Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

En Drosophila In Vivo skade Model til at studere Neuroregeneration i perifere og centrale nervesystem

doi: 10.3791/57557 Published: May 5, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer her, en protokol bruger Drosophila sensoriske neuron - dendritiske arborization (da) neuron skade model, som kombinerer i vivo live imaging, to-foton laser axotomy/dendriotomy og kraftfuld flyve genetiske værktøjskassen, som en platform for screening potentielle initiativtagere og hæmmere af neuroregeneration.

Abstract

Genvækst kapacitet af beskadigede neuroner styrer neuroregeneration og funktionel genopretning efter nervesystem traumer. I de seneste par årtier, er blevet identificeret forskellige indre og ydre hæmmende faktorer involveret i begrænsning af axon regenerering. Men blot at fjerne disse hæmmende signaler er utilstrækkelig for vellykket regenerering, der angiver eksistensen af yderligere lovgivningsmæssige maskiner. Drosophila melanogaster, frugtflue, deler evolutionært bevarede gener og signalering veje med hvirveldyr, herunder mennesker. Ved at kombinere de kraftfulde genetiske værktøjskasse af fluer med to-foton laser axotomy/dendriotomy, beskriver vi her Drosophila sensoriske neuron-dendritiske arborization (da) neuron skade model som en platform for systematisk screening for roman regenerering regulatorer. Kort, omfatter dette paradigme a) udarbejdelsen af larver, b) læsion induktion til dendrite(s) eller axon(s) ved hjælp af en to-foton laser, c) levende Konfokal imaging efter skade og d) data analyse. Vores model giver meget reproducerbare skade af enkelt mærket neuroner, axoner og dendrites af veldefinerede neuronal undertyper, i både perifere og centrale nervesystem.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Axoner manglende evne til at regenerere efter en skade på centralnervesystemet (CNS), kan føre til permanent handicap hos patienter, og spiller også en rolle i de irreversible neurologiske underskud i neurodegenerative sygdomme1,2 ,3,4,5. CNS miljø, samt den iboende vækst evne af neuroner, bestemmer, om axoner er i stand til at regenerere efter traumer. Ekstracellulære faktorer fra oligodendrocyte, astroglial og fibroblastic kilder har vist sig at hæmme neuronal vækst4,6,7,8, men fjernelsen af disse molekyler kun tillader begrænset spiring5. Iboende regenerering signaler kan påvirke regenerativ succes5,9 og repræsenterer potentielle terapeutiske mål, men disse processer er stadig ikke veldefineret på molekylært niveau. Stigninger i trofiske faktor signalering eller afskaffelse af endogene bremser, som pt fosfatase10, kan resultere i cytoskeletale regenerering under visse omstændigheder. Kombinationer af forskellige metoder anset for at være individuelt effektiv også kun levere begrænset samlede recovery til dato11,12,13,14. Derfor, der er desperat behov for at identificere yderligere veje for målrettet terapi. Ud over indledningen af axon genvækst, om og hvordan axoner re-wire til de korrekte mål, reform synapse specificitet, og opnå funktionel genopretning er vigtige ubesvarede spørgsmål.

Sammenfattende er aktuelle forståelse af maskinen dikterer axon regenerering stadig meget fragmentariske. En del af problemet er tekniske vanskeligheder med at studere axon regenerering i pattedyr i real-time, en tilgang, der er dyrt, tidskrævende og udfordrende til at gennemføre storstilet genetiske skærme. Drosophila melanogaster, på den anden side har vist sig for at være en usædvanlig kraftfuld system til studiet af komplekse biologiske spørgsmål. Frugt flue har været medvirkende til at definere gener og signalering veje, der er påfaldende bevaret i mennesker og har været en vellykket model for studiet af menneskelige lidelser, såsom neurodegenerative sygdomme, gennem de store molekylær genetik værktøjer rådighed til at manipulere gen funktion15. Bananfluer er navnlig anses for at være et ideelt værktøj for opdagelsen af gener involveret i neurale skade og genvækst15,16. Flere flyve neurale skade modeller er blevet udviklet, herunder voksen-hoved eller larve ventrale nerve ledningen (VNC) stikkende med nåle, larve VNC eller nerve crush med pincet, larve neuron laser axotomy, olfaktoriske receptor neuron fjernelse, explants hjerneskade, og perifere nerve læsion af wing fratrædelsesgodtgørelse15,17,18,19,20,21,22,23. Spændende, har seneste arbejde udnytte Drosophila skade modeller avancerede vores forståelse af de cellulære reaktionsveje og genetiske bruges af nervesystemet til at reagere på neurale skader, hvoraf nogle har vist sig at være bevaret i pattedyr24 ,25. Igen, dette understreger nytten af denne model organisme for at identificere nye mekanismer af neurale reparation.

Beskrevet her er en to-foton laser-baseret Drosophila larve sensoriske neuron skade model. En to-foton laser blev første gang brugt til at skære axoner i zebrafisk i vivo i 200326. I samme år blev den første laser dendriotomy udført i Drosophila ved hjælp af en pulserende kvælstof laser27. Kort efter bruges flere C. elegans labs femtosekund lasere til at oprette modeller af axon regenerering28. I 2007, Wu og kolleger sammenlignet og rapporteret forskelle mellem laser skader i C. elegans induceret af forskellige typer af lasere29. I 2010, var axon regenerering efter laser axotomy først vist sig at forekomme i Drosophila30. Bygger på denne omfattende laser skade litteratur, har vi udviklet en flyve neurale skade model ved hjælp af to-foton laser, som giver præcise induktion af skade til målrettede websteder med minimal undertrykkelse af netbårne af nærliggende væv, giver en relativt ren system til at studere både de indre og ydre egenskaber af neuroregeneration med enkelt-celle opløsning. Specifikt, vi har etableret et sæt skade metoder for dendritiske arborization (da) sensoriske neuroner i både det perifere nervesystem (PNS) og CNS. Da neuroner kan inddeles i fire forskellige klasser adskiller sig primært ved deres dendrit forgrening kompleksiteter: klasse I til IV31. Vores offentliggjort arbejde viser, at da neuron regenerering ligner pattedyr skade modeller på fænotypiske og molekylært niveau: da neuroner vise specifikke regenerering klasseegenskaber med klasse IV men ikke klasse I eller III da neuroner udstiller regenerering i den PNS; klasse IV da neuron axons regenerere håndfast i periferien, men deres regenerativ potentiale reduceres dramatisk i CNS, der dermed ligner dorsalrods ganglion (DRG) neuroner i pattedyr; forbedre mTOR aktivitet via Yvonne_h_p forbedrer sletning eller Akt overekspression axon regenerering i flyve CNS19. Utilizing denne skade model, vi har udøvet genetiske skærme og har identificeret RNA forarbejdning enzymet Rtca som et evolutionært bevarede hæmmende faktor for axon regenerering, forbinder axon skade til cellulært stress og RNA ændring20 .

I de præsenterede paradigme, er skaden fremkaldt via laser axotomy/dendriotomy af larve klasse IV eller III da neuroner, mærket af ppk-CD4-tdGFP eller 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80, henholdsvis. Skaden, der er udført på 2nd til 3rd instar larver på ca 48-72 h efter æglægning (h AEL). Til PNS er axotomy læsion målrettet til del af axon ~ 20-50 µm fra cellen organ, for CNS axotomy til et område af ~ 20 µm i diameter på commissure krydset i VNC, og dendriotomy til de primære dendritiske gren punkter. Den samme neuron er afbildet på 8-24 timer efter skade (AI) at bekræfte komplet transection, og 48-72 h AI at vurdere regenerering. Gennem time-lapse Konfokal imaging, kan degeneration og regeneration af individuelle axoner/dendritter, der er blevet skadet i vivo følges over tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. forberedelse af kultur plader og flasker

  1. Forberedelse af druesaft agar plader
    1. Tilsættes 10 g agar pulver, 200 mL drue saft og 192 mL ddH2O i et bægerglas og mikroovn i ca 4-5 min, omrøring periodisk indtil agaren er fuldstændig opløst.
    2. I et stinkskab, køle ned løsningen til ca. 60 ° C. Tilføje 4,2 mL 95% ethanol og 4,0 mL iseddike. Justere det samlede volumen af løsningen på 400 mL med ddH2O. Mix godt.
    3. For hver 35-mm plade, tilføje omkring 2-3 mL af opløsningen. Lave ca 120-150 plader i alt 400 mL druesaft agar løsning.
    4. Vente 10 min at køle ned pladerne og størkne agar løsning. Pack druesaft agar plader i selvstændige forseglet ziplock poser og opbevares ved 4 ° C til fremtidig brug.
  2. Forberedelse af Drosophila kultur flasker
    1. Brug en kniv til at punch en 1,5 cm side længde trekantede hul på den ene væg af Drosophila kultur flaske og fylde hul med en 2-2,5 cm diameter kugle af bomuld til ventilation.
    2. Sæt flasken med en druesaft agar plade suppleret med omkring 0,5 cm3 gær pasta.

2. indsamling af Drosophila larver

  1. Oprette krydsninger af voksne fluer
    1. Sted 10 jomfruelige hunner og 5 mandlige voksne fluer sammen i en kultur flaske tilsluttet med et druesaft agar plade.
    2. Placer flaske bunde op ved 25° C, så fluer vil lægge æg på druesaft agar plade. Ændre tallerken med pasta, gær mindst en gang om dagen. For en 2-h samling periode, som tillader høst af larver af en homogen udviklingsstadiet, start med mere end 20 jomfruelige hunner og 10 hanner i trin 2.1.1.
    3. Kultur plade ved 25° C i en 60-mm petriskål med et vådt væv, for eksempel, dyppet i 0,5% propionsyre løsning. Arranger væv, så det ikke blokerer ilt flow.
      Bemærk: Propionsyre løsning bruges til at opretholde fugtigheden i fadet og undgå vækst af skimmel.
  2. Høst larver af en bestemt alder
    1. Bruge et par pincet til at overføre larver af den ønskede scene, for eksempel 2nd til 3rd instar larver på 48-72 h efter æglægning (AEL), til en ny druesaft agar plade uden gær pasta.
    2. Fjerne gær fra den larverne hud ved at lade dem kravle rundt på den nye plade, til at forhindre potentielle indblanding af gær med laser axotomy og billedbehandling. Alternativt kan du grundigt rengøre larverne ved at vaske dem i en skål af PBS og tørring kortvarigt på et stykke silkepapir.

3. to-foton skade og konfokal Imaging

  1. Mikroskop setup
    Bemærk: En Konfokal laser scanning mikroskop med en to-foton laser blev anvendt til dette eksperiment, men andre systemer med en tilsvarende setup vil også være tilstrækkeligt. To-foton laser (930 nm) blev brugt til at levere skade og en Argon laser (488 nm) blev brugt til Konfokal billeddannelse af normal god landbrugspraksis.
    1. I starten af hver session, slå to-foton laser og/eller den Konfokal laser(s) og mikroskop. Åbn den billedbehandlingsprogrammer.
    2. To-foton skade, at angive følgende parametre for imaging normal god landbrugspraksis med to-foton laser på 930 nm (1.950 mW).
      1. Vælg linje scanningstilstand. Åbne hul hele vejen. Øge laser intensitet ~ 20% (390 mW).
      2. Vælg 512 x 512 som ramme scanningen. Bruge maksimal scanning hastighed (typisk med pixel hviletiden på 0,77 µs). Sikre, at det gennemsnitlige antal er 1 og bitdybde er 8 bits.
      3. Indstil gain ~ 750 og forskudt mod 0.
      4. Gem denne pre-sæt forsøgsplan som 2 P normal god landbrugspraksis 930 Ablation, giver mulighed for nemt genbruge fremover eksperimenter.
    3. Konfokal imaging, at angive følgende parametre for imaging normal god landbrugspraksis med Argon laser på 488 nm:
      1. Vælg erhvervelse fanen og derefter Z-stakken.
      2. Under "Laser", aktivere bemyndigelse for 488 nm Argon laser.
      3. Gå til kanaler, Vælg 488 mm laser, og øge laser power 5-10%. Pinhole, bruge 1-2 luftige enhed (AU). Justere gevinst til 650.
      4. I Erhvervelse Mode, Vælg 1024 x 1024 som ramme scanningen, skal du bruge maksimal scanning hastighed, et gennemsnitligt antal 2 og bitdybde på 8 Bit.
      5. Gem denne forudindstillede forsøgsplan som Normal god landbrugspraksis Imaging.
  2. Larverne anæstesi med diethylether og montering
    1. I et stinkskab, placere en 60-mm glasfad i en 15-cm plastik petriskål. Fold og lå et stykke silkepapir i bunden af glasskål, derefter placere en druesaft agar plade på væv. Tilføje diethylether i glasskål, til det punkt, hvor silkepapir er gennemblødt og der er et lag af flydende ether tilbage i skålen. Holde låg på på alle tidspunkter.
    2. Forberede et glas dias med en dråbe halocarbon 27 olie i centrum. Tilføj 4 steder af vakuum fedt på de fire hjørner af diaset, og senere understøtter coverslip.
    3. Bruge pincet til at afhente en renset larve og placere den på agar plade i 60-mm glasfad. Dække glasskål med låg og vente, indtil larve stopper flytter. PNS skade/imaging, skal du tegne en larve, så snart sin hale stopper trækninger. Til CNS, vent indtil den hele larve bliver ubevægelig, især de hoved segmenter.
      Bemærk: Timingen af ether eksponering er kritisk. Se diskussion.
    4. Omhyggeligt afhente de bedøvede larve og placere den hoved-opretstående til drop halocarbon olie på diaset. Tilføje en coverslip på toppen af diaset. Brug blide tryk til at skubbe på coverslip, indtil det rører larver (figur 1A).
    5. Justere de larve position ved forsigtigt at skubbe coverslip mod venstre eller højre for at rulle larve, så at neuron/axon/dendrit af interesse er på toppen og tættest på mikroskop linse.
    6. Til PNS skade, montere larve dorsale side op, således at både tracheas er synlige. Derefter rulle larve ~ 30 grader til venstre for sårede klasse III da neuron axons (figur 1B og 1 C), 90 grader for sårede klasse IV da neuron axons (figur 1B og 1E) eller ~ 30 grader for sårede klasse IV da neuron dendritter) Figur 2A).
    7. For CNS skade, placere larve for at være perfekt ventrale side op (figur 3A), således at det pågældende område er tættest på mikroskop linsen i z-plan.
  3. Skade af to-foton laser
    1. Placer slide med larve under lup og Fastgør det på plads med diasholderen på scenen. Brug 10 X (0,3 NA) mål at finde larve.
    2. Tilsættes 1 dråbe af objektive olie på coverslip, skifte til 40 X (1,3 NA) mål og justere fokus.
    3. Skifte til tilstanden scanning og genbruge forsøgsplan 2 P normal god landbrugspraksis 930 Ablation. Kontroller, at pinhole åbnes helt.
      Bemærk: Konfigurationen skal optimeres baseret på de enkelte systemer.
    4. Starte tilstanden Live for at finde regionen af interesse (ROI), og finjustere indstillingerne for at opnå god billedkvalitet med den passende zoom.
      Bemærk: Formålet med dette trin er at finde neuron/axon/dendrit at såre, snarere end at tage det bedste kvalitet billede. Derfor bruge de minimale indstillinger tilstrækkelig til at visualisere målområdet, for at undgå overeksponering eller photobleaching.
    5. Stop Live scan, således at knappen Beskær vil blive tilgængelige. Lad stillbilledet tjene som køreplanen. Vælg funktionen afgrøde og justere vinduet scan til at fokusere på målet om at komme til skade.
    6. Reducere ROI for at være på størrelse med webstedet potentielle skade. For eksempel, bare dække bredde en axon og en dendrit, sikre præcision af skaden og reducere skader omkringliggende væv. Hvis det ønskes, zoome ind på ROI før beskæring, giver mulighed for mere præcis skade.
    7. Åbn et nyt imaging vindue. Reducere scanning hastighed og øge laser intensitet. Bestemme stigningen i laser intensiteten baseret på væv fluorescens signal scannet i Live -mode.
    8. Typisk angive to-foton laser intensiteten fra 25% til PNS skade og 50-100% for VNC skade. Til PNS axon skade, sikre, at laser intensitet er ~ 480 mW og pixel hviletiden er 8.19 μs. For VNC axon skaden, sikre, at laser intensitet og pixel hviletiden er normalt 965-1930 mW og 8.19-32.77 μs, henholdsvis.
    9. Start fortløbende scanning. Lad markøren svæve over knappen fortløbende . Holde et vågent øje med billedet og stoppe scanningen, så snart en drastisk stigning i Fluorescens er observeret.
      Bemærk: Udseendet af fluorescens spike skyldes auto-fluorescens på skaden site.
    10. Skifte tilbage til Live-mode ved at genbruge indstillingerne. Find det pågældende område, der var bare rettet ved at justere fokus.
      Bemærk: En god indikation af vellykket skade er udseendet af et lille krater, ring-lignende struktur eller lokaliserede snavs lige ved skaden site.
    11. Flytte til den næste neuron og Gentag fra trin 3.3.5, at såre flere neuroner i et enkelt dyr. Eller Gentag trin 3.3.5 mens gradvist stigende magt og/eller reducere scanning hastighed, hvis den oprindelige skade var utilstrækkelig.
      Bemærk: I tilfælde af at laser power er alt for høj, et stort beskadigede område vil være synlig i efter skade live scan billedet. For meget skade kan forårsage død af larve.
    12. Genskab larve ved omhyggeligt at fjerne coverslip og overføre den tilskadekomne larve på en ny tallerken med pasta, gær. Grøft flere huler på agar plade med pincet; Alternativt, lave en ø af agar i pladen i stedet for at bruge hele pladen, til at reducere muligheden for larver kravler ud af pladen.
    13. Sæt pladen i et 60-mm petriskål med vådt væv (gennemblødt med 0,5% propionsyre løsning) og kultur ved stuetemperatur eller 25° C.
      Bemærk: Larve forbliver i larve fase for ca en ekstra dag ved stuetemperatur (22° C) i forhold til ved 25° C.
  4. Efter skade Konfokal imaging
    1. Billede den tilskadekomne larve på ønskede tidspunkter ved at forberede larve ved hjælp af den samme procedure for anæstesi og montering som i trin 3.2, derefter imaging med Konfokal laser.
      Bemærk: Image larve på 24 h efter skade (AI) at bekræfte cytoskeletale personskade og 48 h AI (klasse IV da neuroner) eller 72 h AI (klasse III da neuroner) at vurdere regenerering.
    2. Find larve ved hjælp af de 10 X mål, derefter skifte til en 25 X (0,8 NA) mål. Genbruge forsøgsplan Normal god landbrugspraksis Imaging.
    3. Klik på knappen Live og finde de samme neuron såret tidligere.
    4. Angive de første og sidste Z positioner i live scan-vinduet. Tryk på stop, og klik på Start eksperimentere for at erhverve en Z-stakken billede.
      Bemærk: Sørg for, at en normalisering punkt (axon konvergerende punkt) er inkluderet, når du optager billeder, således at kvantificering af regenerering er muligt (figur 1 d, 1F) – dette diskuteres yderligere i afsnittet data analyse.
    5. Skifte til Billedbehandling, Vælg billedet lige taget og generere en maksimal intensitet projektion. Gem både z-stakken og maksimal intensitet projektion billeder.

4. dataanalyse

  1. Behandle og kvantificere billeder ved hjælp af enten den imaging software eller ImageJ.
  2. Kvantificering af axon regenerering i PNS
    1. Beregne regenerering procentdel, som henviser til procent af regenererende axoner blandt alle de axoner, der var lesioned. Score et axon som regenererende så længe det regrows ud over skaden site.
    2. Foranstaltning regenerering længde, som er stigningen i axon længde. Hvis kvantificering med ImageJ, brug værktøjet Segmenterede linje til at spore den regenererede axon, og bruge foranstaltning i rullemenuen analyser for at få længden af den linje, der repræsenterer den regenererede axon.
    3. Beregne Regenerering indeks, som er stigningen i normaliseret axon længde.
      Bemærk: Axon længde er normaliseret af afstanden mellem cellen kroppen og axon konvergerende punkt (DCAC) – axon længde/DCAC (fig. 1 d og 1F). Denne værdi hjælper konto for enhver cytoskeletale vækst, der skyldes larve skalering. En positiv værdi repræsenterer regenerering, en værdi på 0 betyder ingen regenerering og en negativ værdi betyder retraktion.
  3. Kvantificering af dendrit regenerering
    1. Beregne regenerering procentdel, som er procent af da neuroner blandt alle dem, der udskilles der viser indlysende dendrit genvækst.
      Bemærk: Dendrit genvækst er scorede som positiv, hvis nye dendritter regrow ud fra tilbagetrukken dendritiske stilken og videre skaden site. Skaden site er bestemt ved seværdigheder, og i nogle tilfælde, er let synlig på grund af den resterende skade-induceret autofluorescence.
    2. Beregne øge gren punkter, som tæller tilføjelsen af nye dendritiske gren point efter skade.
    3. Beregne øge samlede dendrit længde, som er den kumulative længde af alle de nye dendritter tilføjet efter skade.
  4. Kvantificering af axon regenerering i CNS
    Bemærk: Hvis en læsion websted viser degeneration for det første tidspunkt afbildet (figur 3B), vil det blive inkluderet i analysen af regenerering længde og hastighed.
    1. Foranstaltning regenerering længde, som er længden af fornybare axon.
      Bemærk: Den fornybare axon af en enkelt læsion site er identificeret som det stammer fra den oprindelige axon rute før skaden.
    2. Beregne normaliseret regenerering længde, som normaliserer regenerering længde til længden af commissure segment - langsgående afstanden mellem Commissurer ("Y" i figur 3A og 3B).
      Bemærk: Denne værdi hjælper korrekte for effekten af larve størrelse forskelle.
    3. Beregne regenerering sats, hvilket er procent af regenererende segmenter blandt alle de segmenter, der var lesioned, at afspejle regenerering kapacitet på en given genotype.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Da neuroner Vis differential regenerering potentielle mellem de perifere og centrale nervesystem, samt klasse specificitet. Dette giver unikke muligheder for at screene for romanen faktorer, der er nødvendige for axon regenerering (ved hjælp af klasse IV PNS skade), såvel som dem, der er hæmmende for regenerering (med klasse IV CNS skade og klasse III PNS skade).

Axon regenerering i PNS

Som et eksempel, er karakterisering af regenerering af klasse III- og klasse IV da neuroner beskrevet. Disse neuroner er placeret bilateralt i hvert organ segment. Flere neuroner kan blive kvæstet i den samme larve; typisk 3-4 neuroner i højre side af abdominal segmenter A7-A2. Klasse III- og klasse IV da neuroner kan visualiseres ved 19-12-Gal4, UAS-CD4tdGFP, repo-Gal80 og ppk-CD4tdGFP, henholdsvis. Bedøver og montere 48-72 h AEL larver som beskrevet, justere placeringen af larverne, således at da neuronerne interesse står op (figur 1A og 1B). Vi sårer normalt klasse III ddaF og klasse IV v'ada neuroner (figur 1 c og 1E). Udføre axotomy og genoprette larver som beskrevet. Kort efter skade (AI), har larverne genvundet fra kirurgi og udstille normal bevægelse. Overlevelsesraten her er typisk over 80%. Kassér larver, der er døde eller syge. Remount resten som beskrevet og vurdere degeneration. På 24 h AI, de distale axoner skal have afsluttet degeneration på denne tidspunkt19, og axon stilken vil være let synlige (fig. 1 d og 1F). Reimage de samme larver på 48 h AI for klasse IV da neuroner eller 72 h AI for klasse III da neuroner til at vurdere regenerering. Vi tilstræber normalt at vurdere mindst 20 sårede neuroner pr. eksperimentelle tilstand. I (vildtype) WT fremgår dyr, hvorimod typisk ~ 70% af afhuggede klasse IV da neuroner vil har regenereret end skade site (figur 1F), klasse III da neuroner undlader at regrow, af vækst kegle stalling (fig. 1 d).

Dendrit regenerering

Vi udfører normalt dendriotomy på klasse IV da neuroner ddaC (figur 2A). Som vist i skematisk diagram, er skaden, der målrettet til den primære dendritiske forgreningspunktet. Baseret på erfaring, når såret på 48 h AEL, regenerere ~ 50% af ddaC neuroner deres dendritter (figur 2B). I de resterende 50%, nærliggende dendritter invadere og dække den ledige plads. Derudover er regenerering potentialet af disse neuroner reduceret hvis såret ved en senere udviklingsstadiet.

Axon regenerering i CNS

VNC axon skade, overlevelsesraten for larver varierer betydeligt og afhænger af den alder, hvor skade er induceret. Baseret på erfaring, larver af 48-72 h AEL typisk har den højeste overlevelse (> 60%) blandt de forskellige stadier testet. Larverne yngre end 48 h AEL overleve dårligt efter skade, mens de ældre end 72 h AEL er det vanskeligt at indføre skade i VNC. Desuden er det lettere at fremkalde skader på de bageste commissure segmenter end de forreste, som disse bageste segmenter af VNC er tættere på den ventrale overflade og således mere tilgængelig ved hjælp af laser (figur 3A).

For at såre klasse IV da neuron axons i CNS, montere larver som tidligere beskrevet (figur 3A). Find stigen-lignende struktur af axon bundter der indgår i VNC (figur 3A), og udføre axotomy som skitseret under mikroskop. Degeneration er bekræftet på 8 h AI og regenerering opgøres til 24 og 72 h AI. Som vist i figur 3B, axoner på 8 h AI er allerede begyndt at degenerere, og på 24 h AI, axon regenerering er observeret mens axon snavs kan stadig findes rundt skade websteder. WT axoner Vis begrænset genvækst i VNC og undlade at genoprette de huller, der er genereret af skade (figur 3B). For at kvantificere regeneration evne til tilskadekomne axoner, anvendes genvækst længde efter skade er målt og længden af commissure segment (Y i figur 3A) til normalisering (figur 3 c).

Figure 1
Figur 1: Da neuron axon regenerering i periferien viser klasse specificitet. (A og B) Skematisk tegning, der viser placeringen af larverne. (C) skematisk tegning af klasse III da neuroner. (D) axoner af klasse III da neuroner ddaF, mærket med 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80 / +, undlader at regrow. (E) skematisk tegning af klasse IV da neuroner. (F) axoner af klasse IV da neuroner v'ada, mærket med ppk-CD4-tdGFP / +, regrow ud over webstedet læsion. (D og F) Røde linje angiver axon længde, mens grøn stiplet linje markerer afstanden mellem cellen kroppen og axon konvergerende punkt (DCAC). Den blå prik markerer axon konvergerende punkt. Skalalinjen = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Da neuron dendrit regenerering. (A) Illustrative repræsentation af klasse IV da neuroner. (B) Illustrative repræsentation af dendrit regenerering i klasse IV da neuron ddaC, mærket af ppk-CD4-tdGFP / +. Laser ablation er målrettet til den primære forgreningspunktet og foregår på 48 h AEL. På 24 h AI skade transection af neurite er bekræftet, og på 72 h AI regenerering er kvantificeret. Dendritter ddaC neuroner påvise betydelige genvækst, med nye dendritiske grene spiring fra afhuggede stilken til flise den ledige plads. Det er værd at bemærke, at nye terminal grene kontinuerligt er føjet til de uskadt dendritter på denne udviklingsstadiet. Skalalinjen = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Da neuron axon regenerering i VNC. (A) skematisk tegning af en Drosophila larve monteret på et dias og afbildet under mikroskop. Klasse IV da neuron axons i VNC visualiseret i en ppk-CD4tdGFP / + larve. To kandidat commissure segmenter er vist i zoomet ind i billedet og den skematiske tegning. Hver af dem har to skade websteder (røde cirkler). (B) Konfokal billeder af en skadet segment afbildet på 8, 24 og 72 timer efter skade (AI). Røde linjer skildrer de fornybare axoner. (C) måling og normalisering af fornybare axoner. Skalalinjen = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Når oprettelsen af fly krydser, kan antallet af hunner og hanner bruges variere afhængigt af genotyper og antallet af larver behov for konkrete eksperimenter. For WT fluer bruger typisk tværs 10 tæver og 5 hanner. Vinduet indsamling kan blive indsnævret, afhængigt af nøjagtigheden af larver alder påkrævet. For eksempel, vil en 2-h samling periode give larver af en mere homogen befolkning. I dette tilfælde vil ved hjælp af 20 eller mere jomfruelige hunner for at oprette Kors hjælpe give tilstrækkelige æg. Udbytte fra den første dag er normalt knappe, så indsamle pladen med æg to eller flere dage efter oprettelsen af salen. Når yderligere dyrkning pladen med æg, anbefales det i blød væv i 60-mm petriskål i 0,5% propionsyre løsning i stedet for vand, som vil ikke kun hjælpe med at opretholde fugtigheden i skålen men også undgå vækst af skimmel.

Når du opretter enheder til larver anæstesi og montering, Sørg for at bruge en glasskål, fordi Æter vil smelte gennem plast. Glasfad har til huse i en 15-cm plastik petriskål i tilfælde af en lækage. Tissue-papir hjælper bevare ether i skålen, så larve kan effektivt slået ud af ether dampe. Ved hjælp af rav dropper flasker for at gemme delprøver af Æter og tilføje ether i dråber med glas dropper anbefales. Fylde æteren og altid holde et lag af flydende ether i bunden af fadet for optimal effekt.

Timingen af ether eksponering er kritisk: under anæstesi vil føre til larve opsving i midten af imaging-session og rystende billeder; en anæstesi overdosis, eller direkte kontakt med ether væske, vil forårsage dødelighed. For at maksimere overlevelse og succesrate, vores tommelfingerregel er som følger: for PNS skade/imaging, tegne larve så snart sin hale stopper trækninger; til CNS, vent indtil den hele larve bliver ubevægelig, især de hoved segmenter. Selv en lille bevægelse vil forstyrre skade og billeddannelse af VNC axoner. Ældre larver har tendens til at tage længere tid at banke. Det tager normalt mindre end 2 min til larver yngre end 72 h AEL og 2-5 min til larver ældre end 72 h AEL.

Når du opretter intensiteten af den to-foton laser til skade, bestemmes værdien af væv fluorescens signalet fra "Live" scan. Skaden, der er indført ved "Kontinuerlige" scanning som trin 3.3. Den skade-induceret stigning i Fluorescens er på grund af autofluorescence på skaden site og fungerer som en god indikator for fratrædelsesgodtgørelse af neurite. Det tager typisk 1-10 s se fluorescens spike. Det er afgørende at styre scanningstidspunktet når Fluorescens er forhøjet. PNS skade er det vigtigt at stoppe scanning straks. Langvarig udsættelse vil forstørre skaden site og skader omkringliggende væv. Dette giver dog mulighed for at justere scan tid og manipulere sværhedsgraden af skaden. En vellykket skade bør have en læsion størrelse diameter mindre end 3-4 μm. For VNC axon skade, VNC axoner er indlejret langt dybere i forhold til da neuron PNS axoner/dendritter, hvilket er lige under huden, og som derfor kræver højere laser intensitet. Vi forlader normalt scanningen på for et par sekunder. Dette er at sikre, at hele axon bundt er afbrudt. Hvis radius for læsion websteder er mere end halvdelen af bredden af commissure bundt, tælles sådan skade websteder som mislykket. Sådanne larverne har en lav overlevelsesrate og medtages ikke i analysen.

Til axon regenerering er regeneration evne lignende på tværs af larve faser. Men for dendrit regenerering efter en enkelt dendrit cut, regenerering potentielle reduceres efter 72 h AEL19. Axon skade udføres således typisk på 48 h - 72 h AEL og dendrit skade på 48h AEL, med henblik på regenerering på 120h AEL. Larver af 24h AEL kan også bruges, men de kræver mere forsigtig håndtering, givet deres mindre størrelse. Larverne forpupper efter 120 h AEL, gør imaging mere udfordrende. Derfor er vores slutpunkt normalt 120 h AEL.

Hvad er indbyrdes forhold mellem degeneration og regeneration? Til PNS skade på 24 h AI, har normalt den distale axon/dendrit i WT afsluttet Wallerian degeneration mens revitalisering ikke er begyndt på dette tidspunkt. Derfor mener vi, at degeneration af afhuggede neurites i WT larver, kun har en meget begrænset indflydelse på regenerering, hvis overhovedet. For VNC skade, axoner på 8 h AI er allerede begyndt at degenerere og på 24 h AI, axon regenerering er observeret mens axon snavs kan stadig findes rundt skade websteder. Resterne synes ikke at blokere regenerering. Det er imidlertid muligt, at under visse omstændigheder kan være en overlapning eller endda en krydstale mellem degeneration og regeneration. I virkeligheden, er det blevet rapporteret, at i alderen mus, vragrester clearance efter perifer nerveskade er langsommere end hos unge dyr. Samtidig, blev langsommere reinnervation af den neuromuskulære junction observeret, som kan henføres til det større antal forhindringer regenererende axoner møde i de gamle dyr. Overraskende, dog axoner fra alderen dyr regenerere hurtigt og reinnervate neuromuskulære junction websteder effektivt når ikke konfronteret med vragrester32. Dette tyder på at lette vragrester clearance kan være en potentiel strategi at fremme regenerering.

Sammenlignet med andre neuroregeneration modeller, har flyve sensoriske neuron skade model unikke fordele. Musemodeller normalt tage uger til måneder at udføre og er ikke egnet til at gennemføre storstilet genetiske skærme; C. elegans kun har en primitiv centralnervesystemet, hvilket ikke kan nøje sammenfatte regenerering hindringer i mammale CNS; forskellige fra pattedyr, zebrafisk CNS axoner regenerere håndfast. Den hurtige livscyklus af fluer, alsidighed flyve genetik, tilgængelighed og stereotype mønstre af axoner/dendritter flyve sensoriske neuroner, og egenskaberne karakteristiske regenerering af flyve sensoriske neuroner – subtype specifikke regenerering i den PNS og begrænset regenerering i CNS – gøre Drosophila da neuroner en attraktiv model til at studere neuroregeneration. Desuden, de seneste undersøgelser fra knuste mus retinal ganglion celler (RGCs) også foreslå, at neuronal undertyper bærer tydelig regenerering kompetence; nogle RGC undertyper kan regenerere, mens andre i det tilsyneladende homogen nerve bundt undlader at regrow33. Dette vigtige fund antyder at neuronal type-specifikke strategier bør udnyttes til at fremme regenerering og funktionel genopretning og argumenterer stærkt for at induktion af axon skade og efterfølgende regenerering analyse bør gennemføres i en neuronal undertype-specifikke måde. Desuden, de cellulære og molekylære determinanter for denne regenerering type-specificitet forbliver stort set ukendt19,33. Derfor, da neuron skade model tilbyder den ideelle paradigme for at løse disse problemer.

I forhold til axon regenerering, er undersøgelser fokuserer på dendrit regenerering meget sjældnere. Dendrit skade opstår, såsom i traumatisk hjerneskade, slagtilfælde, og mange former for neurodegeneration, men næsten intet vides om dendritter evne til at reparere og reformere neurale forbindelser. Da neuron skade model igen giver et meget tilgængeligt system, der viser stereotype mønstre, klasse specificitet og tidsmæssige forordning19, for at udforske denne retning.

Det er også værd at nævne, at det er muligt at skade en mærket enkelt axon i PNS, udføres den måde skade i CNS medfører læsion af et bundt af axoner. Hvis det ønskes, kan MARCM34 eller FLP-out klon35 tilgang bruges til at mærke enkelt axoner i CNS. Derudover når gliaceller er samtidig mærket med mRFP (Repo-Gal4, UAS-mRFP), er ophobning af glia processer observeret specifikt på webstedet læsion. Desuden udtryk for Ptp99A, den flyve homolog af chondroitin sulfat proteoglycan (CSPG) phosphacan / PTPRZ1, er op-reguleret på webstedet læsion. Ptp99A Co lokaliserer med glial celler og omgiver den skade site, danner en ring-lignende struktur ligner hvad er blevet rapporteret til astroglial ar i pattedyr19,36,37. Til sidst, da neuron skader model, når det kombineres med markører for andre celletyper såsom glial celler eller immunceller, vil gøre det muligt i vivo real-time overvågning af de flercellede interaktioner mellem en skadet neuron og dens omgivende miljø.

Mens denne flyve larver sensoriske neuron skade model giver os mulighed for at finde potentielle neuroregeneration lovgivere både i PNS og CNS, har det stadig flere begrænsninger. Først, det er ikke for høj overførselshastighed på nuværende tidspunkt. Typisk, 5-6 genotyper kunne blive screenet af én person i en uge. Det skal optimeres for at udføre en uvildig skærmen. Andet, som ether anæstesi på larver kan vare fra flere min til ikke mere end 20 min, det er ikke optimalt for langsigtet billeddannelse. Således er bestemt tidspunkt punkter, der er repræsentative for axon degeneration og regeneration henholdsvis valgt for billeddannelse. For det tredje, selv om denne protokol indfører en måde at såre axoner netop, muligheden for skader på omkringliggende væv kan ikke helt udelukkes. I VNC, kan disse væv være glial celler, axoner og dendrites af andre neuroner. For at minimere denne potentielle advarsel, vi minimere skade websteder, gælder den laveste laser power mulige, og udføre de samme procedurer i parallel til både styre og eksperimentere grupper. For det fjerde etableringen af CNS skade paradigme, forskellige skade websteder blev testet, herunder steder tæt på axon termini, at vi valgte at bruge og posten punkt af axoner i VNC. Indgangspunkter blev fundet for at være mere vanskeligt at skade fordi de er dybere i vævet og mere tilbøjelige til at flytte. Således, disse praktiske grunde, vi vælger for den nuværende metode, som er mere sammenhængende, bedre kontrolleret, og godt for større eksperimenter. En potentiel bekymring, er som anført ovenfor, muligheden for sårede nærliggende væv, såsom de postsynaptiske komponenter og de gliaceller. På den anden side er det et udestående spørgsmål hvordan det beskadigede omgivende væv påvirke degeneration og regeneration af axoner. For eksempel, hvordan glial arret påvirker axon regenerering. Det præsenterer en anden grund hvorfor vores skade model kan ligner skade modeller hos pattedyr, hvor axoner og væv omkring læsion websteder er normalt såret samtidigt.

Laser skade efterfulgt af time-lapse mikroskopi er en følsom analyse for at studere axon/dendrit regenerering. Men en største bekymring i denne analyse er den opfattede omkostninger, som spænder fra <$ 10K for low-end solid-state impuls lasere, $25-100K for femtosekund lasere til >$ 100K for to-foton laser. Der er flere gode diskussioner om forskellige lasersystemer anvendes til axotomy29,38,39,40,41,42,43, 44 , 45. for at opsummere, konventionelle lasere er optimal for skæring axoner i om 30-50 µm fra overfladen. Der vil være flere kollaterale skader med nano og pico anden lasere sammenlignet med femtosekund laser, især som dybden af målområdet øger45. For sårede axoner i VNC, dybde, er typisk omkring 50-100 µm, det er vigtigt at minimere vævsskader. I dette tilfælde to-foton laser er ideelle, som fokuserer laser power til brændplanet, reducere sikkerhedsstillelse vævsskader uden kompromitterende væv penetration. Afslutningsvis to-foton system er dyrt men tilbyder den bedste præcision og væv bevarelse. Men hvis kun PNS axoner er målet for axotomy, konventionelle impuls lasere kan være en mere overkommelig alternativ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker Jessica Goldshteyn for teknisk support. Arbejde i sangen lab er finansieret af NIH grant R00NS088211, og den intellektuelle og udviklingsforstyrrelser Research Center (IDDRC) nye Program udvikling Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous Acros Organics AC615080010
Halocarbon 27 Oil Genesee Scientific 59-133
Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L VWR 97062-948 
Agar powder, Alfa Aesar, 500GM VWR AAA10752-36
Grape juice Welch’s
Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%) VWR 64-17-5
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
Propionic Acid J.T.Baker U33007
Cover Glasses: Rectangles Fisher Scientific 12-544-D 50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope Zeiss
Zen software Zeiss
Chameleon Ultra II Coherent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yakura, J. S. Recovery following spinal cord injury. (1996).
  2. Harel, N. Y., Strittmatter, S. M. Can regenerating axons recapitulate developmental guidance during recovery from spinal cord injury? Nature reviews. Neuroscience. 7, 603-616 (2006).
  3. Jurewicz, A., Matysiak, M., Raine, C. S., Selmaj, K. Soluble Nogo-A, an inhibitor of axonal regeneration, as a biomarker for multiple sclerosis. Neurology. 68, 283-287 (2007).
  4. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7, 617-627 (2006).
  5. Sun, F., He, Z. Neuronal intrinsic barriers for axon regeneration in the adult CNS. Curr Opin Neurobiol. (2010).
  6. Liu, B. P., Cafferty, W. B., Budel, S. O., Strittmatter, S. M. Extracellular regulators of axonal growth in the adult central nervous system. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 361, 1593-1610 (2006).
  7. Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal intrinsic mechanisms of axon regeneration. Annu Rev Neurosci. 34, 131-152 (2011).
  8. Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. Nogo limits neural plasticity and recovery from injury. Curr Opin Neurobiol. 27, 53-60 (2014).
  9. He, Z., Jin, Y. Intrinsic Control of Axon Regeneration. Neuron. 90, 437-451 (2016).
  10. Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
  11. Geoffroy, C. G., Hilton, B. J., Tetzlaff, W., Zheng, B. Evidence for an Age-Dependent Decline in Axon Regeneration in the Adult Mammalian Central Nervous System. Cell Rep. 15, 238-246 (2016).
  12. Geoffroy, C. G., et al. Effects of PTEN and Nogo Codeletion on Corticospinal Axon Sprouting and Regeneration in Mice. J Neurosci. 35, 6413-6428 (2015).
  13. Jin, D., et al. Restoration of skilled locomotion by sprouting corticospinal axons induced by co-deletion of PTEN and SOCS3. Nat Commun. 6, 8074 (2015).
  14. Wang, X., et al. Axonal regeneration induced by blockade of glial inhibitors coupled with activation of intrinsic neuronal growth pathways. Exp Neurol. 237, 55-69 (2012).
  15. Fang, Y., Bonini, N. M. Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila models of nerve injury. Annual review of cell and developmental biology. 28, 575-597 (2012).
  16. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
  17. Leyssen, M., et al. Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain. The EMBO journal. 24, 2944-2955 (2005).
  18. MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50, 869-881 (2006).
  19. Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes Dev. 26, 1612-1625 (2012).
  20. Song, Y., et al. Regulation of axon regeneration by the RNA repair and splicing pathway. Nat Neurosci. 18, 817-825 (2015).
  21. Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
  22. Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Curr Biol. 22, 590-595 (2012).
  23. Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
  24. Brace, E. J., DiAntonio, A. Models of axon regeneration in Drosophila. Exp Neurol. 287, 310-317 (2017).
  25. Hao, Y., Collins, C. Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 44, 84-91 (2017).
  26. Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).
  27. Sugimura, K., et al. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
  28. Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432, 822 (2004).
  29. Wu, Z., et al. Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15132-15137 (2007).
  30. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Mol Biol Cell. 21, 767-777 (2010).
  31. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
  32. Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33, 19480-19491 (2013).
  33. Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85, 1244-1256 (2015).
  34. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
  35. Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
  36. Buss, A., et al. NG2 and phosphacan are present in the astroglial scar after human traumatic spinal cord injury. BMC Neurol. 9, 32 (2009).
  37. McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar. J Neurosci. 19, 10778-10788 (1999).
  38. Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. J Microsc. 234, 1-8 (2009).
  39. Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Phys Rev Lett. 99, 158104 (2007).
  40. Venugopalan, V., Guerra, A. 3rd, Nahen, K., Vogel, A. Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation. Phys Rev Lett. 88, 078103 (2002).
  41. Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans. Opt Express. 16, 5963 (2008).
  42. O'Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (2009).
  43. Tsai, P. S., et al. Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems. Curr Opin Biotechnol. 20, 90-99 (2009).
  44. Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
  45. Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. J Vis Exp. (2011).
En <em>Drosophila In Vivo</em> skade Model til at studere Neuroregeneration i perifere og centrale nervesystem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, D., Li, F., Guttipatti, P., Song, Y. A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System. J. Vis. Exp. (135), e57557, doi:10.3791/57557 (2018).More

Li, D., Li, F., Guttipatti, P., Song, Y. A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System. J. Vis. Exp. (135), e57557, doi:10.3791/57557 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter