Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Een Drosophila In Vivo letsel Model voor het bestuderen van de Neuroregeneration in de perifere en centrale zenuwstelsel

Published: May 5, 2018 doi: 10.3791/57557
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2
1Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Pennsylvania
* These authors contributed equally

Summary

Hier presenteren we een protocol met de Drosophila sensorisch neuron - dendritische arborization (da) neuron letsel model, dat in vivo combineert wonen imaging, twee-foton laser axotomy/dendriotomy en de krachtige vliegen genetische werkset, als een platform voor de screening potentiële initiatiefnemers en remmers van neuroregeneration.

Abstract

De capaciteit van de hergroei van beschadigde neuronen regelt neuroregeneration en functionele herstel na trauma van het zenuwstelsel. In de afgelopen decennia, zijn verschillende intrinsieke en extrinsieke remmende factoren die betrokken zijn bij de beperking van axon regeneratie geïdentificeerd. Gewoon verwijderen van deze remmende signalen is echter onvoldoende is voor de succesvolle regeneratie, met vermelding van het bestaan van aanvullende regelgevende machines. Drosophila melanogaster, de fruitvlieg, deelt evolutionair geconserveerde genen en signaalroutes met gewervelde dieren, inclusief de mens. Combineert de krachtige genetische werkset van vliegen met twee-foton laser axotomy/dendriotomy, beschrijven wij hier de Drosophila sensorisch neuron-dendritische arborization (da) neuron letsel model als een platform voor het systematisch screenen voor roman regeneratie regelgevers. Kortom, dit paradigma omvat a) de voorbereiding van de larven, b) laesie inductie dendrite(s) of axon(s) met behulp van een twee-foton laser, c) live confocal imaging na analyse schade en d) gegevens. Ons model kan zeer reproduceerbare verwonding van enkele gelabelde neuronen, axonen en dendrites van welomschreven neuronale subtypes, in zowel de perifere en centrale zenuwstelsel.

Introduction

Het onvermogen van axonen te regenereren na een letsel aan het centrale zenuwstelsel (CNS), kan leiden tot permanente handicaps in patiënten, en speelt ook een rol in de onomkeerbare neurologische tekorten in neurodegeneratieve ziekten1,2 ,3,4,5. De CNS-milieu, alsmede het groeivermogen van de intrinsieke van neuronen, bepaalt of axonen zijn in staat om te regenereren na trauma. Extracellulaire factoren uit Oligodendrocyt, astroglial en fibroblastic bronnen is aangetoond dat het bemoeilijken van de neuronale groei4,,6,,7,8, maar de afschaffing van deze moleculen alleen voorziet in beperkte kiemen van5. Regeneratie van de intrinsieke signalen kunnen beïnvloeden van regeneratieve succes5,9 en vertegenwoordigen therapeutisch doelwit, maar deze processen zijn nog steeds niet duidelijk omschreven op moleculair niveau. Stijgingen van de trofische factor signalering of eliminatie van endogene remmen, zoals de Pten fosfatase10, kunnen resulteren in axonale regeneratie in bepaalde omstandigheden. Combinaties van verschillende methoden gevonden worden individueel effectieve verstrek ook alleen beperkte totale terugwinning tot op heden11,12,13,14. Daarom is er een wanhopige behoefte om te identificeren van extra trajecten voor gerichte therapie. Naast de inleiding van axon hergroei, of en hoe axonen opnieuw aan de juiste doelgroep, hervorming synapse specificiteit, draad en bereiken functionele herstel zijn belangrijke onbeantwoorde vragen.

Kortom is de huidige begrip van de machine dicteert axon regeneratie nog zeer fragmentarisch. Deel van het probleem is de technische moeilijkheid van het bestuderen van axon regeneratie bij zoogdieren in real-time, een aanpak die is duur, tijdrovend en uitdagend voor het uitvoeren van grootschalige genetische schermen. Drosophila melanogaster, aan de andere kant, heeft bewezen een uitzonderlijk krachtig systeem voor de studie van complexe biologische vragen. De fruitvlieg behulpzaam bij het definiëren van genen en signalering van trajecten die zijn opvallend bewaard bij de mens geweest en is een succesvol model voor de studie van menselijke aandoeningen, zoals neurodegeneratieve aandoeningen, door de enorme moleculaire genetica-gereedschappen beschikbaar voor het manipuleren van gene functie15. In het bijzonder, fruitvliegjes worden beschouwd als een ideaal hulpmiddel voor de ontdekking van de genen die betrokken zijn in de neurale letsel en hergroei15,16. Verschillende vliegen neurale letsel modellen zijn ontwikkeld, met inbegrip van volwassene-hoofd of larvale ventrale zenuw snoer (VNC) steken met naalden, larvale VNC of Verbrijzeling van de zenuw met pincet larvale neuron laser axotomy, olfactorische receptor neuron verwijdering, explantaten hersenletsel, en laesie van de perifere zenuw door vleugel severance15,17,18,19,20,21,22,23. Opwindend, hebben recente werk met behulp van Drosophila letsel modellen geavanceerde ons begrip van de cellulaire en genetische trajecten die door het zenuwstelsel gebruikt om te reageren op neurale letsel, waarvan een aantal is aangetoond dat ze worden bewaard in zoogdieren24 ,25. Nogmaals, dit benadrukt het nut van deze modelorganisme voor herkenbare roman mechanismen voor neurale reparatie.

Hier beschreven is een twee-foton laser gebaseerde Drosophila larvale sensorisch neuron letsel model. Een twee-foton laser werd voor het eerst gebruikt te snijden axonen in zebrafish in vivo in 200326. In datzelfde jaar werd de eerste laser dendriotomy uitgevoerd in Drosophila met behulp van een gepulseerde stikstof laser27. Kort daarna, gebruikt verschillende C. elegans labs femtoseconde lasers om modellen van axon regeneratie28. In 2007, Wu en collega's vergeleken en de verschillen tussen laser verwondingen in C. elegans geïnduceerd door verschillende soorten lasers29gemeld. In 2010 bleek axon regeneratie na laser axotomy eerste optreden in Drosophila30. Voortbouwend op deze uitgebreide laser letsel literatuur, hebben we een model van de vlieg neurale letsel met behulp van de laser twee-foton, waarmee nauwkeurige inductie van letsel naar gerichte sites met minimale verstoring van de aangrenzende weefsels, bieden een relatief schone systeem om te studeren zowel de intrinsieke en extrinsieke eigenschappen van neuroregeneration met eencellige resolutie. In het bijzonder hebben we een aantal letsel methoden voor de sensorische neuronen dendritische arborization (da) opgericht in zowel het perifere zenuwstelsel (PNS) en CNS. Da neuronen kunnen worden ingedeeld in vier verschillende klassen onderscheiden zich vooral door hun dendriet vertakkende complexiteit: klasse I tot en met IV31. Onze gepubliceerde werk toont dat da neuron regeneratie lijkt op zoogdieren schade modellen op de fenotypische en moleculair niveau: da neuronen beeldschermeigenschappen klasse specifieke regeneratie, met klasse IV maar niet klasse I of III da neuronen exposeren regeneratie in de PNS; klasse IV da neuron axonen regenereren krachtig in de periferie, maar hun regeneratieve potentieel is drastisch verminderd in het VNV, dus lijkend op achterwortelganglia ganglion (DRG) neuronen in zoogdieren; verbetering van de mTOR activiteit via Pten verbetert schrapping of Akt overexpressie axon regeneratie in de vlieg CNS19. Gebruik makend van dit letsel model, wij hebben het uitvoeren van genetische schermen en hebben het RNA verwerking enzym Rtca geïdentificeerd als een evolutionair geconserveerde remmende factor voor axon regeneratie, koppelen van axon blessure tot cellulaire stress en RNA wijziging20 .

In de gepresenteerde paradigma, wordt de schade veroorzaakt via laser axotomy/dendriotomy van larvale klasse IV of III da neuronen, gelabeld door ppk-CD4-tdGFP of 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80, respectievelijk. De schade wordt uitgevoerd op 2nd aan 3rd instar-larven op ongeveer 48-72 uur na ei leggen (h AEL). Voor PNS is axotomy de laesie gericht op de sectie van axon ~ 20-50 µm uit de buurt van de cel lichaam, voor CNS axotomy naar een gebied van ~ 20 µm in diameter bij het knooppunt commissuur de VNC en dendriotomy aan de primaire dendritische vertakkingspunten. Het dezelfde neuron is beeld 8-24 uur na letsel (AI) om te bevestigen de volledige transect, en bij 48-72 h AI te beoordelen van de regeneratie. Via time-lapse confocal imaging, kunnen de degeneratie en regeneratie van individuele axonen/dendrites die gewonde in vivo zijn na verloop van tijd worden gecontroleerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bereiding van de platen van de cultuur en flessen

  1. Bereiding van druivensap agar platen
    1. Voeg 10 g agar poeder, 200 mL druiven SAP en 192 mL ddH2O in een bekerglas en magnetron voor ongeveer 4-5 min, roeren met tussenpozen totdat de agar volledig is opgelost.
    2. In een zuurkast afkoelen van de oplossing tot ca. 60 ° C. 4.2 mL 95% ethanol en 4,0 mL ijsazijn toevoegen. Het totale volume van de oplossing tot 400 mL met ddH2O. Mix goed aanpassen.
    3. Voeg ongeveer 2-3 mL van de oplossing voor elke plaat 35-mm. Ongeveer 120-150 platen voor een totaal van 400 mL druivensap agar oplossing maken
    4. Wacht 10 minuten te koelen van de platen en stollen de agar-oplossing. Pak het druivensap agar platen in zichzelf gesloten ziplock zakken en bewaren bij 4 ° C voor toekomstig gebruik.
  2. Voorbereiding van Drosophila cultuur flessen
    1. Gebruik een mes om de punch een 1,5 cm kant lengte driehoekige gat op een muur van de Drosophila cultuur fles en vul het gat met een 2-2.5 cm diameter bal van katoen voor ventilatie.
    2. Sluit de fles met een druivensap agarplaat aangevuld met ongeveer 0.5 cm3 van gist plakken.

2. verzameling van Drosophila larven

  1. Kruisen van volwassen vliegen instellen
    1. Plaats 10 maagdelijke teefjes en 5 mannelijke volwassene vliegt samen in een fles van de cultuur aangesloten met een druivensap agarplaat.
    2. Plaats de bodem van de fles boven bij 25° C, zodat de vliegen zullen leggen eieren op het druivensap agarplaat. Het wijzigen van de plaat met gist plakken ten minste eenmaal per dag. Voor een periode van 2-h collectie, waardoor de oogsten van de larven van een homogene ontwikkelingsstadium, beginnen met meer dan 20 Maagd vrouwen en 10 mannen in stap 2.1.1.
    3. Cultuur de plaat bij 25° C in een petrischaal 60 mm met een vochtige tissues, bijvoorbeeld, gedrenkt in een oplossing van 0.5% propionzuur. Het weefsel zo rangschikken dat zuurstof stroom worden niet geblokkeerd.
      Opmerking: De propionzuur oplossing wordt gebruikt voor behouden van vochtigheid in de schotel en voorkomen dat de groei van schimmel.
  2. Larven van de oogst van een bepaalde leeftijd
    1. Kunt een paar pincet te dragen van de larven van de gewenste fase, bijvoorbeeld 2nd aan 3rd instar-larven 48-72 uur na ei leggen (AEL), een nieuwe druivensap agarplaat zonder gist plakken.
    2. Verwijder de gist van de larven in de huid door hen te laten kruipen rond op de nieuwe plaat, om te voorkomen dat potentiële verstoren van gist laser axotomy en beeldvorming. U kunt ook grondig schoon de larven door hen in een schotel van PBS wassen en drogen kort op een stuk van papieren zakdoekje.

3. twee-foton letsel en Confocal Imaging

  1. Microscoop setup
    Opmerking: Een confocale laser scanning microscoop met een twee-foton laser voor dit experiment werd gebruikt, maar andere systemen met een gelijkwaardige setup ook volstaat. De twee-foton laser (930 nm) werd gebruikt voor het leveren van de schade en een laser Argon (488 nm) voor confocal beeldvorming van GFP werd gebruikt.
    1. Aan het begin van elke sessie, schakel de twee-foton laser en/of de confocale laser, en de Microscoop. De imaging software niet openen.
    2. Voor twee-foton letsel, instellen van de volgende parameters voor imaging GFP met de twee-foton laser op 930 nm (1,950 mW).
      1. Selecteer lijn scanmodus. Het gaatje helemaal openstellen. Verhogen van de intensiteit van de laser ~ 20% (390 mW).
      2. 512 x 512 als de frame-scan selecteren Gebruik maximaal scansnelheid (meestal met de pixel Nadruktijd op 0.77 µs). Ervoor zorgen dat het gemiddelde aantal 1 is en bitdiepte van 8 bits is.
      3. Set winst ~ 750, en de verschuiving naar 0.
      4. Sla dit vooraf ingestelde experimentele protocol als 2 P GFP 930 ablatie, waardoor voor eenvoudig hergebruik in de toekomst experimenten.
    3. Voor confocal imaging, instellen van de volgende parameters voor imaging GFP met de laser Argon op 488 nm:
      1. Selecteer het tabblad overname en vervolgens Z-stack.
      2. Onder "Laser", zet voor de 488 nm Argon laser.
      3. Ga naar kanalen, selecteer de laser 488 mm, en de kracht van de laser tot 5-10% verhogen. Gebruik voor het gaatje, de 1-2 luchtige eenheid (AU). De winst voor de 650 aanpassen.
      4. Overname modus, 1024 x 1024 selecteren als de frame-scan, gebruik de maximale scan snelheid, een gemiddeld aantal 2 en bitdiepte van 8 bits.
      5. Sla dit vooraf ingestelde experimentele protocol als GFP Imaging.
  2. Larven anesthesie met diethylether en montage
    1. Plaats een schotel van 60 mm glas in een 15 cm kunststof petrischaal in een zuurkast. Vouwen en lag een stuk weefsel papier aan de onderkant van de glazen schotel, plaats dan een agarplaat druivensap op het weefsel. Diethylether in de glazen schotel, toevoegen aan het punt waar het weefsel papier doorweekt is en er is een laag van vloeibare ether resterende in de schotel. Houd het deksel op te allen tijde.
    2. Bereiden een glasplaatje met een druppel van halonen 27 olie in het midden. 4 plaatsen voor vacuüm vet op de vier hoeken van de dia, hoger ondersteunen het dekglaasje aan toevoegen.
    3. Pincet te halen een schoongemaakte larve en plaats het op de agarplaat in de schotel van 60 mm glas gebruiken Dekking van de glazen schotel met het deksel en wacht totdat de larve niet meer beweegt. Voor PNS letsel/imaging, nemen de larve zodra haar staart spiertrekkingen stopt. Voor de CNS, wachten totdat de hele larve onbeweeglijk verandert, met name de hoofd segmenten.
      Opmerking: De timing van de ether blootstelling is van cruciaal belang. Zie discussie.
    4. Voorzichtig halen de larve van de narcose en het hoofd-rechtop in de daling van halonen olie op de dia te plaatsen. Een dekglaasje aan op de top van de dia toevoegen. Gebruik zachte druk om druk op het dekglaasje aan, totdat het raakt de larve (figuur 1A).
    5. De larve van positie aanpassen door het dekglaasje aan naar links of naar rechts om te rollen van de larve, zachtjes te duwen zodat de neuron/axon/dendriet van belang op de top en het dichtst bij de Microscoop lens is.
    6. Voor PNS letsel oplopen de dorsale zijde van de larve, zodat zowel de tracheas zichtbaar zijn. Rol vervolgens de larve ~ 30 graden naar links voor verwonden van klasse III da neuron axonen (figuur 1B en 1 C), 90 graden voor verwonden van klasse IV da neuron axonen (figuur 1B en 1E) of ~ 30 graden voor verwonden van klasse IV da neuron dendrites) Figuur 2A).
    7. Bij CNS letsel, plaatst u de larve te perfect ventrale zijde naar boven (figuur 3A), zodat de regio van belang is het dichtst bij de Microscoop lens in het z-vlak.
  3. Letsel door twee-foton laser
    1. Plaats de dia met de larve onder de Microscoop en veilig in plaats met de houder van de dia in het werkgebied. Gebruik de 10 X (0.3 nvt) doelstelling te vinden van de larve.
    2. Overschakelen naar de 40 X (1.3 nvt), voeg 1 druppel objectieve olie op het dekglaasje aan doelstelling en de focus aan te passen.
    3. Overschakelen naar de modus scannen en hergebruiken van het experimentele protocol Ablatie van 2 P GFP 930. Zorg ervoor dat het gaatje is helemaal geopend.
      Opmerking: De configuratie moet worden geoptimaliseerd op basis van afzonderlijke systemen.
    4. Start de Live -modus om te zoeken van de regio van belang (ROI) en fine-tunen van de instellingen om goede beeldkwaliteit met de juiste zoom.
      Opmerking: Het doel van deze stap is om te vinden de neuron/axon/dendriet te verwonden, in plaats van het nemen van de beste kwaliteit beeld. Daarom gebruiken de minimale instellingen voldoende te visualiseren het doelgebied, om overbelichting of photobleaching te vermijden.
    5. Stop Live scan, zodat de knop bijsnijden beschikbaar zullen komen. Laat het stilstaande beeld dienen als de routekaart. Selecteer de functie Crop en aanpassen van het venster scannen om zich te concentreren op het doel te worden verwond.
    6. De ROI te de grootte van de potentiële site van verwonding verminderen. Bijvoorbeeld alleen betrekking op de breedte van een axon en een dendriet, vermindering van schade aan naburige weefsels te waarborgen van de precisie van de schade. Indien gewenst, zoom in op de ROI voor bijsnijden, zodat nauwkeuriger letsel.
    7. Open een nieuw venster van de beeldvorming. Verlaag de snelheid van de scan en laser intensiteit te verhogen. De toename in intensiteit van de laser op basis van het weefsel fluorescentie signaal gescand in de Live -modus bepalen.
    8. Meestal stelt u de intensiteit van de twee-foton laser vanaf 25% voor PNS letsel en 50-100% voor VNC letsel. Voor PNS axon blessure, ervoor zorgen dat de intensiteit van de laser ~ 480 mW en pixel Nadruktijd is 8.19 µs. Voor de VNC axon blessure, zorgen ervoor dat de laser intensiteit en pixel Nadruktijd meestal 965-1930 mW en µs 8.19-32.77, respectievelijk.
    9. Continu scan starten. Laat de cursor zweefde over de knop continue . Nauwlettend in de gaten te houden op de afbeelding en de scan stoppen zodra een drastische verhoging van fluorescentie wordt waargenomen.
      Opmerking: Het uiterlijk van de fluorescentie-Prikker is te wijten aan auto-fluorescentie bij de site van de schade.
    10. Terugschakelen naar de Live-modus door het hergebruik van de instellingen. Het gebied van belang, dat was gewoon door aanpassing van de focus gericht te vinden.
      Opmerking: Een goede indicatie van succesvolle letsel is de verschijning van een kleine krater, ring-achtige structuur of gelokaliseerde puin rechts op de site van de schade.
    11. Ga naar het volgende neuron en herhaal vanaf stap 3.3.5, te verwonden meerdere neuronen in een enkel dier. Of Herhaal stap 3.3.5 terwijl geleidelijk de macht vergroten en/of vermindering van de snelheid van de scan als de eerste schade onvoldoende was.
      Opmerking: In het geval dat de kracht van de laser te is hoog, een groot beschadigde gebied worden zichtbaar in de afbeelding na letsel live scan. Teveel schade kan leiden tot de dood van de larve.
    12. De larve herstellen door het zorgvuldig verwijderen van het dekglaasje aan en overdracht van de larve van de benadeelde op een nieuw bord met gist plakken. Verschillende grotten op de agarplaat sloot met een tang; Daarnaast maken een eiland agar in de plaat in plaats van de hele plaat, om de mogelijkheid van de larve kruipen uit de plaat verminderen.
    13. Zet de plaat in een petrischaal 60 mm met vochtige tissues (geweekt met 0,5% propionzuur oplossing) en cultuur bij kamertemperatuur of 25° C.
      Opmerking: De larve blijft in het larvale stadium voor ongeveer een extra dag bij kamertemperatuur (22° C) in vergelijking met bij 25° C.
  4. Na letsel confocal imaging
    1. Beeld de larve van de benadeelde op gewenste tijdstippen door het opstellen van de larve die volgens dezelfde procedure van anesthesie en montage zoals in stap 3.2, vervolgens met de confocale laser imaging.
      Opmerking: Het imago van de larve aan 24 h na blessure (AI) te bevestigen van axonale schade en aan 48 h AI (klasse IV da neuronen) of 72 h AI (klasse III da neuronen) te beoordelen van de regeneratie.
    2. Zoek de larve die met behulp van de 10 X doelstelling, en schakel over naar een 25 X (0.8 nvt) doelstelling. Hergebruik van de experimentele protocol GFP Imaging.
    3. Klik op de knop Live en vinden het dezelfde neuron eerder gewond.
    4. De eerste en laatste Z-positie in het venster live scan instelt. Druk op stoppen en klikt u op Start experimenteren om te verwerven van de afbeelding van een Z-stack.
      Opmerking: Zorg ervoor dat de punt van een normalisatie (het axon convergerende punt) opgenomen is bij het vastleggen van beelden, zodat de kwantificering van regeneratie is mogelijk (Figuur 1 d, 1F) – Dit is besproken in de sectie van de data-analyse verder.
    5. Overschakelen naar Image Processing, selecteert u de afbeelding alleen genomen en genereren een projectie van maximale intensiteit. Zowel de z-stack en de maximale intensiteit projectie afbeeldingen opslaan.

4. de gegevensanalyse

  1. Verwerken en kwantificeren van de beelden met behulp van het imaging software of ImageJ.
  2. Kwantificering van axon regeneratie in de PNS
    1. Bereken het regeneratie percentage, waarin verwezen naar het percentage wordt van het regenereren van axonen onder alle de axonen die lesioned waren. Score van een axon als regenereren, zolang het buiten de site schade verrot.
    2. Maatregel regeneratie lengte, die de toename van de lengte van de axon is. Kwantificeren met ImageJ, gebruiken de Gesegmenteerde lijn -tool om te traceren van de geregenereerde axon, als maatregel in het vervolgkeuzemenu analyseren gebruikt te bereiken van de lengte van de lijn vertegenwoordigen de geregenereerde axon.
    3. Berekening van de Regeneratie Index, die is de toename van de lengte van de genormaliseerde axon.
      Opmerking: Axon lengte is genormaliseerd door de afstand tussen de cel lichaam en de axon convergerende punt (DCAC) – axon lengte/DCAC (Figuur 1 d en 1F). Deze waarde kan u helpen een axonale groei die is toe te schrijven aan de larvale schalen voor hun rekening. Een positieve waarde vertegenwoordigt regeneratie, een waarde van 0 betekent geen regeneratie, en een negatieve waarde betekent retractie.
  3. Kwantificering van dendriet regeneratie
    1. Regeneratie percentage, dat het percentage van da neuronen onder al degenen verbroken is die tonen duidelijk dendriet hergroei berekenen.
      Opmerking: Dendriet hergroei is georkestreerd als positief als nieuwe dendrites regrow uit van de ingeklapte dendritische stengel en buiten de site van de schade. De site van letsel is bepaald door monumenten, en in sommige gevallen, is waarneembaar als gevolg van de resterende schade-geïnduceerde autofluorescence.
    2. Bereken verhogen van vertakkingspunten, die de toevoeging van nieuwe dendritische vertakkingspunten na blessure telt.
    3. Toename van totale dendriet lengte, die de cumulatieve lengte van alle de nieuwe dendrites toegevoegd na blessure is te berekenen.
  4. Kwantificering van axon regeneratie in het VNV
    Opmerking: Als een laesie site toont degeneratie bij het eerste keer beeld (figuur 3B), zal het worden opgenomen in de analyse van regeneratie lengte en snelheid.
    1. Maatregel regeneratie lengte, die de lengte van de ontstaande axon is.
      Opmerking: De ontstaande axon van een site één laesie is geïdentificeerd als het afkomstig uit de oorspronkelijke axon route voor de schade is.
    2. Bereken Normalized regeneratie lengte, die de lengte van de regeneratie tot de lengte van het segment commissuur - de longitudinale afstand tussen commissures ("Y" in figuur 3A en 3B) normaliseert.
      Opmerking: Deze waarde helpt juist voor het effect van larvale grootte verschillen.
    3. Regeneratie tarief, dat het percentage is van het regenereren van segmenten onder alle segmenten die lesioned waren, om na te denken van de regeneratiecapaciteit van een bepaald genotype te berekenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Da neuronen Toon differentiële regeneratie potentiële tussen de perifere en centrale zenuwstelsel, evenals de specificiteit van de klasse. Dit biedt unieke kansen om te screenen op nieuwe factoren die vereist voor de regeneratie van de axon zijn (met behulp van de klasse IV PNS letsel), evenals die zijn remmende voor regeneratie (met klasse IV CNS letsel en klasse III PNS letsel).

Axon regeneratie in de PNS

Als voorbeeld, wordt de karakterisering van regeneratie van klasse III en klasse IV da neuronen beschreven. Deze neuronen liggen bilateraal in elk segment van het lichaam. Meerdere neuronen kunnen worden verwond in de larve van de dezelfde; normaal gesproken 3-4 neuronen in de rechterkant van abdominale segmenten A7-A2. Klasse III en klasse IV da neuronen kunnen worden gevisualiseerd door 19-12-Gal4, UAS-CD4tdGFP, repo-Gal80 en ppk-CD4tdGFP, respectievelijk. Anesthetize en monteren van 48-72 uur AEL larven, zoals beschreven, aanpassen van de positie van de larven, zodat de da neuronen van belang zijn naar boven (figuur 1A en 1B). We verwonden meestal de ddaF van klasse III en klasse IV v'ada neuronen (Figuur 1 c en 1E). Uitvoeren van axotomy en larven te herstellen zoals beschreven. Kort na letsel (AI), zal de larven van chirurgie en tentoonstelling normale motoriek zijn hersteld. Het overlevingspercentage hier is meestal meer dan 80%. Gooi larven die dood of ziek zijn. De rest remount zoals beschreven en degeneratie te beoordelen. Bij 24 h AI, de distale axonen degeneratie bij deze tijd punt19afgerond moeten zijn, en de axon stam zullen waarneembaar (Figuur 1 d en 1F). PowerSchool de dezelfde larven op 48 h AI voor klasse IV da neuronen of 72 h AI voor klasse III da neuronen te beoordelen van de regeneratie. Meestal willen we ten minste 20 gewonden neuronen per experimentele voorwaarde beoordelen. In (wild type) WT blijkt dieren, overwegende dat meestal ~ 70% van afgesneden klasse IV da neuronen zal hebben gegenereerd buiten de schade site (figuur 1F), klasse III da neuronen niet regrow, uit groei kegel stalling (Figuur 1 d).

Dendriet regeneratie

Meestal voeren we dendriotomy op klasse IV da neuronen ddaC (figuur 2A). Zoals aangegeven in het schematische diagram, is de schade gericht op de primaire dendritische vertakkingspunt. Gebaseerd op ervaring, wanneer gewond bij 48 h AEL, regenereren ~ 50% van de ddaC neuronen hun dendrites (figuur 2B). In de resterende 50%, naburige dendrites binnenvallen en dekking van de vrijgekomen ruimte. Bovendien is het potentieel van de regeneratie van deze neuronen verminderd als gewond bij een later ontwikkelingsstadium.

Axon regeneratie in het VNV

Voor VNC axon blessure, de overlevingskansen van larven varieert aanzienlijk en is afhankelijk van de leeftijd waarop de schade wordt veroorzaakt. Gebaseerd op ervaring, larven van 48-72 uur AEL hebben meestal de hoogste overlevingskansen (> 60%) onder de verschillende stadia getest. Larven jonger dan 48u AEL overleven slecht na letsel, terwijl in die ouder is dan 72 h AEL is het moeilijk om de schade in de VNC. Bovendien, het is makkelijker voor het opwekken van letsel op de achterste commissuur segmenten dan de voorste, zoals deze achterste segmenten van de VNC dichter bij het ventrale oppervlak en dus toegankelijker door laser (figuur 3A zijn).

Om te verwonden klasse IV da neuron axonen in het VNV, mount de larven zoals hiervoor is beschreven (figuur 3A). Zoek de ladder-achtige structuur van axon bundels die deel uitmaken van de VNC (figuur 3A) onder de Microscoop, en uitvoeren van axotomy zoals uiteengezet. Degeneratie is bevestigd tijdens 8 h AI en regeneratie worden beoordeeld op 24 en 72 h AI. Zoals blijkt uit figuur 3B, axonen om 8 h AI zijn al begonnen te ontaarden, en 24 h AI, wordt axon regeneratie waargenomen terwijl axon puin kan nog steeds worden gevonden rond de schade-sites. WT axonen beperkt hergroei in de VNC weergeven en niet opnieuw de lacunes die worden gegenereerd door de schade (figuur 3B). Om te kwantificeren van de regeneratie vermogen van gewonde axonen, wordt de lengte van de hergroei na letsel wordt gemeten en de lengte van het segment commissuur (Y in figuur 3A) gebruikt voor normalisatie (Figuur 3 c).

Figure 1
Figuur 1: Da neuron axon regeneratie in de periferie toont klasse specificiteit. (A en B) Schematische tekening met aanduiding van de plaats van de larven. (C) schematische tekening van klasse III da neuronen. (D) de axonen van de klasse III da neuronen ddaF, aangeduid met 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80 / +, niet te regrow. (E) schematische tekening van klasse IV da neuronen. (F) axonen van de klasse IV da neuronen v'ada, aangeduid met ppk-CD4-tdGFP / +, regrow buiten de site van de laesie. (D en F) Rode lijn geeft axon lengte terwijl groene onderbroken lijn markeert de afstand tussen de cel lichaam en de axon convergerende punt (DCAC). De blauwe stip markeert het axon convergerende punt. Schaal bar = 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Da neuron dendriet regeneratie. (A) illustratieve vertegenwoordiging van klasse IV da neuronen. (B) illustratieve vertegenwoordiging van dendriet regeneratie in klasse IV da neuron ddaC, het label door ppk-CD4-tdGFP / +. Laser Ablatie is gericht op het punt van de primaire tak en verloopt op 48u AEL. Op 24 h AI letsel transect van de neurite is bevestigd, en bij 72 h AI regeneratie wordt gekwantificeerd. Dendrites van ddaC neuronen tonen aanzienlijke hergroei, met nieuwe dendritische takken kiemen uit de afgehakte stengel te tegel van de vrijgekomen ruimte. Het is vermeldenswaard dat nieuwe terminal vestigingen ontwikkelingstoxiciteit vooralsnog voortdurend worden toegevoegd aan de ongedeerd dendrites. Schaal bar = 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Da neuron axon regeneratie in de VNC. (A) schematische tekening van een larve Drosophila gemonteerd op een dia en beeld onder de Microscoop. Klasse IV da neuron axonen in de VNC gevisualiseerd in een ppk-CD4tdGFP / + larve. Twee kandidaat-commissuur segmenten worden weergegeven in de afbeelding in-of uitgezoomd-in en de schematische tekening. Elk van hen heeft twee sites van het letsel (rode cirkels). (B) Confocal beelden van één gewonde segment beeld op 8, 24 en 72 h na blessure (AI). Rode lijnen tonen de ontstaande axonen. (C) meting en normalisering van ontstaande axonen. Schaal bar = 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Wanneer opzetten vlieg kruist, kan het aantal vrouwtjes en mannetjes gebruikt variëren naargelang de genotypen en het aantal larven die nodig zijn voor specifieke experimenten. Voor WT vliegen, typische Kruis gebruikt 10 teefjes en 5 reutjes. Het venster van de collectie kan worden verkleind, afhankelijk van de nauwkeurigheid van de leeftijd van de larven vereist. Bijvoorbeeld, zal een periode van 2-h collectie larven van een meer homogene populatie opleveren. In dit geval zal met behulp van 20 of meer Maagd vrouwtjes instellen de kruisen helpen voldoende eieren opleveren. De opbrengst van de eerste dag is meestal schaars, dus twee of meer dagen na het opzetten van de zaal verzamelen de plaat met eieren. Wanneer verder kweken de plaat met eieren, is het raadzaam om te genieten van het weefsel in de 60-mm petrischaal in 0,5% propionzuur oplossing in plaats van water, dat zal niet alleen helpen handhaven van de vochtigheid in de schotel maar ook voorkomen dat de groei van de schimmel.

Bij het instellen van de apparaten voor larven narcose en montage, zorg ervoor dat een glazen schotel gebruiken omdat ether door middel van kunststoffen smelten zal. De glazen schotel is gehuisvest in een 15 cm kunststof petrischaal in geval van een lek. Het weefsel papier helpt behouden van ether in de schotel zodat de larve kan effectief worden gevloerd door de damp van de ether. Met behulp van amber dropping van flessen voor het opslaan van aliquots van ether en ether in druppels toe te voegen met de glazen pipet wordt aanbevolen. Aanvullen van de ether en houd altijd een laagje vloeibare ether aan de onderkant van de schotel voor optimale effect.

De timing van de ether blootstelling is van cruciaal belang: onder verdoving zal leiden tot herstel van de larve in het midden van de beeldvorming sessie en wankel beelden; een verdoving overdosis, of direct contact met de ether vloeistof, zal leiden tot letaliteit. Om te overleven en succestarief maximaliseren, onze vuistregel is als volgt: voor PNS letsel/imaging, nemen de larve zodra haar staart spiertrekkingen stopt; voor de CNS, wachten totdat de hele larve onbeweeglijk verandert, met name de hoofd segmenten. Zelfs een lichte beweging zal interfereren met de schade en de beeldvorming van VNC axonen. Oudere larven de neiging om langer duren om knock-out. Het duurt meestal minder dan 2 min voor larven jonger dan 72 h AEL en 2-5 min. voor larven die ouder is dan 72 h AEL.

Bij het instellen van de intensiteit van de twee-foton laser voor letsel, wordt de waarde bepaald door het weefsel fluorescentie signaal verkregen uit de "Live"-scan. De schade is geïntroduceerd door "Continue" scan zoals in stap 3.3. De schade-geïnduceerde verhoging van fluorescentie is te wijten aan autofluorescence op de site van letsel en dient als een goede indicator van het doorbranden van de neurite. Meestal duurt het 1-10 s te zien van de fluorescentie-Prikker. Het is cruciaal voor de tijd van de scan zodra fluorescentie is verheven. PNS schade is het noodzakelijk om te scannen onmiddellijk stopzetten. Langdurige blootstelling zal vergroten de site letsel en schade nabijgelegen weefsels. Dit biedt echter de mogelijkheid om te scannen tijd aanpassen en manipuleren van de ernst van het letsel. Een succesvolle letsel moet een laesie grootte diameter kleiner dan 3-4 μm. Voor VNC axon blessure, de VNC axonen zijn ingesloten veel dieper in vergelijking met de da neuron PNS axonen/dendrites, die vlak onder de huid, en zo nodig hoger laser intensiteit. We vertrekken meestal de scan op voor een paar seconden. Dit is om ervoor te zorgen dat de gehele axon bundel is doorgesneden. Als de straal van de laesie sites meer dan de helft van de breedte van de bundel commissuur is, worden dergelijke schade sites geteld als mislukte. Deze larven hebben een laag overlevingspercentage en zal niet worden opgenomen in de analyse.

Voor axon regeneratie is de regeneratie vermogen vergelijkbaar in larvale stadia. Maar voor dendriet regeneratie na een enkele dendriet cut, de potentiële regeneratie na 72 h AEL19is verlaagd. Axon blessure is dus doorgaans uitgevoerd op 48 h - 72 h AEL en dendriet schade bij 48h AEL, met de beoordeling van de regeneratie bij 120h AEL. Larven van 24u AEL kunnen ook worden gebruikt, maar ze vereisen meer zorgvuldige omgang, gezien hun kleinere omvang. Larven verpoppen na 120 h AEL, imaging uitdagender te maken. Daarom is onze eindpunt meestal 120 h AEL.

Wat is de onderlinge relatie tussen degeneratie en regeneratie? Voor PNS letsel, bij 24 h AI, heeft normaal de distale axon/dendriet in WT voltooid Wallerian degeneratie terwijl regeneratie niet op dit tijdstip gestart is. Daarom geloven wij dat in WT larven, degeneratie van afgehakte neurites slechts een zeer beperkte invloed op regeneratie, of helemaal niet. Axonen om 8 h AI hebben al begon te ontaarden VNC letsel, en 24 h AI, wordt axon regeneratie waargenomen terwijl axon puin kan nog steeds worden gevonden rond de schade-sites. Het puin lijkt niet te blokkeren van regeneratie. Het is echter mogelijk dat onder bepaalde omstandigheden kan er een overlapping of zelfs een Overspraak tussen degeneratie en regeneratie. In feite, werd er gemeld dat in leeftijd muizen, opruiming van puin na schade aan de perifere zenuwen langzamer dan die bij jonge dieren is. Gelijktijdig, werd tragere reinnervation van de motorische eindplaat waargenomen, die kunnen worden toegeschreven aan het grotere aantal obstakels regenereren axonen ontmoeting in de oude dieren. Verrassend, echter axonen van leeftijd dieren snel regenereren en reinnervate sites van de motorische eindplaat efficiënt als niet geconfronteerd met puin32. Dit suggereert dat het vergemakkelijken van puin goedkeuring zou een mogelijke strategie ter bevordering van de regeneratie.

In vergelijking met andere neuroregeneration-modellen, heeft de vliegen sensorisch neuron letsel model unieke voordelen. Muismodellen meestal weken tot maanden duren om uit te voeren en zijn niet geschikt voor het uitvoeren van grootschalige genetische schermen; C. elegans heeft alleen een primitieve zenuwstelsel die niet nauw van de regeneratie barrières in de zoogdieren CNS recapituleren kunnen; anders dan zoogdieren, zebravis CNS axonen regenereren krachtig. De snelle levenscyclus van vliegen, de veelzijdigheid van vliegen genetica, toegankelijkheid en stereotiepe patronen van axonen/dendrites van vliegen sensorische neuronen, en de eigenschappen van de karakteristieke regeneratie van vliegen sensorische neuronen-subtype specifieke regeneratie in de PNS en beperkte regeneratie in het VNV – maken Drosophila da neuronen een aantrekkelijk model voor het bestuderen van neuroregeneration. Bovendien, recente studies van geplette muis retinale ganglion cellen (RGCs) ook suggereren dat neuronale subtypen verschillende regeneratie bevoegdheid dragen; Sommige regering van Cambodja subtypen kunnen regenereren, terwijl anderen in de schijnbaar homogeen zenuw bundel niet regrow33. Deze belangrijke bevinding suggereert dat neuronale type-specifieke strategieën moeten worden benut ter bevordering van de regeneratie en functionele herstel en sterk betoogt dat de inductie van axon blessure en latere regeneratie analyse moet worden uitgevoerd een neuronale subtype-specifieke wijze. Bovendien, de cellulaire en Moleculaire determinanten voor deze regeneratie type-specificiteit blijven grotendeels onbekend19,33. Daarom biedt het da neuron letsel model de ideale paradigma om deze kwesties aan te pakken.

Ten opzichte van axon regeneratie, zijn studies gericht op dendriet regeneratie veel schaarser. Dendriet schade zich voordoet, zoals traumatisch hersenletsel, beroerte, en vele vormen van neurodegeneratie, maar er is bijna niets bekend over dendrites vermogen te herstellen en te hervormen van neurale verbindingen. De da neuron letsel model biedt opnieuw een zeer toegankelijk systeem waarin stereotiepe patronen, klasse specificiteit en tijdelijke verordening19, voor het verkennen van deze richting.

Het is ook vermeldenswaard dat hoewel het mogelijk is te verwonden van een gelabelde interne axon in de PNS, de manier schade wordt uitgevoerd in de resultaten van de CNS in de laesie van een bundel van axonen. Indien gewenst, kan MARCM34 of het FLP-out kloon35 aanpak worden gebruikt voor het label van één axonen in het VNV. Bovendien, wanneer gliale cellen worden gelijktijdig aangeduid met mRFP (Repo-Gal4, UAS-mRFP), wordt de accumulatie van glia processen waargenomen specifiek gericht is op de site van de laesie. Bovendien, de uitdrukking van Ptp99A, de vliegen homolog van chondroitin sulfaat Proteoglycaan (CSPG) phosphacan / PTPRZ1, is omhoog-geregeld op de site van de laesie. Ptp99A co lokaliseert met gliale cellen en omringt de schade site, vorming van een ring-achtige structuur vergelijkbaar wat voor astroglial littekens in zoogdieren19,36,,37heeft gemeld. Kortom, zal de da neuron letsel model, in combinatie met markers van andere celtypes zoals gliale cellen of immuuncellen, toestaan in vivo real-time bewaking van de meercellige interacties tussen een benadeelde neuron en omgeving milieu.

Terwijl deze vliegen larven sensorisch neuron letsel model ons kansen om te vinden van potentiële neuroregeneration toezichthouders zowel in de PNS en CNS biedt, heeft op stilstaand verscheidene beperkingen. Ten eerste, het is niet van hoge-doorvoer in dit stadium. Meestal kon 5-6 genotypen worden gescreend door één persoon in een week. Het moet worden geoptimaliseerd om het uitvoeren van een onbevooroordeelde scherm. Ten tweede, zoals de ether narcose op larven van verschillende min aan niet meer dan twintig min duren kan, is het niet optimaal voor op de lange termijn denkbaar. Dus, zijn specifieke tijdstippen die representatief voor axon degeneratie en regeneratie respectievelijk zijn gekozen voor imaging. Ten derde, hoewel dit protocol is een manier om te verwonden axonen juist de invoering, de mogelijkheid van schade aan het omringen van weefsels niet volledig uit te sluiten. In de VNC kunnen deze weefsels gliale cellen, axonen en dendrites van andere neuronen. Om te minimaliseren deze potentiële caveat, we minimaliseren van de schade-sites, de laagste laser macht mogelijk toepassen en dezelfde procedures uit te voeren parallel aan de controle zowel groepen experimenteren. Ten vierde, bij de oprichting van de CNS letsel paradigma, verschillende letsel sites werden getest, met inbegrip van de plaatsen dicht bij de axon termini, dat we koos voor het gebruik en de vermelding punt van axonen in de VNC. De ingangspunten bleken te zijn moeilijker te verwonden, omdat ze dieper in het weefsel en meer kans om te verplaatsen. Dus, voor deze praktische redenen kiezen wij voor de huidige methode, die goed voor grootschaligere experimenten, consequenter en beter gecontroleerde is. Een potentiële zorg, is zoals hierboven vermeld, de mogelijkheid van het naburige weefsels, zoals het postsynaptisch componenten en de gliacellen verwonden. Aan de andere kant, is het een uitstekende vraag hoe de beschadigde omliggende weefsels beïnvloeden de degeneratie en regeneratie van axonen. Bijvoorbeeld, hoe beïnvloedt het gliale litteken axon regeneratie. Dit presenteert een andere reden waarom onze schade-model kan sterk gelijken op letsel modellen in zoogdieren, waarbij axonen en weefsels rond de laesie sites zijn meestal gewond gelijktijdig.

Laser letsel gevolgd door time-lapse microscopie is een gevoelige test voor het bestuderen van axon/dendriet regeneratie. Één hoofdzorg van deze bepaling is echter de vermeende kosten, die van <$ 10K voor low-end solid-state pulse lasers, $25-100K voor femtoseconde lasers aan >$ 100K voor twee-foton lasers varieert. Er zijn verschillende goede discussies over verschillende laser-systemen gebruikt voor axotomy29,38,39,40,41,42,43, 44 , 45. om samen te vatten, conventionele lasers zijn optimaal voor snijden axonen binnen over 30-50 µm van het oppervlak. Er zullen meer collaterale schade met de nano en pico tweede lasers in vergelijking met de femtoseconde laser, vooral omdat de diepte van het doelgebied45toeneemt. Voor verwonden axonen in de VNC, de diepte van die is meestal ongeveer 50-100 µm, is het essentieel om te minimaliseren van weefselbeschadiging. In dit geval de twee-foton laser is ideaal, die richt zich op de kracht van de laser op het brandvlak, vermindering van de collaterale weefselschade zonder afbreuk te doen aan weefsel penetratie. Kortom, het twee-foton-systeem is duur, maar biedt de beste precisie en weefsel instandhouding. Als alleen de PNS axonen het doelwit van axotomy zijn, kunnen conventionele puls lasers echter een meer betaalbaar alternatief.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken Jessica Goldshteyn voor technische ondersteuning. Werk in het lied lab wordt gefinancierd door de NIH-subsidie R00NS088211, en de Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (IDDRC) nieuwe programma Development Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous Acros Organics AC615080010
Halocarbon 27 Oil Genesee Scientific 59-133
Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L VWR 97062-948 
Agar powder, Alfa Aesar, 500GM VWR AAA10752-36
Grape juice Welch’s
Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%) VWR 64-17-5
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
Propionic Acid J.T.Baker U33007
Cover Glasses: Rectangles Fisher Scientific 12-544-D 50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope Zeiss
Zen software Zeiss
Chameleon Ultra II Coherent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yakura, J. S. Recovery following spinal cord injury. , (1996).
  2. Harel, N. Y., Strittmatter, S. M. Can regenerating axons recapitulate developmental guidance during recovery from spinal cord injury? Nature reviews. Neuroscience. 7, 603-616 (2006).
  3. Jurewicz, A., Matysiak, M., Raine, C. S., Selmaj, K. Soluble Nogo-A, an inhibitor of axonal regeneration, as a biomarker for multiple sclerosis. Neurology. 68, 283-287 (2007).
  4. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7, 617-627 (2006).
  5. Sun, F., He, Z. Neuronal intrinsic barriers for axon regeneration in the adult CNS. Curr Opin Neurobiol. , (2010).
  6. Liu, B. P., Cafferty, W. B., Budel, S. O., Strittmatter, S. M. Extracellular regulators of axonal growth in the adult central nervous system. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 361, 1593-1610 (2006).
  7. Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal intrinsic mechanisms of axon regeneration. Annu Rev Neurosci. 34, 131-152 (2011).
  8. Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. Nogo limits neural plasticity and recovery from injury. Curr Opin Neurobiol. 27, 53-60 (2014).
  9. He, Z., Jin, Y. Intrinsic Control of Axon Regeneration. Neuron. 90, 437-451 (2016).
  10. Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
  11. Geoffroy, C. G., Hilton, B. J., Tetzlaff, W., Zheng, B. Evidence for an Age-Dependent Decline in Axon Regeneration in the Adult Mammalian Central Nervous System. Cell Rep. 15, 238-246 (2016).
  12. Geoffroy, C. G., et al. Effects of PTEN and Nogo Codeletion on Corticospinal Axon Sprouting and Regeneration in Mice. J Neurosci. 35, 6413-6428 (2015).
  13. Jin, D., et al. Restoration of skilled locomotion by sprouting corticospinal axons induced by co-deletion of PTEN and SOCS3. Nat Commun. 6, 8074 (2015).
  14. Wang, X., et al. Axonal regeneration induced by blockade of glial inhibitors coupled with activation of intrinsic neuronal growth pathways. Exp Neurol. 237, 55-69 (2012).
  15. Fang, Y., Bonini, N. M. Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila models of nerve injury. Annual review of cell and developmental biology. 28, 575-597 (2012).
  16. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
  17. Leyssen, M., et al. Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain. The EMBO journal. 24, 2944-2955 (2005).
  18. MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50, 869-881 (2006).
  19. Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes Dev. 26, 1612-1625 (2012).
  20. Song, Y., et al. Regulation of axon regeneration by the RNA repair and splicing pathway. Nat Neurosci. 18, 817-825 (2015).
  21. Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
  22. Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Curr Biol. 22, 590-595 (2012).
  23. Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
  24. Brace, E. J., DiAntonio, A. Models of axon regeneration in Drosophila. Exp Neurol. 287, 310-317 (2017).
  25. Hao, Y., Collins, C. Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 44, 84-91 (2017).
  26. Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).
  27. Sugimura, K., et al. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
  28. Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432, 822 (2004).
  29. Wu, Z., et al. Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15132-15137 (2007).
  30. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Mol Biol Cell. 21, 767-777 (2010).
  31. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
  32. Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33, 19480-19491 (2013).
  33. Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85, 1244-1256 (2015).
  34. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
  35. Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
  36. Buss, A., et al. NG2 and phosphacan are present in the astroglial scar after human traumatic spinal cord injury. BMC Neurol. 9, 32 (2009).
  37. McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar. J Neurosci. 19, 10778-10788 (1999).
  38. Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. J Microsc. 234, 1-8 (2009).
  39. Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Phys Rev Lett. 99, 158104 (2007).
  40. Venugopalan, V., Guerra, A. 3rd, Nahen, K., Vogel, A. Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation. Phys Rev Lett. 88, 078103 (2002).
  41. Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans. Opt Express. 16, 5963 (2008).
  42. O'Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
  43. Tsai, P. S., et al. Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems. Curr Opin Biotechnol. 20, 90-99 (2009).
  44. Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
  45. Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. J Vis Exp. , (2011).

Tags

Geneeskunde 135 kwestie Drosophila sensorisch neuron dendritische arborization neuron neurale letsel neuroregeneration axotomy dendriotomy PNS CNS
Een <em>Drosophila In Vivo</em> letsel Model voor het bestuderen van de Neuroregeneration in de perifere en centrale zenuwstelsel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, D., Li, F., Guttipatti, P.,… More

Li, D., Li, F., Guttipatti, P., Song, Y. A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System. J. Vis. Exp. (135), e57557, doi:10.3791/57557 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter