Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um modelo de rato quimérico fígado humano de hipercolesterolemia familiar, usando hepatócitos de células-tronco derivadas de humanas pluripotentes induzidas. Este é um modelo valioso para testar novas terapias para hipercolesterolemia.
Abstract
Hipercolesterolemia familiar (FH) é principalmente causada por mutações do receptor (LDLR) de lipoproteína de baixa densidade e resulta em um aumento do risco de doença cardiovascular precoce devido à marcada elevação de LDL colesterol (LDL-C) no sangue. As estatinas são a primeira linha de drogas hipolipemiantes para tratamento de FH e outros tipos de hipercolesterolemia, mas estão surgindo novas abordagens, em particular PCSK9 anticorpos, que agora estão sendo testados em ensaios clínicos. Para explorar novas abordagens terapêuticas para FH, novas drogas ou novas formulações, nós precisamos apropriado na vivo de modelos. No entanto, diferenças nos perfis metabólicos lipídios em comparação com os seres humanos são dos principais problemas dos modelos animais disponíveis de FH. Para resolver esse problema, geraram um modelo de rato quimérico fígado humano usando células-tronco pluripotentes FH induzida (iPSC)-derivado de hepatócitos (iHeps). Utilizamos camundongos/Ldlr- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG) para evitar rejeição imune de células humanas transplantadas e avaliar o efeito do LDLR-iHeps deficientes em um LDLR nulo de plano de fundo. Transplantado FH iHeps poderíamos repovoar a 5-10% do fígado do rato LRG baseado na coloração de albumina humana. Além disso, o iHeps engrafted respondeu às drogas hipolipemiantes e recapitulada observações clínicas de maior eficácia de anticorpos PCSK9 comparado com estatinas. Nosso modelo de fígado humano quimérico, portanto, poderia ser útil para testes pré-clínicos de novas terapias para FH. Usando o mesmo protocolo, semelhantes humanos fígados quiméricoes ratos para outras variantes genéticas de FH, ou mutações correspondente a outras doenças hereditárias do fígado, também pode ser gerado.
Introduction
Receptor da lipoproteína de baixa densidade (LDLR) capta o colesterol LDL (LDL-C) no sangue de modular a síntese de colesterol no fígado. Mutações no gene LDLR são a causa mais frequente de hipercolesterolemia familiar (FH)1. As estatinas têm sido, tradicionalmente, a primeira linha de medicação para tratar a FH e outros tipos de hipercolesterolemia (herdada ou adquirida). As estatinas inibem a 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A redutase para reduzir a síntese de colesterol no fígado2. Além disso, as estatinas aumentam os níveis de LDLR na superfície do hepatócito para promover plasma apuramento de LDL-C. No entanto, uma ressalva importante do tratamento com estatinas é que simultaneamente induzem a expressão de proprotein convertase subtilisina/hexin 9 (PCSK9), uma enzima que se liga ao LDLR para promover sua degradação3. Este efeito é responsável para a resposta insuficiente ou mesmo nula de estatinas observadas em muitos pacientes. Estudar este mecanismo, inesperadamente, levou à descoberta de uma forma alternativa para tratar a hipercolesterolemia. Anticorpos PCSK9 recentemente aprovados pela FDA estão sendo usados atualmente em ensaios clínicos e mostram maior eficácia e melhor tolerância do que as estatinas4. O sucesso de anticorpos PCSK9 implica também que pode haver outras possibilidades terapêuticas para modular a via de degradação de LDLR (além de PCSK9) em pacientes com hipercolesterolemia. Da mesma forma, não há interesse em desenvolver novos inibidores de PCSK9 diferente de anticorpos, por exemplo, siRNA oligos5.
Para testar novas terapias para FH e em geral qualquer outro tipo de hipercolesterolemia, modelos apropriados na vivo são necessários. Um grande problema do atual na vivo modelos, principalmente de ratos6 e7, de coelhos são suas diferenças fisiológicas com seres humanos. Crucialmente, esses problemas incluem um perfil metabólico diferente de lipídios. A geração de animais quimérico fígado humano8 pode ajudar a superar esta ressalva. O mouse quimérico fígado humano é um tipo de mouse "humanizado", com seu fígado repovoado com hepatócitos humanos, por exemplo, de hepatócitos humanos primários (pHH)9. Um problema com poeira é que não podem ser expandidos ex vivo, rapidamente perdem sua função após o isolamento, e são uma fonte limitada. Uma alternativa a poeira é o uso de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC)-derivado de hepatócitos (iHeps)10. Nomeadamente, iPSCs são específicas do paciente e podem ser cultivadas indefinidamente, então iHeps podem ser produzidos sob demanda, que é uma vantagem significativa sobre pHH fresco. Além disso, iPSCs pode também ser facilmente alterado geneticamente com nucleases desenhador para corrigir ou introduzir mutações em um plano isogénicas para permitir mais fiel comparações11.
Humano rato quimérico fígado com poeira engrafted mostrar semelhanças aos seres humanos no fígado perfis metabólicos, respostas de droga e susceptibilidade à hepatite vírus infecção12. Isso os torna um bom modelo para estudar hiperlipidemia na vivo. Os modelos do rato mais utilizados baseiam-se o rato/Fah- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (FRG)13 e a uPA rato transgénico8, em que até 95% do mouse o fígado pode ser substituído por poeira. Curiosamente, um relatório recente descreveu um humano FH fígado quimérico mouse (baseado no mouse FRG) com poeira de um paciente carregando um homozigoto para a mutação LDLR 14. Neste modelo, os hepatócitos humanos repovoados não tinham nenhum LDLR funcional, mas os hepatócitos de rato residual, reduzindo assim o utilitário para a realização na vivo testes de drogas que depender da via LDLR.
Aqui, nós relatamos um protocolo detalhado, baseado em nosso trabalho recentemente publicado15 para engrafting FH iHeps no fígado do rato/Ldlr- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG). Este rato quimérico fígado humano é útil para a modelagem de FH e realizando testes de droga in vivo.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui que envolvem a utilização de animais foram aprovados pelo Comité sobre o uso de animais vivos no ensino e pesquisa (CULATR) da Universidade de Hong Kong.
1. preparação e testes fenotípicos de rato
-
Geração de ratos de nocaute (KO) Ldlr imunodeficientes.
- Use os ratos cepas Ldlr- / -, Rag2- / -e Il2rg- / - (ver Tabela de materiais).
- Cruz Rag2- / - ratos com Il2rg- / - ratos para gerar Rag2- / -/ Il2rg- / - ratos, então cruzar Ldlr- / - ratos com Rag2- / - / Il2rg- / - ratos para gerar de camundongos/Ldlr- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG)15. Com a idade de 3 a 4 semanas, colete DNA genômico de orelha para determinar o genótipo por PCR e sequenciamento.
- Com a idade de 8 a 12 semanas, use camundongos machos LRG como destinatários para iHeps para gerar ratos quiméricoes fígados humanos.
- Alimente os ratos com uma dieta de alto teor de gordura e colesterol (HFHC) 7 dias antes do transplante iHep para ajudá-los a desenvolver a hipercolesterolemia.
- Para induzir a lesão hepática, o que facilita a proliferação de engrafted iHeps no fígado, coloque o rato em um recipiente estéril e irradiá-los usando um irradiador gama com raios-γ na dose de 3 Gy 24 h antes da enxertia. Em seguida, retorne os ratos para suas gaiolas de habitação. O status Íntegro destes ratos irradiados podem ser monitorado pela medição do seu peso. Vão ser sacrificados, ratos com perda de peso de 20% ou mais.
2. iHep diferenciação e dissociação
LDLR KO heterozigoto (+ /-) ou homozigotos iPSCs humana de KO (- / -) ou paciente FH-iPSCs com mutações heterozigotas LDLR (FH iPSCs) são usados para produzir iHeps. A geração de LDLR + ou- / - iPSCs e iPSCs FH é descrito no nosso anterior relatório15.
- Diferenciação dirigida de iPSCs em iHeps
Nota: O método para diferenciação de iPSCs humana em iHeps é modificado de uma anterior relatório16.- Três dias antes da diferenciação (dia -3), sementes de iPSCs sobre matriz extracelular revestido placas 6-bem (ver Tabela de materiais) com uma densidade de 300.000 células/poço em 1,5 mL (também adiante) do meio de manutenção de iPSC humana (veja tabela de materiais ) suplementado com inibidor ROCK 5 µM (Y27632). Cultura de células a 37 ° C numa incubadora umidificado 5% CO2 . Normalmente, o iHeps de uma placa de 6 são suficientes para engraft 5 ratos.
- 24 horas depois (dia -2) e 48 h depois (dia -1), mudar o meio a meio de manutenção de iPSC humano fresco sem inibidor ROCK.
Nota: iPSCs antes de diferenciação deve expressar altos níveis de OCT4 e NANOG, que pode ser examinada por RT-PCR quantitativo, imunofluorescência ou citometria de fluxo. - No dia 0 de diferenciação, lave as células com RPMI 1640 uma vez e adicione RPMI 1640 suplementado com Activin A de 100 ng/mL e 25 ng/mL WNT3a.
- No dia 1 e dia 2 de diferenciação, mudar o meio para RPMI 1640 suplementado com 100 ng/mL Activin A.
Nota: Se há muita morte celular nesta fase (dias 0-3), até 0,5% de soro fetal bovino (FBS) pode ser adicionado ao meio para melhorar a viabilidade celular. No entanto, recomendamos que teste a quantidade mínima de FBS a ser adicionado para cada linha de iPSC específicas, como FBS em excesso também pode afetar a diferenciação. - No dia 3, lavar as células com DMEM uma vez e então mudar para 2 médias de palcond (substituição de 20% de soro, 1 x não aminoácidos essenciais, 2 M L-glutamina, 0,1 M beta-Mercaptoetanol e dimetilsulfóxido 1% em meio DMEM). Altere o meio de todos os outros dias até o dia 10.
Nota: No dia 7, as células devem chegaram a confluência e exibir bordas claras. Pode haver algumas áreas indiferenciadas que aparecem nesta fase; ignoro se a percentagem dessas áreas é pequena. Se a porcentagem é alta, reduzir a confluência de iPSCs no dia 0 e reduzir a quantidade de FBS usado no primeiro estágio de diferenciação. - No dia 10, lave as células com o meio basal de hepatócitos uma vez e alterne para o hepatócito cultura suplementado com 20 ng/mL hepática fator de crescimento humano e 20 ng/mL oncostatin M para promover maturação iHep. Altere o meio de todos os outros dias.
Nota: na presente fase, > 90% das células deve ser positivo para HNF4A, de acordo com citometria de fluxo ou coloração de imunofluorescência. - Dia 15 – 17, as células estão prontas para enxertia. Opcionalmente, o sobrenadante da cultura de pilha pode ser coletado e armazenado a-80 ° C para quantificar a secretado albumina (ALB) por iHeps.
Nota: na presente fase, > 80% iHeps deve ser positivo para HNF4A, ALB e α1-antitripsina (AAT), de acordo com a mancha da imunofluorescência. Cerca 60 – 70% do dia 17 iHeps deve ser positivo para ASGPR, como mostrado por citometria de fluxo. Em nossas mãos, iHeps neste período tem capacidade ideal para repovoar o fígado de rato; iHeps pode secretam níveis mais elevados de ALB in vitro, mas também tornam-se senescentes se a enxertia é adiada.
- Dissociação e carregamento de iHeps em uma seringa de insulina
- Prepare os reagentes necessários e materiais:
- 24 h antes da enxertia, descongele a quantidade necessária (V = 40 µ l * número de ratos) da matriz extracelular em um gelo em uma sala fria da caixa e coloque a seringa de insulina e uma caixa de 200 Dicas µ l em um frigorífico de 4 ° C.
- Uma hora antes da enxertia, quente a enzima de dissociação celular suplementado com 50 µ g/mL DNase à temperatura ambiente e coloque o meio RPMI 1640 suplementado com substituição de soro 20% no gelo.
- Leve imagens de contraste de fase (100 X e 200x) de iHeps para registrar seus status, incluindo morfologia celular, crescimento e densidade de células.
- Lavar iHeps com 2ml/bem de temperatura Ca2 + e Mg2 +-livre PBS duas vezes e em seguida, adicione 1 mL de enzima de dissociação celular suplementado com 50 µ g/mL DNase cada poço. Colocar as células de volta em incubadora para 8 – 10 min.
Nota: Para melhorar a dissociação celular com enzima de dissociação de célula, lave as células com Ca2 + e Mg2 +-livre de PBS. Para maximizar a viabilidade celular, sugerimos dissociando não mais do que 6 poços por lote de cada vez. Além disso, sugerimos que restringir o tratamento de enzima de dissociação de célula para menos de 10 minutos. - Morfologia da célula monitor sob o microscópio. Quando a maioria das células se tornam redonda, adicionar um volume igual de frio RPMI 1640, suplementado com substituição de 20% de soro para cada poço, pipetar as células suavemente para desanexar da placa e a suspensão de células de transferência para um novo tubo de 15 mL.
Nota: Este passo é essencial para a viabilidade das células colhidas. Se as células são difíceis de separar da placa, não importa se algumas células estão sobrando. Se as células desanexar como grandes praças de monocamada, depois Pipete suavemente após a centrifugação para obter uma suspensão de célula única. - Repita a etapa 2.2.4 para cada bem até quase todo ligado as células são coletadas. Centrifugar a 200 x g por 3 min a 4 ° C.
- Remover o sobrenadante e ressuspender as células com 2 mL de PBS frio em um tubo de 15 mL. Pipetar as células delicadamente para obter uma suspensão de célula única e em seguida, adicione o PBS fria até um volume final de 1 mL * número de poços dissociados. Finalmente, passe as células através de um filtro de célula 40 µm para remover agregados.
Nota: Normalmente 1-2 x 106 células/poço podem ser colhidas após a filtragem. - Alíquota 20 µ l de suspensão de células e adicionar 20 µ l de solução de azul de Tripan 0,4%, depois contar as células usando um contador de célula automatizada e gravar a concentração da suspensão de células como "C". Calcular o volume necessário (V1 = [106 * (n + 1)] / C, onde n é o número de ratos a ser incorporada) de suspensão de células (1 milhão/mouse) para injeção intrasplenic.
- Alíquota o volume necessário de suspensão de células em tubos de 15 mL e centrifugar 200 x g por 3 min a 4 ° C.
- Remover o sobrenadante, Ressuspender as células no volume apropriado de PBS frio tornar-se o volume da suspensão de células (n + 1) * 55/2 µ l (n = número de ratos) e em seguida, adicione igual volume de matriz extracelular, tornar-se o volume final da suspensão de células (n + 1) * 55 µ l.
- Coloque a seringa de insulina de frio no gelo, desligue o pistão, transferência de 55 µ l de suspensão de células para a seringa e depois colocar o pistão de volta. Bolhas de descarga com cuidado e coloque a seringa no gelo.
- Repita 2.3.10 até que todas as seringas tenham sido carregadas com as células. As seringas estão agora prontas para injeção.
Nota: Para maximizar a viabilidade celular, recomendamos manter as células no gelo depois de dissociação. Para o 2.2.4–2.2.11 de etapas acima, certifique-se de todos os reagentes são mantidos a 2 – 8 ° C antes do uso.
- Prepare os reagentes necessários e materiais:
3. intrasplenic injeção de iHeps
- Anestesia os ratos com cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10mg/kg) injectados intraperitonealmente. Coloque o vet pomada nos olhos de ratos para evitar o ressecamento durante o procedimento de anestesia e monitorar seus reflexos musculares para observar o efeito da anestesia e avaliar a dor.
- Uma vez que os ratos perderam reflexo muscular à estimulação, colocá-los em posição de decúbito lateral direito. Aplica uma camada espessa de creme depilatório para a área de incisão no flanco esquerdo por 5-8 min. Em seguida, retire o creme depilatório e cabelo limpando a área com uma gaze embebida em água.
- Esfregue o flanco esquerdo com iodo-povidona ou, alternativamente, com etanol a 70% 3 vezes seguido por um final de imersão com iodo-povidona para desinfecção.
- Em uma armário biossegurança de nível 2, localizar a posição do baço, que pode ser visualizado de forma transparente no flanco esquerdo e então faça uma incisão da pele e a parede abdominal para 0,5-1 cm. Exteriorize o baço puxando o tecido adiposo suavemente perto usando bicudo pinça. Estabilize o baço usando um cotonete suavemente.
- Insira a agulha da seringa insulina 3 – 4 mm o parênquima do baço e injetar aproximadamente de 50 µ l de suspensão de células suavemente. Retire a agulha e coloque um cotonete de algodão sobre o local da injeção para 1 minuto para prevenir hemorragias e derrame de material.
- Retornar o baço no peritônio e feche a ferida com suturas de nylon 5-0. Em seguida, manter os ratos em uma câmara quente/incubadora para 3 – 16 h para devolvê-las à sua temperatura normal do corpo e para reanimá-los. Os ratos que foram submetidos a cirurgia não são retornados para a companhia de outros animais até que se recuperou totalmente.
- Adicionar o meloxicam (26 μg/mL) para a água potável e injetar buprenorfina (50 μg/kg) por via intramuscular como anti-inflamatório e analgésico, respectivamente. Monitor cirúrgico feridas diariamente para evitar qualquer inflamação.
Nota: Certifique-se de todos os instrumentos e fontes usadas nas etapas 4 a 7 são estéreis.
4. teste de nível de LDL-C plasmático
- Nos dias 0, 7, 14, 21 e 28 pós enxertia, conter os ratos LRG firmemente para minimizar movimento lateral-lateral da cabeça usando o método de conter com as duas mãos e, em seguida, puncionar a veia facial usando a lanceta. Sangue começará a fluir após a remoção do "the Lancet". Colete cerca de 50 µ l de sangue em tubos de 1,5 mL contendo 1 µ l de EDTA.
Nota: Se a alça é muito apertada, o volume de sangue coletado pode ser reduzido e os ratos podem morrer por causa da dificuldade em respirar. - Misture o sangue suavemente os tubos várias vezes por inversão e então centrifugar 950 x g por 15 min. recolher os sobrenadantes e armazená-los a-80 ° C, imediatamente.
- Uma vez que todas as amostras são coletadas, descongelar o plasma à temperatura ambiente e testar o nível de LDL-C, usando um kit de deteção de LDL-C de acordo com o manual do fabricante.
5. in Vivo testar da droga em quimérico ratos Engrafted com LDLR + /- e FH iHeps
- Para induzir a hipercolesterolémia, alimente os ratos uma dieta HFHC 7 dias antes da enxertia.
- A enxertia pós 7 dias, tratar cada grupo de ratos com veículo (PBS, injetado por via subcutânea), 10 mg/kg/semana PCSK9 anticorpos (uma formulação de grau clínico dos anticorpos monoclonais de PCSK9, injetado por via subcutânea, também), 10 mg/kg/dia de sinvastatina (40 mg/L mg / mL na água potável), ou combinado PCSK9 anticorpos e sinvastatina.
- Coleta de plasma de rato no pós enxertia dias 0 (o dia da enxertia), 14, 21 e 28. Armazene as amostras a-80 ° C imediatamente.
- Uma vez que todas as amostras estão disponíveis, teste o nível de plasma LDL usando um kit de deteção de LDL-C, de acordo com o manual do fabricante.
6. teste de função endotelial
Função endotelial é afectada no início de FH e pode ser testada em nosso modelo de rato como um indicador da gravidade da doença ou para avaliar a melhora com tratamentos diferentes. Um stereomicrocope, pinça de dissecação, tesoura, um myograph de fio, hardware de aquisição (ver Tabela de materiais), e um computador são necessários para isso.
- Sacrifica os ratos por injeção intraperitoneal de fenobarbital 100 mg/kg. Remova os órgãos internos para que a aorta descendente paralela à coluna é visível e pode ser dissecada para fora por tesouras, juntamente com o tecido adjacente e coração. Dissecar o aortae usando uma tesoura fina e colocá-los em solução de Krebs oxigenada fria (mM: 119 NaCl, 4.7 KCl, 2.5 CaCl2, 1 MgCl2, 25 NaHCO3, 1.2 KH2PO4e 11 D-glicose).
- Transferi o aortae em solução de Krebs para um prato de petri do silicone revestido. Alfinete o tecido conjuntivo para fixar a posição de aorta sem esticá-lo. Sob um estereomicroscópio, uso de fórceps bem a Primavera a tesoura e dissecar a aorta livre no tecido gordo e adventícia circundante sem danificar a parede do vaso, depois cortá-la em 1,5 a 2 mm segmentos de comprimento.
- Cortar um aproximadamente 2 cm longo e 40 μm inoxidável fio grosso e Coloque suavemente através do lúmen da aorta. Transferi o segmento para a câmara de myograph fio preenchida com solução de Krebs oxigenada, segurando o fio.
- Para medir o comprimento dos segmentos aortae quando estudar a contratilidade, coloque cada segmento perpendicular entre as mandíbulas e registro da leitura (D1) sobre o micrômetro. Remover o segmento e mover as mandíbulas juntos e gravar a leitura (D.0). O comprimento do segmento seria L = D1-D0.
- Siga o guia de usuário para fixar o fio e fixe-a com a chave de fenda enquanto colocando o segmento entre as mandíbulas, mas deixá-lo unstretched.
- Para Normalização antes do experimento, defina o myograph a zero na posição unstretched. Então, lentamente mova a mandíbula separada e observar a tensão de aorta mudar até atingir 3 mN. Depois de 15 minutos, escorra a solução da câmara de myograph e substituir com solução de Krebs fresca, esperar 15 min e ajustar a tensão a 3 mN novamente.
- Altere a solução de Krebs padrão para 60 mM solução de Krebs contendo KCl para induzir uma contração durante pelo menos 15 min. Enxágue com solução de Krebs fresca 3 vezes.
- Adicionar o aumento das concentrações de fenilefrina (Phe; por exemplo, de 10 nM a 100 μM). Lavar com solução de Krebs padrão e adicionar uma única concentração de Phe em ~ 70% da contração máxima da contração anterior. Quando a contração é estável, adicionar o aumento das concentrações de acetilcolina (ACh; por exemplo, de 1 ou 3 nM a 10 ou 30 µM) para induzir vasodilatação. ACh é adicionado em cerca de 2 min de intervalo.
Nota: Em alguns segmentos da aorta com pequena contração induzida por Phe, por exemplo, menor que 30% de KCl induzida por contração, U46619 (outro vasoconstritor) numa concentração de 1 nanômetro a 30 nM pode ser usado para induzir uma contração estável que é maior que 70% dos Contração induzida por kCl. - Limpe o myograph de acordo com o manual do fabricante.
- Usando o software de análise de dados (ver Tabela de materiais), registro a força (F) após cada adição de drogas. Desenhar o marcador para tensão basal (Fbasal) para medição relativa, mover a seta para o ponto mais alto após Phe como FPhee mova para o ponto mais baixo após cada adição de ACh como FACh. Calcular a vasodilatação endotélio-dependente induzida por ACh (EDV) pelo relaxamento % = (FACh-Fbasal) / (FPhe-Fbasal) no eixo y. Prepare uma curva de resposta de concentração em software estatístico usando log10 valor da concentração de M no eixo x.
- Para analisar a diferença estatística, usar a área sob a curva de cada segmento de um mouse e analisar a diferença da área sob a curva entre grupos usando ANOVA One-Way. Pontos individuais também podem ser analisados, se necessário.
7. a prova de iHep repovoamento do fígado de rato
- No ponto de extremidade, sacrifica os ratos injetando intraperitonealmente fenobarbital 100 mg/kg.
- Coleta de plasma por punção cardíaca. Dissecar os lóbulos do fígado usando tesouras oftálmicas, em seguida, pôr fígados um peri-tigela de 10 cm e duas lavagens com soro fisiológico. Remova a solução salina da superfície hepática com papel absorvente e, em seguida, cortar os lóbulos ao redor de 0,6 cm-comprimento de peças. Corrigi os lóbulos do fígado em formol a 10%.
- Incorpore os fígados fixos na seção usando um tecido processamento o sistema e um micrótomo deslizante, respectivamente, de acordo com as instruções do fabricante e parafina.
- Aqueça os slides para 60 ° C durante 1 h derreter a cera. Em seguida, mergulhe os slides em xilol por 5 min, duas vezes e Re-hidratar o tecido com etanol 100%, 90% e 70% sucessivamente.
- Mergulhe os slides para o slide-câmara contendo cerca de 50 mL de solução de recuperação de antígeno e em seguida, colocar a câmara na panela de pressão, a 120 ° C por 1,5 min. Lave o desliza suavemente com a tubulação de água por 5 minutos.
- Manche as seções com anticorpos primários (cerca de 100 µ l/seção) direcionamento humano ALB (hALB) e antígeno núcleos humanos (hNA). Em seguida, mancha com anticorpos secundarios conjugados com uma etiqueta fluorescente ou peroxidase de rábano (que reage com o kit de deteção de DAB).
- Para calcular a porcentagem de hALB + áreas e células hNA +, digitalizar as lâminas coradas com anti-hALB e anti-hNA e reagiu com DAB usando um slide automatizado sistema de digitalização para obter imagens de toda seção.
Nota: Toda a imagens digitalizadas de seção são úteis para calcular a eficiência repovoada de forma imparcial, com base em áreas hALB + ou células hNA + em fígados manchadas de imuno-histoquímica. Como um método alternativo para monitorar a eficiência de repovoamento iHep, nível de albumina humana do plasma pode ser testado usando um kit de ELISA ALB humano específico. - Com imagens de instantâneo para cobrir o slide inteiro usando o slide digital associado software sob 5 Vista X de visualização. Para quantificar a porcentagem de hALB + áreas, para cada imagem de instantâneo, usam o software de imagem de microscópio para qualificar a área positiva (P) e a área total (T) da imagem e usam o Image J para qualificar a área em branco (B). A porcentagem de hALB + áreas é expresso como P/(T-B) * 100%. Para cada grupo de, pelo menos 3 ratos devem ser selecionados. E para cada mouse, pelo menos 4 seções de diferentes posições do fígado devem ser seleccionadas.
- Para quantificar a porcentagem de hNA + células, para cada imagem de instantâneo, selecionar aleatoriamente 1/16 da área com uma software de processamento de imagem e então manualmente contam o número de núcleos totais (T) e hNA + núcleos (N). A porcentagem de hNA + é expressa em N/T * 100%. Para cada grupo de, pelo menos 3 ratos devem ser selecionados. Para cada rato, pelo menos 4 seções de diferentes posições do fígado devem ser selecionadas.
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Representative Results
Dirigido a diferenciação de humano iPSCs em iHeps
Quando chegar a confluência de 70%, iPSCs humanos são diferenciadas em iHeps com um passo 3-Protocolo n º16 (painel superior daFigura 1 ). Após 3 dias de diferenciação de endoderme, colônias de iPSC tornam-se afrouxado e espalhar a confluência completa (painel inferior daFigura 1 ). Em seguida, com 2nd médio de palco, hepatoblasts aparecem e proliferar. Estas células estão lotadas, mas mostram bordas claras nesta fase (dia 7, Figura 1 painel inferior). Após 17 dias de diferenciação, iHeps polarizadas com morfologia típica do hexágono aparecem (painel inferior daFigura 1 ). Estes iHeps expressar marcadores pHH, incluindo AAT e ALB (Figura 2A). Além disso, a proporção de ASGPR + iHeps deve ser relativamente alta, medida pelo fluxo cytometry (Figura 2B)15.
Geração de um iHeps de FH em Vivo doença modelo usando FH
Para ajudar a LRG ratos desenvolver hipercolesterolémia, podemos alimentá-los com uma dieta HFHC 7 dias antes da enxertia (dia -7). No dia da enxertia (dia 0), os ratos LRG exibem cerca de 3 vezes plasma nível de LDL-C (cerca de 600 mg/dL, Figura 3B). Dia que 15 – 17 iHeps estão incorporadas em camundongos LRG através da injeção de intrasplenic; Estes iHeps em breve residem no parênquima hepático e proliferar lá (Figura 3A). No ponto final, fígados destes ratos quiméricoes são coletados e fixo, então manchados com hALB e hNA, ambos os quais devem mostrar uma prova clara de repovoamento de fígado iHep-mediada em fígado de rato LRG baseado em coloração para hALB e hNA (Figura 4A-E). Em nossas mãos, tanto LDLR + /- e FH iHeps poderia reduzir plasma LDL-C nível significativamente 21 dias pós enxertia (Figura 4F). Neste ponto, ratos quiméricoes fígados humanos de FH podem ser usados para testar terapias para FH.
Validação do modelo de Mouse quimérico fígado humano FH usando drogas disponíveis
Para validar o nosso modelo, usamos 2 conhecidas drogas redução de LDL-C, sinvastatina e anticorpos PCSK9 (Figura 5A). Nossos dados demonstram que 21 dias após o tratamento, PCSK9 anticorpos têm uma forte capacidade para baixar o LDL e EDV do que a sinvastatina em ratos quiméricoes FH (Figura 5B-D). Nomeadamente, a redução percentual observado de LDL-C de plasma com anticorpos PCSK9 em camundongos quiméricoes FH é semelhante ao relatado em estudos clínicos4. Estes resultados demonstram o potencial utilitário de ratos quiméricoes LRG, incorporada com FH iHeps para testes pré-clínicos de novos medicamentos para FH.
Figura 1: dirigido a diferenciação de humano iPSCs em painel de iHeps.Top, cronograma para diferenciação de iPSC em iHeps; mídia e citocinas chaves é mostrada para cada estágio. (Painel inferior) Imagens de contraste de fase representativa dos pontos de tempo diferente do iHep diferenciação. KSR: substituição de soro nocaute; HCM: meio de cultura de hepatócitos; HGF: fator de crescimento de hepatócito; OSM: oncostatin M. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: caracterização de iHeps produzido com protocolo de diferenciação modificado. Imunofluorescência (A) de iHeps em vários estágios de diferenciação. Núcleos são corados em azul nas composições mescladas. Bar (B) o gráfico mostra a porcentagem de ASGPR + iHeps derivados obtidos no dia 17, como medido por citometria de fluxo. As amostras foram medidas em 3 experimentos independentes; valores médios são mostrados e barras de erro indicam o desvio padrão (SD). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Geração de um modelo de doença FH In Vivo com iHeps. (A) tempo de linha para a geração de ratos quiméricoes fígados humanos por injeção intrasplenic de FH iHeps em ratos LRG. Bar (B) o gráfico mostra que alimentando LRG ratos com dieta HFHC leva a significativamente aumentado o nível de LDL-C (n = 10). Valores de P são indicadas na figura e foram obtidos usando um teste t não pareado; valores médios são mostrados e barras de erro indicam o erro padrão da média (SEM). Painel B é modificado da Figura 3I do nosso relatório anterior15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: iHep mediada por repovoamento do fígado de ratos LRG. (A) seção totalmente digitalizados imagem representativa de hALB coloração em um fígado de rato repovoado com LDLR + /-iHeps. As setas indicam a clusters de iHeps humana incorporada no fígado do rato; seções ampliadas são mostradas no painel direito. (B) Scatter plot gráfico mostra a porcentagem de repovoada hALB + correspondente a áreas iHep, contendo em um fígado de rato (a partir de diferentes doadores iPSCs), cálculo foi baseado em imagens toda seção digitalizados (n = 19). Valores médios são mostrados e barras de erro indicam imagens representativas de SD. (C) de imuno-histoquímica mancha para hNA em um fígado de rato com engrafted FH iHeps. (D) gráfico de barras mostra o percentual de hNA repovoado + iHeps (a partir de diferentes doadores iPSCs) no LRG fígado de rato (n = 3). Valores médios são mostrados e barras de erro indicam hALB SD. (E) e hNA manchas nas duas seções consecutivas de um fígado de rato repovoada com iHeps de tipo selvagem. (F) gráfico de barras mostra a percentagem de plasma redução de LDL-C da linha de base em enxertia pós dia 21; n = 5 para LDLR + iHeps e n = 6 para iHeps FH e o veículo. Valores de P são indicadas na figura e foram obtidos usando um teste t não pareado; Quer dizer valores são mostradas as barras de erro indicam SEM. painéis B, D e E são modificados de Figura 3-3I do nosso anterior relatório15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Anticorpos PCSK9 mostram mais forte LDL, reduzindo a capacidade do que a sinvastatina em ratos LRG quimérico fígado humano. (A) visão esquemática da droga na vivo testando abordagem usando ratos quiméricoes fígados humanos de FH. (B e C) taxa de variação percentual de plasma LDL-C da linha de base no dias 14, 21 e 28 em camundongos quiméricoes FH, alimentados com dieta HFHC e tratados com os medicamentos indicados; n indica o número de ratos. Valores de P foram obtidas utilizando um teste de Kruskal-Wallis; valores médios são mostrados e barras de erro indicam SEM. (D) EDV em resposta a concentrações crescentes de ACh. Valores de P são indicados na figura para a concentração indicada. Valores de P foram obtidas utilizando ANOVA de duas vias ajustado com a comparação múltipla de Dunnett; barras de erro indicam que sem. Figura 5 é modificado da Figura 4A-4 C e Figura 5A de nosso relatório anterior15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Estudos anteriores usando iHeps em roedores confirmaram que eles são uma maneira eficaz de estudar doenças hepáticas hereditárias17. Ainda mais expandir o uso dessa tecnologia e modelos animais de FH atuais são suboptimal, nós engrafted FH iHeps em camundongos LRG e mostrou que o engrafted LDLR + /- ou heterozigota LDLR-mutante FH iHeps pode reduzir o nível de LDL-C de plasma de ratos e responder aos hipolipemiantes drogas na vivo.
Existem 3 etapas críticas em nosso protocolo para a geração de ratos de quimérico humanos FH fígado usando iHeps:
1) produção de iHeps de alta qualidade através de diferenciação direcionada. Dada a variabilidade clonal entre linhas de iPSC18, é importante usar isogénicas iPSCs para comparações adequadas e para testar a eficiência de diferenciação iHep da linha da célula-mãe antes de executar a engenharia e a enxertia.
2) correto iHep upload para a seringa. Diferentemente de outros protocolos, usamos a matriz extracelular de 50% (v/v, concentração final) para Ressuspender iHeps e então enviá-los para a seringa de insulina. Acreditamos que a matriz extracelular protege as células e fornece um microambiente que facilita a migração de iHep no fígado do baço. As bolhas são um factor letal para a cirurgia e devem ser evitadas completamente na seringa.
3) corrigir o número de células engrafted. Sobrecarga de células também pode levar a taxa de letalidade elevada. Recomendamos que engrafting iHeps 1 milhão por rato de 25 – 30 g.
Nosso protocolo também tem algumas limitações: a lesão hepática induzida por irradiação é moderada e dose única, e o estado de maturação de nosso iHeps não é comparável à poeira. Relacionadas com ambas as considerações, o grau de quimerismo do nosso modelo é semelhante aos recentes relatórios descrevendo NOD/Lt-SCID/IL-2Rγ−/− ratos ou ratos Gunn incorporados com iPSC-derivado iHeps17,19 , mas significativamente inferior FRG ratos ou ratos transgénicos uPA, incorporados com poeira. Para superar esta ressalva, por um lado, um poderia otimizar ainda mais o protocolo de diferenciação hepática para melhorar a maturação dos iHeps. Por outro lado, os ratos LRG poderiam ser cruzados com ratos do grupo de apoio para gerar camundongos Ldlr- / -/Fah- / -/Rag2- / -/Il2rg- / .
Em resumo, aqui descrevemos um protocolo detalhado para a geração de fígado humanos quimérico de animais com FH iHeps e para testar a funcionalidade do engrafted iHeps. Importante, estes ratos quiméricoes podem ser usados na vivo testar da droga. Nosso modelo provavelmente pode ser otimizado por melhorar a funcionalidade de iHeps ou nocauteando genes adicionais (por exemplo., Fah) do receptor, LRG ratos e será útil para investigar mecanismos patológicos da doença e realizar pré-clínicos estudos.
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Disclosures
H.-F.T. é o coordenador nacional e investigador do ODYSSEY resultados estudo patrocinado pela Sanofi e Regeneron Pharmaceuticals.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela ciência de Shenzhen e tecnologia Conselho básico programa de pesquisa (JCYJ20150331142757383), programa de pesquisa de prioridade estratégica da Academia Chinesa de Ciências (XDA16030502), Hong Kong Research Grant Conselho tema com base em pesquisa Esquema (T12-705/11), programa de cooperação do Conselho de bolsas de pesquisa da região administrativa especial de Hong Kong e a Fundação Nacional de ciências naturais da China (12/N-HKU730 e 81261160506), equipe projeto de pesquisa das ciências naturais de Guangdong Fundação (2014A030312001), ciência de Guangzhou e (201607010086), do programa de tecnologia e ciência da província de Guangdong e programa de tecnologia (2016B030229007 e 2017B050506007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 40 µm Cell strainer | BD | B4-VW-352340 | |
| 6-Well plate | Thermofisher | 140675 | Extracellular matrix coated |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | Dissolve in water |
| Antigen retrieval solution | IHC World | IW-1100-1L | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C8106 | CaCl2 |
| Cell dissociation enzyme | Thermofisher | 12604-013 | TrypLE |
| D-glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D5879 | DMSO |
| DMEM | Thermofisher | 10829 | Knockout DMEM |
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| EDTA | USB | 15694 | 0.5 M, PH=8.0 |
| Extracellular matrix (for cell suspension) | Corning | 354234 | Matrigel |
| Extracellular matrix (for iHep differentiation) | Corning | 354230 | Matrigel |
| Hepatocyte basal medium | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte culture medium | Lonza | CC-3198 | |
| High-fat and high-cholesterol diet | Research Diet | D12079B | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human hepatocyte growth factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human iPSC maintenance medium | STEMCELL Technologies | 5850 | mTeSR1 |
| Human oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Ketamine 10% | Alfasan | N/A | |
| L-glutamine | Thermofisher | 35050 | |
| LDL-C detection kit | WAKO | 993-00404 and 993-00504 | |
| Magnesium chloride | VWR | P25108 | MgCl2 |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | NADA 141-213 | |
| Monopotassium phosphate | USB | S20227 | KH2PO4 |
| Non-essential amino acids | Thermofisher | 11140 | |
| PBS | GE | SH30256.02 | Calcium and magnesium-free |
| PCSK9 antibodies | Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals | SAR236553/REGN727 | Alirocumab |
| Phenobarbital | Alfamedic company | 013003 | |
| Phenylephrine | RBI | P-133 | Dissolve in water |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | KCl |
| Povidone-iodine | Mundipharma | Betadine | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Sigma Aldrich | Y0503-5MG | |
| RPMI 1640 | Thermofisher | 21875 | |
| Serum replacement | Thermofisher | 10828 | |
| Silicone coated petri dish | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme | ZOCOR | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | NaCl |
| Trypan blue solution 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| U-46619 | Cayman | 16450 | Dissolve in DMSO |
| Xylazine 2% | Alfasan | N/A | |
| β-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| AAT | DAKO | A0012 | 1:400 |
| ALB | Bethyl Laboratories | A80-129 | 1:200 |
| ASGPR | Santa Cruz | Sc-28977 | 1:100 |
| HNF4A | Santa Cruz | Sc-6557 | 1:35 |
| NANOG | Stemgent | 09-0020 | 1:200 |
| OCT4 | Stemgent | 09-0023 | 1:200 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Il2rg-/- | Jacson lab | 003174 | |
| Ldlr-/- | Jacson lab | 002077 | |
| Rag2-/- | Jacson lab | 008449 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess | |
| Gamma irradiator | MDS Nordion | Gammacell 3000 Elan II | |
| Insulin syringe | BD | 324911 | |
| Powerlab | ADInstruments | Model 8/30 | |
| Slides scanning system | Leica biosystems | Aperio scanScope system | |
| Sliding Microtome | Leica biosystems | RM2125RT | |
| Stereomicrocope | Nikon | SMZ800 | |
| Tissue processing system | Leica biosystems | ASP200S | |
| Wire myograph | DMT | 610M | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Digital slide viewing software | Leica | Aperio ImageScope Version 12.3.2 | |
| Image J | NIH | Version 1.51e | |
| Image processing software | Adobe | Photoshop CC Version 2015 | |
| Microscope imaging software | Carl Zeiss | AxioVision LE Version 4.7 |
References
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