的生成8可能有助于克服这一警告。人肝嵌合体小鼠是一种 "人性化" 的小鼠, 其肝填充与人肝细胞, 如原发性人肝细胞 (pHH)9。pHH 的一个问题是, 它们不能在体内扩张, 在隔离时迅速失去功能, 而且是有限的来源。替代 pHH 是利用诱导多能干细胞 (iPSC) 衍生肝细胞 (iHeps)10。值得注意的是, iPSCs 是有耐心的, 可以无限期地增长, 所以 iHeps 可以根据需求生产, 这是比新鲜 pHH 的一个显著优势。此外, iPSCs 也可以很容易地基因工程与设计师核酸纠正或引入突变的等基因系背景, 以允许更忠实的比较11。
人肝嵌合体小鼠与嫁接 pHH 显示相似的人在肝脏代谢概况, 药物反应和易感性的肝炎病毒感染12。这使它们成为研究体内高脂血症的良好模型。最广泛使用的鼠标模型是基于 Rag2////// Il2rg-/- (悬浮角速度陀螺仪) 小鼠13和转基因小鼠8, 其中多达95% 的小鼠肝脏可以被 pHH 取代。有趣的是, 最近的一份报告描述了一个人跳肝嵌合小鼠 (基于悬浮角速度陀螺仪) 与 pHH 的患者携带纯合LDLR突变14。在这个模型中, 填充人肝细胞没有功能性 LDLR, 但残留的小鼠肝细胞, 从而减少了在体内检测的药物依赖于 LDLR 途径的效用。
在这里, 我们报告一个详细的协议, 根据我们最近出版的工作15为嫁接 FH iHeps 进入Ldlr-//Rag2//Il2rg-/ (LRG) 小鼠肝脏。这种人肝嵌合体小鼠是有用的模拟 FH 和执行药物测试在体内.
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Protocol
所有涉及使用动物的方法, 均已获香港大学教学及研究使用活動动物委员会 (CULATR) 批准。
1. 鼠标准备和表型测试
-
immunodeficient Ldlr击出 (高) 小鼠的生成。
- 使用小鼠菌株Ldlr, Rag2, 和Il2rg (见材料表)。
- 交叉Rag2鼠与Il2rg/小鼠产生Rag2-// Il2rg/小鼠, 然后交叉Ldlr/-老鼠与Rag2-/-/ Il2rg小鼠生成Ldlr-//Rag2//Il2rg- /(LRG) 小鼠15。3岁到4周, 从耳朵收集基因组 DNA, 通过 PCR 和测序确定基因型。
- 8岁至12周时, 用雄性 LRG 小鼠作为 iHeps 的受体, 生成人肝嵌合小鼠。
- 在 iHep 移植前7天, 用高脂肪高胆固醇 (HFHC) 饮食喂养小鼠, 以帮助他们发展胆固醇过高症。
- 为了诱发肝损伤, 促进肝脏嫁接 iHeps 的增殖, 将小鼠放到一个无菌容器中, 用γ射线照射照射器, 在植入前剂量为 3 24 小时。然后, 把老鼠送回他们的笼子里。这些辐照小鼠的健康状况可以通过测量体重来监测。 20% 的体重减轻或更大的老鼠将被安乐死。
2. iHep 分化和离解
LDLR异型高 (+/) 或纯合高 (-/) 人类 iPSCs, 或 fh 患者 iPSCs 异型突变 LDLR (FH iPSCs ) 用于生产 iHeps。LDLR iPSCs 和 FH iPSCs 的生成是在我们上一份报告15中描述的。
- iPSCs 定向分化为 iHeps
注意: 将人 iPSCs 分化为 iHeps 的方法从上一份报告16中修改。- 在分化之前的三天 (天-3), 种子 iPSCs 到细胞外基质涂敷6井板 (见材料表) 密度30万细胞/井在1.5 毫升 (也以下) 的人类 iPSC 维护介质 (见材料表) 辅以5µM 岩石抑制剂 (Y27632)。培养细胞在37°c 在 5% CO2加湿的孵化器。通常情况下, 从6井板 iHeps, 足以嫁接5只老鼠。
- 24小时后 (天-2) 和 48 h 以后 (天-1), 改变媒介到新鲜的人 iPSC 维护媒介没有岩石抑制剂。
注: iPSCs 前分化应表达高水平的 OCT4 和北美, 这可以通过定量 rt-pcr, 免疫荧光, 或流式细胞仪检查。 - 在0天的分化, 清洗细胞与 RPMI 1640 次, 然后添加 RPMI 1640 补充 100 ng/毫升激活 A 和 25 ng/毫升 WNT3a。
- 在1天和天2的分化, 改变培养基为 RPMI 1640 补充 100 ng/毫升激活 A。
注: 如果在这个阶段有太多的细胞死亡 (天 0–3), 多达0.5% 胎牛血清 (血清) 可以添加到培养基, 以改善细胞活力。然而, 我们建议测试每一个特定的 iPSC 线添加的最小量的血清, 因为过量的血清也会影响分化。 - 在3天, 用 DMEM 冲洗细胞一次, 然后切换到2和阶段培养基 (20% 血清置换, 1x 非必需氨基酸, 2 米谷氨酰胺, 0.1 米β-巯基乙醇, 1% 二甲基亚砜 DMEM 培养基)。每隔一天换一次培养基, 直到10天。
注: 在7天, 细胞应该已经达到汇合和显示清晰的边缘。在这个阶段可能出现一些未分化的地区;如果这些区域的百分比较小, 则忽略它们。如果百分比高, 减少 iPSCs 在0天的汇合, 减少在第一阶段的分化使用的血清量。 - 10天, 用肝细胞基质培养基一次冲洗细胞, 然后改用肝细胞培养培养基, 辅以20毫升的人肝生长因子和 20 oncostatin M 促进 iHep 成熟。每隔一天换一次培养基。
注意: 在这个阶段, 根据免疫荧光染色或流式细胞术, > 90% 的细胞应该是阳性的 HNF4A。 - 在15–17天, 细胞已经准备好植入。可选的, 细胞培养的上清可以收集和储存在-80 摄氏度, 以量化的分泌蛋白 (白长袍) 的 iHeps。
注意: 在这个阶段, > 80% iHeps 应该是积极的 HNF4A, 白长袍, 和α1胰岛素 (), 根据免疫荧光染色。60–70% 周围的 17 iHeps 应该是积极的 ASGPR, 如流式细胞仪显示。在我们的手中, iHeps 在这个时期有最佳的能力来重新填充小鼠肝脏;iHeps 可能分泌较高水平的白长袍体外, 但也成为衰老, 如果植入延迟。
- iHeps 在胰岛素注射器中的分离和加载
- 准备所需的试剂和材料:
- 在植入前24小时, 在冷室的冰盒中解冻所需的量 (V = 40 µL * 小鼠数), 并将胰岛素注射器和200µL 提示盒放入4摄氏度冰箱中。
- 在植入之前一个小时, 温暖细胞离解酵素补充与50µg/毫升 DNase I 到室温和地方 RPMI 1640 中等补充与20% 血清替换在冰。
- iHeps 相对比图像 (100X 和 200X) 记录其状态, 包括细胞形态学、生长和细胞密度。
- 洗 iHeps 与2毫升/井的室温 Ca2 +和镁2 +免费 PBS 两次, 然后添加1毫升的细胞离解酶补充50µg/毫升 DNase 我每个井。把细胞放回孵化器中8–10分钟。
注: 为了改善细胞离解酶, 用 Ca2 +镁2 +免费 PBS 冲洗细胞。为了最大限度地提高细胞的生存能力, 我们建议每次游离每批不超过6口。此外, 我们建议限制细胞离解酶治疗少于10分钟。 - 观察显微镜下的细胞形态学。当大多数细胞变成圆形时, 加入等量的冷 RPMI 1640 补充20% 的血清置换到每一个井, 轻轻地将细胞从盘子中分离出来, 将细胞悬浮液转移到新的15毫升管上。
注意: 这一步对收获细胞的生存能力至关重要。如果细胞很难从盘子中分离出来, 那么, 如果一些细胞被留下来, 就无关紧要了。如果细胞分离成单层的大正方形, 则在离心后轻轻吸管获得单个细胞悬浮。 - 重复步骤2.2.4 为每个井, 直到几乎所有连接的细胞被收集。离心机在 200 x g 3 分钟在4摄氏度。
- 用2毫升的冷 PBS 在15毫升管中取出上清和并用重悬细胞。轻轻地将细胞移去, 获得单细胞悬浮液, 然后将冷 PBS 添加到最终体积为1毫升的离解井数中。最后, 通过40µm 细胞过滤器将细胞移除聚合体。
注: 通常 1-2 x 106细胞/井可以在过滤后收获。 - 整除20µL 细胞悬浮, 并添加20µL 0.4% 台盼蓝溶液, 然后使用自动细胞计数器计数细胞, 并记录细胞悬浮的浓度为 "C"。计算所需的体积 (V1 = [106 * (n + 1)]/C, 其中 n 是嫁接的小鼠数量) 脾注射的细胞悬浮 (100万/小鼠)。
- 整除所需的细胞悬浮量为15毫升管和离心机在 200 x g 3 分钟在4摄氏度。
- 除去上清, 并用重悬适当体积的冷 PBS 细胞, 使细胞悬浮量 (n+1) * 55/2 µL (n = 小鼠数), 然后加入等量的细胞外基质, 使细胞悬浮 (n+1) * 55 µL 的最终体积。
- 将冷胰岛素注射器放在冰上, 拔出活塞, 将55µL 细胞悬浮液转移到注射器中, 然后将活塞向后放。小心排出气泡, 把注射器放回冰上。
- 重复2.3.10 直到所有注射器都装满了细胞。注射器现在已经准备好注射了。
注意: 为了最大限度地提高细胞活力, 我们建议在分离后将细胞放在冰上。对于上述步骤 2.2. 4–2.2. 11, 确保所有试剂在使用前保持在2–8°c。
- 准备所需的试剂和材料:
3. 脾注射液 iHeps
- 麻醉小鼠与氯胺酮 (100 毫克/千克) 和甲苯噻嗪 (10 毫克/千克) 注射腹腔。在小鼠眼上放上兽医软膏, 防止麻醉过程中的干燥, 并监测其肌肉反应, 观察麻醉效果, 评估疼痛。
- 一旦老鼠失去了对刺激的肌肉反射, 把它们放在右侧的侧压位置。将厚层的脱毛膏涂抹在左侧的切口区, 5–8分钟。然后, 去掉脱毛的奶油和头发, 用水湿润的纱布垫擦拭这个区域。
- 用聚维酮碘擦洗左侧面, 或者用70% 乙醇3次, 然后最后浸泡聚维酮碘进行消毒。
- 在2级生物安全柜中, 定位脾脏的位置, 可以透明地在左侧进行可视化, 然后切开皮肤和腹壁0.5–1厘米. Exteriorize 脾通过轻轻地拉出脂肪组织在它附近使用尖钳。用棉签轻轻地稳定脾脏。
- 将胰岛素注射器的针3–4毫米插入脾脏的实质, 轻轻注射大约50µL 细胞悬浮液。收回针, 并放置棉花拭子在注射部位1分钟, 以防止出血和溢出的材料。
- 将脾返腹膜, 用5–0尼龙缝合闭合伤口。然后, 保持小鼠在温暖的房间/孵化器 3–16 h, 以恢复他们的正常体温和恢复他们。经过手术的小鼠在完全康复之前不会返回其他动物的公司。
- 将 meloxicam (26 微克/毫升) 添加到饮用水中, 分别注射丁丙诺啡 (50 微克/千克) 肌肉为消炎药和镇痛剂。每天监测手术伤口, 防止炎症。
注意: 确保步骤4-7 中使用的所有仪器和用品都是无菌的。
4. 血浆低密度脂蛋白 C 水平测试
- 在0、7、14、21和28天后植入, LRG 小鼠紧紧地用双手抑制法将头部侧移最小化, 然后用柳叶刀穿刺面部静脉。清除柳叶刀后血液就会开始流动。收集约50µL 的血液到1.5 毫升的管含有1µL EDTA。
注: 如果抓地力太紧, 收集的血量可能会减少, 老鼠可能因呼吸困难而死亡。 - 通过多次反转管, 然后离心 950 x g 15 分钟, 轻轻地混合血液. 收集上清液并立即将其存储在-80 摄氏度。
- 收集所有样品后, 在室温下解冻等离子, 并根据制造商手册, 使用低密度脂蛋白 c 检测试剂盒测试低密度脂蛋白 c 水平。
5.在体内药物检测中嵌合体小鼠嫁接LDLR +/-跳频 iHeps
- 为诱导高胆固醇血症, 在植入前7天喂养小鼠 HFHC 饮食。
- 在7天后植入, 治疗每组小鼠与车辆 (PBS, 注射皮下), 10 毫克/千克/周 PCSK9 抗体 (临床级配方的 PCSK9 单克隆抗体, 注射过), 10 毫克/千克/日辛伐他汀 (40 毫克/升毫克/毫升在饮用水中), 或联合 PCSK9 抗体和辛伐他汀。
- 收集老鼠血浆在天 0 (植入), 14, 21 和28后植入。立即将样品存放在-80 摄氏度。
- 根据制造商手册, 一旦所有样品都可用, 使用低密度脂蛋白 C 检测试剂盒测试血浆 ldl 水平。
6. 内皮功能测试
在 FH 早期, 内皮功能受到影响, 可以在我们的小鼠模型中进行测试, 以此作为判断病情严重性的指标, 或评估不同治疗方法的改进。stereomicrocope, 解剖钳, 剪刀, 电线 myograph, 购置硬件 (见材料表), 并为此需要一台计算机。
- 用腹腔注射100毫克/千克苯巴比妥来牺牲老鼠。取出内脏, 使与脊柱平行的降主动脉可见, 可以用剪刀与相邻的组织和心脏一起解剖。用细剪刀解剖主动脉, 把它们放在冷氧克雷布斯溶液中 (mM: 119 氯化钠, 4.7 氯化钾, 2.5 CaCl2, 1 氯化镁2, 25 NaHCO3, 1.2, 2 PO4, 11 d-葡萄糖)。
- 将克雷布斯溶液中的主动脉转移到有机硅涂层的培养皿中。固定结缔组织固定主动脉位置, 而不伸展。在显微镜下, 使用细钳弹簧剪刀和解剖的主动脉从周围的脂肪和血管外膜组织没有损害血管壁, 然后将其切割成1.5 至2毫米长度段。
- 切约2厘米长和40微米厚的不锈钢线, 轻轻地把通过主动脉腔。将该段转移到通过 myograph 填充含氧克雷布斯溶液的导线室。
- 在研究收缩力时, 测量主动脉段的长度, 将每个段垂直放置在颚部之间, 并记录读数 (D1) 在千分尺上。移除线段并将颚移到一起并记录读数 (D0)。段的长度为 L = d1-d0。
- 按照用户指南, 夹紧电线, 并确保它与螺丝刀, 同时放置在颌骨之间的部分, 但让它无拉伸。
- 为了在实验前进行规范化, 请将 myograph 设置为零无拉伸位置。然后, 慢慢地将下颚分开, 观察主动脉张力的变化, 直到达到3锰。15分钟后, 从 myograph 室排出溶液, 用新鲜克雷布斯溶液代替, 等待15分钟, 再调整张力为3锰。
- 改变标准的克雷布斯溶液, 以60毫米含氯化钾的克雷布斯溶液, 以诱导收缩至少15分钟, 用新鲜的克雷布斯溶液冲洗3次。
- 增加肾上腺素浓度;例如, 从10毫微米到100微米)。用标准的克雷布斯溶液洗净, 并添加一个单一浓度的70% 的最大收缩从前收缩。当收缩稳定时, 增加乙酰胆碱的浓度 (胆碱;例如, 从1或 3 nM 到10或30µM) 诱发血管舒张。以大约2分钟的间隔添加乙酰胆碱。
注: 在一些主动脉段中, 小剂量引起收缩, 例如小于30% 的氯化钾诱发收缩, U46619 (另一收缩) 浓度从 1 nm 到 30 nm, 可用于诱发稳定收缩, 大于70% 的氯化钾引起的收缩。 - 根据制造商手册清洁 myograph。
- 使用数据分析软件 (见材料表), 记录每添加药物后的力 (F)。绘制标记为基底张力 (F基部) 的相对测量, 移动箭头到最高点后, 作为 f, 然后移动到最低点后, 每增加的乙酰胆碱作为 f.在 Y 轴上计算乙酰胆碱诱导的内皮依赖性血管舒张 (EDV)% 松弛 = (f乙酰胆碱基)/(f)基部。利用 X 轴上 M 上浓度的 log10 值, 编制统计软件的浓度响应曲线。
- 为了分析统计差异, 利用各段曲线下的面积, 用单向方差分析法对各组曲线下区域间的差异进行研究。如果需要, 也可以分析各个点。
7. 小鼠肝脏 iHep 重写的证据
- 在终点, 通过注射腹腔100毫克/千克苯巴比妥来牺牲老鼠。
- 心脏穿刺采集血浆。用眼科剪刀解剖肝叶, 然后将肝脏放入10厘米的围盘中, 用生理盐水冲洗两次。用吸水纸从肝脏表面去除盐水, 然后将裂片切成0.6 厘米长的片状。将肝脏的裂片固定在10% 福尔马林中。
- 根据制造商的指示, 将固定肝脏嵌入石蜡切片和切片, 分别使用组织处理系统和滑动切片。
- 将滑块加热到60摄氏度, 1 小时即可熔化蜡。然后, 在二甲苯中浸泡5分钟两次, 并连续水化100%、90%、70% 乙醇的组织。
- 将滑块浸入包含大约50毫升抗原检索溶液的滑动腔内, 然后将腔室放入压力锅中, 120 °c 1.5 分钟. 用管道水轻轻地冲洗幻灯片5分钟。
- 用主要抗体 (大约100µL/节) 染色人体白蛋白 (hALB) 和人细胞核抗原 (海航) 的部分。然后, 与荧光标签或辣根过氧化物酶 (这与民建联检测试剂盒反应) 的次生抗体染色。
- 要计算 hALB + 区域和海航 + 单元格的百分比, 请扫描带有反 hALB 和反海航的幻灯片, 并使用自动滑动扫描系统对其进行反应, 以获得整个剖面图像。
注: 全断面扫描图像有助于以无偏的方式计算填充效率, 其方法是基于免疫组化染色肝脏中的 hALB + 面积或海航 + 细胞。作为一种替代的方法来监测 iHep 重写效率, 血浆人白蛋白水平可以通过一个人的具体的长袍 ELISA 试剂盒测试。 - 在5X 视图下使用相关的数字幻灯片查看软件, 拍摄快照图像以覆盖整个幻灯片。要量化 hALB + 区域的百分比, 对于每个快照图像, 使用显微镜成像软件来限定图像的正面积 (P) 和总面积 (T), 并使用图像 J 来限定空白区域 (B)。hALB + 面积的百分比表示为 P/(T B) * 100%。对于每组, 至少应选择3只老鼠。对于每只老鼠, 至少有4节来自不同部位的肝脏应该被选择。
- 为了量化海航 + 单元格的百分比, 对于每个快照图像, 随机选择1/16 的区域与图像处理软件, 然后手动计算总核 (T) 和海航 + 核 (N) 的数量。海航 + 的百分比表示为 N/吨 * 100%。对于每组, 至少应选择3只老鼠。对于每只老鼠, 应选择至少4节从肝脏的不同位置。
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Representative Results
人 iPSCs 定向分化为 iHeps
当达到70% 汇合, 人类 iPSCs 被区分成 iHeps 与3步协议16 (图 1上部板)。经过3天的内胚层分化, iPSC 殖民地变得松动和蔓延到完全汇合 (图 1下板)。然后, 用 2级培养基, hepatoblasts 出现并增殖。这些细胞是拥挤的, 但在这个阶段显示清晰的边缘 (7 天,图 1下面板)。经过17天的分化, 极化 iHeps 与典型的六边形形态出现 (图 1下板)。这些 iHeps 表达 pHH 标记, 包括本学和白长袍 (图 2A)。此外, ASGPR + iHeps 的比例应该是相对较高的, 用流式细胞仪 (图 2B)15来测量。
跳频 iHeps 在体内疾病模型中的生成
为了帮助 LRG 小鼠发展高胆固醇血症, 我们在植入前7天 HFHC 饮食喂养他们 (7 天)。在植入日 (0 天), LRG 小鼠显示大约3倍血浆 LDL C 水平 (大约600毫克/dL,图 3B)。日 15–17 iHeps 通过脾注射液嫁接成 LRG 小鼠;这些 iHeps 很快就驻留在肝脏实质中, 并在那里增殖 (图 3A)。在终点, 这些嵌合体小鼠的肝脏被收集和固定, 然后染色与 hALB 和海航, 这两个应显示明确证明 iHep 介导肝重写在 LRG 小鼠肝脏染色 hALB 和海航 (图 4A-E)。在我们的手, LDLR +/-和 FH iHeps 可以减少血浆 LDL C 水平显着21天后植入 (图 4F)。此时, fh 人肝嵌合小鼠可以用来测试 fh 的治疗方法。
利用药物对跳频人肝嵌合体小鼠模型的验证
为了验证我们的模型, 我们使用了2众所周知的低密度脂蛋白 C 降低药物, 辛伐他汀和 PCSK9 抗体 (图 5A)。我们的数据表明, 治疗后21天, PCSK9 抗体有较强的低密度脂蛋白降低和 EDV 的能力比辛伐他汀嵌合体小鼠 (图 5B-D)。值得注意的是, 在跳频嵌合体小鼠血浆低密度脂蛋白 C 与 PCSK9 抗体的减少率类似于临床试验中报告的4。这些结果表明, LRG 嵌合体小鼠嫁接与 fh iHeps 的潜在效用, 为新的跳频药物的前期试验。
图 1: 将人类 iPSCs 定向分化为 iHeps. 顶部面板, iPSC 分化为 iHeps 的时间线;每个阶段都显示关键的细胞因子和培养基.(下板)iHep 分化不同时间点的代表性相对比图像。KSR: 剔除血清置换术;HCM: 肝细胞培养培养基;肝细胞生长因子;OSM: oncostatin m . 请点击这里查看这个数字的大版本.
图 2: 改进的分化协议产生的 iHeps 的表征.(A) iHeps 在不同分化阶段的免疫荧光。细胞核在被合并的组合物中以蓝色染色。(B) 条形图显示17天获得的 ASGPR + iHeps 的百分比, 由流式细胞仪测量。在3项独立实验中测量样品;显示平均值, 误差线表示标准偏差 (SD)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: iHeps 的体内疾病模型中的 FH 的生成.(A) 通过脾注射 FH iHeps 成 LRG 小鼠, 生成人肝嵌合小鼠的时间线。(B) 条形图显示, 喂养 LRG 小鼠 HFHC 饮食导致低密度脂蛋白 C 水平 (n = 10) 显著增加。P值在图上标明, 并使用非配对 t 检验得到;显示平均值, 误差条表示平均值的标准误差 (SEM)。小组 B 是从我们上一份报告15的图 3I中修改的.请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: iHep 介导的 LRG 小鼠肝脏重写.(A) 具有代表性的全断面-扫描图像的 hALB 染色在小鼠肝脏填充与LDLR iHeps。箭头表示人 iHeps 嫁接到小鼠肝脏的簇;缩放的部分显示在右面板中。(B) 散点图显示了填充 hALB + 对应于小鼠肝脏中 iHep 区域的百分比 (来自不同的捐献者 iPSCs), 计算是基于全断面扫描图像 (n = 19)。显示平均值, 误差线表示 SD. (C) 嫁接 FH iHeps 的小鼠肝脏中的海航免疫组化染色的代表性图像。(D) 条形图显示填充海航 + iHeps (来自不同捐献者 iPSCs) 在 LRG 小鼠肝脏中的百分比 (n = 3)。显示平均值, 误差线指示 SD. (E) hALB 和海航染色两个连续切片的小鼠肝填充与野生型 iHeps。(F) 条形图显示了植入后21天血浆低密度脂蛋白 C 降低的百分比;n = 5 为LDLR +/-iHeps 和 n = 6 为 FH iHeps 和车。P值在图上标明, 并使用非配对 t 检验得到;平均值显示误差线表示 SEM. 面板 B、D 和 E 从我们上一份报告15中的图 3G-3I修改.请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: PCSK9 抗体在人肝嵌合体 LRG 小鼠中表现出比辛伐他汀降低能力强。(A) 使用 FH 人肝嵌合体小鼠体内药物检测方法的示意图。(B和C) 血浆低密度脂蛋白 C 的百分比变化从基线在 14, 21 和28天, 在跳频嵌合体小鼠喂养与 HFHC 饮食和治疗的指示药物;n 表示老鼠的数量。P值是通过克鲁斯卡尔-沃利斯试验获得的;显示平均值, 误差线表示 SEM. (D) EDV 对乙酰胆碱浓度的增加作出反应。P值在图形上表示为浓度。用 Dunnett 多比较法调整双因素方差分析, 得到P值;误差线表示 SEM.图 5是从图 4A-4C和图 5A修改了我们以前的报告15.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
以前在啮齿目动物中使用 iHeps 的研究证实, 它们是研究遗传性肝病17的有效方法。为了进一步扩大这种技术的使用, 因为目前的 fh 动物模型是不优的, 我们嫁接 fh iHeps 成 LRG 小鼠, 并表明嫁接LDLR +/或异型LDLR突变的 FH iHeps 可以减少小鼠血浆 LDL C 水平并对体内降脂药物作出反应。
我们的协议中有3个关键步骤使用 iHeps 生成人跳肝嵌合体小鼠:
1) 通过定向分化生产优质 iHeps。鉴于 iPSC18线之间的无性系变异, 在执行工程和植入之前, 使用等基因系 iPSCs 进行适当的比较, 并测试母细胞系的 iHep 分化效率是很重要的。
2) 正确的 iHep 上传到注射器。不同于其他协议, 我们使用50% 细胞外基质 (最终浓度, v/v) 并用重悬 iHeps, 然后上传到胰岛素注射器。我们相信细胞外基质能保护神经细胞, 并提供一种微环境, 促进 iHep 从脾脏迁移到肝脏。气泡是外科手术的致命因素, 应该在注射器中完全避免。
3) 正确的嫁接细胞数。细胞超载也会导致致死率的高。我们建议嫁接1–1.5 百万 iHeps 每 25–30 g 鼠标。
我们的协议也有一定的局限性: 辐射诱发的肝损伤是中度和单剂量的, iHeps 的成熟状态与 pHH 不相媲美。与这两个因素有关, 我们模型的嵌合体程度类似于最近的报告, 描述NOD/Lt-SCID/IL-2Rγ−/− 小鼠或大鼠嫁接与 iPSC 衍生 iHeps17,19, 但明显低于悬浮角速度陀螺仪或嫁接与 pHH 的转基因小鼠。为了克服这一告诫, 一方面, 可以进一步优化肝脏分化协议, 以改善 iHeps 的成熟度。另一方面, LRG 小鼠可以与悬浮角速度陀螺仪小鼠交叉, 以产生 Ldlr/////// Rag2/Il2rg/ 鼠。
总之, 这里我们描述了一个详细的协议, 以生成人肝嵌合体动物与 FH iHeps, 并测试功能的嫁接 iHeps。重要的是, 这些嵌合体的小鼠可用于体内药物检测。我们的模型可能通过改进 iHeps 的功能或在接受者 LRG 小鼠中敲出额外的基因 ( 例如, 发) 来优化, 并且对疾病的病理机制进行研究并进行临床前研究。
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Disclosures
折合是由赛诺菲和 Regeneron 制药赞助的奥德赛结果研究的国家协调员和调查员。
Acknowledgments
这项工作得到了深圳市科技委员会基础研究计划 (JCYJ20150331142757383)、中国科学院战略优先研究计划 (XDA16030502)、香港研究资助局主题研究项目的支持。计划 (T12-705/11)、香港特别行政区研究资助局和中国国家自然科学基金 (N-HKU730/12 及 81261160506) 合作计划, 广东自然科学研究小组项目基金会 (2014A030312001), 广州科技项目 (201607010086), 广东省科技项目 (2016B030229007 和 2017B050506007)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 40 µm Cell strainer | BD | B4-VW-352340 | |
| 6-Well plate | Thermofisher | 140675 | Extracellular matrix coated |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | Dissolve in water |
| Antigen retrieval solution | IHC World | IW-1100-1L | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C8106 | CaCl2 |
| Cell dissociation enzyme | Thermofisher | 12604-013 | TrypLE |
| D-glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D5879 | DMSO |
| DMEM | Thermofisher | 10829 | Knockout DMEM |
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| EDTA | USB | 15694 | 0.5 M, PH=8.0 |
| Extracellular matrix (for cell suspension) | Corning | 354234 | Matrigel |
| Extracellular matrix (for iHep differentiation) | Corning | 354230 | Matrigel |
| Hepatocyte basal medium | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte culture medium | Lonza | CC-3198 | |
| High-fat and high-cholesterol diet | Research Diet | D12079B | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human hepatocyte growth factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human iPSC maintenance medium | STEMCELL Technologies | 5850 | mTeSR1 |
| Human oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Ketamine 10% | Alfasan | N/A | |
| L-glutamine | Thermofisher | 35050 | |
| LDL-C detection kit | WAKO | 993-00404 and 993-00504 | |
| Magnesium chloride | VWR | P25108 | MgCl2 |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | NADA 141-213 | |
| Monopotassium phosphate | USB | S20227 | KH2PO4 |
| Non-essential amino acids | Thermofisher | 11140 | |
| PBS | GE | SH30256.02 | Calcium and magnesium-free |
| PCSK9 antibodies | Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals | SAR236553/REGN727 | Alirocumab |
| Phenobarbital | Alfamedic company | 013003 | |
| Phenylephrine | RBI | P-133 | Dissolve in water |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | KCl |
| Povidone-iodine | Mundipharma | Betadine | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Sigma Aldrich | Y0503-5MG | |
| RPMI 1640 | Thermofisher | 21875 | |
| Serum replacement | Thermofisher | 10828 | |
| Silicone coated petri dish | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme | ZOCOR | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | NaCl |
| Trypan blue solution 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| U-46619 | Cayman | 16450 | Dissolve in DMSO |
| Xylazine 2% | Alfasan | N/A | |
| β-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| AAT | DAKO | A0012 | 1:400 |
| ALB | Bethyl Laboratories | A80-129 | 1:200 |
| ASGPR | Santa Cruz | Sc-28977 | 1:100 |
| HNF4A | Santa Cruz | Sc-6557 | 1:35 |
| NANOG | Stemgent | 09-0020 | 1:200 |
| OCT4 | Stemgent | 09-0023 | 1:200 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Il2rg-/- | Jacson lab | 003174 | |
| Ldlr-/- | Jacson lab | 002077 | |
| Rag2-/- | Jacson lab | 008449 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess | |
| Gamma irradiator | MDS Nordion | Gammacell 3000 Elan II | |
| Insulin syringe | BD | 324911 | |
| Powerlab | ADInstruments | Model 8/30 | |
| Slides scanning system | Leica biosystems | Aperio scanScope system | |
| Sliding Microtome | Leica biosystems | RM2125RT | |
| Stereomicrocope | Nikon | SMZ800 | |
| Tissue processing system | Leica biosystems | ASP200S | |
| Wire myograph | DMT | 610M | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Digital slide viewing software | Leica | Aperio ImageScope Version 12.3.2 | |
| Image J | NIH | Version 1.51e | |
| Image processing software | Adobe | Photoshop CC Version 2015 | |
| Microscope imaging software | Carl Zeiss | AxioVision LE Version 4.7 |
References
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