Summary
نقدم هنا، بروتوكول باستخدام المورفولوجية الحسية العصبية-نموذج الإصابة العصبية الجذعية أربوريزاتيون (دا)، الذي يجمع في فيفو يعيش التصوير واثنين-فوتون الليزر أكسوتومي/ديندريوتومي والأدوات الوراثية يطير قوية، منصة لفحص المروجين ومثبطات نيوروريجينيريشن المحتملة.
Abstract
ويحكم قدرة نمو الخلايا العصبية التالفة نيوروريجينيريشن واسترداد الفنية بعد الصدمة العصبي. على مدى العقود القليلة الماضية، تم تحديد الذاتية والخارجية المثبطة العوامل المختلفة المشاركة في تقييد التجدد إكسون. ومع ذلك، ببساطة إزالة هذه الإشارات المثبطة لا تكفي للتجديد الناجح، مما يشير إلى وجود إليه تنظيمية إضافية. وتشاطر melanogaster المورفولوجية، ذبابة الفاكهة، الجينات تقحم المصانة ومسارات الإشارات مع الفقاريات، بما في ذلك البشر. الجمع بين الأدوات الوراثية قوية من الذباب بالليزر اثنين-فوتون أكسوتومي/ديندريوتومي، ونحن تصف هنا العصبية الحسية المورفولوجية – نموذج الإصابة العصبية الجذعية أربوريزيشن (دا) كمنصة للفحص بشكل منتظم للرواية تجديد المنظمين. بإيجاز، يتضمن هذا النموذج أ) إعداد اليرقات، وتحريض ب) الآفة إلى dendrite(s) أو axon(s) استخدام الليزر اثنين-فوتون، ج) يعيش [كنفوكل] التصوير بعد الإصابة ود) تحليل البيانات. لدينا نموذج يمكن استنساخه بشدة إصابة واحدة من الخلايا العصبية المسماة ومحاور عصبية و dendrites من الأنواع الفرعية العصبية محددة تحديداً جيدا، في كل من الأجهزة الطرفية والجهاز العصبي المركزي.
Introduction
عجز محاور عصبية لتجديد بعد إصابة الجهاز العصبي المركزي (CNS)، قد تؤدي إلى الإعاقة الدائمة في المرضى، وتلعب أيضا دوراً في العجز العصبية لا رجعة فيها في أمراض الأعصاب1،2 3، ،،من45. البيئة الجهاز العصبي المركزي، فضلا عن القدرة الجوهرية نمو الخلايا العصبية، تحديد ما إذا كانت محاور عصبية قادرة على تجديد بعد الصدمة. عوامل خارج الخلية من أوليجوديندروسيتي، أستروجليال، ومصادر الليفية قد ثبت أن تعوق نمو الخلايا العصبية4،6،،من78، ولكن القضاء على هذه الجزيئات يسمح فقط لمحدودة تنتشر5. يمكن أن تؤثر على نجاح التجدد5،9 إشارات التجديد الأصيلة وتمثل الأهداف العلاجية المحتملة، ولكن هذه العمليات التي لا تزال غير واضحة المعالم على المستوى الجزيئي. يمكن أن تؤدي الزيادات في إشارات العوامل التغذوية أو القضاء على الفرامل الذاتية، مثل الفوسفاتيز فتن10، تجديد محواري في ظروف معينة. تركيبات من الأساليب المختلفة التي وجدت لتكون فعالة على حدة أيضا إلا تقديم الإنعاش عموما محدود حتى الآن11،12،،من1314. ولذلك، هناك حاجة ماسة لتحديد مسارات إضافية للعلاج المستهدفة. بالإضافة إلى الشروع في إعادة نمو محور عصبي، وكيفية إعادة الأسلاك إلى الهدف الصحيح، إصلاح المشبك خصوصية، محاور عصبية وتحقيق الانتعاش وظيفية هي الأسئلة الهامة.
وباختصار، لا يزال الفهم الحالي لجهاز إملاء التجدد إكسون مجزأة جداً. جزء من المشكلة هو صعوبة التقنية دراسة إكسون التجدد في الثدييات في الوقت الحقيقي، ونهج التي مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، وتحديا لإجراء الشاشات الوراثية على نطاق واسع. من ناحية أخرى، melanogaster المورفولوجية، ثبت أن نظام استثنائي قوية لدراسة المسائل البيولوجية المعقدة. ذبابة الفاكهة كانت مفيدة في تحديد الجينات وإشارات المسارات التي يتم المحافظة عليها لافت للنظر في البشر وكان نموذجا ناجحاً لدراسة الظروف البشرية، مثل أمراض الأعصاب، من خلال أدوات هائلة في مجال علم الوراثة الجزيئي المتاحة للتلاعب بالجينات الدالة15. وتعتبر ذبابة الفاكهة على وجه الخصوص، لتكون أداة مثالية لاكتشاف الجينات المشتركة في الإصابة العصبية ونمو15،16. -تم تطوير نماذج الإصابة العصبية يطير عدة، بما في ذلك الرأس بالغ أو اليرقات البطني العصب الحبل (فنك) طعن بالإبر، فنك اليرقات أو سحق العصب مع الملقط، العصبية اليرقات أكسوتومي الليزر، وإزالة الخلايا العصبية مستقبلات الشم، إصابة explants الدماغ، والآفة الأعصاب الطرفية بالجناح قطع15،17،،من1819،20،21،،من2223. المثير، تقدمت الأخيرة العمل استخدام المورفولوجية نماذج الإصابة فهمنا للمسارات الخلوية والوراثية المستخدمة من قبل الجهاز العصبي للاستجابة للإصابات العصبية، البعض منها قد ثبت أن تكون حفظت في الثدييات24 ،25. مرة أخرى، وهذا يؤكد فائدة هذا الكائن نموذج لتحديد آليات الرواية لإصلاح العصبية.
الموصوفة هنا اثنين-فوتون الليزر المورفولوجية العصبية حسية يرقات إصابة نموذج يستند. كان أول من استخدم ليزر اثنين-فوتون قطع محاور عصبية في الزرد في فيفو في 200326. في نفس العام، أجرى ديندريوتومي الليزر الأول في المورفولوجية استخدام ليزر النبضي نيتروجين27. بعد ذلك بقليل، يستخدم عدد من معامل C. ايليجانس ليزر femtosecond لوضع نماذج ل التجدد إكسون28. في عام 2007، وو والزملاء مقارنة والإبلاغ عن الاختلافات بين إصابات الليزر في C. ايليجانس الناجمة عن أنواع مختلفة من أشعة الليزر29. في عام 2010، تبين إكسون التجديد بعد الليزر أكسوتومي أول مرة تحدث في المورفولوجية30. بناء على هذا الأدب إصابة ليزر مكثفة، قمنا بتطوير نموذج إصابة العصبية يطير باستخدام الليزر اثنين-فوتون، الذي يسمح تعريفية دقيقة الإصابة إلى المواقع المستهدفة مع اضطراب الحد الأدنى من الأنسجة المجاورة، توفير بيئة نظيفة نسبيا نظام لدراسة الخصائص الذاتية والخارجية كلا من نيوروريجينيريشن مع القرار خلية واحدة. على وجه التحديد، أنشأنا مجموعة من الأساليب إصابة للخلايا العصبية الحسية أربوريزيشن الجذعية (دا) في كلا الجهاز العصبي المحيطي (PNS)، والجهاز العصبي المركزي. يمكن تجميع الخلايا العصبية دا في أربع فئات متميزة تتميز أساسا بتعقيداتها التفريع تغصن: الفئة الأولى إلى الرابع31. أعمالنا المنشورة يوضح أن تجديد الخلايا العصبية دا يشبه نماذج إصابة الثدييات على المستوى الجزيئي والمظهرية: الخلايا العصبية دا عرض خصائص فئة محددة التجدد، مع الفئة الرابعة ولكن لا الطبقة الأولى أو الخلايا العصبية دا الثالث العارضة التجدد في السندات الإذنية؛ الفئة الرابع دا محاور عصبية العصبية تجديد قوة في المحيط، ولكن إمكاناتها التجدد يتم تقليل كبير في الجهاز العصبي المركزي، وهكذا تشبه الخلايا الجذرية الظهرية العقدة (DRG) العصبية في الثدييات؛ تعزيز النشاط mTOR عبر فتن الحذف أو Akt overexpression يعزز تجديد إكسون في الطيران والملاحة والمراقبة19. استخدام هذا النموذج الإصابة، قد تم أداء شاشات الجينية، وحددت الإنزيم تجهيز الجيش الملكي النيبالي Rtca كعامل مثبطة تقحم مصانة للتجدد إكسون، ربط إكسون الإصابة بالإجهاد الخلوية وتعديل الحمض النووي الريبي20 .
في النموذج المقدم، وهو الناجم عن الإصابة عن طريق الليزر أكسوتومي/ديندريوتومي من فئة اليرقات الرابع أو الثالث دا الخلايا العصبية، المسمى ppk-CD4--تدجفب أو الريبو UAS-CD4--تدجفب،، 19-12-Gal4-Gal80، على التوالي. تتم الإصابة على 2nd ليرقات الطورrd 3 في حوالي 48-72 ساعة بعد بيضة زرع (ح AEL). للسندات الإذنية يستهدف أكسوتومي الآفة إلى المقطع من محور عصبي ~ 20-50 ميكرون بعيداً عن جسم الخلية, أكسوتومي الجهاز العصبي المركزي إلى منطقة ~ 20 ميكرومتر في القطر عند تقاطع كوميسوري في فنك، وديندريوتومي إلى النقاط فرع الجذعية الأولية. يتم تصويرها العصبية نفسها في 8-24 ساعة بعد الإصابة (منظمة العفو الدولية) لتأكيد ترانسيكشن كاملة، وفي ح 48-72 منظمة العفو الدولية لتقييم التجدد. من خلال الوقت الفاصل بين التصوير [كنفوكل]، يمكن رصدها بالانحطاط والتجديد لكل محاور عصبية/dendrites التي تم المصابين في فيفو على مر الزمن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد لوحات الثقافة وزجاجات
- إعداد لوحات أجار عصير العنب
- إضافة 10 غم من مسحوق أجار وعصير العنب 200 مل مل 192 ddH2س في الكأس والموجات الدقيقة لحوالي 4-5 دقيقة، مع التحريك بشكل متقطع حتى يذوب في أجار تماما.
- في غطاء دخان، يبرد حل حوالي 60 درجة مئوية. إضافة الإيثانول 95% مل 4.2 و 4.0 مل حمض الخليك الجليدية. ضبط الحجم الكلي للحل إلى 400 مل مع مزيج O. ddH2أيضا.
- لكل لوحة 35 ملم، إضافة حوالي 2-3 مل الحل. جعل حوالي 120-150 لوحات لما مجموعة 400 مل عصير العنب أجار الحل.
- انتظر 10 دقائق يبرد اللوحات وترسيخ الحل أجار. حزمة عصير العنب لوحات أجار في أكياس ziplock الذاتية مختومة وتخزينها عند 4 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
- إعداد زجاجات الثقافة المورفولوجية
- استخدام شفرة لكمه 1.5 سم جانب طول ثلاثي ثقب في جدار واحد من زجاجة الثقافة المورفولوجية وملء الحفرة مع كرة قطرها 2-2.5 سم من القطن للتهوية.
- قم بتوصيل الزجاجة مع لوحة أجار عصير عنب وتستكمل مع حوالي 0.5 سم3 من عجينة الخميرة.
2-جمع اليرقات المورفولوجية
- إعداد صلبان ذباب الكبار
- 10 مكان العذراء الإناث والكبار الذكور 5 الذباب معا في زجاجة ثقافة توصيله بلوحة أجار عصير عنب.
- ضع قيعان زجاجة أعلى عند 25 درجة مئوية، حيث أن الذباب سوف تضع بيضها على لوحة أجار عصير العنب. تغيير اللوحة مع لصق الخميرة على الأقل مرة واحدة في يوم. لفترة جمع 2-h، الذي يسمح لحصاد يرقات مرحلة التطوير متجانسة، تبدأ مع أكثر من 20 العذراء الإناث والذكور 10 في خطوة 2.1.1.
- الثقافة لوحة عند 25 درجة مئوية في طبق بتري 60 ملم مع أنسجة رطبة، على سبيل المثال، غارقة في محلول 0.5% حمض البروبيونيك. ترتيب الأنسجة بحيث أنها لا تعوق تدفق الأوكسجين.
ملاحظة: يتم استخدام الحل حمض البربيونيك الاحتفاظ بالرطوبة في الطبق وتجنب نمو العفن.
- حصاد يرقات سن معينة
- استخدام زوج من الملقط لنقل اليرقات المرحلة المرغوبة، على سبيل المثال، 2nd ليرقات الطورrd 3 في 48-72 ساعة بعد بيضة زرع (AEL)، لوح أجار عصير عنب جديدة دون لصق الخميرة.
- إزالة الخميرة من الجلد اليرقات بالسماح لهم بالزحف حول لوحة جديدة، للحيلولة دون التدخل المحتمل من الخميرة مع أكسوتومي الليزر والتصوير. وبدلاً من ذلك، دقة تنظيف اليرقات بغسلها في طبق من برنامج تلفزيوني والتجفيف بإيجاز على قطعة من المناديل الورقية.
3-اثنين-فوتون الإصابة وتصوير [كنفوكل]
- إعداد المجهر
ملاحظة: استخدمت ليزر [كنفوكل] المسح مجهر مع ليزر اثنين-فوتون لهذه التجربة، ولكن الأنظمة الأخرى مع إعداد ما يعادل تكفي أيضا. الليزر اثنين-فوتون (930 nm) استخدمت لإيصال الضرر وليزر أرجون (488 نانومتر) كان يستخدم لتصوير [كنفوكل] للتجارة والنقل.- في بداية كل دورة، تشغيل الليزر اثنين-فوتون و/أو laser(s) [كنفوكل]، والمجهر. فتح برامج التصوير.
- لإصابة اثنين-فوتون، قم بإعداد المعلمات التالية للتصوير التجارة والنقل مع الليزر اثنين-فوتون في 930 نانومتر (1,950 ميغاواط).
- حدد وضع خط المسح الضوئي. فتح الثقب طوال الطريق. زيادة كثافة الليزر ~ 20% (390 ميجاوات).
- حدد 512 × 512 كمسح الإطار. استخدام أقصى سرعة المسح الضوئي (عادة مع الوقت يسكن بكسل في المايكروثانيه 0.77). ضمان أن متوسط عدد 1 وعمق بت 8 بت.
- مجموعة كسب ~ 750، والإزاحة إلى 0.
- حفظ هذا البروتوكول التجريبية المحددة مسبقاً ف 2 بروتينات فلورية خضراء 930 الاجتثاث، مما يسمح لتسهيل إعادة الاستخدام والتجارب في المستقبل.
- لتصوير [كنفوكل]، قم بإعداد المعلمات التالية للتصوير التجارة والنقل مع ليزر الأرجون في 488 نانومتر:
- حدد علامة التبويب اقتناء ثم Z-المكدس.
- تحت "الليزر"، قم بتشغيل قوة الليزر الأرجون 488 من شمال البحر الأبيض المتوسط.
- اذهب إلى القنوات، حدد الليزر 488 مم، وزيادة قوة الليزر إلى 5-10 في المائة. للثقب، استخدام وحدة مهواة 1-2 (الاتحاد الأفريقي). ضبط المكاسب إلى 650.
- في اكتساب وضع، حدد 1024 × 1024 كإطار المسح الضوئي، واستخدام سرعة المسح الضوئي كحد أقصى، ومتوسط عدد 2، وعمق بت 8 بت.
- حفظ هذا البروتوكول التجريبية المحددة مسبقاً التصوير التجارة والنقل.
- تخدير اليرقات مع إثيل الاثير وتصاعد
- في غطاء دخان، ضع طبق زجاج 60 ملم في بلاستيك 15 سم طبق بيتري. حظيرة ووضع قطعة من المناديل الورقية في الجزء السفلي من الطبق الزجاج، ثم ضع طبق أجار عصير عنب في الأنسجة. إضافة إثيل الاثير إلى الطبق الزجاج، إلى النقطة حيث يتم استيعابه المناديل الورقية، وهناك طبقة من سائل البروم المتبقية في الطبق. الحفاظ على الغطاء في جميع الأوقات.
- إعداد شريحة زجاجية مع قطره واحدة من الهالوكربون النفط 27 في المركز. إضافة 4 بقع الشحوم فراغ على الأركان الأربعة للشريحة، على دعم في وقت لاحق ساترة.
- استخدام الملقط لالتقاط يرقة تنظيفها ووضعها على لوحة أجار في الطبق الزجاج عيار 60 ملم. تغطية صحن زجاج مع غطاء لها وانتظر حتى يتوقف اليرقة يتحرك. للسندات الإذنية الإصابة/تصوير، إخراج اليرقة حالما يتوقف ذيله الوخز. للجهاز العصبي المركزي، انتظر حتى تصبح اليرقة كامل بلا حراك، لا سيما في الجزء المتعلق بالرأس.
ملاحظة: توقيت التعرض خماسي البروم ثنائي الفينيل الحاسم. انظر النقاش. - عناية تلتقط اليرقة أنيسثيتيزيد ووضعه رئيس تستقيم في قطره النفط الهالوكربون على الشريحة. إضافة ساترة فوق الشريحة. استخدام ضغط لطيف لدفع إلى الأسفل في ساترة، حتى أنها تمس اليرقة (الشكل 1A).
- ضبط الموضع في اليرقة بلطف دفع ساترة نحو اليمين أو اليسار دحر اليرقة، حيث يكون العصبية/إكسون/تغصن الاهتمام على أعلى وأقرب إلى عدسة المجهر.
- لإصابة الجهاز العصبي المحيطي، جبل الجانب الظهرية اليرقة، حيث أن كلا تراتشيس تكون مرئية. ثم لفة اليرقة ~ 30 درجة إلى اليسار لإصابة الطبقة الثالثة دا العصبية محاور عصبية (الشكل 1 باء وجيم 1) أو 90 درجة لإصابة الصف الرابع دا العصبية محاور عصبية (الشكل 1B و 1E) ~ 30 درجة للصف الرابع دا العصبية dendrites (مما أدى إلى إصابة الشكل 2 (أ)).
- لإصابة الجهاز العصبي المركزي، ضع اليرقة أن يكون الجانب البطني تماما حتى (الشكل 3 ألف)، حيث أن منطقة الاهتمام الأقرب إلى عدسة المجهر في z-الطائرة.
- الإصابة بالليزر اثنين-فوتون
- ضع الشريحة مع اليرقة تحت المجهر، وأنه في مكان أمن مع صاحب الشريحة على المسرح. هدف الاستخدام 10 × (0.3 غ) للعثور على اليرقة.
- إضافة 1 قطره نفط موضوعية على ساترة، وقم بالتبديل إلى 40 × (1.3 غ) الهدف وضبط التركيز.
- قم بالتبديل إلى وضع المسح الضوئي، وإعادة استخدام بروتوكول تجريبي ف 2 بروتينات فلورية خضراء 930 الاجتثاث. تأكد من أن يتم فتح الثقب كل وسيلة.
ملاحظة: يحتاج التكوين الأمثل استناداً إلى النظم الفردية. - بدء وضع حية لتحديد موقع منطقة الفائدة (العائد على الاستثمار)، وضبط الإعدادات لتحقيق جودة الصورة مع التكبير المناسبة.
ملاحظة: الغرض من هذه الخطوة العثور على الخلايا العصبية/إكسون/تغصن تجرح، بدلاً من أخذ صورة ذات جودة أفضل. ولذلك، استخدم إعدادات الحد الأدنى الكافي لتصور المنطقة المستهدفة، بغية تجنب التعرض المفرط أو فوتوبليتشينج. - إيقاف المسح حية ، حتى يصبح الزر اقتصاص المتاحة. واسمحوا الصورة لا تزال بمثابة خارطة الطريق. حدد وظيفة المحاصيل وضبط نافذة المسح الضوئي للتركيز على الهدف يكون أصيب بجراح.
- تخفيض العائد على الاستثمار أن يكون حجم الموقع المحتمل للإصابة. على سبيل المثال، تغطي فقط عرض محور عصبي أو تغصن، ضمان دقة الإصابة وتقليل الضرر للأنسجة المجاورة. إذا رغبت في ذلك، التكبير في العائد على الاستثمار قبل زراعة المحاصيل، مما يسمح للإصابة أكثر دقة.
- فتح نافذة جديدة في تصوير. الحد من سرعة المسح الضوئي وزيادة كثافة الليزر. تحديد الزيادة في كثافة الليزر استناداً إلى إشارة fluorescence الأنسجة الممسوحة ضوئياً في وضع حية .
- بشكل عام، تعيين كثافة الليزر اثنين-فوتون بدءاً من 25% لإصابة الجهاز العصبي المحيطي و 50-100% للإصابة فنك. للسندات الإذنية إكسون الإصابة، تأكد أن كثافة الليزر ميغاواط ~ 480 بكسل الوقت يسكن 8.19 ميكروثانية. للضرر إكسون فنك، تكفل الليزر بكسل وكثافة الوقت يسكن عادة ميغاواط 965-1930 و 8.19 32.77 ميكروثانية، على التوالي.
- بدء تشغيل التفحص المستمر . اترك المؤشر تحوم فوق الزر مستمر . تراقب عن كثب على الصورة وإيقاف المسح الضوئي كما لوحظ حدوث زيادة مفاجئة في الأسفار.
ملاحظة: مظهر سبايك الأسفار نظراً لصف السيارات في موقع الإصابة. - التبديل إلى طريقة العيش عن طريق إعادة استخدام الإعدادات. العثور على منطقة الفائدة التي استهدفت فقط بضبط التركيز.
ملاحظة: مؤشر جيد لإصابة النجاح هو المظهر من الحفرة الصغيرة، وهيكل الشبيهة بخاتم، أو الحطام مترجمة الحق في موقع الإصابة. - الانتقال إلى الخلايا العصبية التالية وكرر من الخطوة 3.3.5، إصابة الخلايا العصبية متعددة في حيوان مفردة. أو كرر الخطوة 3.3.5 بينما تدريجيا زيادة الطاقة و/أو تقليل سرعة المسح الضوئي في حالة الإصابة الأولى لم تكن كافية.
ملاحظة: في الحالة التي قوة الليزر جداً عالية، منطقة تالفة كبيرة ستكون مرئية في الصورة تفحص يعيش مرحلة ما بعد الإصابة. إصابة أكثر من اللازم قد يسبب موت اليرقة. - استرداد اليرقة بعناية إزالة ساترة ونقل اليرقة المصابين على صفيحة جديدة مع لصق الخميرة. خندق عدة كهوف على لوحة أجار مع ملقط؛ وبدلاً من ذلك، جعل جزيرة أجار في اللوحة بدلاً من استخدام لوحة كاملة، للحد من إمكانية اليرقة الزحف خارج اللوحة.
- وضع اللوحة في طبق بتري 60 ملم مع الأنسجة رطبة (مبللة مع محلول حمض البربيونيك 0.5%)، والثقافة في درجة حرارة الغرفة أو 25 درجة مئوية.
ملاحظة: ستظل اليرقة في مرحلة اليرقات لحوالي يوما إضافيا في درجة حرارة الغرفة (22 درجة مئوية)، بالمقارنة إلى عند 25 درجة مئوية.
- تصوير [كنفوكل] ما بعد الإصابة
- صورة اليرقة المصابين في النقاط الزمنية المطلوبة بإعداد اليرقة باستخدام نفس الإجراء للتخدير وتصاعد كما هو الحال في "الخطوة 3-2"، ثم التصوير بالليزر [كنفوكل].
ملاحظة: صورة اليرقة في 24 ساعة بعد الإصابة (منظمة العفو الدولية) لتأكيد الإصابة محواري وفي ح 48 منظمة العفو الدولية (الفئة الرابعة دا الخلايا العصبية) أو ح 72 منظمة العفو الدولية (الفئة الثالثة دا الخلايا العصبية) لتقييم التجدد. - تحديد موقع اليرقة استخدام الهدف العاشر 10، ثم التبديل إلى 25 × (0.8 غ) الهدف. إعادة استخدام البروتوكول التجريبي التصوير التجارة والنقل.
- انقر فوق الزر حية والعثور على الخلايا العصبية نفسه أصيب سابقا.
- تعيين مواقف زي الأول والأخير في إطار المسح حية. اضغط إيقاف ثم انقر فوق بدء التجربة للحصول على صورة Z-مكدس.
ملاحظة: تأكد من أن نقطة تطبيع (نقطة التقاء إكسون) يتم تضمين عند التقاط الصور حيث أن التحديد الكمي للتجديد من الممكن (الشكل 1، 1-واو)-يناقش هذا الأمر في قسم تحليل البيانات. - قم بالتبديل إلى معالجة الصور، حدد الصورة اتخذت للتو، وتوليد إسقاطاً أقصى شدتها. حفظ كل z-المكدس وأقصى شدتها صور الإسقاط.
- صورة اليرقة المصابين في النقاط الزمنية المطلوبة بإعداد اليرقة باستخدام نفس الإجراء للتخدير وتصاعد كما هو الحال في "الخطوة 3-2"، ثم التصوير بالليزر [كنفوكل].
4. تحليل البيانات
- وعملية تحديد حجم الصور باستخدام أي من برامج التصوير أو إيماجيج.
- التحديد الكمي للتجدد إكسون في السندات الإذنية
- حساب النسبة المئوية التجديد، الذي يشير إلى النسبة المئوية لتجديد محاور عصبية بين جميع محاور عصبية التي كانت ليسيونيد. نقاط محور عصبي كتجديد طالما أنها ريجرووس خارج موقع الإصابة.
- قياس طول التجدد، وهو الزيادة في طول محور عصبي. إذا كان التحديد الكمي مع إيماجيج، استخدم أداة سطر مجزأة لتتبع إكسون المجددة، واستخدام الإجراء في القائمة المنسدلة تحليل للحصول على طول الخط الذي يمثل محور عصبي المجددة.
- حساب مؤشر التجدد، وهو الزيادة في طول إكسون تم تسويتها.
ملاحظة: هو تطبيع إكسون طول المسافة بين خلايا الجسم واكسون تتلاقى نقطة (مبدئي) – إكسون طول/مبدئي (الشكل 1 و 1F). وتساعد هذه القيمة حساب لأي نمو محواري أن يرجع إلى تحجيم اليرقات. قيمة إيجابية تمثل التجديد وقيمة 0 تعني لا التجديد، وقيمة سلبية يعني تراجع.
- التحديد الكمي للتجدد تغصن
- حساب التجديد النسبة المئوية، وهو النسبة المئوية للخلايا العصبية دا بين جميع أولئك الذين قطعت تظهر نمو تغصن واضحة.
ملاحظة: يتم تسجيل نمو تغصن كما تنمو dendrites إيجابية إذا جديدة خارجاً من الساق الجذعية تراجع وما بعدها في موقع الإصابة. موقع الإصابة محددة المعالم، وفي بعض الحالات، هو العيان سبب أوتوفلوريسسينسي الناجمة عن الإصابات المتبقية. - حساب زيادة النقاط فرع، التي تعول إضافة نقاط جديدة فرع الجذعية بعد الإصابة.
- حساب زيادة الطول الإجمالي تغصن، الذي هو طول التراكمي لجميع dendrites جديدة تضاف بعد الإصابة.
- حساب التجديد النسبة المئوية، وهو النسبة المئوية للخلايا العصبية دا بين جميع أولئك الذين قطعت تظهر نمو تغصن واضحة.
- التحديد الكمي للتجدد إكسون في الجهاز العصبي المركزي
ملاحظة: إذا كان موقع آفة يظهر تنكس في الوقت النقطة الأولى المصورة (الشكل 3B)، أنه سيتم تضمين في تحليل طول التجدد ومعدل.- قياس طول التجدد، وهو طول محور عصبي ريجرووينج.
ملاحظة: يتم تعريف إكسون ريجرووينج موقع آفة واحدة أنها تنبع قبالة الطريق إكسون الأصلية قبل الإصابة. - حساب طول التجدد Normalized، الذي ضبط طول التجديد على طول الجزء commissure-المسافة الطولية بين كوميسوريس ("Y" في الشكل 3 ألف و 3 باء).
ملاحظة: يساعد على هذه القيمة الصحيحة لأثر اختلاف حجم اليرقات. - حساب معدل التجدد، وهو النسبة المئوية لتجديد قطاعات بين جميع القطاعات التي كانت ليسيونيد، لكي تعكس قدرة التجدد النمط الوراثي خاصة.
- قياس طول التجدد، وهو طول محور عصبي ريجرووينج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الخلايا العصبية دا إظهار التجدد التفاضلية المحتملة بين الأجهزة الطرفية والجهاز العصبي المركزي، فضلا عن خصوصية الفئة. وهذا يوفر فرصاً فريدة للشاشة لرواية العوامل المطلوبة لتجديد إكسون (باستخدام فئة الإصابة الرابعة السندات الإذنية)، فضلا عن تلك التي المثبطة للتجدد (مع إصابة "الجهاز العصبي المركزي الرابع" فئة وفئة إصابة الثالث السندات الإذنية).
إكسون التجدد في السندات الإذنية
على سبيل مثال، يرد وصف التجدد في الصف الثالث والصف الرابع دا الخلايا العصبية. وتقع هذه الخلايا العصبية على أساس ثنائي في كل جزء من الجسم. يمكن جروح متعددة الخلايا العصبية في اليرقة نفسها؛ بشكل عام، 3-4 الخلايا العصبية في الجانب الأيمن من البطن شرائح A7-A2. الصف الثالث والصف الرابع دا الخلايا العصبية يمكن تصور الريبو 19-12-Gal4، UAS-CD4tdGFP-Gal80 و ppk-CD4tdGFP، على التوالي. تخدير وجبل اليرقات AEL ح 48-72 كما هو موضح، ضبط موضع اليرقات حيث أن الخلايا العصبية دا للاهتمام هي مواجهة (الشكل 1A و 1B). نحن عادة ما تجرح داف الصف الثالث والصف الرابع فعدا من الخلايا العصبية (الشكل 1 و 1E). أداء أكسوتومي واسترداد يرقات كما هو موضح. بعد وقت قصير من إصابة (منظمة العفو الدولية)، سوف قد شُفي اليرقات إلى جراحة ومعرض الحركة العادية. معدل البقاء على قيد الحياة هنا هو عادة ما يزيد على 80 في المائة. تجاهل اليرقات ميتة أو مريضة. قم بإعادة تحميل ما تبقى كما هو موضح وتقييم الانحطاط. في ح 24 منظمة العفو الدولية، ينبغي استكمال محاور عصبية القاصي الانحطاط في هذا الوقت النقطة19، وسوف تكون الجذعية إكسون العيان (الشكل 1 و 1F). Reimage اليرقات نفسه في ح 48 منظمة العفو الدولية للصف الرابع دا الخلايا العصبية أو ح 72 منظمة العفو الدولية للفئة الثالثة دا الخلايا العصبية لتقييم التجدد. ونحن نهدف عادة لتقييم الخلايا العصبية أصيب مالا يقل عن 20 كل حالة تجريبية. في (نوع البرية) WT الحيوانات، بينما عادة ما تفشل ~ 70% دا قطع الصف الرابع سوف يكون مجدد الخلايا العصبية خارج موقع الإصابة (الشكل 1F)، الفئة الثالثة دا الخلايا العصبية لتنمو، يدل على ذلك مخروط النمو المماطلة (الشكل 1).
تغصن التجديد
ونحن عادة بتنفيذ ديندريوتومي في الصف الرابع دا الخلايا العصبية دك (الشكل 2A). كما هو موضح في الرسم التخطيطي، والضرر يستهدف نقطة فرع الجذعية الأولية. استناداً إلى التجربة، عندما أصيب بجراح في ح 48 AEL، تجديد ~ 50 ٪ من الخلايا العصبية دك بهم dendrites (الشكل 2). في ال 50 في المائة المتبقية، تغزو dendrites المجاورة وتغطي مساحة شاغرة. بالإضافة إلى ذلك، يتم تقليل إمكانية تجديد هذه الخلايا العصبية إذا أصيب في مرحلة التطوير في وقت لاحق.
إكسون التجدد في الجهاز العصبي المركزي
فنك إكسون الضرر بمعدل بقاء يرقات تختلف إلى حد كبير ويعتمد على العمر الذي هو الناجم عن الإصابة. استناداً إلى التجربة، اليرقات 48-72 ساعة AEL وعادة ما يكون أعلى معدل للبقاء على قيد الحياة (> 60 في المائة) بين مختلف مراحل اختبارها. البقاء اليرقات أصغر سنا من ح 48 AEL سيئة بعد الإصابة، بينما في تلك التي مضى عليها أكثر من 72 ح AEL من الصعب إدخال الضرر فنك. وعلاوة على ذلك، أنه من الأسهل للحث على الإصابة في الجزء الخلفي من كوميسوري من الأمامية، كما أن هذه الأجزاء الخلفية لفنك أقرب إلى السطح البطني وهكذا أكثر يسرا بالليزر (الشكل 3A).
لتصيب الفئة الرابعة دا العصبية محاور عصبية في الجهاز العصبي المركزي، جبل اليرقات كما تم وصفه سابقا (الشكل 3A). تحت المجهر، موقع هيكل سلم مثل حزم إكسون التي تشكل جزءا من فنك (الشكل 3 ألف)، وأداء أكسوتومي كما هو مبين. ويؤكد الانحطاط في 8 ح تقييم منظمة العفو الدولية والتجدد في ح 24 و 72 منظمة العفو الدولية. كما هو موضح في الشكل 3، محاور عصبية في 8 ح منظمة العفو الدولية قد بدأت بالفعل تتدهور، وهو لاحظ التجدد إكسون في ح 24 منظمة العفو الدولية، في حين ولا يزال الحطام إكسون يمكن الاطلاع على جميع أنحاء مواقع الإصابة. محاور عصبية WT إظهار نمو محدود في فنك وتعجز عن إعادة الثغرات الناتجة عن الإصابة (الشكل 3B). لقياس قدرة التجدد محاور عصبية المصابين، طول نمو بعد الإصابة ويتم قياس وطول الجزء commissure (Y في الشكل 3 ألف) يستخدم للتطبيع (الشكل 3).
رقم 1: دا العصبية إكسون التجدد في المحيط يعرض خصوصية الفئة. (أ وب) التخطيطي الرسم تظهر موضع لليرقات. (ج) التخطيطي الرسم من الدرجة الثالثة دا الخلايا العصبية. (د) محاور عصبية داف الخلايا العصبية دا الثالث فئة، المسمى مع 19-12-Gal4، UAS-CD4--تدجفب، الريبو-Gal80/+، إلا أن تنمو. (ﻫ) التخطيطي الرسم من الصف الرابع دا الخلايا العصبية. (و) محاور عصبية فعدا الخلايا العصبية دا في الفئة الرابعة، المسمى ب ppk-CD4--تدجفب/+، تنمو خارج موقع الآفة. (D و F) الخط الأحمر يشير إلى طول إكسون في حين يمثل خط أخضر متقطع المسافة بين خلايا الجسم ومحور عصبي تتلاقى نقطة (مبدئي). النقطة الزرقاء يمثل نقطة التقاء إكسون. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: دا العصبية تغصن التجدد. (أ) التمثيل توضيحية للصف الرابع دا الخلايا العصبية. (ب) تمثيل توضيحية تغصن التجدد في دك العصبية دا من الدرجة الرابعة، المسمى ب ppk-CD4--تدجفب/+. التذرية الليزر يستهدف نقطة الفرع الرئيسي، ويجري في ح 48 AEL. ويتأكد في إصابة ح 24 منظمة العفو الدولية ترانسيكشن نورت، وهو كمياً التجدد في ح 72 منظمة العفو الدولية. Dendrites من الخلايا العصبية دك تثبت إعادة نمو كبيرة، مع فروع الجذعية جديدة نبتت من الساق المقطوعة لبلاط المساحة الشاغرة. تجدر الإشارة إلى أن فروع محطة طرفية جديدة يتم إضافتها بشكل مستمر إلى dendrites يصب في هذه المرحلة الإنمائية. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: دا العصبية إكسون التجدد في فنك. (أ) الرسم التخطيطي ليرقة المورفولوجية التي شنت على شريحة وتصويرها تحت المجهر. في الفصل الرابع دا محاور عصبية العصبية في فنك تصور في ppk-CD4tdGFP/+ اليرقة. وترد جزأين commissure مرشح في التكبير في الصورة أو الرسم التخطيطي. كل واحد منهم لديه إصابة موقعين (دوائر حمراء). (ب) صور [كنفوكل] الجزء المصاب واحد تصويرها في 8 و 24 و 72 ساعة بعد الإصابة (منظمة العفو الدولية). تصوير خطوط حمراء محاور عصبية ريجرووينج. (ج) قياس والتطبيع لتنمية مجددا محاور عصبية. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عند تقاطع إعداد الطيران، يمكن أن تختلف عدد الإناث والذكور المستخدمة تبعاً الأنماط الجينية وعدد اليرقات بحاجة لإجراء تجارب محددة. لوزن الذباب، يستخدم الصليب النموذجية 10 من الإناث والذكور 5. وقد ضاقت الإطار مجموعة، تبعاً لدقة سن اليرقات المطلوبة. على سبيل المثال، سوف تسفر عن فترة جمع 2-ح يرقات سكان أكثر تجانساً. في هذه الحالة، سوف يساعد استخدام الإناث 20 أو أكثر العذراء لإعداد الصلبان تسفر عن البيض كافية. العائد من اليوم الأول عادة الشحيحة، وجمع حتى اللوحة مع البيض اثنين أو أكثر من أيام بعد إعداد الدائرة. عند زيادة استزراع اللوحة مع البيض، من المستحسن أن نقع في الأنسجة في صحن بتري 60 ملم في 0.5% حمض البربيونيك الحل بدلاً من الماء، والتي سوف لا تساعد فقط على الاحتفاظ بالرطوبة في الطبق ولكن أيضا تجنب نمو العفن.
عند إعداد أجهزة للتخدير اليرقات والمتصاعدة، تأكد من استخدام طبق زجاج لأنه سوف تذوب خماسي البروم ثنائي الفينيل من خلال المواد البلاستيكية. الطبق الزجاج يقع في بلاستيك 15 سم طبق بيتري في حالة حدوث تسرب. المناديل الورقية تساعد على الحفاظ على خماسي البروم ثنائي الفينيل في الطبق بحيث اليرقة يمكن أن فعالية خرج من بخار البروم ثنائي الفينيل. من المستحسن استخدام العنبر إسقاط الزجاجات لتخزين مختبرين خماسي البروم ثنائي الفينيل وإضافة البروم ثنائي الفينيل في قطرات مع القطارة الزجاج. تجديد الاثير ودائما طبقة من السائل خماسي البروم ثنائي الفينيل في الجزء السفلي من الطبق للتأثير الأمثل.
توقيت التعرض خماسي البروم ثنائي الفينيل الحرجة: التخدير الناقص يؤدي إلى استرداد اليرقة في منتصف الدورة التصوير والصور المهتزة؛ سوف يتسبب جرعة زائدة من التخدير، أو الاتصال المباشر مع سائل البروم ثنائي الفينيل، الفتك. إلى أقصى حد ممكن بقاء الطفل ومعدل النجاح، لدينا القاعدة الأساسية كما يلي: للسندات الإذنية الإصابة/تصوير، إخراج اليرقة حالما يتوقف ذيله رفة؛ للجهاز العصبي المركزي، انتظر حتى تصبح اليرقة كامل بلا حراك، لا سيما في الجزء المتعلق بالرأس. حركة طفيفة حتى يتداخل مع الإصابة والتصوير من محاور عصبية فنك. يرقات القديمة تميل إلى يستغرق وقتاً أطول لضرب. وعادة ما يستغرق أقل من 2 دقيقة لليرقات أصغر سنا من 72 ح AEL و 2-5 دقائق لليرقات أقدم من 72 ح AEL.
عند إعداد كثافة الليزر اثنين-فوتون للإصابة، يتم تحديد القيمة بواسطة إشارة fluorescence الأنسجة التي تم الحصول عليها من المسح الضوئي "لايف". الإصابة يتم تقديمها بواسطة المسح الضوئي '' استمرار '' كما هو الحال في الخطوة 3، 3. الزيادة الناجمة عن الإصابة في الأسفار ويرجع أوتوفلوريسسينسي في موقع الإصابة ويخدم كمؤشر جيد لقطع نورت. بشكل عام، فإنه يأخذ s 1-10 لمعرفة المصطلحات الأسفار. من المهم للتحكم في وقت المسح مرة واحدة مرتفعة الأسفار. لإصابة الجهاز العصبي المحيطي، من الضروري إيقاف المسح فورا. التعرض لفترة طويلة سيتم تكبير الصورة في موقع الإصابة وتلف الأنسجة المجاورة. ومع ذلك، هذا فرصة لضبط وقت المسح الضوئي والتعامل مع شدة الإصابة. إصابة ناجحة يجب أن يكون قطرها حجم آفة أقل من 3-4 ميكرومتر. لإصابة إكسون فنك، يتم تضمين محاور عصبية فنك أعمق بكثير مقارنة بالعصبية دا السندات الإذنية الليزر محاور عصبية/dendrites، التي هي حق تحت الجلد، ومن ثم تتطلب أعلى كثافة. ونحن عادة ترك المسح الضوئي في لبضع ثوان أكثر. وهذا للتأكد من أن حزمة كاملة إكسون هي تقطع. إذا كان نصف قطر مواقع الآفة أكثر من نصف عرض الحزمة commissure، تحسب هذه المواقع إصابة ناجحة كما. هذه اليرقات يكون معدل بقاء منخفضة ولن يتم تضمين في التحليل.
لتجديد إكسون، يشبه قدرة التجدد عبر مراحل اليرقات. ولكن لتجديد تغصن بعد قطع تغصن واحد، يتم تقليل التجديد المحتملة بعد 72 ح AEL19. وهكذا تتم إصابة إكسون عادة في ح 48-72 ح AEL وإصابة 48 ح AEL، مع تقييم للتجدد في ح 120 AEL تغصن. يمكن أيضا استخدام اليرقات 24 ساعة AEL، لكنها تتطلب معالجة أكثر حذراً، ونظرا لصغر حجمها. بوبات اليرقات بعد 120 ح AEL، مما يجعل التصوير أكثر تحديا. لذلك، لدينا نقطة النهاية عادة 120 ح AEL.
ما هي العلاقة المتبادلة بين الانحطاط والتجدد؟ لإصابة الجهاز العصبي المحيطي، ح 24 منظمة العفو الدولية، عادة إكسون/تغصن القاصي في وزن أكملت تنكس واليريان بينما لم يبدأ التجديد في هذه المرحلة الزمنية. ولذلك، نعتقد أن في وزن اليرقات، تنكس نيوريتيس مقطوعة سوى أثر محدود جداً على التجدد، على كل حال. لإصابة فنك، محاور عصبية في 8 ح منظمة العفو الدولية قد بدأت بالفعل تتدهور، وهو لاحظ التجدد إكسون في ح 24 منظمة العفو الدولية، في حين يمكن لا يزال العثور على الحطام إكسون حول مواقع الإصابة. لا يبدو الحطام كتلة التجدد. ومع ذلك، من الممكن أن تحت ظروف معينة، قد يكون هناك تداخل أو حتى الحديث المتبادل بين الانحطاط والتجدد. وفي الواقع، أفيد أن إزالة الأنقاض بعد تلف الأعصاب الطرفية في الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين، أبطأ من ذلك في صغار الحيوانات. في الوقت ذاته، رينيرفيشن أبطأ من الوصلات العصبية العضلية ولوحظ، التي يمكن أن تعزى إلى عدد أكبر من عوائق تجديد اللقاء محاور عصبية في الحيوانات القديمة. المثير للدهشة، ومع ذلك، محاور عصبية من الحيوانات الذين تتراوح أعمارهم بين إعادة بسرعة ورينيرفاتي مواقع الوصلات العصبية العضلية كفاءة عندما لا يواجه بالحطام32. وهذا يوحي بأن تسهيل إزالة الحطام قد يكون استراتيجية محتملة لتعزيز التجديد.
بالمقارنة مع غيرها من نماذج نيوروريجينيريشن، النموذج الإصابة العصبية الحسية يطير لديه مزايا فريدة من نوعها. نماذج الماوس عادة ما يستغرق أسابيع إلى أشهر لأداء وليست مناسبة لإجراء الشاشات الوراثية على نطاق واسع؛ C. ايليجانس فقط بنظام العصبي المركزي بدائية التي قد لا الخص عن كثب الحواجز التجدد في CNS الثدييات؛ مختلفة من الثدييات، الزرد CNS محاور عصبية تجديد قوة. دورة حياة سريعة من الذباب، وبراعة في علم الوراثة يطير وإمكانية الوصول والزخرفة النمطية محاور عصبية/dendrites من الخلايا العصبية الحسية يطير، وخصائص التجدد المميزة للخلايا العصبية الحسية يطير – نوع فرعي التجدد محددة في السندات الإذنية والتجدد محدودة في الجهاز العصبي المركزي – جعل المورفولوجية دا الخلايا العصبية نموذجا جذاباً لدراسة نيوروريجينيريشن. وعلاوة على ذلك، توحي الدراسات الأخيرة من خلايا الشبكية العقدة سحقت الماوس (رجكس) أيضا تحمل الأنواع الفرعية العصبية اختصاص تجديد متميزة؛ يمكن إعادة إنشاء بعض الأنواع الفرعية حكومة كمبوديا الملكية، في حين فشل الآخرين في الحزمة العصبية التي تبدو متجانسة لتنمو33. هذا الاستنتاج الهام يوحي بأن الاستراتيجيات الخاصة بنوع الخلايا العصبية ينبغي استغلالها لتعزيز التجديد والانتعاش وظيفية، وتحتج بشدة أن استحثاث الإصابة إكسون وتحليل التجدد اللاحقة ينبغي أن يجري في الخلايا العصبية بطريقة محددة النوع الفرعي. وعلاوة على ذلك، تظل المحددات الخلوية والجزيئية لهذا التجدد النوع-الخصوصية غير معروف إلى حد كبير19،33. ولذلك، يوفر الطراز الإصابة العصبية دا النموذج المثالي لمعالجة هذه القضايا.
مقارنة بالتجديد إكسون، الدراسات التي تركز على التجدد تغصن ندرة كثيرا. تغصن يقع الضرر، مثلما حدث في إصابات الدماغ الرضية، والسكتة الدماغية، والعديد من أشكال نيوروديجينيريشن، ولكن لا يعرف شيء تقريبا عن قدرة dendrites إصلاح وإصلاح الوصلات العصبية. مرة أخرى، يوفر النموذج الإصابة العصبية دا نظام الوصول للغاية التي تعرض الزخرفة النمطية وخصوصية الفئة19من التنظيم الزمني، لاستكشاف هذا الاتجاه.
كما تجدر الإشارة إلى أنه بينما من الممكن أن تصيب من إكسون مفردة مسماة في السندات الإذنية، تتم إصابة الطريق في نتائج المؤتمر الوطني السيادي في الآفة حزمة من محاور عصبية. إذا رغبت في ذلك، يمكن ماركم34 أو في حزب العمل الفيجي استنساخ35 النهج لتسمية واحدة من محاور عصبية في الجهاز العصبي المركزي. بالإضافة إلى ذلك، عندما تتم تسمية الخلايا الدبقية في وقت واحد مع مرفب (الريبو-Gal4، مرفب UAS)، يلاحظ تراكم عمليات إطلاق على وجه التحديد في موقع الآفة. وعلاوة على ذلك، التعبير عن Ptp99A، هومولوج تطير من شوندروتن سلفات بروتيوغليكان (كسبج) فوسفاكان/PTPRZ1، أعلى-وينظم في موقع الآفة. Ptp99A يموضع اشتركت مع الخلايا الدبقية ويحيط الموقع الضرر، وتشكيل بنية شبيهة بخاتم مشابه لما قيل عن الندوب أستروجليال في الثدييات19،،من3637. وفي الختام، نموذج الإصابة العصبية دا، عندما تقترن بعلامات من أخرى أنواع الخلايا مثل الخلايا الدبقية أو الخلايا المناعية، سيسمح في فيفو المراقبة في الوقت الحقيقي من التفاعلات متعددة الخلايا بين العصبية المصابين ومحيطها البيئة.
بينما يوفر لنا هذا النموذج الإصابة العصبية الحسية يرقات ذبابة الفرص للعثور على المنظمين نيوروريجينيريشن المحتملة في الجهاز العصبي المحيطي والجهاز العصبي المركزي، لا يزال لديه العديد من القيود. أولاً، ليس من الإنتاجية العالية في هذه المرحلة. عادة، يمكن أن يكون صاحبها شخص واحد الوراثية 5-6 في أسبوع واحد. أنه يحتاج إلى الأمثل بغية القيام على شاشة غير متحيزة. ثانيا، كما يمكن أن تستمر التخدير الاثير على اليرقات من عدة دقائق إلى لا يزيد عن عشرين دقيقة، ليس الأمثل لتصوير طويلة الأجل. وهكذا، يتم اختيار وقت محدد النقاط التي هي الممثل لانحطاط إكسون والتجديد على التوالي للتصوير. ثالثا، على الرغم من أن هذا البروتوكول هو استحداث وسيلة لإيذاء محاور عصبية على وجه التحديد، إمكانية إلحاق ضرر بالانسجة المحيطة لا يمكن تماما استبعاد. في فنك، يمكن أن تكون هذه الأنسجة الخلايا الدبقية، ومحاور عصبية و dendrites من الخلايا العصبية الأخرى. للتقليل من هذه المحاذير المحتملة، علينا التقليل من مواقع الإصابة وتطبيق أدنى ممكن طاقة الليزر وتنفيذ نفس الإجراءات بالتوازي مع كل مراقبة وتجربة المجموعات. الرابع، عملية إعداد نموذج إصابة الجهاز العصبي المركزي، تم اختبار مواقع إصابات مختلفة، بما في ذلك في المواقع قريبة من تيرميني إكسون التي اخترنا لاستخدام والدخول نقطة من محاور عصبية إلى فنك. تم العثور على نقاط الدخول لتكون أكثر صعوبة إيذاء لأنها أعمق في الأنسجة وأكثر عرضه للانتقال. وهكذا، لهذه الأسباب العملية، اخترنا للطريقة الحالية، التي أكثر اتساقا وأفضل من التي تسيطر عليها، وجيدة لإجراء التجارب على نطاق أوسع. أحد الشواغل المحتملة، كما ذكر أعلاه، هو إمكانية إصابة الأنسجة المجاورة، مثل مكونات بوستسينابتيك والخلايا الدبقية. من ناحية أخرى، أنها معلقة السؤال كيف تلف الأنسجة المحيطة بها التأثير في الانحطاط والتجديد لمحاور عصبية. على سبيل المثال، كيف يؤثر ندبة الدبقية إكسون التجدد. وهذا يشكل سببا آخر لماذا لدينا نموذج الضرر قد تشبه نماذج الإصابة في الثدييات، وفيه محاور عصبية والأنسجة المحيطة بمواقع الآفة عادة ما يصابون في وقت واحد.
الليزر إصابة تليها الوقت الفاصل بين الفحص المجهري مقايسة حساسة لدراسة تجديد إكسون/تغصن. ومع ذلك، هو أحد الشواغل الرئيسية لهذا التحليل التكلفة المتصورة، الذي يتراوح من 100 ألف دولار <$ 10 ك لأشعة الليزر المنخفضة نبض الحالة الصلبة، $25-100 ك لليزر femtosecond > لاثنين-فوتون أشعة الليزر. وهناك عدة مناقشات جيدة حول نظم الليزر المختلفة المستخدمة في أكسوتومي29،،من3839،،من4041،42،43، 44 , 45-وباختصار، الليزر التقليدية الأمثل لقطع محاور عصبية داخل حول 30-50 ميكرون من على سطح الأرض. سيكون هناك مزيد من الأضرار الجانبية مع الليزر الثانية نانو وبيكو بالمقارنة مع ليزر femtosecond، لا سيما وأن يزيد عمق المنطقة المستهدفة من45. لإصابة محاور عصبية في فنك، عمق الذي عادة حوالي 50-100 ميكرومتر، من الضروري الحد من تلف الأنسجة. في هذه الحالة، الليزر اثنين-فوتون المثل الأعلى، الذي يركز السلطة الليزر للمستوى البؤري، الحد من الأضرار الجانبية الأنسجة دون تعريض الأنسجة الاختراق. وفي الختام، نظام اثنين-فوتون مكلف ولكن يوفر أفضل الحفاظ على الدقة والأنسجة. بيد إلا إذا هي محاور عصبية السندات الإذنية هدفا أكسوتومي، ليزر النبض التقليدية قد يكون بديلاً أكثر بأسعار معقولة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر جيسيكا جولدشتيين لتقديم الدعم التقني. العمل في مختبر أغنية تموله المنحة المعاهد الوطنية للصحة R00NS088211، والفكرية وجائزة تنمية البرنامج الجديد مركز البحوث العاهات الخلقية (إيدرك).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous | Acros Organics | AC615080010 | |
| Halocarbon 27 Oil | Genesee Scientific | 59-133 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L | VWR | 97062-948 | |
| Agar powder, Alfa Aesar, 500GM | VWR | AAA10752-36 | |
| Grape juice | Welch’s | ||
| Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%) | VWR | 64-17-5 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Propionic Acid | J.T.Baker | U33007 | |
| Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12-544-D | 50 mm X 22 mm |
| Zeiss LSM 880 laser scanning microscope | Zeiss | ||
| Zen software | Zeiss | ||
| Chameleon Ultra II | Coherent |
References
- Yakura, J. S. Recovery following spinal cord injury. , (1996).
- Harel, N. Y., Strittmatter, S. M. Can regenerating axons recapitulate developmental guidance during recovery from spinal cord injury? Nature reviews. Neuroscience. 7, 603-616 (2006).
- Jurewicz, A., Matysiak, M., Raine, C. S., Selmaj, K. Soluble Nogo-A, an inhibitor of axonal regeneration, as a biomarker for multiple sclerosis. Neurology. 68, 283-287 (2007).
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7, 617-627 (2006).
- Sun, F., He, Z. Neuronal intrinsic barriers for axon regeneration in the adult CNS. Curr Opin Neurobiol. , (2010).
- Liu, B. P., Cafferty, W. B., Budel, S. O., Strittmatter, S. M. Extracellular regulators of axonal growth in the adult central nervous system. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 361, 1593-1610 (2006).
- Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal intrinsic mechanisms of axon regeneration. Annu Rev Neurosci. 34, 131-152 (2011).
- Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. Nogo limits neural plasticity and recovery from injury. Curr Opin Neurobiol. 27, 53-60 (2014).
- He, Z., Jin, Y. Intrinsic Control of Axon Regeneration. Neuron. 90, 437-451 (2016).
- Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
- Geoffroy, C. G., Hilton, B. J., Tetzlaff, W., Zheng, B. Evidence for an Age-Dependent Decline in Axon Regeneration in the Adult Mammalian Central Nervous System. Cell Rep. 15, 238-246 (2016).
- Geoffroy, C. G., et al. Effects of PTEN and Nogo Codeletion on Corticospinal Axon Sprouting and Regeneration in Mice. J Neurosci. 35, 6413-6428 (2015).
- Jin, D., et al. Restoration of skilled locomotion by sprouting corticospinal axons induced by co-deletion of PTEN and SOCS3. Nat Commun. 6, 8074 (2015).
- Wang, X., et al. Axonal regeneration induced by blockade of glial inhibitors coupled with activation of intrinsic neuronal growth pathways. Exp Neurol. 237, 55-69 (2012).
- Fang, Y., Bonini, N. M. Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila models of nerve injury. Annual review of cell and developmental biology. 28, 575-597 (2012).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Leyssen, M., et al. Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain. The EMBO journal. 24, 2944-2955 (2005).
- MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50, 869-881 (2006).
- Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes Dev. 26, 1612-1625 (2012).
- Song, Y., et al. Regulation of axon regeneration by the RNA repair and splicing pathway. Nat Neurosci. 18, 817-825 (2015).
- Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
- Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Curr Biol. 22, 590-595 (2012).
- Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
- Brace, E. J., DiAntonio, A. Models of axon regeneration in Drosophila. Exp Neurol. 287, 310-317 (2017).
- Hao, Y., Collins, C. Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 44, 84-91 (2017).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).
- Sugimura, K., et al. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
- Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432, 822 (2004).
- Wu, Z., et al. Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15132-15137 (2007).
- Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Mol Biol Cell. 21, 767-777 (2010).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33, 19480-19491 (2013).
- Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85, 1244-1256 (2015).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Buss, A., et al. NG2 and phosphacan are present in the astroglial scar after human traumatic spinal cord injury. BMC Neurol. 9, 32 (2009).
- McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar. J Neurosci. 19, 10778-10788 (1999).
- Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. J Microsc. 234, 1-8 (2009).
- Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Phys Rev Lett. 99, 158104 (2007).
- Venugopalan, V., Guerra, A. 3rd, Nahen, K., Vogel, A. Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation. Phys Rev Lett. 88, 078103 (2002).
- Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans. Opt Express. 16, 5963 (2008).
- O'Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Tsai, P. S., et al. Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems. Curr Opin Biotechnol. 20, 90-99 (2009).
- Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
- Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. J Vis Exp. , (2011).
