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Drosophila no Vivo lesão modelo para o estudo de Epilepsias na periferia e sistema nervoso Central

Published: May 5, 2018 doi: 10.3791/57557
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2
1Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Pennsylvania
* These authors contributed equally

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo utilizando a drosófila neurônio sensorial - modelo de lesão do neurônio arborização dendrítica (da), que combina na vivo ao vivo de imagens, dois fotões do laser axotomy/dendriotomy e poderoso toolbox genético mosca, como uma plataforma para a seleção de potenciais promotores e inibidores de Epilepsias.

Abstract

A capacidade de regeneração de neurônios danificados governa Epilepsias e recuperação funcional após trauma do sistema nervoso. Ao longo das últimas décadas, vários intrínsecos e extrínsecos inibitórios envolvido na restrição de regeneração do axônio foram identificados factores. No entanto, simplesmente removendo esses sinais inibitórios é insuficiente para regeneração bem sucedida, indicando a existência de máquinas de regulamentação adicional. Drosophila melanogaster, a mosca da fruta, compartilha genes evolutivamente conservados e vias de sinalização com vertebrados, incluindo seres humanos. Combinando a poderosa caixa de ferramentas genética de moscas com dois fotões do laser axotomy/dendriotomy, descrevemos aqui o neurônio sensorial drosófila – modelo de lesão de neurônio de arborização dendrítica (da) como uma plataforma para a seleção sistematicamente para romance reguladores de regeneração. Brevemente, este paradigma inclui um) a preparação de larvas, indução b) lesão de dendrite(s) ou axon(s), usando um laser de dois fotões, c) ao vivo confocal de imagem pós-lesão e d) análise de dados. Nosso modelo permite lesão altamente reprodutível de único rotulada de neurônios, axônios e dendritos dos subtipos neuronais bem definidos, no sistema nervoso central e periférico.

Introduction

A incapacidade de axônios de regeneração após uma lesão ao sistema nervoso central (CNS), pode causar deficiência permanente em pacientes e também desempenha um papel nos déficits neurológicos irreversíveis na de doenças neurodegenerativas1,2 ,3,4,5. O ambiente do CNS, bem como a capacidade intrínseca de crescimento de neurônios, determina se os axônios são capazes de regenerar após trauma. Fatores extracelulares do oligodendrocyte, Ralevic e fibroblástica fontes têm sido mostrados para impedir o crescimento neuronal4,6,7,8, mas a eliminação destas moléculas só permite limitada brotando5. Sinais de regeneração intrínseca podem influenciar o sucesso regenerativa5,9 e representam alvos terapêuticos, mas estes processos são ainda não bem definidos a nível molecular. Aumento do fator trófico sinalização ou eliminação de freios endógenos, tais como a fosfatase Pten10, pode resultar em regeneração axonal em determinadas circunstâncias. Combinações de diferentes métodos considerados individualmente eficazes também só fornecem recuperação global limitada à data11,12,13,14. Portanto, há uma necessidade desesperada de identificar caminhos adicionais para a terapia-alvo. Além do início do crescimento do axônio, se e como axônios re-fio para o alvo correto, especificidade de sinapse de reforma e alcançar a recuperação funcional são importantes perguntas sem resposta.

Em resumo, o entendimento atual da maquinaria ditando a regeneração do axônio ainda é muito fragmentado. Parte do problema é a dificuldade técnica de estudar o axônio regeneração em mamíferos em tempo real, uma abordagem que é caro, demorado e desafiador para a realização de telas genéticas em grande escala. Drosophila melanogaster, por outro lado, tem provado para ser um sistema extremamente poderoso para o estudo das complexas questões biológicas. Mosca da fruta tem sido fundamental na definição de genes e sinalização de caminhos que são surpreendentemente conservados em humanos e tem sido um modelo de sucesso para o estudo das condições humanas, tais como doenças neurodegenerativas, através das ferramentas de vasta genética molecular disponível para manipular o gene função15. Em particular, as moscas de fruta são consideradas para ser uma ferramenta ideal para a descoberta de genes envolvidos na lesão neural e rebrota15,16. Foram desenvolvidos vários modelos de lesão neural voar, incluindo adulto-cabeça ou larval nervo ventral cabo (VNC) esfaqueamento com agulhas, larval VNC ou esmagamento do nervo com fórceps, neurônio larval do laser axotomy, remoção de neurônio olfactory do receptor, explantes crânio-encefálico, e lesão de nervo periférico pela ala indenização15,17,18,19,20,21,22,23. Excitantemente, trabalho utilizando drosófila lesão modelos mais recentes têm avançado nossa compreensão das vias celulares e genéticas utilizados pelo sistema nervoso reagir a lesões neurais, alguns dos quais foram mostrados para ser conservada na mamíferos24 ,25. Novamente, isso enfatiza a utilidade deste organismo modelo para identificação novos mecanismos de reparação neural.

Aqui descrito é um dois fotões baseados em laser modelo de Drosophila larval neurônio sensorial lesão. Um laser de dois fotões foi usado primeiramente para cortar axônios no zebrafish na vivo em 200326. No mesmo ano, realizou-se o primeiro dendriotomy do laser em drosófila usando um laser de nitrogénio pulsado27. Logo depois, diversos laboratórios de c. elegans usado femtosecond laser para estabelecer modelos de axônio regeneração28. Em 2007, Wu e colegas comparado em relataram as diferenças entre lesões do laser em c. elegans induzido por vários tipos de lasers29. Em 2010, regeneração do axônio depois do laser axotomy primeiro foi mostrada para ocorrer em Drosophila30. Baseando-se nesta literatura de lesão extensa do laser, nós desenvolvemos um modelo de lesão neural voar usando o laser de dois fotões, que permite a indução precisa da lesão alvo sites com mínima perturbação dos vizinhos de tecidos, proporcionando um ambiente relativamente limpo sistema para estudar as propriedades intrínsecas e extrínsecas de Epilepsias com resolução de célula única. Especificamente, nós estabelecemos um conjunto de métodos de lesão para os neurônios sensoriais arborização dendrítica (da) em ambos os sistema nervoso periférico (SNP) e CNS. Os neurônios da podem ser agrupados em quatro classes distintas, distinguidas-se principalmente por suas complexidades de ramificação dendrito: classe I-IV31. Nosso trabalho publicado mostra que da regeneração de neurônio assemelha-se a modelos de mamíferos lesão a nível molecular e fenotípica: neurônios da Exibir Propriedades de regeneração específicas de classe, com classe IV mas não classe I ou neurônios III da expositora regeneração na PNS; axônios de neurônio classe IV da regeneram robustamente na periferia, mas seu potencial regenerativo é drasticamente reduzida no SNC, assemelhando-se, assim, neurônios do gânglio (DRG) raiz dorsal nos mamíferos; aumentando a atividade de mTOR através de Pten exclusão ou superexpressão Akt aumenta a regeneração do axônio na mosca da CNS19. Utilizando este modelo de lesão, vêm realizando telas genéticas e identificaram a enzima de processamento do RNA Rtca como fator inibitório evolutivamente conservado para a regeneração do axônio, vinculando a lesão do axônio ao estresse celular e modificação do RNA20 .

No paradigma apresentado, a lesão é induzida através do laser axotomy/dendriotomy de larva classe IV ou III da neurônios, rotuladas por ppk-CD4-tdGFP ou 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80, respectivamente. A lesão é executada em 2nd para 3rd ínstar larvas em cerca de 48-72 h após a postura (h AEL) de ovos. Para PNS axotomy a lesão é direcionado para a seção do axônio ~ 20-50 µm longe do corpo celular, para axotomy de CNS para uma área de ~ 20 µm de diâmetro no cruzamento comissura no VNC e dendriotomy para os pontos de ramificação dendrítica principal. O mesmo neurônio é fotografado em 8-24 h após a lesão (AI) para confirmar a transecção completa e em 48-72 h AI para avaliar a regeneração. Através da imagem latente confocal lapso de tempo, a degeneração e regeneração de axônios/dendrites individuais que foram feridos na vivo podem ser monitorados ao longo do tempo.

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Protocol

1. preparação das placas de cultura e garrafas

  1. Preparação de placas de ágar de suco de uva
    1. Adicione 10 g de pó de ágar-ágar, suco de uva 200 mL e 192 mL ddH2O em um copo e microondas por cerca de 4-5 min, mexendo intermitentemente até o ágar é dissolvido completamente.
    2. Em uma coifa, arrefecer a solução para cerca de 60 ° C. Adicione 4,2 mL de etanol 95% e 4,0 mL de ácido acético glacial. Ajuste o volume total da solução para 400 mL com DDQ2Mix O. bem.
    3. Para cada placa de 35 mm, adicione cerca de 2-3 mL da solução. Faz aproximadamente 120-150 placas para um total de 400 mL de solução de ágar suco de uva.
    4. Espere 10 minutos para arrefecer as placas e solidificar a solução de ágar. Embalar o suco de uva placas de ágar em sacos ziplock Self selado e armazenar a 4 ° C para uso futuro.
  2. Preparação de frascos de cultura de Drosophila
    1. Use uma lâmina para um buraco de 1,5 cm lado comprimento triangular em uma parede do frasco de cultura da drosófila e enche o buraco com uma esfera de diâmetro de 2 a 2,5 cm de algodão para ventilação.
    2. Conecte a garrafa com uma placa de ágar de suco de uva suplementada com cerca de 0,5 cm3 de massa de levedura.

2. coleção de larvas de Drosophila

  1. Configurar cruzes de moscas adultas
    1. Lugar 10 fêmeas virgens e 5 masculino adulto voa juntos em um frasco de cultura ligado com uma placa de ágar de suco de uva.
    2. Coloque o fundo da garrafa a 25° C, para que moscas colocarão ovos na placa de ágar de suco de uva. Mude a placa com fermento pasta pelo menos uma vez por dia. Para um período de coleta 2-h, que permite a colheita de larvas de um grau de desenvolvimento homogêneo, comece com mais de 20 virgens fêmeas e 10 machos na etapa 2.1.1.
    3. A placa a 25° C, em um prato de Petri de 60-mm com um tecido molhado, por exemplo, embebida em solução de ácido propiônico 0,5% de cultura. Organize o tecido para que ele não bloqueia o fluxo de oxigênio.
      Nota: A solução de ácido propiônico é usada para manter a umidade no prato e evitar o crescimento de mofo.
  2. Larvas de colheita de uma idade específica
    1. Use um par de pinças para transferir as larvas da fase desejada, por exemplo, 2nd para 3rd ínstar larvas em 48-72 h após a postura (AEL), de ovos para uma nova placa de ágar de suco de uva sem fermento colar.
    2. Remova o fermento da pele das larvas por deixá-los rastejar ao redor na placa nova, para impedir que potenciais interferindo de levedura axotomy do laser e imagem. Em alternativa, limpe cuidadosamente as larvas por lavá-los em um prato de PBS e secagem brevemente num pedaço de papel de seda.

3. dois fotões lesão e imagem latente Confocal

  1. Instalação do microscópio
    Nota: Para este experimento, utilizou-se um laser confocal microscópio com um laser de dois fotões, mas outros sistemas com uma configuração equivalente também serão suficiente. O laser de dois fotões (930 nm) foi usado para a entrega de lesão e um laser de argônio (488 nm) foi usado para a imagem latente confocal de GFP.
    1. No início de cada sessão, ligue o laser dois fotões e/ou o laser(s) confocal e o microscópio. Abra o software de imagem.
    2. Por lesão de dois fotões, configurar os seguintes parâmetros para a imagem latente GFP com o laser de dois fotões em 930 nm (1.950 mW).
      1. Selecione o modo de varredura de linha. Abra o pinhole todo o caminho. Aumentar a intensidade do laser de ~ 20% (390 mW).
      2. Selecione 512 x 512 como a varredura de quadro. Use a máxima velocidade de digitalização (normalmente com o tempo de interrupção de pixel em 0,77 µs). Certifique-se que o número médio é 1 e profundidade de bits é de 8 bits.
      3. Jogo ganho ~ 750, e o deslocamento para 0.
      4. Salve este protocolo experimental pré-estabelecidos como 2P GFP 930 ablação, permitindo fácil reutilização experiências no futuro.
    3. Para a imagem latente confocal, configurar os seguintes parâmetros para a imagem latente GFP com o laser de argônio em 488 nm:
      1. Selecione a guia de aquisição e Z-pilha.
      2. Sob o "Laser", liga a energia do laser de argônio 488 nm.
      3. Vá para canais, selecione o laser 488 mm e aumentar a potência do laser para 5-10%. Para o pinhole, use a unidade arejado de 1-2 (AU). Ajuste o ganho a 650.
      4. No Modo de aquisição, selecione 1024 x 1024 como a varredura de quadro, use a velocidade de varredura máxima, um número médio de 2 e profundidade de bits de 8 bits.
      5. Salve este protocolo experimental pré-estabelecidos como GFP Imaging.
  2. Anestesia de larvas com éter dietílico e montagem
    1. Em uma coifa, coloque um prato de vidro de 60mm em um prato de Petri de plástico de 15 cm. Dobra e coloque um pedaço de papel de tecido na parte inferior do prato de vidro, em seguida, coloque uma placa de ágar de suco de uva no tecido. Adicione éter dietílico para o prato de vidro, até o ponto onde o papel de tecido é encharcado e há uma camada de éter líquido restante no prato. Manter o sigilo em todos os momentos.
    2. Prepare uma lâmina de vidro com uma gota de halocarbono 27 óleo no centro. Adicione 4 manchas de graxa de vácuo para os quatro cantos do slide, para depois apoiar a lamela.
    3. Use fórceps para pegar uma larva limpa e coloque-o sobre a placa de ágar-ágar no prato de vidro 60mm. Cubra o prato de vidro com a tampa e espere até que a larva para de se mover. Para PNS lesão/imagens, tire a larva assim que sua cauda parar de tremer. Para o CNS, esperar até que a larva inteira torna-se imóvel, especialmente os segmentos de cabeça.
      Nota: O tempo de exposição do éter é essencial. Consulte a discussão.
    4. Cuidadosamente pegue a larva anestesiada e colocá-lo na cabeça-vertical à gota de óleo halocarbono no slide. Adicione uma lamela em cima do slide. Use pressão suave para empurrar para baixo sobre a lamela, até que toca a larva (figura 1A).
    5. Ajuste a posição da larva empurrando suavemente a lamela para a esquerda ou direita para rolar a larva, para que o neurônio/axônio/dendrito de interesse está no topo e mais próximo à lente do microscópio.
    6. Por lesão PNS, monte o lado dorsal de larva, para que ambos os tracheas são visíveis. Em seguida, rode a larva ~ 30 graus para a esquerda para ferir axônios de neurônios de classe III da (figura 1B e 1C), 90 graus para ferir axônios de neurônios de classe IV da (figura 1B e 1E) ou ~ 30 graus para ferir classe IV da neurônio dendritos ( Figura 2A).
    7. Por lesão do CNS, posicione a larva para ser perfeitamente ventral para cima (Figura 3A), para que a região de interesse é mais próxima à lente do microscópio no plano z.
  3. Lesão por dois fotões laser
    1. Coloque o slide com a larva ao microscópio e fixá-lo no lugar com o suporte do slide no palco. Objetivo de uso a 10 X (0,3 NA) para encontrar a larva.
    2. Adicione 1 gota de óleo objectiva no sentido do lamela, alterne para o 40 X (NA 1.3) objectivo e ajustar o foco.
    3. Alterne para o modo de digitalização e reutilizar o protocolo experimental 2P GFP 930 ablação. Certifique-se de que pinhole é aberto todo o caminho.
      Nota: A configuração precisa ser otimizado com base em sistemas individuais.
    4. Inicie no modo Live para localizar a região de interesse (ROI) e ajustar as configurações para obter boa qualidade de imagem com o zoom apropriado.
      Nota: O objetivo desta etapa é encontrar o neurônio/axônio/dendrito para ferir, ao invés de levar a melhor qualidade de imagem. Portanto, use as configurações mínimas suficientes para visualizar a área-alvo, a fim de evitar a superexposição ou fotobranqueamento.
    5. Interrompa a digitalização de Live , para que o botão recortar se tornará disponível. Deixe a imagem ainda servir como roteiro. Selecione a função Crop e ajustar a janela de digitalização para focar o alvo a ser ferido.
    6. Reduza o ROI para o tamanho do local da lesão em potencial. Por exemplo, apenas cobrir a largura de um axônio ou um dendrito, para assegurar a precisão da lesão e reduzir os danos aos tecidos vizinhos. Se desejado, amplie o ROI antes de cortar, permitindo a lesão mais preciso.
    7. Abra uma nova janela de imagem. Reduzir a velocidade de varredura e aumentar a intensidade do laser. Determine o aumento da intensidade do laser com base do sinal de fluorescência do tecido digitalizadas em modo Live .
    8. Normalmente, defina a intensidade de dois fotões do laser a partir de 25% para lesão PNS e 50-100% para lesões VNC. Por lesão do axônio PNS, certifique-se de que a intensidade do laser é ~ 480 mW e pixel tempo Perm é 8,19 μs. Para a lesão do axônio VNC, certifique-se de que o tempo de interrupção de pixel e intensidade do laser são geralmente 965-1930 mW e 8.19-32,77 μs, respectivamente.
    9. Começa a varredura contínua . Deixe o cursor pairando sobre o botão de contínuo . Fique de olho na imagem e interromper a digitalização como um drástico aumento na fluorescência é observado.
      Nota: O aparecimento do pico de fluorescência é devido ao autofluorescência no local da lesão.
    10. Alternar para o modo de viver reutilizando as configurações. Localizar a região de interesse que foi direcionada apenas ajustando o foco.
      Nota: Uma boa indicação de lesão bem sucedida é a aparência de uma pequena cratera, estrutura em forma de anel ou detritos localizados bem no local da lesão.
    11. Mover para o próximo neurônio e repetir da etapa 3.3.5, ferir vários neurônios em um único animal. Ou repita o passo 3.3.5 enquanto gradualmente aumentando a potência e/ou reduzir a velocidade de verificação se a lesão inicial foi insuficiente.
      Nota: No caso em que a potência do laser é muito alta, uma grande área danificada será visível na imagem de varredura ao vivo pós-lesão. Muito prejuízo pode causar a morte da larva.
    12. Recupere a larva cuidadosamente removendo a lamela e transferir a larva ferida em um novo prato com pasta de fermento. Vala de várias cavernas na placa de ágar com pinça; Como alternativa, fazer uma ilha de agar na placa em vez de usar a placa inteira, para reduzir a possibilidade da larva rastejando fora da placa.
    13. Colocar a placa em uma placa de Petri 60mm com tecido molhado (embebido em solução de ácido propiônico 0,5%) e da cultura em temperatura ambiente ou 25° C.
      Nota: A larva permanecerá na fase larval durante aproximadamente um dia extra em temperatura ambiente (22° C) em comparação com a 25° C.
  4. Imagem latente confocal pós-lesão
    1. Imagem a larva ferida em pontos de tempo desejado, preparando a larva usando o mesmo procedimento de anestesia e montagem como no passo 3.2, então a imagem com o laser confocal.
      Nota: A larva em 24 h após a lesão (AI) para confirmar a lesão axonal e em AI (neurônios da classe IV) de 48 h ou 72 h AI (neurônios da III classe) para avaliar a regeneração da imagem.
    2. Localize a larva usando o objectivo X 10 e, em seguida, alternar para um 25 X (0,8 NA) objectivo. Reutilize o protocolo experimental GFP Imaging.
    3. Clique no botão Live e encontrar o mesmo neurônio ferido anteriormente.
    4. Defina as posições de Z primeiras e o últimas na janela de verificação ao vivo. Pressione o botão stop e clique Iniciar experiências para adquirir uma imagem de Z-pilha.
      Nota: Certifique-se que uma normalização (ponto o axônio convergentes) é incluído quando a captura de imagens para que a quantificação da regeneração é possível (Figura 1, 1F) – isto é discutido mais na seção de análise de dados.
    5. Alterne para o Processamento de imagem, selecione a imagem que acaba de tomar e gerar uma projeção de intensidade máxima. Salve o z-pilha e intensidade máxima projeção imagens.

4. análise de dados

  1. Processar e quantificar imagens usando a imagem software ou ImageJ.
  2. Quantificação da regeneração do axônio no PNS
    1. Calcule a percentagem de regeneração, que refere-se a porcentagem de regeneração de axônios entre todos os axônios que estavam lesionados. Marca um axônio como regeneração, enquanto regrows além do local da lesão.
    2. Medida comprimento de regeneração, que é o aumento no comprimento do axônio. Se quantificar com ImageJ, use a ferramenta de Linha segmentada para rastrear o axônio regenerado e usar medida no menu suspenso Analyze para obter o comprimento da linha que representa o axônio regenerado.
    3. Calcule o Índice de regeneração, que é o aumento no comprimento do axônio normalizado.
      Nota: O comprimento do axônio é normalizado pela distância entre o corpo celular e axônio convergindo ponto (DCAC) – comprimento do axônio/DCAC (Figura 1 e 1F). Esse valor ajuda a conta para qualquer crescimento axonal que é devido à escamação larval. Um valor positivo representa a regeneração, um valor de 0 significa que não há regeneração e um valor negativo significa retração.
  3. Quantificação da regeneração dendrito
    1. Calcule porcentagem regeneração, que é a porcentagem de neurônios entre todos aqueles cortada que mostram o óbvio dendrito regrowth.
      Nota: Dendrito rebrota é marcada como positivos se novas dendrites crescerem fora do tronco dendrítica retraído e além do local da lesão. O local da lesão é determinado pelos pontos de referência e, em alguns casos, é prontamente visível devido a autofluorescência induzida por lesão residual.
    2. Calcule o aumento de pontos de ramificação, que conta com a adição de novos pontos de ramificação dendrítica após lesão.
    3. Calcule o aumento do comprimento total dos dentritos, que é o comprimento cumulativo de todos os dendritos novos adicionados após a lesão.
  4. Quantificação da regeneração do axônio no SNC
    Nota: Se um site de lesão mostra degeneração no primeiro tempo ponto fotografado (Figura 3B), ele será incluído na análise do comprimento de regeneração e taxa.
    1. Medida comprimento de regeneração, que é o comprimento do axônio renováveis.
      Nota: O axônio renováveis de um site de lesão única é identificado como se origina fora da rota original do axônio antes da lesão.
    2. Calcule o comprimento de regeneração Normalized, que normaliza o comprimento de regeneração para o comprimento do segmento de comissura - a distância longitudinal entre comissuras ("Y" na Figura 3A e 3B).
      Nota: Este valor ajuda correto para o efeito das diferenças de tamanho larval.
    3. Calcule a taxa de regeneração, que é a porcentagem de regeneração de segmentos entre todos os segmentos que foram lesados, para refletir a capacidade de regeneração de um determinado genótipo.

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Representative Results

Os neurônios da mostram diferencial regeneração potencial entre o periférico e sistema nervoso central, bem como especificidade de classe. Isso oferece oportunidades únicas para a tela para novos fatores que são necessários para a regeneração do axônio (usando a classe lesão PNS IV), bem como aqueles que são inibitórios para regeneração (com lesão de classe IV CNS e classe lesão III PNS).

Regeneração do axônio no PNS

Por exemplo, é descrita a caracterização da regeneração de neurônios da classe III e classe IV. Estes neurônios estão localizados bilateralmente em cada segmento do corpo. Vários neurônios podem ser feridos na mesma larva; Normalmente, de 3-4 neurônios no lado direito dos segmentos abdominais A7-A2. Classe III e neurônios da classe IV podem ser visualizados por Repo de 19-12-Gal4, UAS-CD4tdGFP, - Gal80 e ppk-CD4tdGFP, respectivamente. Anestesia e montar as larvas AEL de 48-72 h, conforme descrito, ajustar a posição das larvas, para que os neurônios de interesse estão virada para cima (figura 1A e 1B). Nós geralmente ferir o ddaF de classe III e classe IV v'ada os neurônios (Figura 1 e 1E). Executar axotomy e recuperar as larvas conforme descrito. Logo após a lesão (AI), as larvas vão se recuperaram de cirurgia e exposição de locomoção normal. A taxa de sobrevivência aqui é tipicamente mais de 80%. Descarte as larvas que estão mortos ou doentes. Remontar o restante conforme descrito e avaliar a degeneração. A 24 h, AI, o axônio distal deve ter concluído a degeneração neste tempo ponto19, e a haste do axônio será prontamente visível (Figura 1 e 1F). Recriar as mesmas larvas 48 h AI para neurônios da classe IV ou 72 h AI para neurônios da classe III para avaliar a regeneração. Nós geralmente visam avaliar pelo menos 20 feridos neurônios por condição experimental. No (tipo selvagem) WT animais, Considerando que normalmente ~ 70% do da classe decepada IV neurônios vão ter regenerado além do local da lesão (Figura 1F), neurônios da classe III falhar regenerar, evidenciado pelo cone de crescimento empatar (Figura 1).

Regeneração do dendrito

Normalmente realizamos dendriotomy na classe IV da ddaC de neurônios (Figura 2A). Como mostrado no diagrama esquemático, a lesão é direcionada para o ponto de ramificação dendrítica principal. Baseado na experiência, quando ferido em 48 h AEL, ~ 50% dos neurônios ddaC regenerar suas dendrites (Figura 2B). Nos 50% restantes, dendrites vizinhos invadem em cobrem o espaço vago. Além disso, o potencial de regeneração destes neurônios é reduzido se ferido numa fase de desenvolvimento mais tarde.

Regeneração do axônio no SNC

Por lesão do axônio VNC, a taxa de sobrevivência das larvas varia consideravelmente e depende da idade em que a lesão é induzida. Com base na experiência, as larvas de 48-72 h AEL normalmente têm a maior taxa de sobrevivência (> 60%) entre as diferentes fases testado. Larvas mais jovens do que 48h AEL mal sobrevivem após a lesão, enquanto aqueles mais de 72 h AEL é difícil apresentar lesão no VNC. Além disso, é mais fácil induzir lesão em segmentos de comissura posterior do que o anterior, como esses segmentos posteriores do VNC estão mais perto da superfície ventral e, portanto, mais acessível por laser (Figura 3A).

Para ferir os axônios de neurônios da classe IV no SNC, monte as larvas como descritas anteriormente (Figura 3A). Sob o microscópio, localize a escada de estrutura de feixes de axônio que integram o VNC (Figura 3A) e executar o axotomy, conforme descrito. A degeneração é confirmada às 8 h AI e regeneração são avaliados a 24 e 72 h AI. Como mostrado na Figura 3B, axônios a 8 h AI já começaram a se degenerar, e em 24h AI, regeneração do axônio é observada enquanto os restos do axônio podem ainda ser encontrado em torno dos locais de lesão. Axônios WT mostram regrowth limitado no VNC e falharem se reconectar as lacunas geradas pela lesão (Figura 3B). Para quantificar a capacidade de regeneração de axônios lesionados, o comprimento de rebrota após lesão é medido e o comprimento do segmento de comissura (Y na Figura 3A) é usado para Normalização (Figura 3).

Figure 1
Figura 1: Da regeneração de axônio neurônio na periferia exibe especificidade de classe. (A e B) Esquema mostrando a posição das larvas de desenho. (C) desenho esquemático do neurônios da classe III. (D) axônios de classe III da neurônios ddaF, rotulado com 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80 / +, não conseguem regenerar. (E) desenho esquemático do neurônios da classe IV. (F) axônios da v'ada de neurônios da classe IV, rotulado com ppk-CD4-tdGFP / +, crescerem além do local da lesão. (D e F) Linha vermelha indica o comprimento do axônio enquanto linha tracejada verde marca a distância entre o corpo celular e axônio convergindo ponto (DCAC). O ponto azul marca o ponto de convergência do axônio. Barra de escala = 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Da regeneração de dendrito neurônio. (A) representação ilustrativa de neurônios da classe IV. (B) representação ilustrativa da regeneração dendrito em classe IV da neurônio ddaC, rotulado por ppk-CD4-tdGFP / +. Ablação a laser é direcionada para o ponto de ramificação primária e é realizada em 48 h AEL. Em lesões de 24h AI transecção do axônio é confirmada, e a 72 h AI regeneração é quantificada. Dendrites dos neurônios ddaC demonstram regrowth substancial, com novas ramificações dendríticas brotando do tronco decepado telhar o espaço vago. É interessante notar que novos ramos terminais são continuamente adicionados para os dendritos ilesos nesta fase do desenvolvimento. Barra de escala = 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Da regeneração de axônio neurônio no VNC. (A) desenho esquemático de uma larva de Drosophila montado em um slide e fotografada sob o microscópio. Classe de axônios de neurônios da IV no VNC visualizadas em um ppk-CD4tdGFP / + larva. Dois segmentos de comissura do candidato são mostrados na imagem zoom-in e o desenho esquemático. Cada um deles tem dois locais de lesão (círculos vermelhos). (B) imagens Confocal de um segmento lesionado fotografada no 8, 24 e 72 h após a lesão (AI). Linhas vermelhas mostram os axônios renováveis. (C) medição e normalização das renováveis axônios. Barra de escala = 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Quando atravessa a criação de mosca, o número de fêmeas e machos usados pode variar dependendo dos genótipos e o número de larvas que precisava para experiências específicas. Para moscas WT, típica Cruz usa 10 fêmeas e 5 machos. A janela de coleção pode ser reduzida, dependendo da precisão da larvas era necessária. Por exemplo, um período de 2-h coleção irá produzir larvas de uma população mais homogênea. Neste caso, usar 20 ou mais virgens fêmeas para configurar as cruzes ajudará a produzir ovos suficientes. O rendimento do primeiro dia é geralmente escasso, para recolher o prato com ovos dois ou mais dias após a criação da câmara. Quando o cultivo ainda mais o prato com ovos, recomenda-se embeber o tecido na prato de Petri 60mm em solução de ácido propiônico 0,5% em vez de água, que irá não só ajudar a manter a umidade no prato, mas também evitar o crescimento de mofo.

Ao configurar os dispositivos para anestesia de larvas e montagem, certifique-se de usar um prato de vidro porque éter vai derreter através de plásticos. O prato de vidro está alojado em um plástico de 15 cm no caso de um vazamento de Petri. O papel de tecido ajuda a preservar o éter no prato, para que a larva pode ser efetivamente nocauteada pelo vapor de éter. É recomendável utilizar âmbar soltando garrafas para armazenar alíquotas de éter e adição de éter em gotículas com a conta-gotas de vidro. Reabastecer o éter e mantenha sempre uma camada de éter líquido no fundo do prato para o efeito ideal.

O tempo de exposição do éter é crítico: sob anestesia levará a recuperação de larva no meio da sessão de imagens e imagens tremidas; uma overdose de anestesia, ou contato direto com o líquido de éter, causará a letalidade. Para maximizar a sobrevivência e a taxa de sucesso, nossa regra é a seguinte: para PNS lesão/imagens, tirar a larva, assim como sua cauda para de tremer; para o CNS, esperar até que a larva inteira torna-se imóvel, especialmente os segmentos de cabeça. Até mesmo um ligeiro movimento irá interferir com a lesão e a imagem de axônios VNC. Larvas mais velhas tendem a demorar mais tempo para bater para fora. Geralmente, leva menos de 2 min para larvas mais jovens do que 72 h AEL e 2-5 min para mais de 72 h AEL de larvas.

Ao configurar a intensidade do laser dois fotões por lesão, o valor é determinado pelo sinal de fluorescência do tecido obtido o scan "Ao vivo". A lesão é introduzida pela verificação "Contínua", como na etapa 3.3. O aumento da fluorescência induzida por lesão é devido a autofluorescência no local da lesão e serve como um bom indicador da indenização do axônio. Normalmente, demora de 1-10 s para ver o pico de fluorescência. É fundamental para controlar o tempo de verificação, uma vez que a fluorescência é elevada. Por lesão PNS, é essencial para parar a verificação imediatamente. Exposição prolongada vai ampliar o local da lesão e danificar os tecidos vizinhos. No entanto, isto fornece a oportunidade para ajustar o tempo de verificação e manipular a gravidade da lesão. Uma lesão bem sucedida deve ter um diâmetro de tamanho de lesão menor que 3-4 μm. Por lesão do axônio VNC, os axônios VNC são incorporados mais profundo em comparação com o neurônio da PNS axônios/dendrites, que são bem debaixo da pele e portanto necessitam de maior intensidade de laser. Geralmente deixamos o scan por mais alguns segundos. Isso é para garantir que o pacote inteiro axônio é cortado. Se o raio dos sites de lesão é mais de metade da largura do feixe comissura, tais sites de lesão são contados como vencidas. Essas larvas têm uma taxa de sobrevivência baixa e não serão incluídas na análise.

Para a regeneração do axônio, a capacidade de regeneração é semelhante em toda a fase larval. Mas para a regeneração do dendrito após um corte único dendrito, a potencial de regeneração é reduzida após 72 h AEL19. Assim, a lesão do axônio geralmente é executada em 48 h - 72 h AEL e dendrito lesão a 48h AEL, com a avaliação da regeneração em 120h AEL. Larvas de 24h AEL também podem ser usadas, mas exigem tratamento mais cuidadoso, dado a sua menor dimensão. As larvas pupate após 120h AEL, tornando a imagem mais desafiador. Portanto, nosso ponto de extremidade é geralmente 120 h AEL.

O que é a inter-relação entre a degeneração e regeneração? Por lesão PNS, a 24 h AI, normalmente o axônio/dendrito distal em WT completou degeneração Wallerian enquanto regeneração não iniciado neste ponto do tempo. Portanto, acreditamos que em larvas WT, a degeneração de neuritos cortadas só tem um impacto muito limitado na regeneração, se em tudo. Por lesão VNC, axônios a 8 h AI já começaram a se degenerar e a 24 h AI, regeneração do axônio é observada enquanto os restos do axônio ainda podem ser encontrado em torno dos locais de lesão. Os restos não parecem bloquear a regeneração. No entanto, é possível que em determinadas circunstâncias, pode haver uma sobreposição ou até mesmo uma conversa cruzada entre degeneração e regeneração. Na verdade, foi relatado que em ratos envelhecidos, afastamento de escombros após danos nos nervos periféricos é mais lento que em animais jovens. Concomitantemente, reinervação mais lenta da junção neuromuscular foi observada, o que pode ser atribuído ao maior número de obstruções regenerar axônios encontro nos animais velhos. Surpreendentemente, no entanto, axônios do envelhecido animais regeneram rapidamente e reinnervate sites de junção neuromuscular eficientemente quando não confrontados com detritos32. Isto sugere que a facilitar a liberação de detritos pode ser uma estratégia potencial para promover a regeneração.

Comparado a outros modelos de Epilepsias, o modelo de lesão do neurônio sensorial mosca tem vantagens exclusivas. Modelos de mouse normalmente demorar semanas a meses para executar e não são adequados para a realização de grandes telas genéticas; C. elegans tem apenas um primitivo sistema nervoso que não pode recapitular estreitamente as barreiras de regeneração no SNC mamíferos; diferente dos mamíferos, axônios de CNS zebrafish regeneram robustamente. O ciclo de vida rápido de moscas, a versatilidade de mosca genética, acessibilidade e padronização estereotipada de axônios/dendritos de neurônios sensoriais voar e as propriedades de regeneração característica de voar neurônios sensoriais – subtipo específica regeneração na PNS e limitado a regeneração no SNC – fazer Drosophila da neurônios um modelo atraente para o estudo de Epilepsias. Além disso, estudos recentes de células ganglionares da retina de rato esmagado (RGCs) também sugerem que subtipos neuronais ostentar competência distinta da regeneração; Alguns subtipos RGC podem regenerar, Considerando que os outros no pacote do nervo aparentemente homogêneo falharem regenerar a33. Este importante achado sugere que neuronal estratégias específicas do tipo devem ser exploradas para promover a regeneração e recuperação funcional e argumenta fortemente que a indução de lesão do axônio e análise subsequente regeneração deve ser realizada em um forma de subtipo específico neuronal. Além disso, os celulares e moleculares determinantes para este tipo de regeneração-especificidade permanecem em grande parte desconhecido19,33. Portanto, o modelo de lesão do neurônio da oferece o paradigma ideal para abordar estas questões.

Comparado a regeneração do axônio, estudos enfocando a regeneração dendrito são muito mais escassos. Dendrito ocorrer, como em traumatismo crânio-encefálico, acidente vascular cerebral e muitas formas de neurodegeneração, ainda quase nada é conhecido sobre a capacidade dos dendritos para reparar e reformar as conexões neurais. O modelo de lesão do neurônio da novo fornece um sistema altamente acessível que exibe padronização estereotipada, especificidade de classe e Regulamento temporal19, para explorar nesse sentido.

Também vale a pena mencionar que, enquanto é possível ferir um único axônio etiquetado no PNS, a lesão de forma é executada nos resultados da CNS na lesão de um feixe de axônios. Se desejado, MARCM34 ou a abordagem de35 clone FLP-para fora pode ser usada para rotular o único axônios no SNC. Além disso, quando as células gliais são rotuladas simultaneamente com mRFP (Repo-Gal4, UAS-mRFP), o acúmulo de processos glia é observado especificamente no local da lesão. Além disso, a expressão de Ptp99A, o mosca do homólogo de condroitina sulfato proteoglycan (CSPG) phosphacan / PTPRZ1, é o acima-está regulada no local da lesão. Ptp99A co localiza com células gliais e circunda o local da lesão, formando uma estrutura em anel semelhante ao que tem sido relatado para cicatrizes Ralevic em mamíferos19,36,37. Em conclusão, o modelo de lesão de neurônio da, quando combinado com marcadores de outros tipos de células, como células gliais ou células imunes, permitirá na vivo vigilância em tempo real das interações multicelulares entre um neurônio ferido e arredores meio ambiente.

Enquanto este modelo de lesão do neurônio sensorial de larvas de mosca nos fornece oportunidades para encontrar potenciais reguladores de Epilepsias no CNS e PNS, ainda tem várias limitações. Primeiro, não é de alta taxa de transferência, neste momento. Normalmente, 5-6 genótipos podem ser rastreados por uma pessoa em uma semana. Ele precisa ser otimizado a fim de realizar uma tela imparcial. Em segundo lugar, como a anestesia de éter em larvas pode durar de vários min a não mais de 20 min, não é ideal para a imagem latente a longo prazo. Assim, pontos de tempo específico que são representante de degeneração do axônio e regeneração respectivamente são escolhidos para a imagem latente. Em terceiro lugar, mesmo que este protocolo está introduzindo uma forma de ferir axônios, precisamente, a possibilidade de danos aos tecidos circundantes não pode ser completamente descartada. No VNC, estes tecidos podem ser células gliais, axônios e dendritos de outros neurônios. Para minimizar este potencial ressalva, nós minimizar os locais de lesão, aplicar o mais baixo possível de energia do laser e executar os mesmos procedimentos em paralelo para controlar e experimentar a grupos. Em quarto lugar, no processo de criação do paradigma da lesão CNS, lesão de diferentes sites foram testado, incluindo os locais perto da termini axônio que escolhemos para usar e a entrada ponto de axônios para o VNC. Os pontos de entrada foram encontrados para ser mais difícil de se ferir porque eles são mais profundos no tecido e mais provável que se movem. Assim, por estas razões práticas, optamos para o método atual, que é mais consistente, mais controlada e bom para experiências em maior escala. Uma preocupação potencial, como dito acima, é a possibilidade de ferir os tecidos vizinhos, tais como os componentes pós-sinápticos e as células gliais. Por outro lado, é uma excelente pergunta como os tecidos circunvizinhos danificados influenciam a degeneração e a regeneração dos axônios. Por exemplo, como a cicatriz glial afeta a regeneração do axônio. Isto apresenta uma outra razão por que nosso modelo de lesão pode assemelham-se pròxima modelos de lesão nos mamíferos, em que axônios e tecidos ao redor dos locais de lesão são geralmente feridos simultaneamente.

Lesão do laser, seguido por microscopia de lapso de tempo é um ensaio sensível para o estudo a regeneração do axônio/dendrito. No entanto, uma preocupação principal deste teste é o custo percebido, que varia de <$ 10K para low-end Solid-State Laser, $25-100K para femtosecond lasers para >$ 100k para lasers de dois fotões. Existem várias boas discussões sobre sistemas diferentes do laser usados para axotomy29,38,39,40,41,42,43, 44 , 45. para resumir, lasers convencionais são ideais para axônios corte dentro sobre 30-50 µm da superfície. Haverá mais danos colaterais com os lasers de segunda nano e pico, em comparação com o laser de femtosecond, especialmente à medida que a profundidade da área alvo aumenta45. Ferindo os axônios no VNC, a profundidade do que é tipicamente aproximadamente 50 a 100 µm, é essencial para minimizar o dano tecidual. Neste caso, o laser de dois fotões é ideal, que se concentra a potência do laser para o plano focal, redução dos danos colaterais tecido sem penetração de tecido comprometedora. Em conclusão, o sistema de dois fotões é caro, mas oferece a melhor preservação de precisão e tecido. No entanto, se apenas os axônios do SNP são alvo de axotomy, laser convencional pode ser uma alternativa mais acessível.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos a Jessica Goldshteyn para suporte técnico. Trabalho no laboratório de música é financiado pela concessão de NIH R00NS088211, intelectual e o prêmio de desenvolvimento de programa novo inabilidades desenvolventes Research Center (IDDRC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous Acros Organics AC615080010
Halocarbon 27 Oil Genesee Scientific 59-133
Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L VWR 97062-948 
Agar powder, Alfa Aesar, 500GM VWR AAA10752-36
Grape juice Welch’s
Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%) VWR 64-17-5
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
Propionic Acid J.T.Baker U33007
Cover Glasses: Rectangles Fisher Scientific 12-544-D 50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope Zeiss
Zen software Zeiss
Chameleon Ultra II Coherent

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Li, D., Li, F., Guttipatti, P., Song, Y. A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System. J. Vis. Exp. (135), e57557, doi:10.3791/57557 (2018).

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