Summary
여기, 우리로 초파리 감각 신경- vivo에서 결합 하는 수지상 arborization (다) 신경 부상 모델, 라이브 영상, 2 광자 레이저 axotomy/dendriotomy, 그리고 강력한 비행 유전 도구 상자, 를 사용 하 여 프로토콜을 제시 잠재적인 발기인 및 neuroregeneration의 억제제 상영을 위한 플랫폼.
Abstract
손상 된 신경의 재 성장을 용량 신 경계 외상 후 neuroregeneration 및 복구 기능을 제어합니다. 지난 몇 년간 다양 한 내부 및 외부 억제 요인 축 삭 재생의 제한에 관련 된 발견 되었습니다. 그러나,이 금지 신호를 단순히 제거 추가 규제의 존재를 나타내는 성공적인 재생에 대 한 충분 하지 않습니다. 초파리 melanogaster, 과일 파리, 척추 동물, 인간을 포함 한와 진화론 보존된 유전자와 신호 경로 공유 합니다. 파리의 강력한 유전자 도구 상자를 결합 하 여 두 광자 레이저 axotomy/dendriotomy와 함께, 우리는 설명 여기 초파리 감각 신경-체계적으로 소설에 대 한 심사를 위한 플랫폼으로 수지상 arborization (다) 신경 상해 모델 재생 레 귤 레이 터. 간단히,이 패러다임) dendrite(s) 또는 axon(s) 2 광자 레이저, c) 라이브 confocal 영상 포스트 상해 및 d) 데이터 분석을 사용 하 여 애벌레, b) 병 변 유도의 준비를 포함 한다. 우리의 모델에는 단일 레이블된 뉴런, 축 삭, 및 주변 및 중앙 신경 시스템에의 잘 정의 된 신경 하위의 dendrites의 높은 재현성 부상 수 있습니다.
Introduction
후 중앙 신경 시스템 (CNS)에 부상 환자, 영구 장애 발생할 수 있습니다 및 또한 신경 퇴행 성 질환1,2에에서 돌이킬 수 없는 신경학 상 적자에 역할을 다시 생성 하는 축 삭의 무 능력 ,3,,45. CNS 환경 뿐만 아니라 본질적인 성장 능력 뉴런의 축 삭 외상 후 재생성 수 있습니다 여부를 결정 합니다. 세포 외 요인 oligodendrocyte, astroglial, 및 fibroblastic 소스에서 신경 성장4,6,7,8, 하지만 이러한 분자의 제거를 방해 하 보였다 만 제한5돋 아 수 있습니다. 본질적인 재생 신호 재생 성공5,9 에 영향을 미칠 수 있습니다 잠재적인 치료 목표를 대표 하지만 이러한 프로세스는 분자 수준에서 아직도 분명 하지. 영양 요소 신호 또는10Pten 인산 가수분해 효소 등 생 브레이크의 제거 증가 axonal 재생 특정 상황에서 발생할 수 있습니다. 개별적으로 효과적인 것으로 발견 하는 다른 방법의 조합 또한만11,12,,1314날짜 제한 전체 복구를 제공 합니다. 따라서, 타겟된 치료에 대 한 추가 경로 식별 하는 절망적 인 필요가 있다. 뿐만 아니라 자라나는 축 삭의 개시 여부와 축 삭 다시 올바른 대상, 개혁 시 냅 스 특이성, 와이어 및 달성 하는 방법 기능 복구 중요 한 의문점이 있습니다.
요약에서 기계 지시 된 축 삭 재생의 현재 이해는 매우 단편적인 여전히. 문제의 일부는 축 삭의 기술적인 어려움 포유류 실시간 재생, 소모, 비용과 수행 대규모 유전 스크린에 도전 하는 방식. 초파리 melanogaster, 다른 한편으로, 복잡 한 생물 학적 질문의 연구에 대 한 매우 강력한 시스템을 입증 했다. 과일 파리 유전자를 정의 하 고 신호 통로 기 막히게 인간에서 보존 하는 수단이 되었으며 인간의 조건, 광대 한 분자 유전학 도구를 통해 신경 퇴행 성 질환 등의 연구에 대 한 성공적인 모델 되었습니다. 유전자 기능15조작에 사용할 수 있습니다. 특히, 초파리 신경 상해 및 자라나15,16에 관련 된 유전자의 발견에 대 한 이상적인 도구가 될 여겨진다. 성인 머리 또는 애벌레 복 부 신경 코드 (VNC) 찌르는 바늘, 애벌레 VNC 또는 집게, 애벌레 신경 레이저 axotomy, 후 각 수용 체 신경 제거, 뇌 explants 부상, 신경 호감을 포함 한 몇 가지 비행 신경 상해 모델 개발 되었습니다. 그리고 날개 퇴직금15,17,18,19,20,21,,2223여 주변 신경 병 변. 최근 작품 활용 초파리 부상 모델 excitingly, 세포와 유전자 경로 일부는 포유류24에에서 보존 될 표시 되었습니다 신경 부상에 대응 하는 신 경계에 의해 사용에 대 한 우리의 이해 고급 ,25. 다시,이 신경 선의 소설 메커니즘을 식별에 대 한이 모델 생물의 유틸리티를 강조 한다.
여기에 설명 된 2-광자 초파리 애벌레 감각 신경 상해 레이저 기반 모델이 이다. 두 광자 레이저 zebrafish에서 vivo에서 200326에 축 삭을 처음 사용 되었다. 같은 해, 첫 번째 레이저 dendriotomy 초파리 27펄스 질소 레이저 사용 하 여 수행 했습니다. 잠시 후, 여러 선 충 C. 실험실 축 삭 재생28의 모델을 확립 펨 레이저를 사용 합니다. 2007 년, 우 동료 비교 및 선 충 C. 레이저29의 다양 한 종류에 의해 유도 된에서 레이저 부상 간의 차이점을 보고. 2010 년에 축 삭 재생 레이저 axotomy 후 처음 초파리30에 표시 했다. 이 광범위 한 레이저 부상 문학에 건물, 우리는 개발 조직 이웃의 최소한의 섭 동으로 대상된 사이트에 상해의 정확한 유도 허용, 2-광자 레이저를 사용 하 여 비행 신경 상해 모델 상대적으로 깨끗 한 제공 단일 셀 해상도와 neuroregeneration의 기본 및 외부 속성을 공부 하는 시스템. 특히, 우리 모두는 말 초 신 경계 (PNS)에서 수지상 arborization (다) 감각 신경에 대 한 부상 메서드의 집합 설정한 및 CNS. 다 신경 그들의 모 수석 분기 복잡성에 의해 주로 구별 4 가지 종류로 분류 될 수 있다: 431종류 I. 우리의 출판된 일 다 신경 재생 phenotypic 및 분자 수준에서 포유류 부상 모델 유사한 보여준다: 다 신경 클래스 4와 클래스 특정 재생 속성을 표시 하지만 나 III 다 신경 재생을 전시 하지 클래스는 PNS; 클래스 4 다 신경 축 삭 주변에 견고 하 게 다시 생성 하지만 그들의 재생 잠재력은 따라서 닮은 포유류; 지 루트 신경 절 (DRG) 신경, CNS에서 극적으로 감소 Pten 통해 mTOR 활동 강화 삭제 또는 Akt overexpression 비행19CNS 축 삭 재생 향상. 이 부상 모델을 활용 하 여 우리 유전 스크린을 수행 되 고 있다 식별 RNA 가공 효소 Rtca 축 삭 재생을 위한 진화론 보존된 억제 요인으로 세포 스트레스 및 RNA 수정20 축 삭 상해를 연결 .
제시 패러다임에서 부상 애벌레 클래스 IV 또는 III 다 신경, ppk 권총-CD4-tdGFP 또는 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80에 의해 표시 된 각각의 레이저 axotomy/dendriotomy를 통해 유도 된다. 부상 (h AEL) 누워 계란 후 약 48-72 h에 3rd 탈피 애벌레를 2nd 에 수행 됩니다. PNS에 대 한 axotomy 병 변 세포 체, CNS axotomy ~ 20 µ m 직경, VNC에 commissure에의 지역 및 기본 수지상 브랜치 포인트에 dendriotomy에서 축 삭 ~ 20-50 µ m의 섹션 타겟팅 됩니다. 같은 신경은 부상 (AI) 완전 한 transection, 확인 후 8-24 h 고 48-72 h 재생을 평가 하기 위해 AI에서 몇 군데. 시간 경과 confocal 영상 통해 변성 및 부상 vivo에서 개별 axons/dendrites의 재생 시간이 지남에 모니터링할 수 있습니다.
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Protocol
1입니다. 문화 접시와 병의 준비
- 포도 주스 한 천 배지 준비
- 비 커와 일시적으로 agar 완전히 녹아 때까지 저 어 약 4-5 분 동안 전자 레인지에 한 천 분말, 200ml 포도 주스와 192 mL ddH2O 10 g를 추가 합니다.
- 약 60 ° c 솔루션 진정 연기 후드, 4.2 mL 95% 에탄올과 4.0 mL 빙 초 산을 추가 합니다. 잘 ddH2오 믹스 400 mL에 솔루션의 전체 볼륨을 조정 합니다.
- 각 35 m m 플레이트에 대 한 솔루션의 약 2-3 mL를 추가 합니다. 400 mL 포도 주스 한 천 해결책의 총 약 120-150 번호판을 확인 합니다.
- 진정 하 판이 고 공고히 한 솔루션 10 분 기다립니다. 한 천 배지 각자 밀봉된 애 가방에 포도 주스를 포장 하 고 나중에 사용할 4 ° C에서 저장.
- Drosophila 문화 병의 준비
- 블레이드를 사용 하 여 초파리 문화 병의 1 개의 벽에 1.5 c m 측면 길이 삼각 구멍 펀치와 환기에 대 한 면의 2-2.5 cm 직경 공 구멍을 채우십시오.
- 효 모 반죽의 0.5 c m3 에 대 한 보충 포도 주스 한 천 배지와 병을 연결 합니다.
2입니다. 초파리 애벌레의 수집
- 성인 파리의 십자가를 설정합니다
- 장소 10 처녀 암컷과 5 남성 성인 문화 병 포도 주스 한 천 배지와 연결에 함께 난다.
- 병 바닥까지 25 ° C에서 되도록 놓습니다 포도 주스 한 접시에 알을 낳는 것 이다 파리. 하루에 적어도 한 번 효 모 반죽과 접시를 변경 합니다. 균질 성 발달 단계의 애벌레의 수확을 허용, 2-h 컬렉션 기간에 대 한 20 개 이상의 처녀 여성 및 10 남성 2.1.1 단계에서 시작 합니다.
- 0.5% 프로 산 성 솔루션에 배어와 젖은 조직, 예를 들어 60 mm 페 트리 접시에 25 ° C에서 격판덮개 문화. 산소 흐름을 차단 하지 않습니다 있도록 조직 정렬.
참고: 프로 산 솔루션 접시에 습도 유지 하 고 곰 팡이의 성장을 피하기 위해 사용 됩니다.
- 특정 나이의 애벌레를 수확
- 효 모 반죽 없이 새로운 포도 주스 한 접시에 원하는 단계, 예를 들어 2nd 3rd 탈피 애벌레 (AEL) 누워 계란 후 48-72 h에 애벌레를 전송 집게의 쌍을 사용 합니다.
- 누 룩에서에서 제거 애벌레의 피부 하 여 레이저 axotomy 및 이미징 효 잠재적인 방해에서 방지 하기 위해 새로운 접시에 주변 탐색 합니다. 또는, PBS의 접시에 그들을 세척 하 고 티슈 페이퍼의 조각에 잠시 건조 하 여 애벌레 청소 철저 하 게.
3. 2-광자 부상과 Confocal 영상
- 현미경 설치
참고: 두 광자 레이저 스캔 현미경 confocal 레이저는이 실험을 위해 사용 되었다 하지만 해당 설치 다른 시스템도 충분 합니다. 두 광자 레이저 (930 nm) 부상과 아르곤 레이저를 전달 하기 위해 사용 되었다 (488 nm) GFP의 confocal 영상을 위해 사용 되었다.- 각 세션의 시작 부분에서 2 광자 레이저 / confocal laser(s)와 현미경 설정. 이미징 소프트웨어를 엽니다.
- 930에서 2 광자 레이저 GFP를 이미징에 대 한 다음 매개 변수를 설정 하는 2 광자 부상, nm (1950 mW).
- 라인 스캔 모드를 선택 합니다. 줄곧 pinhole을 엽니다. ~ 20%에 레이저 강도 증가 (390 mW).
- 프레임 스캔으로 512 x 512를 선택 합니다. 최대 스캐닝 속도 (일반적으로 0.77 µs에 픽셀 유지 시간)를 사용 합니다. 평균 수는 1 비트 깊이 8 비트 확인 합니다.
- 하 ~ 750, 고 0 오프셋 설정된 얻을.
- 2 P GFP 930 제거를 쉽게 허용으로 실험 프로토콜 재사용 미래에이 사전 설정 저장 실험.
- 488에 아르곤 레이저 GFP를 이미징에 대 한 다음 매개 변수를 설정 하는 confocal 영상, 대 한 뉴 멕시코:
- 인수 탭 그리고 Z-스택을 선택 합니다.
- "레이저"에서 488 nm의 아르곤 레이저의 전원을 켭니다.
- 채널선택 488 m m 레이저, 레이저 파워 5-10%를 증가 이동 합니다. Pinhole에 대 한 1-2 공기 단위 (AU)를 사용 합니다. 650에 이득을 조정 합니다.
- 획득 모드에서 프레임 스캔으로 1024 x 1024를 선택, 최대 검색 속도, 2의 평균 수 8 비트의 비트 심도 사용 하 여.
- GFP 이미징이 미리 설정된 실험 프로토콜을 저장 합니다.
- 애벌레 마 취 diethyl 에테르와 장착
- 증기 두건에서 15 cm 플라스틱 페 트리 접시에에서 60-m m 유리 접시를 놓습니다. 배 고 누워 유리 접시의 바닥에 휴지 조각 다음 조직에 포도 주스 한 접시를 놓습니다. 유리 그릇에 휴지가 젖 었는 접시에 남아 있는 액체 에테르의 레이어는 포인트 diethyl 에테르를 추가 합니다. 항상 뚜껑을 유지.
- 준비 halocarbon의 한 방울을 유리 슬라이드 중앙에 27 오일. 4 관광 명소는 coverslip 지원 슬라이드의 네 모퉁이에 진공 그리스의 추가 합니다.
- 집게를 사용 하 여 청소 유 충 데리 러와 60 m m 유리 접시에 한 접시에 그것을 배치. 유리 접시의 뚜껑을 커버 하 고 유 충 이동 중지 될 때까지 기다립니다. PNS 부상/이미징, 유 충을 꺼내 꼬리 중지 꿈 틀 자 마자. CNS에 대 한 전체 애벌레 움직이지 않는, 될 때까지 기다릴 특히 머리 세그먼트.
참고: 에테르 노출의 타이밍은 중요 합니다. 토론을 참조 하십시오. - 신중 하 게 마 취 유 충을 선택 하 고 슬라이드에 halocarbon 오일 방울 머리 똑바로 장소. 슬라이드 위에 coverslip을 추가 합니다. 부드러운 압력을 사용 하 여 때까지 유 충 (그림 1A)를만 지는 coverslip에 밀어.
- 그는 신경/축 삭/모 수석의 현미경 렌즈에 가까운 위쪽에 왼쪽 이나 오른쪽, 애벌레를 향해 coverslip을 부드럽게 눌러 유 충의 위치를 조정 합니다.
- 모두는 tracheas 표시 되도록 PNS 부상, 유 충 등 사이드를 탑재 합니다. 다음 클래스 III 다 신경 축 삭 (그림 1B 및 1 C), 클래스 4 다 신경 축 삭 (그림 1B , 1E), 부상에 대 한 90도 또는 ~ 30 클래스 IV 다 신경 모 수석 (부상도 부상에 대 한 왼쪽 유 충 ~ 30도 롤 그림 2A)입니다.
- CNS 상해에 대 한 관심의 영역이 z-평면에서 현미경 렌즈에 가장 가까운 되도록 완벽 하 게 복 부 쪽 (그림 3A), 수 유 충을 놓습니다.
- 두 광자 레이저에 의해 부상
- 현미경 애벌레와 슬라이드를 놓고 무대에서 슬라이드 홀더를 가진 장소에서 안전 합니다. 유 충을 찾을 수 (0.3 없음) X 10 사용 하 여 목적.
- coverslip에 객관적인 오일 1 방울을 추가, (1.3 없음) X 40으로 전환 목표는 초점을 조정 하 고.
- 스캔 모드를 전환 하 고 실험 프로토콜 2 P GFP 930 절제를 다시 사용 합니다. Pinhole 줄곧 열 다는 것을 확인 하십시오.
참고: 구성 해야 최적화 개별 시스템에 기반으로 합니다. - (ROI), 관심 영역을 찾으려고 라이브 모드를 시작 하 고 적절 한 확대와 좋은 이미지 품질을 달성 하기 위해 설정을 세부적으로 조정할.
참고:이 단계의 목적은 최고의 품질의 이미지를 복용 하는 것 보다는 신경/축 삭/모 수석, 다치게 하 찾는 것입니다. 따라서, 최소한의 설정 대상 영역을 시각화 하기 위해 충분 한를 사용 하 여 노출 과도 또는 photobleaching를 피하기 위하여. - 자르기 단추를 사용할 수 있게 됩니다 있도록 라이브 검색을 중지 합니다. 스틸 이미지는 로드맵 역할을 하자. 자르기 기능을 선택 하 고 스캔 창 부상 될 대상에 초점을 조정 합니다.
- 상해의 예비 사이트의 크기를 투자 수익을 줄일 수 있습니다. 예를 들어 그냥 축 삭 또는 상해의 정밀도 보장 하 고 주변 조직에 손상을 줄일 수 있는 모 수석의 폭을 커버. 필요한 경우 확대 투자 수익에 자르기 전에 더 정확한 부상에 대 한 허용 합니다.
- 새로운 이미징 창을 엽니다. 스캔 속도 감소 시키고 레이저 강도 증가 한다. 라이브 모드에서 스캔 조직 형광 신호에 따라 레이저 강도 증가 결정 합니다.
- 일반적으로, PNS 부상에 대 한 25% 및 VNC 부상에 대 한 50-100%에서 시작 하는 2 광자 레이저 강도 설정 합니다. PNS 축 삭 상해에 대 한 레이저 강도 ~ 480 mW 및 픽셀 인지 확인 유지 시간 8.19 μ s 이다. VNC 축 삭 상해에 대 한 레이저의 강도 및 픽셀 유지 시간은 일반적으로 965-1930 년 mW 8.19 32.77 µs, 각각 확인 합니다.
- 연속 스캔을 시작 합니다. 연속 단추를 가리키면 커서를 둡니다. 이미지에 주의깊게 감시 하 고 형광에 있는 급격 한 증가 관찰 하자마자 검사를 중지 합니다.
참고: 형광 스파이크의 모양을 부상 사이트에 자동 형광 때문 이다. - 설정을 다시 사용 하 여 라이브 모드로 다시 전환 합니다. 그냥 초점을 조정 하 여 대상 관심 영역을 찾아.
참고: 성공적인 상해의 좋은 표시는 작은 분화구, 고리 모양의 구조, 또는 부상 사이트에서 지역화 된 파편의 외관 이다. - 다음 뉴런에 이동 하 고 반복 단계 3.3.5, 하나의 동물에 여러 신경 손상에서. 또는 점차적으로 증가 하는 힘 및 초기 부상 충분 하지 않은 경우 검사 속도 줄이는 동안 3.3.5 단계를 반복 합니다.
참고: 경우에는 레이저 파워는 너무 높은, 큰 손상된 영역 표시 됩니다 후 부상 라이브 스캔 이미지에. 너무 많은 부상 유 충의 죽음을 일으킬 수 있습니다. - 신중 하 게 제거 하는 coverslip 고 부상된 유 충 효 모 반죽과 새로운 접시에 전송 유 충을 복구 합니다. 집게;와 한 접시에 여러 동굴을도 랑 또는, 전체 접시 접시 밖으로 크롤 링 하는 유 충의 가능성을 줄이기 위해 사용 하는 대신 접시에 한 천의 섬을 확인 합니다.
- 젖은 조직 (0.5% 프로 산 솔루션 젖 었)와 문화 실내 온도 또는 25 ° C에서 60 mm 페 트리 접시에 접시를 넣어
참고: 유 충 약 25 ° c.에에 비해 실 온 (22 ° C)에서 추가 일에 대 한 애벌레 단계에 유지 됩니다.
- 이후 부상 confocal 영상
- 이미지 마 취와 다음 confocal 레이저 이미징 단계 3.2에서 장착의 동일한 절차를 사용 하 여 유 충을 준비 하 여 원하는 시간 지점에서 부상된 유 충.
참고: 이미지 확인 axonal 상해 상해 (AI) 후 24 시간 및 48 h AI (클래스 4 다 신경) 또는 72 h 재생을 평가 하기 위해 AI (클래스 III 다 신경) 유 충. - 10 X 목표를 사용 하 여 유 충을 찾아 (0.8 없음) X 25로 전환 후 목표. GFP 이미징실험 프로토콜을 다시 사용 합니다.
- 라이브 버튼을 클릭 하 고 이전 부상 같은 뉴런을 찾을.
- 라이브 검색 창에서 첫 번째 및 마지막 Z 위치를 설정 합니다. 중지를 Z 스택 이미지를 얻으려고 시작 실험 을 클릭 합니다.
참고: 재생의 정량화가 가능한 이미지를 캡처할 때 정규화 지점 (축 삭 수렴 지점) 포함 되어 있는지 확인 (그림 1D, 1 층)-이 설명 데이터 분석 섹션에서 추가. - 전환 이미지 처리하, 촬영, 이미지를 선택 하 고 최대 강도 투영을 생성. Z-스택 및 최대 강도 프로젝션 이미지를 저장 합니다.
- 이미지 마 취와 다음 confocal 레이저 이미징 단계 3.2에서 장착의 동일한 절차를 사용 하 여 유 충을 준비 하 여 원하는 시간 지점에서 부상된 유 충.
4. 데이터 분석
- 처리 하 고 이미징 소프트웨어 또는 ImageJ를 사용 하 여 이미지를 계량.
- PNS에서 축 삭 재생의 정량화
- 재생 비율, lesioned 했다 모든 axons 중 축 삭 재생의 %는 계산 합니다. 으로 부상 사이트 넘어 regrows 재생성으로 축 삭을 점수.
- 측정 재생 길이, 축 삭 길이 증가입니다. ImageJ로 측정, 세그먼트 선 도구를 사용 하 여 재생성 된 축 삭을 추적 하 고 분석 메뉴에서 측정값 을 사용 하 여 재생성 된 축 삭을 대표 하는 라인의 길이.
- 정규화 된 축 삭 길이 증가 재생 지를 계산 합니다.
참고: 축 삭 길이 셀 바디와 수렴 하는 지점 (DCAC)-축 삭 길이/DCAC (그림 1D 및 1F) 축 삭 사이의 거리에 의해 정규화 됩니다. 이 값 애벌레 스케일링은 어떤 axonal 성장에 대 한 계정을 수 있습니다. 양수 값 재생, 0 의 값은 아무 재생 나타내고 음수 값은 철회.
- 모 수석 중생의 정량화
- 재생 비율, 다 신경 절단 하는 모든 사람들 사이에서 %는 분명 모 수석 자라나 표시를 계산 합니다.
참고: 모 수석 자라나는 경우 새로운 긍정적인 dendrites 철회 수지상 줄기에서 및 부상 사이트 넘어 밖으로 regrow로 점수입니다. 부상 사이트 결정 랜드마크로 그리고 어떤 경우에, 잔여 상해 유도 autofluorescence 쉽게 표시. - 지 포인트의 증가, 부상 후 새로운 모 수석 분기 포인트의 추가 계산 계산 합니다.
- 총 모 수석 길이 증가, 부상 후 추가 된 모든 새로운 모 수석의 누적 길이 계산 합니다.
- 재생 비율, 다 신경 절단 하는 모든 사람들 사이에서 %는 분명 모 수석 자라나 표시를 계산 합니다.
- CNS 축 삭 재생의 정량화
참고: 병 변 사이트는 처음으로 지점 몇 군데 (그림 3B)에 변성을 보여줍니다, 그것은 재생 길이 속도의 분석에서 포함 될 것입니다.- 측정 재생 길이regrowing 축 삭의 길이입니다.
참고: 단일 병 변 사이트의 regrowing 축 삭 부상 전에 원래 축 삭 경로 원본으로 식별 됩니다. - Normalized 재생 길이, 재생 길이 commissure 세그먼트-commissures ("Y" 그림 3A 와 3B) 사이의 경도 거리의 길이를 정규화를 계산 합니다.
참고:이 값 애벌레 크기 차이의 효과 대 한 올바른 수 있습니다. - 재생 속도, 재생 했다 lesioned, 특정 유전자 형의 재생 능력을 반영 하기 위해 모든 세그먼트 사이 세그먼트의 %를 계산 합니다.
- 측정 재생 길이regrowing 축 삭의 길이입니다.
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Representative Results
다 신경 클래스 특이성 뿐 아니라 주변 및 중앙 신경 조직 사이 잠재적인 차동 재생을 보여줍니다. 이 축 삭 재생 (를 사용 하 여 클래스 IV PNS 부상)로 (클래스 IV CNS 상해와 클래스 III PNS 부상) 재생에 대 한 금지는 그에 필요한 새로운 요소에 대 한 화면에 독특한 기회를 제공 합니다.
PNS에서 축 삭 재생
예를 들어, 클래스 III과 클래스 4 다 신경 세포의 재생의 특성을 설명 합니다. 이러한 신경 양측 각 몸 세그먼트에 있습니다. 여러 신경 같은 유 충;에 손상 될 수 있습니다. 복 부 세그먼트 a 7-a 2의 오른쪽에 일반적으로 3-4 신경. 클래스 III 및 클래스 IV 다 신경 수 구상 될 UAS-CD4tdGFP, 19-12-Gal4 repo-Gal80 와 ppk 권총-CD4tdGFP, 각각. Anesthetize 고 설명, 관심의 다 신경 (그림 1A 및 1B)을 직면 하는 애벌레의 위치 조절 48-72 h AEL 애벌레를 탑재. 우리는 일반적으로 클래스 III ddaF 및 클래스 IV v'ada 신경 (그림 1C 와 1E)을 다치게. Axotomy를 수행 하 고 설명 된 대로 애벌레를 복구. 조금 후에 부상 (AI), 애벌레는 수술과 전시 정상적인 운동에서 복구할가지고 있습니다. 생존 율 여기 일반적으로 80% 이상입니다. 죽 었 거 나 아픈는 애벌레를 삭제 합니다. 설명 된 대로 나머지를 다시 탑재 하 고 변성을 평가. 24 h AI, 원심 축 삭이 시간 포인트19, 변성을 완료 해야 하 고 축 삭 줄기는 쉽게 보이는 (그림 1D 및 1F) 될 것입니다. 48 h AI 클래스 IV 다 신경 또는 72 h 클래스 III 다 신경에 대 한 재생을 평가 하기 위해 AI에서 같은 애벌레 다행인 우리는 일반적으로 실험 조건 당 적어도 20 부상된 뉴런을 평가 하고자 합니다. (야생 타입) WT에에서 동물, 반면 절단된 클래스 IV da 뉴런 부상 사이트 (그림 1 층), 클래스 III 다 신경 넘어 재생성 해야 됩니다 ~ 70% 일반적으로 regrow, 하지에 의해 입증 성장 콘 (그림 1D) 연기.
모 수석 재생
우리는 일반적으로 클래스 4 다 신경 ddaC (그림 2A)에서 dendriotomy를 수행합니다. 도식 다이어그램 에서처럼 기본 수지상 분기 지점으로 부상이 타겟입니다. 48 h AEL 부상 때 경험에 따라, ddaC 뉴런의 50%는 그들의 dendrites (그림 2B)를 다시 생성 합니다. 나머지 50%에서 이웃 dendrites 침략 하 고 빈 공간을 커버. 또한, 이러한 신경 세포의 재생 잠재력 나중 발달 단계에서 부상 하는 경우에, 감소 된다.
CNS 축 삭 재생
VNC 축 삭 상해, 애벌레의 생존 율 실질적으로 변화 하 고는 부상 유발은 나이에 따라 달라 집니다. 경험을 바탕으로, 48-72 h AEL의 애벌레 일반적으로 가장 높은 생존 율을가지고 (> 60%)는 여러 단계 중 테스트. 48 h AEL 보다 젊은 애벌레 동안 72 h AEL 보다 더 오래 된 그들에서 VNC에 부상 소개 하기가 부상 후 제대로 살아남을. 앞쪽, 보다 후부 commissure 세그먼트에서 상해를 유도 하는 것이 더 쉽습니다 또한, VNC의 후부 이러한 세그먼트는 복 부 표면에 가까이 하 고 따라서 더 많은 액세스할 수 레이저 (그림 3A).
CNS에서 클래스 4 다 신경 축 삭 손상, 앞에서 설명한 애벌레 (그림 3A)를 탑재 합니다. 현미경 축 삭 번들의 사다리 모양의 구조 (그림 3A), VNC의 양식을 일부 찾아서 설명 axotomy를 수행. 변성은 AI와 재생 24 그리고 72 h 인공 지능 평가 h 8에 확인 됩니다. 그림 3B에서 같이, 8 h AI에서 축 삭 이미 타락 한, 시작 했습니다 그리고 24 h AI, 축 삭 재생은 관찰 축 삭 파편 여전히 부상 사이트 주변 찾을 수 있습니다. WT axons 제한 자라나는 VNC에 표시 하 고 부상 (그림 3B)에 의해 생성 된 간격을 연결할 실패 합니다. 손상 된 축 삭의 재생 능력을 계량 하는 자라나 후 부상 측정 길이 commissure 세그먼트 (Y에 그림 3A)의 정규화 (그림 3C) 사용 됩니다.
그림 1: 주변에 다 신경 축 삭 재생 표시 클래스 특이성. (A와 B) 회로도 애벌레의 위치를 보여주는 그림 클래스 III da 뉴런의 그림 (C) 회로도 (D)는 클래스 III 다 신경 ddaF, 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80 / +, 표시의 축 삭 regrow 하지. 클래스 4 da 뉴런의 그림 (E) 회로도 (F) 로 표시 된 클래스 IV 다 신경 v'ada의 축 삭 ppk 권총-CD4-tdGFP / +, 병 변 사이트 넘어 regrow. (D와 F) 빨간색 선은 녹색 파선 셀 바디와 수렴 하는 지점 (DCAC) 축 삭 사이의 거리를 표시 하는 동안 축 삭 길이 나타냅니다. 블루 도트 축 삭 수렴 점을 표시합니다. 눈금 막대 = 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 다 신경 재생 모 수석. (A) 클래스 IV da 뉴런의 설명을 표현. (B) 으로 표시 된 클래스 IV 다 신경 ddaC에 모 수석 중생의 설명을 표현 ppk 권총-CD4-tdGFP / +. 레이저 절제 및 기본 분기 지점에 대상 48 h AEL에서 실시 합니다. 24 h AI 부상에는 neurite transection 확인, 그리고 72 h AI 재생 계량입니다. DdaC 뉴런의 dendrites와 새로운 수지상 타일 빈 공간에 잘린된 줄기에서 돋 아 실질적인 자라나를 보여 줍니다. 그것은 새로운 터미널 지점이 발달 단계에서 손상 되지 않은 모 수석에 지속적으로 추가 됩니다 지적 가치가 있다. 눈금 막대 = 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: VNC에 다 신경 축 삭 재생. (A) 도식 초파리 유 충의 슬라이드에 그림과 현미경 이미지. 4 다 신경 축 삭 시각 VNC에 클래스는 ppk 모델-CD4tdGFP / + 유 충. 두 후보 commissure 세그먼트 확대 이미지와 도식 드로잉에 표시 됩니다. 그들의 각각 두 부상 사이트 (빨간색 원)이 있다. (B) 부상 (AI) 후 8, 24, 72 h에 몇 군데 한 부상된 세그먼트의 공초점 이미지. 레드 라인 regrowing axons 묘사. (C) 측정 및 축 삭 regrowing의 정규화 눈금 막대 = 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
플라이를 설정 넘어, 여성 및 남성 사용의 수는 genotypes 및 특정 실험에 필요한 애벌레의 수에 따라 달라질 수 있습니다. WT 파리에 대 한 일반적인 크로스 10 여성 5 남성을 사용합니다. 컬렉션 창 애벌레 나이 요구의 정확도 따라 축소 수 있습니다. 예를 들어 2-h 컬렉션 기간 더 균질 인구의 애벌레를 얻을 것입니다. 이 경우에, 20 또는 더 처녀 여성을 사용 하 여 십자가를 설정 도움이 됩니다 충분 한 달걀을 얻을. 첫날부터 수확량은 일반적으로 부족 한, 그래서 수집 계란 접시 챔버를 설정 후 2 개 이상 일. 때 더 계란 접시 배양, 조직 0.5% 프로 산 솔루션 뿐만 아니라 접시에 습도 유지할 것 이다 하지만 금형의 성장을 방지는 물 대신에 60 mm 페 트리 접시에 담가 두는 것이 좋습니다.
애벌레 마 취 및 장착에 대 한 장치를 설정할 때 때문에 에테르 플라스틱을 통해 녹을 것 이다 유리 접시를 사용 하 여 있는지 확인 하십시오. 유리 접시는 15 cm 플라스틱 페 트리 접시는 누출 경우에 지 내게 됩니다. 티슈 페이퍼는 유 충 수 있습니다 효과적으로 기 절 에테르 증기에 의해 접시에 에테르를 보존 하는 데 도움이 됩니다. 호박 에테르의 aliquots를 저장 하는 병을 포기 하 고 유리 dropper 방울에 에테르를 추가 사용 하 여 것이 좋습니다. 에테르를 보충 하 고 항상 최적의 효과 대 한 접시의 바닥에 액체 에테르의 레이어를 유지.
에테르 노출의 타이밍은 중요 한:이 마 취 이미징 세션 고 흔들리는 이미지; 유 충 회복으로 이어질 것입니다 마 취 과다, 또는 에테르 액체와 직접 접촉 치를 발생할 것입니다. 생존 및 성공률을 극대화 하기 위해, 엄지 우리의 규칙은 다음과 같습니다: PNS 부상/이미징, 꺼내 유 충으로 즉시 그것의 꼬리는 꿈 틀; 중지 CNS에 대 한 전체 애벌레 움직이지 않는, 될 때까지 기다릴 특히 머리 세그먼트. 심지어 약간의 운동 부상과 VNC axons의 이미징 방해할 것 이다. 더 오래 된 애벌레 밖으로 노크 하는 데 걸리는 경향이 있다. 그것은 일반적으로 72 h AEL 보다 젊은 애벌레에 대 일 분 미만 및 72 h AEL 보다 더 오래 된 애벌레에 대 한 2-5 분 걸립니다.
부상 2 광자 레이저의 강도 설정할 때 값 "라이브" 검사에서 얻은 조직 형광 신호에 의해 결정 됩니다. 상해는 단계 3.3 에서처럼 "연속" 검사에 의해 소개 된다. 형광의 부상 유발 증가 부상 사이트에 autofluorescence 때문 이며 역할은 neurite의 세 브 란 스의 좋은 지표. 일반적으로, 그것은 1-10의 형광 스파이크 볼 수 걸립니다. 그것은 일단 형광은 고가의 검사 시간을 제어 하는 중요 한입니다. PNS 부상에 대 한 즉시 검색을 중단 필수적 이다. 장기간된 노출 부상 사이트를 확대 하 고 주변 조직 손상. 그러나,이 검색 시간을 조정 하 고 부상의 심각도 조작 하는 기회를 제공 한다. 성공적인 부상 병 변 크기 직경 3-4 μ m 보다 작은 있어야 한다. VNC 축 삭 상해, VNC 축 삭 포함 훨씬 더 깊은 다 신경 PNS에 비해 축 삭/모 수석, 피부 바로 아래 고 따라서 높은 필요 레이저 강도. 우리가 일반적으로 몇 가지 더 많은 초 동안에 검사를 둡니다. 이것은 전체 축 삭 번들 절단 되도록 이다. 병 변 사이트의 반지름은 commissure 번들의 절반 이상이 너비, 부상 사이트 등으로 실패 한 계산 됩니다. 이러한 애벌레 낮은 생존 율 있고 분석에 포함 되지 않습니다.
축 삭 재생을 위한 재생 능력은 애벌레 단계에 걸쳐 유사. 하지만 단일 모 수석 후 모 수석 중생에 대 한 잠재적인 재생 72 h AEL19후 감소 된다. 따라서, 축 삭 상해 48 h-72 h AEL 및 48 h AEL, 120 h AEL에서 중생의 평가 모 수석 부상에서 일반적으로 수행 됩니다. 24 h AEL의 애벌레를 사용할 수 있습니다, 그러나 그들의 더 작은 크기를 주어 더 주의 깊은 취급을 요구 한다. 애벌레는 120 h AEL, 더 도전 영상 만들기 후 pupate. 따라서, 우리의 끝점은 일반적으로 120 h AEL입니다.
변성 및 재생 사이의 상호 관계는 무엇입니까? PNS 부상, 24 h AI, 일반적으로 원심 축 삭/모 수석 WT에 완료 했습니다 Wallerian 퇴보 중생이 시간 포인트에서 시작 되지 않은 하는 동안. 따라서, 우리 믿습니다는 WT 애벌레에서 잘린된 neurites의 퇴보만 매우 제한 된에 대 한 충격이 재생, 전혀 면. VNC 부상에 대 한 축 삭에서 8 h AI 타락 한에 이미 시작 하 고 24 h AI, 축 삭 재생은 관찰 축 삭 파편 부상 사이트 주위 여전히 찾을 수 있습니다. 재생을 차단 하는 파편 보이지 않는다. 그러나, 그것은 특정 상황에서 있을 수 있습니다 겹치는 또는 심지어 변성 및 재생 사이 누화입니다. 사실, 그것은 세 쥐, 말 초 신경 손상 후 파편 클리어런스 젊은 동물 보다 느리게가 보고 되었습니다. 수반, 신경 근육 접합의 느린 reinnervation 관찰 되었다는 오래 된 동물에서 축 삭 만남을 다시 생성 하는 장애물의 더 많은 표시 될 수 있습니다. 그러나 놀랍게도,, 세 동물에서 축 삭 신속 하 게 다시 생성 하 고 reinnervate 신경 근육 학 교차로 사이트 하지 파편32와 직면 했을 때 효율적으로. 이 파편 클리어런스를 용이 하 게 재생을 촉진 하는 잠재적인 전략을 수 있습니다 제안 합니다.
다른 neuroregeneration 모델에 비해 비행 감각 신경 손상 모델은 고유한 장점이 있습니다. 마우스 모델 보통 주 개월 수행을 실시 하는 대규모 유전 스크린; 적합 하지 않습니다. C. 선 충 기본 중앙 신 경계 재생 장벽을 포유류 CNS;에 밀접 하 게 정리 하지 수는 있다 포유류에서 다른, zebrafish CNS 축 삭 튼튼하게 재생성합니다. 파리의 급속 한 라이프 사이클, 비행 유전학, 접근성 및 비행 감각 뉴런의 축 삭/모 수석 및 비행 감각 신경-의 특성 재생 속성의 틀에 박힌 패턴의 하위 특정 재생에는 PNS 그리고 CNS-제한 된 재생 neuroregeneration 공부에 대 한 매력적인 모델 초파리 다 신경 세포를 확인 합니다. 또한, 짓 눌린된 마우스 망막 신경 절 세포 (RGCs)에서 최근 연구는 또한 제안 신경 하위 고유한 재생 능력; 곰 반면 다른 겉보기 균질 성 신경 다발에33를 regrow 실패 일부 RGC 하위 재생할 수 있습니다. 이 중요 한 찾는 신경 유형 별 전략 재생 및 기능 복구 악용 한다 제안 하 고 강력 하 게 주장 한다 축 삭 상해 및 후속 재생 분석의 유도에서 수행 해야 한 신경 하위 특정 방식 으로입니다. 또한,이 재생 유형-특이성에 대 한 세포질이 고 분자 결정 요인 크게 알려지지 않은19,33남아 있습니다. 따라서, 다 신경 상해 모델 이러한 문제를 해결 하기 위해 이상적인 패러다임을 제공 합니다.
축 삭 재생에 비해, 모 수석 재생에 초점을 맞추고 연구는 훨씬 scarcer. 모 수석 부상 발생 등 외상 성 뇌 손상, 뇌졸중, 그리고 다양 한 형태의 neurodegeneration, 아직 거의 아무것도 dendrites의 능력을 복구 하 고 개혁 하는 신경 연결에 대 한 알려져 있다. 다 신경 상해 모델은 다시이 방향으로 탐험을 틀에 박힌 패턴, 클래스 특이성, 및 임시 규칙19를 표시 하는 매우 액세스할 수 있는 시스템을 제공 합니다.
그것은 또한 PNS에서 레이블이 단일 축 삭 손상 수 있지만 방법 부상 axons의 번들의 병 변에서 CNS 결과에서 수행 됩니다 언급 가치가 있다. 원하는 경우, MARCM34 또는 FLP 아웃 클론35 접근 단일 축 삭 CNS에 라벨을 사용할 수 있습니다. 또한, glial 세포 mRFP (Repo Gal4, UAS mRFP) 동시에 표시 됩니다, 명과 프로세스의 축적 병 변 사이트에서 구체적으로 관찰 됩니다. 또한, Ptp99A, 콘의 비행 체의 식 황산 proteoglycan (CSPG) phosphacan / PTPRZ1, 병 변 사이트에서 위로 이다. Ptp99A 공동 glial 세포 localizes 고 둘러싼 부상 사이트 어떤 포유류19,,3637astroglial 흉터에 대 한 보고 되었습니다 비슷한 고리 모양의 구조를 형성. 결론적으로, 다 신경 상해 모델, glial 세포, 면역 세포 등 다른 세포 유형의 표시와 함께 부상된 신경 및 그것의 포위 사이 다세포 상호 작용의 비보에 실시간 감시를 허용할 것 이다 환경입니다.
이 비행 거리 애벌레 감각 신경 손상 모델 우리 잠재적인 neuroregeneration 레 귤 레이 터 모두 PNS 그리고 CNS에서 찾을 수 있는 기회를 제공, 하지만 아직 몇 가지 제한이 있다. 첫째, 그것 아니다 높은 처리량의 현재 단계에서. 일반적으로, 5-6 genotypes 1 주일에 한 사람에 의해 상영 될 수 있습니다. 그것은 편견된 화면 수행 최적화 시킬 필요가 있다. 둘째, 애벌레에 에테르 마 취 20 분 더 이상으로 보다 몇 분에서 지난 수 있습니다, 그것 아니다 장기 이미징에 대 한 최적의. 따라서, 특정 시간 점은 대표 축 삭 변성 및 재생의 각각은 이미징에 대 한 선택 됩니다. 셋째, 비록이 프로토콜은 축 삭을 정확 하 게 손상 하는 방법을 소개 하 고, 주변 조직에 손상의 가능성 수 없습니다 완전히 배제할 수 없습니다. VNC, glial 세포, axons과 다른 뉴런의 dendrites이이 조직 될 수 있습니다. 이 잠재적인 경고를 최소화 하기 위해 우리는 부상 사이트 최소화 가능한 전원 낮은 레이저를 적용 하 고 모두 제어 및 실험 그룹을 동시에 동일한 절차를 수행. 넷째, CNS 상해 패러다임을 설정 하는 과정에서 다른 부상 사이트 테스트를 주변에 사이트를 포함 하 여 축 삭 테르미니 우리가 사용 하기로 하 고 항목 축 삭의 VNC로 합니다. 엔트리 포인트는 더 어려운 조직에 깊이 때문에 다치게 하 고 더 이동 하는 것을 발견 했다. 따라서, 이러한 실용적인 이유로, 우리는 현재 방법, 더 일관 된, 더 나은 제어 및 더 큰 스케일 실험에 대 한 좋은 선택. 1 잠재적인 관심사, postsynaptic 컴포넌트와 glial 세포 등 인접 조직, 부상 가능성입니다. 다른 한편으로, 그것은 뛰어난 질문 어떻게 손상된 주변 조직에 영향을 미칠 변성 및 축 삭의 재생입니다. 예를 들어 어떻게 glial 흉터 축 삭 재생을 적용 됩니다. 이 왜 우리의 부상 모델 부상 모델 포유류에서 어떤 병 변 사이트 주위 조직과 축 삭 일반적으로 부상 하는 동시에 유사한 수 있습니다 또 다른 이유를 제공 합니다.
다음 시간 경과 현미경 레이저 부상 모 수석의 축 삭 재생을 공부에 대 한 중요 한 분석 결과 이다. 그러나,이 분석 결과의 하나의 주요 관심사는 범위에서 <$ 10k 저가형 솔리드 펄스 레이저, $25-100, 000에 펨 레이저 >$ 100, 000 두 광자 레이저에 대 한 인식된 비용. 다른 레이저 시스템 axotomy29,38,39,40,41,,4243, 사용에 대 한 몇 가지 좋은 면담이 있다 44 , 45. 요약 하면, 기존의 레이저는 절단에 대 한 내 축 삭에 대 한 최적의 표면에서 30-50 µ m. 특히 늘어나면 대상 영역의 깊이45펨 레이저에 비해 나노와 피코 초 레이저와 더 많은 부수적인 피해 있을 것입니다. VNC에 축 삭, 부상에 대 한의 깊이 일반적으로 약 50-100 µ m, 그것은 조직 손상을 최소화 하기 위해 필수적입니다. 이 경우에, 2 광자 레이저는 이상적이 초점을 맞추고 레이저 파워 손상 조직 침투 없이 부수적인 조직의 손상을 줄이고 초점 비행기를. 결론적으로, 두 광자 시스템은 비용이 많이 드는 하지만 최고의 정밀도 조직 보존을 제공 합니다. 그러나, PNS 축 삭은 axotomy에 대 한 대상, 경우에 기존의 펄스 레이저 보다 저렴 한 대체 있을 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 기술 지원에 대 한 제시카 Goldshteyn 감사합니다. 노래 랩에서 일 NIH 그랜트 R00NS088211, 그리고 지적 및 발달 장애 연구 센터 (IDDRC) 새로운 프로그램 개발 수상에 의해 자금이 다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous | Acros Organics | AC615080010 | |
| Halocarbon 27 Oil | Genesee Scientific | 59-133 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L | VWR | 97062-948 | |
| Agar powder, Alfa Aesar, 500GM | VWR | AAA10752-36 | |
| Grape juice | Welch’s | ||
| Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%) | VWR | 64-17-5 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Propionic Acid | J.T.Baker | U33007 | |
| Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12-544-D | 50 mm X 22 mm |
| Zeiss LSM 880 laser scanning microscope | Zeiss | ||
| Zen software | Zeiss | ||
| Chameleon Ultra II | Coherent |
References
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