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Medicine

एक Drosophila परिधीय और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में Neuroregeneration अध्ययन के लिए Vivo चोट मॉडल में

doi: 10.3791/57557 Published: May 5, 2018
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम Drosophila संवेदी ंयूरॉन-वृक्ष arborization (डीए) ंयूरॉन चोट मॉडल है, जो vivo लाइव इमेजिंग, दो फोटॉन लेजर axotomy/dendriotomy, और शक्तिशाली मक्खी आनुवंशिक toolbox, के रूप में जोड़ती है का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल मौजूद neuroregeneration के संभावित प्रवर्तकों और अवरोधकों को परखने के लिए एक मंच ।

Abstract

क्षतिग्रस्त न्यूरॉन्स की वृद्धि क्षमता तंत्रिका तंत्र आघात के बाद neuroregeneration और कार्यात्मक वसूली नियंत्रित करता है. पिछले कुछ दशकों में, विभिंन आंतरिक और बाह्य निरोधात्मक axon पुनर्जनन के प्रतिबंध में शामिल कारकों की पहचान की गई है । हालांकि, बस इन निरोधात्मक cues हटाने सफल पुनर्जनन के लिए अपर्याप्त है, अतिरिक्त विनियामक मशीनरी के अस्तित्व का संकेत है । Drosophila melanogaster, फल मक्खी, शेयर evolutionarily संरक्षित जीन और रीढ़ के साथ संकेत रास्ते, मनुष्यों सहित. दो फोटॉन लेजर axotomy/dendriotomy के साथ मक्खियों के शक्तिशाली आनुवंशिक toolbox संयोजन, हम यहां का वर्णन Drosophila संवेदी ंयूरॉन – वृक्ष arborization (डीए) ंयूरॉन चोट मॉडल उपंयास के लिए व्यवस्थित स्क्रीनिंग के लिए एक मंच के रूप में पुनर्जनन नियामकों । संक्षेप में, इस प्रतिमान शामिल है एक) लार्वा की तैयारी, ख) dendrite को घाव प्रेरण (ओं) या axon (ओं) का उपयोग कर एक दो फोटॉन लेजर, सी) लाइव फोकल इमेजिंग के बाद चोट और घ) डेटा विश्लेषण । हमारे मॉडल एकल लेबल ंयूरॉंस की अत्यधिक reproducible चोट सक्षम बनाता है, axons, और अच्छी तरह से परिभाषित ंयूरॉन उपप्रकार के dendrites, दोनों परिधीय और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में ।

Introduction

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axons की अक्षमता केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के लिए एक चोट के बाद पुनर्जीवित करने के लिए, रोगियों में स्थायी विकलांग के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और भी neurodegenerative रोगों में अपरिवर्तनीय स्नायविक घाटे में एक भूमिका निभाता है1,2 ,3,4,5. सीएनएस पर्यावरण, साथ ही साथ न्यूरॉन्स के आंतरिक विकास की क्षमता, निर्धारित करता है कि क्या axons आघात के बाद पुनर्जीवित करने में सक्षम हैं. oligodendrocyte, astroglial, और fibroblastic स्रोतों से Extracellular कारकों को ंयूरॉन वृद्धि4,6,7,8, लेकिन इन अणुओं के उंमूलन को बाधित दिखाया गया है केवल सीमित अंकुरण के लिए अनुमति देता है5। आंतरिक पुनर्जनन संकेत reअपक्षयी सफलता5,9 प्रभावित और संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं, लेकिन इन प्रक्रियाओं अभी भी आणविक स्तर पर अच्छी तरह से परिभाषित नहीं कर रहे हैं । पौष्टिकता फैक्टर सिग्नलिंग या अंतर्जात ब्रेक के उन्मूलन में बढ़ता है, जैसे Pten फॉस्फेट10, कुछ परिस्थितियों में axonal पुनर्जनन में परिणाम कर सकते हैं । व्यक्तिगत रूप से प्रभावी हो पाया विभिंन तरीकों के संयोजन भी केवल तारीख11,12,13,14के लिए सीमित समग्र वसूली प्रदान करते हैं । इसलिए, वहां एक हताश करने के लिए लक्षित चिकित्सा के लिए अतिरिक्त रास्ते की पहचान की जरूरत है । axon पुनर्वृद्धि की दीक्षा के अलावा, चाहे और कैसे axons पुनः सही लक्ष्य को तार, सुधार synapse विशिष्टता, और कार्यात्मक वसूली प्राप्त करने के महत्वपूर्ण अनुत्तरित प्रश्न हैं ।

संक्षेप में, हुक्म axon पुनर्जनन मशीनरी की वर्तमान समझ अभी भी बहुत खंडित है । समस्या का हिस्सा वास्तविक समय में स्तनधारियों में axon पुनर्जनन अध्ययन के तकनीकी कठिनाई है, एक दृष्टिकोण है कि महंगा है, समय लेने वाली, और चुनौतीपूर्ण बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीन के संचालन के लिए । Drosophila melanogaster, दूसरी ओर, जटिल जैविक प्रश्नों के अध्ययन के लिए एक असाधारण शक्तिशाली प्रणाली साबित हो गया है । फल मक्खी जीन और संकेत मार्ग है कि हड़ताली मनुष्यों में संरक्षित कर रहे है परिभाषित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है और मानव स्थितियों के अध्ययन के लिए एक सफल मॉडल किया गया है, neurodegenerative रोगों के रूप में, विशाल आणविक आनुवंशिकी उपकरणों के माध्यम से जीन फंक्शन15में हेरफेर करने के लिए उपलब्ध है । विशेष रूप से, फलों मक्खियों तंत्रिका चोट में शामिल जीन की खोज के लिए एक आदर्श उपकरण माना जाता है और पुनर्वृद्धि15,16। कई मक्खी तंत्रिका चोट मॉडल, वयस्क सिर या लार्वा ventral तंत्रिका गर्भनाल (vnc) सुई, लार्वा VNC या संदंश के साथ तंत्रिका क्रश, लार्वा ंयूरॉन लेजर axotomy, घ्राण रिसेप्टर ंयूरॉन हटाने, मस्तिष्क explants चोट, के साथ छुरा सहित विकसित किया गया है, और परिधीय तंत्रिका घावों के द्वारा विंग विच्छेद15,17,18,19,20,21,22,23. रोमांचक रूप से, हाल ही में काम Drosophila चोट मॉडल का उपयोग सेलुलर और तंत्रिका तंत्र तंत्रिका चोटों का जवाब करने के लिए द्वारा इस्तेमाल किया आनुवंशिक रास्ते के बारे में हमारी समझ को उन्नत किया है, जिनमें से कुछ स्तनधारियों में संरक्षित किया जा करने के लिए दिखाया गया है24 ,25. फिर, यह तंत्रिका मरंमत के उपंयास तंत्र की पहचान के लिए इस मॉडल जीव की उपयोगिता पर जोर देती है ।

यहां बताया गया है कि एक दो फोटॉन लेजर आधारित Drosophila लार्वा संवेदी ंयूरॉन चोट मॉडल है । एक दो फोटॉन लेजर पहले २००३26में vivo में zebrafish में axons कटौती किया गया था । एक ही वर्ष में, पहली लेजर dendriotomy एक स्पंदित नाइट्रोजन लेजर27का उपयोग कर Drosophila में प्रदर्शन किया गया । फौरन बाद, कई सी एलिगेंस लैब्स femtosecond पराबैंगनीकिरण का इस्तेमाल किया axon पुनर्जनन28के मॉडल की स्थापना । २००७ में, वू और सहयोगियों की तुलना में और लेजर चोटों के बीच अंतर की सूचना दी सी. एलिगेंस पराबैंगनीकिरण के विभिंन प्रकार के द्वारा प्रेरित29। २०१० में, लेजर axotomy के बाद axon पुनर्जनन पहले Drosophila30में होने के लिए दिखाया गया था । इस व्यापक लेजर चोट साहित्य पर बिल्डिंग, हम एक मक्खी तंत्रिका चोट मॉडल दो फोटॉन लेजर, जो पड़ोसी ऊतकों की ंयूनतम गड़बड़ी के साथ लक्षित साइटों को चोट के सटीक प्रेरण अनुमति देता है का उपयोग कर विकसित किया है, एक अपेक्षाकृत साफ प्रदान एकल-कक्ष रिज़ॉल्यूशन के साथ neuroregeneration के आंतरिक और बाह्य दोनों गुणों का अध्ययन करने के लिए सिस्टम । विशेष रूप से, हम दोनों परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएन) और सीएनएस में वृक्ष arborization (डीए) संवेदी न्यूरॉन्स के लिए चोट के तरीकों का एक सेट की स्थापना की है । डीए ंयूरॉंस चार अलग मुख्य रूप से उनके dendrite शाखाओं में बंटी परिसरों द्वारा प्रतिष्ठित वर्गों में वर्गीकृत किया जा सकता है: मैं चतुर्थ वर्ग के लिए31। हमारे प्रकाशित कार्य से पता चलता है कि डा न्यूरॉन पुनर्जनन phenotypic और आणविक स्तर पर स्तनधारी चोट मॉडल जैसा दिखता है: दा न्यूरॉन्स वर्ग विशिष्ट पुनर्जनन गुण, वर्ग चतुर्थ लेकिन नहीं वर्ग मैं या तृतीय दा न्यूरॉन्स में पुनर्जनन प्रदर्शन के साथ प्रदर्शित पीएन; कक्षा चतुर्थ दा ंयूरॉन axons परिधि में मजबूती से पुनर्जंम है, लेकिन उनकी अपक्षयी क्षमता नाटकीय रूप से सीएनएस में कम है, इस प्रकार पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रंथि (डीआरजी) स्तनधारियों में ंयूरॉंस जैसी; Pten विलोपन के माध्यम से mTOR गतिविधि बढ़ाने या एकेटी एक्सप्रेस19सीएनएस में axon पुनर्जनन को बढ़ाता है । इस चोट मॉडल का उपयोग, हम आनुवंशिक स्क्रीन प्रदर्शन किया गया है और axon पुनर्जनन के लिए एक evolutionarily संरक्षित निरोधात्मक कारक के रूप में आरएनए प्रोसेसिंग एंजाइम Rtca की पहचान की है, सेलुलर तनाव और आरएनए संशोधन करने के लिए axon चोट जोड़ने20 .

प्रस्तुत प्रतिमान में, चोट लेजर axotomy/dendriotomy के माध्यम से प्रेरित है लार्वा वर्ग चतुर्थ या तृतीय दा ंयूरॉंस, द्वारा लेबल ppk-CD4- tdGFP या 19-12-Gal4, यूएएस-CD4-tdGFP, रेपो-Gal80, क्रमशः । चोट 2एन डी पर 3rd instar लार्वा के आसपास ४८-७२ एच पर अंडा बिछाने (एच AEL) के बाद किया जाता है । पीएन axotomy के लिए घाव axon ~ 20-50 सेल शरीर से दूर µm के अनुभाग के लिए लक्षित है, एक क्षेत्र के लिए सीएनएस axotomy के लिए ~ 20 µm में की संयोजिका जंक्शन पर VNC में, और प्राथमिक dendriotomy शाखा अंक के लिए वृक्ष के लिए । एक ही ंयूरॉन है 8-24 पर छवि की चोट के बाद एच (ऐ) पूरा transection की पुष्टि करने के लिए, और ४८-७२ एच ऐ में पुनर्जनन का आकलन करने के लिए । समय के माध्यम से चूक फोकल इमेजिंग, अलग axons/dendrites कि vivo में घायल हो गया है के अध कि पतन और पुनर्जनन समय के साथ निगरानी की जा सकती है ।

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Protocol

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1. संस्कृति प्लेट और बोतलों की तैयारी

  1. अंगूर का रस आगर प्लेट्स की तैयारी
    1. आगर पाउडर के 10 ग्राम, २०० मिलीलीटर अंगूर का रस, और १९२ मिलीलीटर ddH2हे एक चोंच और माइक्रोवेव में लगभग 4-5 मिनट के लिए जोड़ें, आवर्तक रूप जब तक कि आगर पूरी तरह से भंग है ।
    2. एक धुएं डाकू में, लगभग ६० डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान शांत । ४.२ मिलीलीटर ९५% इथेनॉल और ४.० मिलीलीटर हिमनदों एसिटिक एसिड जोड़ें । ddH2O के साथ ४०० मिलीलीटर के समाधान की कुल मात्रा को समायोजित करें ।
    3. प्रत्येक ३५ मिमी प्लेट के लिए, समाधान के बारे में 2-3 मिलीलीटर जोड़ें । ४०० मिलीलीटर अंगूर का रस आगर समाधान की कुल के लिए लगभग 120-150 प्लेटें बनाओ ।
    4. 10 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए नीचे प्लेटें शांत और आगर समाधान जमना । स्व-सील ziplock बैग और भविष्य में उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर में अंगूर का रस आगार प्लेटें पैक ।
  2. Drosophila संस्कृति की बोतलों की तैयारी
    1. एक ब्लेड का प्रयोग करें एक १.५ सेमी की ओर लंबाई त्रिकोणीय छेद पंच करने के लिए Drosophila संस्कृति की बोतल की एक दीवार पर और वेंटिलेशन के लिए कपास की 2-2.5 सेमी व्यास गेंद के साथ छेद भरें ।
    2. एक अंगूर का रस आगर थाली खमीर पेस्ट के बारे में ०.५ सेमी3 के साथ पूरक के साथ बोतल प्लग ।

2. Drosophila लार्वा का संग्रह

  1. सेट अप वयस्क मक्खियों के पार
    1. प्लेस 10 कुंवारी महिलाओं और 5 पुरुष वयस्क एक संस्कृति की बोतल में एक साथ मक्खियों एक अंगूर का रस आगर प्लेट के साथ खामियों को दूर किया ।
    2. बोतल नीचे से 25 डिग्री सेल्सियस पर जगह है, ताकि मक्खियों अंगूर का रस आगर प्लेट पर अंडे देना होगा । खमीर पेस्ट के साथ प्लेट बदलें कम से एक दिन में एक बार । एक 2-एच संग्रह अवधि, जो एक समरूप विकासात्मक चरण के लार्वा की कटाई परमिट के लिए, 20 से अधिक कुंवारी महिलाओं और 10 पुरुषों के साथ चरण 2.1.1 में शुरू करते हैं ।
    3. संस्कृति एक गीले ऊतक के साथ एक ६० मिमी पेट्री डिश में 25 डिग्री सेल्सियस पर थाली, उदाहरण के लिए, ०.५% propionic एसिड समाधान में लथपथ । ऊतक की व्यवस्था है कि यह ऑक्सीजन प्रवाह ब्लॉक नहीं करता है ।
      नोट: propionic एसिड समाधान पकवान में नमी बनाए रखने और मोल्ड के विकास से बचने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
  2. एक विशिष्ट आयु के फसल लार्वा
    1. संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए वांछित चरण के लार्वा हस्तांतरण, उदाहरण के लिए, 2एनडी 3rd instar लार्वा के लिए 48-72 ज पर अंडे बिछाने (AEL), खमीर पेस्ट के बिना एक नया अंगूर का रस आगर प्लेट करने के लिए ।
    2. उंहें नई थाली पर चारों ओर क्रॉल, लेजर axotomy और इमेजिंग के साथ खमीर के संभावित हस्तक्षेप से रोकने के लिए दे द्वारा लार्वा की त्वचा से खमीर निकालें । वैकल्पिक रूप से, पंजाब के एक डिश में उन्हें धोने और टिशू पेपर के एक टुकड़े पर संक्षेप में सुखाने के द्वारा लार्वा को अच्छी तरह से साफ ।

3. दो-फोटॉन चोट और फोकल इमेजिंग

  1. माइक्रोस्कोप सेटअप
    नोट: एक दो फोटॉन लेजर के साथ एक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप इस प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया गया था, लेकिन एक समकक्ष सेटअप के साथ अंय प्रणालियों भी पर्याप्त होगा । दो फोटॉन लेजर (९३० एनएम) चोट पहुंचाने और एक आर्गन लेजर (४८८ एनएम) GFP के फोकल इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
    1. प्रत्येक सत्र की शुरुआत में, दो पर बारी-फोटॉन लेजर और/या फोकल लेजर (ओं), और माइक्रोस्कोप । इमेजिंग सॉफ़्टवेयर खोलें ।
    2. दो-फोटॉन चोट के लिए, ९३० एनएम (१,९५० मेगावाट) पर दो-फोटॉन लेज़र के साथ इमेजिंग GFP के लिए निम्न पैरामीटर सेट करें ।
      1. रेखा स्कैन मोड का चयन करें । pinhole सभी तरह खोलो । लेजर तीव्रता को बढ़ाने के लिए ~ 20% (३९० मेगावाट) ।
      2. का चयन करें ५१२ x ५१२ फ़्रेम स्कैन के रूप में । अधिक से अधिक स्कैनिंग गति का उपयोग करें (आमतौर पर पिक्सेल के साथ ०.७७ µs पर समय निवास) । सुनिश्चित करें कि औसत संख्या 1 है और बिट गहराई 8 बिट्स है ।
      3. प्राप्त करने के लिए ~ ७५०, और ऑफ़सेट 0 के लिए सेट करें ।
      4. इस पूर्व-सेट प्रायोगिक प्रोटोकॉल को 2P GFP ९३० पृथकके रूप में सहेजें, भविष्य के प्रयोगों में आसान पुनः प्रयोग के लिए अनुमति देता है ।
    3. फोकल इमेजिंग के लिए, ४८८ एनएम पर आर्गन लेजर के साथ इमेजिंग GFP के लिए निम्न पैरामीटर सेट करें:
      1. प्राप्ति टैब का चयन करें और फिर Z-स्टैक
      2. "लेज़र" के अंतर्गत, ४८८ एनएम आर्गन लेज़र के लिए पावर चालू करें ।
      3. चैनलपर जाएं, ४८८ mm लेज़र का चयन करें, और लेजर पावर को 5-10% बढ़ाएं । pinhole के लिए, 1-2 हवादार इकाई (AU) का उपयोग करें । ६५० के लिए लाभ समायोजित करें ।
      4. प्राप्ति मोडमें, फ़्रेम स्कैन के रूप में १०२४ x १०२४ का चयन करें, अधिकतम स्कैन गति, 2 की औसत संख्या, और 8 बिट की बिट गहराई का उपयोग करें ।
      5. इस पूर्व-सेट प्रायोगिक प्रोटोकॉल को GFP इमेजिंगके रूप में सहेजें ।
  2. लार्वा diethyl ईथर के साथ संज्ञाहरण और बढ़ते
    1. एक धुएं डाकू में, एक 15 सेमी प्लास्टिक पेट्री डिश में एक ६० मिमी ग्लास डिश जगह है । गुना और गिलास पकवान के तल पर टिशू पेपर का एक टुकड़ा रखना है, तो ऊतक पर एक अंगूर का रस आगर प्लेट जगह है । कांच पकवान में diethyl ईथर जोड़ें, बिंदु जहां टिशू पेपर लथपथ है और वहां तरल ईथर पकवान में शेष की एक परत है । हर समय ढक्कन चालू रखें ।
    2. केंद्र में halocarbon 27 तेल की एक बूंद के साथ एक गिलास स्लाइड तैयार करें । स्लाइड के चार कोनों पर वैक्यूम तेल के 4 धब्बे जोड़ें, बाद में coverslip का समर्थन करने के लिए ।
    3. संदंश का उपयोग करने के लिए एक साफ लार्वा लेने और यह ६०-mm ग्लास डिश में आगर प्लेट पर जगह है । इसके ढक्कन के साथ कांच पकवान कवर और जब तक लार्वा चलती बंद हो जाता है रुको । पीएन चोट/इमेजिंग के लिए, जैसे ही इसकी पूंछ हिल बंद हो जाता है लार्वा बाहर ले । सीएनएस के लिए, जब तक पूरे लार्वा स्थिर हो जाता है, विशेष रूप से प्रमुख क्षेत्रों रुको ।
      ध्यान दें: ईथर जोखिम के समय महत्वपूर्ण है । चर्चा देखें ।
    4. ध्यान से anesthetized लार्वा उठाओ और स्लाइड पर halocarbon तेल की बूंद में यह सिर-ईमानदार जगह है । स्लाइड के शीर्ष पर कोई coverslip जोड़ें । coverslip पर नीचे पुश करने के लिए कोमल दबाव का प्रयोग करें, जब तक यह लार्वा (चित्र 1a) को छूता है ।
    5. लार्वा रोल करने के लिए बाएं या दाएं की ओर coverslip को धकेलते हुए लार्वा की स्थिति को समायोजित करें, जिससे कि ंयूरॉन/axon/dendrite ब्याज की शीर्ष पर और निकटतम माइक्रोस्कोप लेंस के लिए है ।
    6. पीएन चोट के लिए, लार्वा पृष्ठीय ओर माउंट, ताकि दोनों tracheas दिखाई दे रहे हैं । फिर लार्वा रोल ~ कक्षा III दा ंयूरॉन axons (चित्र 1b और 1C) को घायल करने के लिए छोड़ दिया करने के लिए 30 डिग्री, वर्ग चतुर्थ दा ंयूरॉन axons (आंकड़ा 1b और 1E), या ~ घायल वर्ग चतुर्थ दा ंयूरॉन dendrites के लिए 30 डिग्री घायल के लिए ९० डिग्री ( चित्र 2a) ।
    7. सीएनएस चोट के लिए, लार्वा की स्थिति को पूरी तरह से ventral साइड (चित्रा 3), ताकि ब्याज का क्षेत्र z-विमान में माइक्रोस्कोप लेंस के निकटतम हो ।
  3. दो-फोटॉन लेजर से चोट
    1. इस माइक्रोस्कोप के तहत लार्वा के साथ स्लाइड रखें और मंच पर स्लाइड धारक के साथ जगह में सुरक्षित । लार्वा खोजने के लिए 10x (०.३ NA) उद्देश्य का उपयोग करें.
    2. coverslip पर उद्देश्य तेल की 1 ड्रॉप जोड़ें, 40X (१.३ NA) उद्देश्य के लिए स्विच और ध्यान समायोजित करें ।
    3. स्कैनिंग मोड में स्विच करें और प्रायोगिक प्रोटोकॉल पुन: उपयोग 2P GFP ९३० पृथक। सुनिश्चित करें कि pinhole सभी तरह से खोला गया है ।
      नोट: कॉन्फ़िगरेशन को व्यक्तिगत सिस्टम पर आधारित ऑप्टिमाइज़ करने की आवश्यकता होती है.
    4. रुचि के क्षेत्र (ROI) का पता लगाने के लिए लाइव मोड प्रारंभ करें, और उपयुक्त ज़ूम के साथ अच्छी छवि गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए सेटिंग्स को फ़ाइन-ट्यून करे ।
      नोट: इस कदम का उद्देश्य सबसे अच्छी गुणवत्ता की छवि लेने के बजाय घायल करने के लिए ंयूरॉन/axon/dendrite मिल रहा है । इसलिए, जोखिम या photobleaching से बचने के लिए, लक्ष्य क्षेत्र को विज़ुअलाइज़ करने के लिए न्यूनतम सेटिंग्स का उपयोग करें.
    5. लाइव स्कैन रोकें, ताकि क्रॉप बटन उपलब्ध हो जाए । चलो अभी भी छवि रोडमैप के रूप में सेवा करते हैं । क्रॉप फ़ंक्शन का चयन करें और घायल होने के लिए लक्ष्य पर ध्यान केंद्रित करने के लिए स्कैन विंडो समायोजित कर दें ।
    6. रॉय को कम करने के लिए चोट के संभावित स्थल का आकार हो । उदाहरण के लिए, बस एक axon या एक dendrite की चौड़ाई कवर, चोट की परिशुद्धता सुनिश्चित करने के लिए और पड़ोसी ऊतकों को नुकसान को कम । यदि वांछित, फसल से पहले रॉय पर ज़ूम, और अधिक सटीक चोट के लिए अनुमति देता है ।
    7. कोई नई इमेजिंग विंडो खोलें । स्कैन की गति को कम करने और लेजर तीव्रता में वृद्धि । लाइव मोड में स्कैन किए गए टिशू प्रतिदीप्ति सिग्नल के आधार पर लेजर की तीव्रता में वृद्धि का निर्धारण करें ।
    8. आमतौर पर, दो फोटॉन लेजर पीएन चोट और VNC चोट के लिए 50-100% के लिए 25% से शुरू तीव्रता सेट । पीएन axon चोट के लिए, सुनिश्चित करें कि लेजर तीव्रता है ~ ४८० मेगावाट और पिक्सेल निवास समय ८.१९ μs है । VNC axon चोट के लिए, सुनिश्चित करें कि लेजर तीव्रता और पिक्सेल निवास समय आमतौर पर कर रहे है 965-1930 मेगावाट और 8.19-32.77 μs, क्रमशः ।
    9. निरंतर स्कैन प्रारंभ करें । कर्सर को निरंतर बटन पर होवर करना छोड़ें । छवि पर एक करीबी नज़र रखो और प्रतिदीप्ति में एक कठोर वृद्धि के रूप में मनाया के रूप में जल्द ही स्कैन बंद ।
      नोट: प्रतिदीप्ति स्पाइक की उपस्थिति चोट साइट पर ऑटो प्रतिदीप्ति के कारण है ।
    10. सेटिंग्स का पुनः उपयोग करके लाइव मोड में वापस जाएँ. उस रुचि का क्षेत्र ढूंढें जिसे केवल फ़ोकस समायोजित करके लक्षित किया गया था ।
      नोट: सफल चोट का एक अच्छा संकेत एक छोटा सा गड्ढा, अंगूठी की तरह संरचना की उपस्थिति, या चोट साइट पर स्थानीयकृत मलबे सही है ।
    11. अगले ंयूरॉन करने के लिए ले जाएं और कदम 3.3.5 से दोहराने के लिए, एक ही जानवर में कई ंयूरॉंस घायल । या दोहराएं चरण 3.3.5 जबकि धीरे शक्ति में वृद्धि और/या यदि प्रारंभिक चोट अपर्याप्त था स्कैन गति को कम करने ।
      नोट: लेजर शक्ति बहुत अधिक है कि मामले में, एक बड़े क्षतिग्रस्त क्षेत्र के बाद चोट लाइव स्कैन छवि में दिखाई देगा । बहुत अधिक चोट के कारण लार्वा की मृत्यु हो सकती है ।
    12. ध्यान से coverslip को हटाने और खमीर पेस्ट के साथ एक नई थाली पर घायल लार्वा स्थानांतरित द्वारा लार्वा पुनर्प्राप्त । संदंश के साथ आगर प्लेट पर कई गुफाओं खाई; वैकल्पिक रूप से, पूरी थाली का उपयोग कर के बजाय प्लेट में आगर के एक द्वीप बनाने, लार्वा प्लेट के बाहर रेंगने की संभावना को कम करने के लिए.
    13. गीले ऊतक के साथ एक ६० मिमी पेट्री डिश में थाली रखो (०.५% propionic एसिड समाधान के साथ लथपथ) और संस्कृति कमरे के तापमान या 25 डिग्री सेल्सियस पर ।
      नोट: लार्वा 25 डिग्री सेल्सियस की तुलना में कमरे के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) पर लगभग एक अतिरिक्त दिन के लिए लार्वा अवस्था में रहेगा ।
  4. पोस्ट-इंजरी फोकल इमेजिंग
    1. संज्ञाहरण की एक ही प्रक्रिया का उपयोग लार्वा तैयार करने और चरण ३.२ के रूप में बढ़ते, तो फोकल लेजर के साथ इमेजिंग द्वारा वांछित समय बिंदुओं पर घायल लार्वा छवि ।
      नोट: छवि लार्वा के बाद 24 में चोट (एअर इंडिया) axonal चोट की पुष्टि करने के लिए और ४८ ज एअर इंडिया (कक्षा IV दा न्यूरॉन्स) या ७२ एच ऐ (वर्ग III दा न्यूरॉन्स) के उत्थान का आकलन करने के लिए.
    2. 10x उद्देश्य का उपयोग लार्वा की स्थिति जानें, तो एक 25X (०.८ NA) उद्देश्य के लिए स्विच । प्रायोगिक प्रोटोकॉल GFP इमेजिंगका पुनः उपयोग करना ।
    3. लाइव बटन पर क्लिक करें और वही ंयूरॉन पहले से घायल खोजें ।
    4. लाइव स्कैन विंडो में प्रथम और अंतिम Z स्थितियां सेट करें । रोकें दबाएं और Z-स्टैक छवि प्राप्त करने के लिए प्रयोग प्रारंभ करें क्लिक करे ।
      नोट: सुनिश्चित करें कि कोई सामांयीकरण बिंदु (axon converging बिंदु) छवियों को कैप्चर करते समय शामिल किया गया है ताकि ठहराव का पुनर्जनन संभव हो (चित्र 1 d, 1F) – यह आगे डेटा विश्लेषण अनुभाग में चर्चा है ।
    5. छवि प्रसंस्करणके लिए स्विच, बस लिया छवि का चयन करें, और एक अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण उत्पन्न करते हैं । z-स्टैक और अधिकतम तीव्रता प्रोजेक्शन छवियां दोनों सहेजें ।

4. डेटा विश्लेषण

  1. इमेजिंग सॉफ़्टवेयर या ImageJ का उपयोग करके छवियों को संसाधित और बढ़ाता है ।
  2. ठहराव में axon उत्थान के पीएन
    1. उत्थान प्रतिशतहै, जो सभी axons है कि घावों के बीच axons reचूकने के प्रतिशत को संदर्भित करता है की गणना । स्कोर एक axon के रूप में जब तक यह चोट साइट से परे regrows के रूप में फिर से उत्पंन ।
    2. पुनर्जनन लंबाई, जो axon लंबाई में वृद्धि हुई है उपाय । यदि ImageJ के साथ बढ़ाता है, तो पुनः जनरेटेड axon ट्रेस करने के लिए सेगमेंट्ड लाइन उपकरण का उपयोग करें, और पुनः जनरेटेड axon का प्रतिनिधित्व करने वाली पंक्ति की लंबाई प्राप्त करने के लिए विश्लेषण करें ड्रॉप-डाउन मेनू में माप का उपयोग करे ।
    3. पुनर्जनन सूचकांककी गणना, जो सामान्यीकृत axon लंबाई में वृद्धि हुई है ।
      नोट: Axon लंबाई कोशिका शरीर और Axon converging बिंदु (DCAC) – Axon लंबाई/DCAC (चित्रा 1 डी और 1F) के बीच की दूरी से सामान्यीकृत है । यह मान लार्वा स्केलिंग के कारण किसी भी axonal वृद्धि के लिए खाते में मदद करता है । कोई धनात्मक मान पुनर्जनन का प्रतिनिधित्व करता है, तो 0 का मान कोई पुनर्जनन नहीं, और ऋणात्मक मान का अर्थ है पुनर्कर्षण ।
  3. dendrite उत्थान के ठहराव
    1. पुनर्जनन प्रतिशत है, जो उन सभी गंभीर है कि स्पष्ट dendrite पुनर्वृद्धि दिखाने के बीच डीए न्यूरॉन्स का प्रतिशत है की गणना ।
      नोट: Dendrite regrowth सकारात्मक के रूप में बनाए गए है अगर नया dendrites मुकर वृक्ष स्टेम से बाहर regrow और चोट साइट से परे । चोट साइट स्थलों द्वारा निर्धारित किया जाता है, और कुछ मामलों में, अवशिष्ट चोट प्रेरित autofluorescence के कारण आसानी से दिखाई देता है ।
    2. शाखा बिंदुओं की वृद्धिकी गणना करें, जो चोट के बाद नए वृक्ष शाखा बिंदुओं के अलावा गिना जाता है ।
    3. कुल dendrite लंबाई की वृद्धिकी गणना, जो सभी नए dendrites की संचयी लंबाई है चोट के बाद जोड़ा.
  4. ठहराव में axon उत्थान के सीएनएस
    नोट: यदि कोई घाव साइट पर पहली बार पॉइंट किया गया (चित्र बी) का पतन दिखाता है, तो उसे पुनर्जनन की लंबाई और दर के विश्लेषण में शामिल किया जाएगा ।
    1. पुनर्जनन लंबाई, जो axon की लंबाई है को मापने ।
      नोट: यह चोट से पहले मूल axon मार्ग के उद्भव के रूप में एक एकल घाव साइट के regrowing axon की पहचान की है ।
    2. सामान्यीकृत पुनर्जनन लंबाईकी गणना, जो संयोजिका खंड की लंबाई के लिए पुनर्जनन लंबाई को सामान्य-commissures के बीच अनुदैर्ध्य दूरी ("Y" चित्रा 3 और ख बीमें).
      नोट: यह मान लार्वा आकार अंतर के प्रभाव के लिए सही में मदद करता है ।
    3. एक विशेष जीनोटाइप की पुनर्जनन क्षमता को प्रतिबिंबित करने के लिए, जो क्षतिग्रस्त हो गए सभी खंडों के बीच पुनर्सृजन का प्रतिशत है, पुनर्जनन दरकी गणना करें ।

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Representative Results

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दा ंयूरॉंस परिधीय और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के बीच अंतर पुनर्जनन क्षमता दिखाने के लिए, साथ ही वर्ग विशिष्टता । यह axon पुनर्जनन के लिए आवश्यक है कि उपंयास कारकों के लिए स्क्रीन करने के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान करता है (कक्षा चतुर्थ पीएन चोट का उपयोग), साथ ही उन है कि पुनर्जनन के लिए निरोधात्मक (कक्षा चतुर्थ सीएनएस चोट और कक्षा III पीएन चोट के साथ) कर रहे हैं ।

पीएन में Axon पुनर्जनन

एक उदाहरण के रूप में, कक्षा III और कक्षा चतुर्थ दा ंयूरॉंस के उत्थान के लक्षण वर्णन किया गया है । ये न्यूरॉन्स प्रत्येक बॉडी सेगमेंट में द्विपक्षीय रूप से स्थित होते हैं. एकाधिक न्यूरॉन्स एक ही लार्वा में घायल हो सकते हैं; आमतौर पर, उदर खंडों के दाईं ओर में 3-4 न्यूरॉन्स A7-A2. वर्ग III और कक्षा चतुर्थ दा न्यूरॉन्स 19-12-Gal4, यूएएस-CD4tdGFP, रेपो-Gal80 और ppk-CD4tdGFP, क्रमशः द्वारा visualized किया जा सकता है । Anesthetize और माउंट 48-72 एच AEL लार्वा के रूप में वर्णित है, ताकि लार्वा की स्थिति का समायोजन किया जा सके ताकि ब्याज की मंहगाई न्यूरॉन्स (चित्र 1a और 1b) का सामना करना पड़े । हम आमतौर पर कक्षा III ddaF और कक्षा चतुर्थ v'ada ंयूरॉंस (चित्रा 1C और 1E) घायल । axotomy प्रदर्शन और लार्वा के रूप में वर्णित पुनर्प्राप्त । चोट (एअर इंडिया) के फौरन बाद, लार्वा सर्जरी से बरामद किया जाएगा और सामान्य गतिवान का प्रदर्शन करेगा । जीवित रहने की दर यहां आम तौर पर ८०% से अधिक है । मृत या बीमार हैं कि लार्वा त्यागें । शेष पुनः माउंट के रूप में वर्णित है और अध कि आकलन । 24 ज एअर इंडिया में, बाहर axons इस समय बिंदु19पर पूरा अध? ' होना चाहिए, और axon स्टेम आसानी से दिखाई जाएगी (आंकड़ा 1 डी और 1F) । कक्षा IV da न्यूरॉन्स के लिए ४८ एच ऐ पर एक ही लार्वा छवि या वर्ग III दा न्यूरॉन्स के लिए ७२ एच ऐ पुनर्जनन उत्थान का आकलन करने के लिए. हम आमतौर पर प्रयोगात्मक हालत प्रति कम से कम 20 घायल ंयूरॉंस का आकलन करने के लिए लक्ष्य । में (जंगली प्रकार) WT पशु, जबकि आम तौर पर ~ ७०% गंभीर वर्ग चतुर्थ दा ंयूरॉंस की चोट साइट (चित्रा 1F), वर्ग III दा ंयूरॉंस के पार पुनर्जीवित करने के लिए असफल हो जाएगा, वृद्धि शंकु द्वारा सबूत (चित्रा 1 डी) ।

Dendrite उत्थान

हम आमतौर पर कक्षा चतुर्थ दा न्यूरॉन्स ddaC (चित्रा 2a) पर dendriotomy प्रदर्शन करते हैं । के रूप में योजनाबद्ध आरेख में दिखाया गया है, चोट प्राथमिक वृक्ष शाखा बिंदु करने के लिए लक्षित है । अनुभव के आधार पर, जब ४८ ज AEL में घायल हो गए, ~ ५०% ddaC न्यूरॉन्स के अपने dendrites (चित्रा बी) पुनर्जंम । शेष ५०% में, पड़ोसी dendrites आक्रमण और खाली जगह को कवर किया । इसके अतिरिक्त, इन न्यूरॉन्स की पुनर्जनन क्षमता कम हो जाती है, तो बाद में विकास के चरण में घायल हो जाते हैं ।

सीएनएस में Axon पुनर्जनन

VNC axon चोट के लिए, लार्वा के जीवित रहने की दर काफी बदलती है और जिस पर चोट प्रेरित है उंर पर निर्भर करता है । अनुभव के आधार पर, 48-72 एच AEL के लार्वा आमतौर पर उच्चतम जीवित दर (> 60%) विभिन्न चरणों का परीक्षण के बीच है । लार्वा से छोटा ४८ h AEL चोट के बाद खराब बच, जबकि उन में से अधिक उंर ७२ ज AEL यह VNC में चोट का परिचय मुश्किल है । इसके अलावा, यह पूर्वकाल से पीछे संयोजिका क्षेत्रों में चोट के लिए प्रेरित आसान है, के रूप में VNC के इन पीछे क्षेत्रों ventral सतह के करीब है और इस तरह लेजर द्वारा और अधिक सुलभ (3 अंक) ।

सीएनएस में कक्षा चतुर्थ दा ंयूरॉन axons घायल करने के लिए, पहले वर्णित के रूप में लार्वा माउंट (चित्रा 3) । माइक्रोस्कोप के तहत, सीढ़ी की तरह axon बंडलों की संरचना का पता लगाने कि VNC के फार्म का हिस्सा (आंकड़ा 3ए), और के रूप में axotomy प्रदर्शन । अध... 8 ज एअर इंडिया में पुष्टि की है और पुनर्जनन 24 और ७२ ज एअर इंडिया में मूल्यांकन कर रहे हैं । के रूप में चित्र 3 बीमें दिखाया गया है, 8 एच ऐ पर axons पहले से ही पतित शुरू कर दिया है, और 24 ज एअर इंडिया में, axon पुनर्जनन मनाया जबकि axon मलबे अभी भी चोट साइटों के आसपास पाया जा सकता है । WT axons VNC में सीमित पुनर्वृद्धि दिखाने के लिए और चोट (चित्र बी) द्वारा उत्पंन अंतराल को जोड़ने में विफल । घायल axons की पुनर्जनन क्षमता को बढ़ाता है, चोट के बाद वृद्धि की लंबाई मापा जाता है और संयोजिका खंड (Y चित्रा 3में ) की लंबाई सामान्यीकरण के लिए प्रयोग किया जाता है (चित्रा 3सी).

Figure 1
चित्र 1: दा ंयूरॉन axon पुनर्जनन परिधि में वर्ग विशिष्टता प्रदर्शित करता है । (A और B) योजनाबद्ध ड्राइंग लार्वा की स्थिति दिखाई दे रही है । (ग) कक्षा III दा ंयूरॉंस की योजनाबद्ध ड्राइंग । (घ) Axons के वर्ग III दा न्यूरॉन्स ddaF, लेबल के साथ 19-12-Gal4, यूएएस-CD4-tdGFP, रेपो-Gal80/ (ङ) कक्षा चतुर्थ दा न्यूरॉन्स की योजनाबद्ध ड्राइंग. (च) Axons चतुर्थ दा न्यूरॉन्स v'ada, ppk-CD4-tdGFP/+के साथ लेबल, घाव साइट से परे पुनः विकसित. (D और F) लाल रेखा axon लंबाई को इंगित करती है जबकि हरा डैश्ड रेखा सेल बॉडी और axon converging पॉइंट (DCAC) के बीच की दूरी को चिह्नित करता है । नीला बिंदी axon converging पॉइंट को निशाना बनाता है । स्केल बार = 20 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: दा ंयूरॉन dendrite पुनर्जनन । (क) कक्षा चतुर्थ दा न्यूरॉन्स के गाये प्रतिनिधित्व. (ख) कक्षा चतुर्थ दा न्यूरॉन ddaC में dendrite उत्थान के तराने निरूपण, ppk-CD4-tdGFP/ लेजर पृथक प्राथमिक शाखा बिंदु पर लक्षित है और ४८ ज AEL में आयोजित किया जाता है । पर 24 ज एअर इंडिया चोट transection neurite की पुष्टि की है, और पर ७२ ज ऐ पुनर्जनन quantified है । Dendrites ddaC न्यूरॉन्स की भारी वृद्धि प्रदर्शित करता है, नई वृक्ष शाखाओं के साथ गंभीर स्टेम से अंकुरित करने के लिए खाली जगह टाइल । यह ध्यान देने योग्य है कि नई टर्मिनल शाखाओं लगातार इस विकासात्मक मंच पर घायल dendrites के लिए जोड़ रहे है लायक है । स्केल बार = 20 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: VNC में डा ंयूरॉन axon पुनर्जनन । (क) एक Drosophila लार्वा एक स्लाइड पर घुड़सवार की योजनाबद्ध ड्राइंग और माइक्रोस्कोप के तहत imaged । कक्षा चतुर्थ दा ंयूरॉन में axons एक ppk-CD4tdGFP में कल्पना VNC/ दो प्रत्याशी संयोजिका खंड में छवि ज़ूम में दिखाया गया है और योजनाबद्ध ड्राइंग । उनमें से प्रत्येक दो चोट साइटों (लाल हलकों) है । (ऐ) चोट के बाद 8, 24 और ७२ ज में imaged एक घायल खंड के (ख) फोकल छवियां । लाल रेखाओं को फिर से विकसित axons दर्शाते हैं । (ग) पुनर्वृद्धि axons का माप और सामान्यीकरण. स्केल बार = 20 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

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जब ऊपर मक्खी की स्थापना, महिलाओं और उपयोग पुरुषों की संख्या पादी और विशिष्ट प्रयोगों के लिए आवश्यक लार्वा की संख्या के आधार पर भिन्न हो सकते हैं । WT मक्खियों के लिए, ठेठ पार 10 महिलाओं और 5 पुरुषों का उपयोग करता है । संग्रह खिड़की, लार्वा की आवश्यकता उम्र की सटीकता के आधार पर संकुचित हो सकता है । उदाहरण के लिए, एक 2-h संग्रह अवधि में अधिक समरूप जनसंख्या का लार्वा निकलेगा । इस मामले में, 20 या अधिक कुंवारी महिलाओं का उपयोग करने के लिए सेट को पार पर्याप्त अंडे उपज में मदद मिलेगी । पहले दिन से उपज आमतौर पर दुर्लभ है, तो दो या अधिक दिनों के लिए चैंबर की स्थापना के बाद अंडे के साथ थाली इकट्ठा । जब आगे अंडे के साथ प्लेट संवर्धन, यह ६०-mm पेट्री डिश में ०.५% propionic एसिड समाधान के बजाय पानी में ऊतक सोख करने के लिए सिफारिश की है, जो न केवल पकवान में नमी बनाए रखने में मदद करेगा, लेकिन यह भी मोल्ड के विकास से बचें ।

जब लार्वा संज्ञाहरण के लिए उपकरणों की स्थापना और बढ़ते, ईथर प्लास्टिक के माध्यम से पिघल जाएगा क्योंकि एक गिलास पकवान का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें । ग् डिश लीक होने की स्थिति में 15 सेमी प् लास्टिक पेट्री डिश में रखे जाते हैं । ऊतक कागज में मदद करता है पकवान में ईथर की रक्षा इतना है कि लार्वा प्रभावी ढंग से ईथर के ऊपर से खटखटाया जा सकता है भाप । ईथर के aliquots की दुकान और कांच ड्रॉपर के साथ बूंदों में ईथर जोड़ने के लिए एंबर छोड़ने की बोतलें का उपयोग करने की सिफारिश की है । ईथर की भरपाई और हमेशा इष्टतम प्रभाव के लिए पकवान के तल पर तरल ईथर की एक परत रखने के लिए ।

ईथर जोखिम के समय महत्वपूर्ण है: के अंतर्गत-संज्ञाहरण इमेजिंग सत्र और अस्थिर छवियों के बीच में लार्वा रिकवरी करने के लिए नेतृत्व करेंगे; एक संज्ञाहरण अधिक मात्रा, या ईथर तरल के साथ सीधे संपर्क, घातकता का कारण होगा । अस्तित्व और सफलता की दर को अधिकतम करने के लिए, हमारे अंगूठे का नियम इस प्रकार है: पीएन चोट/इमेजिंग के लिए, जैसे ही इसकी पूंछ हिल बंद हो जाता है लार्वा बाहर ले; सीएनएस के लिए, जब तक पूरे लार्वा स्थिर हो जाता है, विशेष रूप से प्रमुख क्षेत्रों रुको । यहां तक कि एक मामूली आंदोलन की चोट और VNC axons की इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप करेंगे । पुराने लार्वा बाहर दस्तक करने के लिए लंबे समय तक ले जाते हैं । यह आमतौर पर लार्वा के लिए 2 से कम ७२ h AEL और 2-5 मिनट से अधिक के लिए ७२ h AEL से पुराने लार्वा लेता है ।

चोट के लिए दो-फोटॉन लेजर की तीव्रता की स्थापना करते समय, मान "लाइव" स्कैन से प्राप्त ऊतक प्रतिदीप्ति संकेत द्वारा निर्धारित किया जाता है । चोट "सतत" स्कैन के रूप में चरण ३.३ में पेश किया है । चोट प्रेरित वृद्धि प्रतिदीप्ति में चोट साइट पर autofluorescence के कारण है और neurite के विच्छेद का एक अच्छा संकेत के रूप में कार्य करता है । आमतौर पर, यह लेता है 1-10 एस प्रतिदीप्ति स्पाइक देखने के लिए । यह एक बार प्रतिदीप्ति ऊंचा है स्कैन समय को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है । पीएन चोट के लिए, यह तुरंत स्कैनिंग बंद करने के लिए आवश्यक है । लंबे समय तक निवेश चोट साइट और पड़ोसी ऊतकों को नुकसान में इजाफा होगा । हालांकि, यह स्कैन समय को समायोजित करने और चोट की गंभीरता में हेरफेर करने का अवसर प्रदान करता है । एक सफल चोट एक घाव आकार व्यास 3-4 माइक्रोन से छोटे होना चाहिए । vnc axon चोट के लिए, vnc axons बहुत गहरी एंबेडेड है दा ंयूरॉन पीएन axons/dendrites, जो त्वचा के नीचे सही है की तुलना में, और इस तरह उच्च लेजर तीव्रता की आवश्यकता है । हम आमतौर पर कुछ और सेकंड के लिए स्कैन पर छोड़ दें । यह सुनिश्चित करने के लिए है कि पूरे axon बंडल गंभीर है । यदि घाव साइटों की त्रिज्या संयोजिका बंडल की चौड़ाई आधे से अधिक है, ऐसी चोट साइटों के रूप में असफल गिना जाता है । इस तरह के लार्वा कम जीवित रहने की दर है और इसे विश्लेषण में शामिल नहीं किया जाएगा ।

axon उत्थान के लिए, उत्थान की क्षमता लार्वा चरणों में समान है । लेकिन एकल dendrite कटौती के बाद dendrite पुनर्जनन के लिए, ७२ h AEL19के बाद पुनर्जनन क्षमता कम हो जाती है । इस प्रकार, axon चोट आम तौर पर ४८ एच-७२ एच AEL और 48h AEL में dendrite चोट पर प्रदर्शन किया है, 120h AEL पर पुनर्जनन के आकलन के साथ । 24 AEL के लार्वा भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन वे अधिक सावधानी से निपटने की आवश्यकता, उनके छोटे आकार दिया । लार्वा pupate के बाद १२० ज AEL, जिससे इमेजिंग अधिक चुनौतीपूर्ण हो । इसलिए, हमारे समापन बिंदु आमतौर पर १२० h AEL है ।

अध-पतन और उत्थान के बीच क्या संबंध है? पीएन चोट के लिए, 24 ज एअर इंडिया में, सामांय रूप से बाहर के axon/dendrite WT में Wallerian अध कि उत्थान पूरा कर लिया है इस समय बिंदु पर शुरू नहीं किया है । इसलिए, हम मानते है कि WT लार्वा के अध कि neurites में केवल पुनर्जनन पर बहुत ही सीमित प्रभाव पड़ता है, अगर सब पर । VNC चोट के लिए, 8 ज एअर इंडिया में axons पहले से ही पतित शुरू कर दिया है, और 24 ज एअर इंडिया में, axon पुनर्जनन जबकि axon मलबे अभी भी चोट साइटों के आसपास पाया जा सकता है मनाया जाता है । मलबा आने से ब्लाक उत्थान नहीं लग रहा है । हालांकि, यह संभव है कि कुछ परिस्थितियों के तहत, वहां एक ओवरलैप या यहां तक कि अध: पतन और पुनर्जनन के बीच एक crosstalk हो सकता है । वास्तव में, यह सूचित किया गया है कि वृद्ध चूहों में, परिधीय तंत्रिका क्षति के बाद मलबे निकासी युवा जानवरों में है कि तुलना में धीमी है । Concomitantly, neuromuscular जंक्शन के धीमी reinnervation मनाया गया, जो पुराने पशुओं में axons मुठभेड़ पुनः उत्पन्न अवरोधकों की अधिक से अधिक संख्या के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । हैरानी की बात है, तथापि, वृद्ध पशुओं से axons जल्दी से पुनर्जीवित और reinnervate neuromuscular जंक्शन साइटों कुशलतापूर्वक जब मलबे के साथ सामना नहीं३२। यह पता चलता है कि मलबे निकासी को सुविधाजनक बनाने के उत्थान को बढ़ावा देने के लिए एक संभावित रणनीति हो सकती है ।

अंय neuroregeneration मॉडल की तुलना में, मक्खी संवेदी ंयूरॉन चोट मॉडल अद्वितीय लाभ है । माउस मॉडल आमतौर पर हफ्तों के लिए महीनों लेने के लिए प्रदर्शन और बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीन के संचालन के लिए उपयुक्त नहीं हैं; C. एलिगेंस केवल एक आदिम केंद्रीय तंत्रिका तंत्र जो बारीकी से स्तनधारी सीएनएस में पुनर्जनन बाधाओं दोहराऊंगा नहीं हो सकता है; स्तनधारियों से अलग, zebrafish सीएनएस axons मजबूती से पुनर्जीवित । मक्खियों के तेजी से जीवन चक्र, मक्खी आनुवंशिकी की बहुमुखी प्रतिभा, पहुंच और axons की टकसाली dendrites/संवेदी ंयूरॉंस के पैटर्न, और उड़ान संवेदी न्यूरॉन्स के विशिष्ट पुनर्जनन गुण-प्रकार में विशेष उत्थान-- पीएन और सीएनएस में सीमित पुनर्जनन – बनाने के Drosophila दा ंयूरॉंस neuroregeneration अध्ययन के लिए एक आकर्षक मॉडल । इसके अलावा, कुचल माउस रेटिना नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं (RGCs) से हाल के अध्ययनों का भी सुझाव है कि न्यूरॉन उपप्रकार अलग पुनर्जनन क्षमता सहन; कुछ RGC उपप्रकारों पुनर्जंम कर सकते हैं, जबकि प्रतीत होता है समरूप तंत्रिका बंडल में दूसरों को फिर से विकसित करने के लिए विफल३३। यह महत्वपूर्ण खोज पता चलता है कि न्यूरॉन प्रकार विशिष्ट रणनीतियों के उत्थान और कार्यात्मक वसूली को बढ़ावा देने के लिए शोषण किया जाना चाहिए और दृढ़ता से तर्क है कि axon चोट और बाद के उत्थान के विश्लेषण के प्रेरण एक में किया जाना चाहिए ंयूरॉन उप प्रकार-विशिष्ट तरीके से । इसके अलावा, इस पुनर्जनन प्रकार विशिष्टता के लिए सेलुलर और आणविक निर्धारकों मोटे तौर पर19,३३अज्ञात रहते हैं । इसलिए, दा ंयूरॉन चोट मॉडल आदर्श प्रतिमान प्रदान करता है इन मुद्दों से निपटने के लिए ।

axon पुनर्जनन की तुलना में, dendrite पुनर्जनन पर ध्यान केंद्रित अध्ययन बहुत कमी कर रहे हैं । Dendrite चोट, ऐसे दर्दनाक मस्तिष्क चोट, स्ट्रोक में, और neurodegeneration के कई रूपों के रूप में, फिर भी लगभग कुछ भी नहीं dendrites ' की मरंमत और तंत्रिका कनेक्शन सुधार करने की क्षमता के बारे में जाना जाता है । दा ंयूरॉन चोट मॉडल फिर से एक अत्यंत सुलभ प्रणाली है कि प्रदर्शित करता है टकसाली patterning, वर्ग विशिष्टता, और लौकिक विनियमन19, इस दिशा का पता लगाने ।

यह भी उल्लेख है कि जब यह संभव है के लायक है पीएन में एक लेबल एकल axon घायल, जिस तरह से चोट axons के एक बंडल के घावों में सीएनएस परिणामों में किया जाता है । यदि वांछित, MARCM३४ या FLP-आउट क्लोन३५ दृष्टिकोण सीएनएस में एकल axons को लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । साथ ही, जब glial कक्षों को एक साथ mRFP (रेपो-Gal4, यूएएस-mRFP) के साथ लेबल कर रहे हैं, तो glia प्रक्रियाओं का संचय विशेष रूप से घाव साइट पर मनाया जाता है. इसके अलावा, Ptp99A की अभिव्यक्ति, chondroitin सल्फेट proteoglycan की मक्खी homolog (CSPG) phosphacan/PTPRZ1, ऊपर है-घाव साइट पर विनियमित । Ptp99A co-glial कोशिकाओं के साथ स्थानीयकृत और चोट साइट के चारों ओर, एक अंगूठी की तरह संरचना बनाने क्या स्तनधारियों में astroglial निशान के लिए रिपोर्ट किया गया है के समान19,३६,३७। अंत में, दा ंयूरॉन चोट मॉडल, जब ऐसे glial कोशिकाओं या प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में अंय प्रकार के सेल के मार्कर के साथ संयुक्त, vivo में एक घायल ंयूरॉन और उसके आसपास के बीच कोशिकीय बातचीत के वास्तविक समय निगरानी में अनुमति देगा वातावरण.

हालांकि इस मक्खी लार्वा संवेदी ंयूरॉन चोट मॉडल पीएन और सीएनएस में दोनों संभावित neuroregeneration नियामकों को खोजने के लिए हमें अवसर प्रदान करता है, यह अभी भी कई सीमाएं हैं । सबसे पहले, यह वर्तमान चरण में उच्च प्रवाह का नहीं है । सामान्यतया, 5-6 पादी एक सप्ताह में एक व्यक्ति द्वारा दिखलाई जा सकता है । यह एक निष्पक्ष स्क्रीन करने के क्रम में अनुकूलित करने की जरूरत है । दूसरा, लार्वा पर ईथर संज्ञाहरण के रूप में कई मिनट से कोई बीस मिनट से अधिक पिछले कर सकते हैं, यह दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए इष्टतम नहीं है । इस प्रकार, विशिष्ट समय अंक है कि axon अध: पतन और पुनर्जनन के प्रतिनिधि है क्रमशः इमेजिंग के लिए चुना जाता है । तीसरा, भले ही इस प्रोटोकॉल axons ठीक घायल करने के लिए एक रास्ता शुरू कर रहा है, आसपास के ऊतकों को नुकसान की संभावना पूरी तरह से इंकार नहीं किया जा सकता है । VNC में, इन ऊतकों glial कोशिकाओं, axons, और अंय ंयूरॉंस की dendrites हो सकता है । इस संभावित चेतावनी को कम करने के लिए, हम चोट साइटों को कम करने, कम लेजर शक्ति संभव लागू करते हैं, और दोनों नियंत्रण और प्रयोग समूहों के समानांतर में एक ही प्रक्रिया करते हैं । चौथे, सीएनएस चोट प्रतिमान स्थापित करने की प्रक्रिया में, विभिंन चोट साइटों axon टर्मिनी है कि हम उपयोग करने के लिए और VNC में axons के प्रवेश बिंदु का फैसला करने के लिए करीब साइटों सहित परीक्षण किया गया । प्रवेश बिंदुओं के लिए अधिक मुश्किल हो पाया था क्योंकि वे ऊतक और अधिक बढ़ने की संभावना में गहरे हैं । इस प्रकार, इन व्यावहारिक कारणों के लिए, हम वर्तमान विधि के लिए चुनते हैं, जो अधिक सुसंगत है, बेहतर नियंत्रित, और बड़े पैमाने पर प्रयोगों के लिए अच्छा है । एक संभावित चिंता, जैसा कि ऊपर कहा गया है, पड़ोसी ऊतकों, जैसे postsynaptic घटकों और glial कोशिकाओं को घायल करने की संभावना है । दूसरी ओर, यह एक उत्कृष्ट सवाल है कि कैसे क्षतिग्रस्त आसपास के ऊतकों axons के अध-पतन और पुनर्जनन को प्रभावित करते हैं । उदाहरण के लिए, कैसे glial निशान axon पुनर्जनन को प्रभावित करता है । यह एक और कारण है कि हमारी चोट मॉडल बारीकी से स्तनधारियों में चोट मॉडल है, जिसमें axons और घाव साइटों के आसपास के ऊतकों आमतौर पर एक साथ घायल हो सकते है प्रस्तुत करता है ।

लेजर चोट समय के बाद चूक माइक्रोस्कोपी axon/dendrite पुनर्जनन के अध्ययन के लिए एक संवेदनशील परख है । हालांकि, इस परख के एक मुख्य चिंता का विषय माना जाता है लागत, जो < $10k से कम अंत ठोस राज्य पल्स पराबैंगनीकिरण के लिए पर्वतमाला, 100K femtosecond पराबैंगनीकिरण के लिए $25-100K के लिए > $ दो फोटॉन पराबैंगनीकिरण के लिए । वहां विभिंन लेजर axotomy29,३८,३९,४०,४१,४२,४३, के लिए इस्तेमाल किया प्रणालियों के बारे में कई अच्छे विचार विमर्श कर रहे हैं ४४ , ४५. संक्षेप में, पारंपरिक पराबैंगनीकिरण सतह से लगभग 30-50 µm के भीतर axons काटने के लिए इष्टतम हैं । वहां नैनो और पिको दूसरा पराबैंगनीकिरण femtosecond लेजर के साथ तुलना में, विशेष रूप से लक्ष्य क्षेत्र की गहराई के रूप में४५बढ़ जाती है के साथ और अधिक संपार्श्विक नुकसान होगा । VNC में axons घायल करने के लिए, गहराई जिनमें से आमतौर पर के बारे में 50-100 µm है, यह ऊतक क्षति को कम करने के लिए आवश्यक है । इस मामले में, दो फोटॉन लेजर आदर्श है, जो फोकल विमान के लिए लेजर शक्ति केंद्रित है, ऊतक प्रवेश समझौता किए बिना जमानती ऊतक क्षति को कम करने । अंत में, दो फोटॉन प्रणाली महंगा है, लेकिन सबसे अच्छा परिशुद्धता और ऊतक संरक्षण प्रदान करता है । हालांकि, अगर केवल पीएन axons axotomy के लिए लक्ष्य कर रहे हैं, पारंपरिक पल्स पराबैंगनीकिरण एक अधिक किफायती विकल्प हो सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता के लिए जेसिका Goldshteyn धंयवाद । गीत लैब में काम NIH अनुदान R00NS088211 द्वारा वित्त पोषित है, और बौद्धिक और विकासात्मक विकलांग अनुसंधान केंद्र (IDDRC) नए कार्यक्रम विकास पुरस्कार ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous Acros Organics AC615080010
Halocarbon 27 Oil Genesee Scientific 59-133
Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L VWR 97062-948 
Agar powder, Alfa Aesar, 500GM VWR AAA10752-36
Grape juice Welch’s
Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%) VWR 64-17-5
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
Propionic Acid J.T.Baker U33007
Cover Glasses: Rectangles Fisher Scientific 12-544-D 50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope Zeiss
Zen software Zeiss
Chameleon Ultra II Coherent

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References

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एक Drosophila परिधीय और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में Neuroregeneration अध्ययन के लिए Vivo चोट मॉडल <em>में</em>
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Li, D., Li, F., Guttipatti, P., Song, Y. A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System. J. Vis. Exp. (135), e57557, doi:10.3791/57557 (2018).More

Li, D., Li, F., Guttipatti, P., Song, Y. A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System. J. Vis. Exp. (135), e57557, doi:10.3791/57557 (2018).

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