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Un modello di ferita Drosophila In Vivo per lo studio della neurorigenerazione la periferica e del sistema nervoso centrale

Published: May 5, 2018 doi: 10.3791/57557
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2
1Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Pennsylvania
* These authors contributed equally

Summary

Qui, presentiamo un protocollo utilizzando la drosofila neurone sensoriale - modello di lesione del neurone arborization dentritico (da), che combina in vivo live imaging, due fotoni laser assotomia/dendriotomy e il potente toolbox di volare genetica, come una piattaforma per lo screening di potenziali promotori e inibitori della neurorigenerazione.

Abstract

La capacità di ricrescita di neuroni danneggiati governa neurorigenerazione ed il recupero funzionale dopo trauma del sistema nervoso. Negli ultimi decenni, sono stati identificati diversi fattori inibitori intrinseche ed estrinseche coinvolti nella restrizione di rigenerazione dell'assone. Tuttavia, semplicemente rimuovendo questi spunti inibitori è insufficiente per successo di rigenerazione, che indica l'esistenza di ulteriori normative macchine. Drosophila melanogaster, il moscerino della frutta, condivide evolutivamente conservati geni e vie di segnalazione con vertebrati, compreso gli esseri umani. Combinando la casella degli strumenti genetico potente di mosche con due fotoni laser assotomia/dendriotomy, descriviamo qui il neurone sensoriale di Drosophila – modello di lesione del neurone arborization dentritico (da) come una piattaforma per lo screening sistematico per il romanzo regolatori di rigenerazione. Brevemente, questo paradigma include un) la preparazione di larve, induzione b) lesione di dendrite(s) o axon(s) utilizzando un laser del due-fotone, c) dal vivo confocale imaging post-infortunio e d) analisi dei dati. Il nostro modello consente altamente riproducibile lesioni di singoli neuroni con etichettati, assoni e dendriti dei sottotipi neuronali ben definiti, nel sistema nervoso centrale e periferico.

Introduction

L'incapacità degli assoni di rigenerarsi dopo una lesione al sistema nervoso centrale (CNS), può portare a disabilità permanenti nei pazienti e svolge anche un ruolo nei deficit neurologici irreversibili in neurodegenerative malattie1,2 ,3,4,5. L'ambiente del CNS, come pure la capacità intrinseche di crescita dei neuroni, determina se gli assoni sono in grado di rigenerare dopo il trauma. Fattori extracellulari da oligodendrociti, astroglial e fibroblastici fonti sono stati indicati per impedire la crescita neuronale4,6,7,8, ma l'eliminazione di queste molecole consente solo limitata5di germogliatura. Segnali di rigenerazione intrinseca possono influenzare il successo rigenerativa5,9 e rappresentano potenziali bersagli terapeutici, ma questi processi sono ancora non ben definiti a livello molecolare. Aumenti in fattore trofico segnalazione o eliminazione dei freni endogeni, quali la fosfatasi Pten10, possono causare la rigenerazione assonale in determinate circostanze. Combinazioni di diversi metodi trovati per essere singolarmente efficace forniscono anche solo limitato recupero complessivo ad oggi11,12,13,14. Di conseguenza, c'è un disperato bisogno per identificare ulteriori vie per la terapia mirata. Oltre l'inizio della ricrescita dell'assone, se e come gli assoni ricollegherai alla destinazione corretta, specificità di sinapsi di riforma e realizzare il recupero funzionale sono importanti domande senza risposta.

In sintesi, comprensione corrente del macchinario dettando la rigenerazione dell'assone è ancora molto frammentaria. Parte del problema è la difficoltà tecnica di studiare assone rigenerazione nei mammiferi in tempo reale, un approccio che è costosa, richiede tempo e stimolante per lo svolgimento di schermi genetici su larga scala. Drosophila melanogaster, d'altra parte, ha dimostrato di essere un sistema eccezionalmente potente per lo studio delle complesse questioni biologiche. Moscerino della frutta è stato determinante nella definizione di geni e vie che sono straordinariamente conservate negli esseri umani di segnalazione ed è stato un modello di successo per lo studio delle condizioni umane, come le malattie neurodegenerative, attraverso gli strumenti di genetica molecolare vasto disponibili per manipolare gene funzione15. In particolare, sono considerate uno strumento ideale per la scoperta di geni coinvolti in lesioni neurali e ricrescita15,16mosche della frutta. Sono stati sviluppati diversi modelli di lesioni neurali volare, compreso adulto-testa o nervo ventrali larvale cavo (VNC) lancinante con aghi, larvale VNC o schiacciamento del nervo con forcipe, neurone larvale laser assotomia, rimozione di neuroni recettori olfattivi, espianti trauma cranico, e la lesione del nervo periferico di ala severance15,17,18,19,20,21,22,23. Eccitante, recente lavoro che utilizzano modelli di lesione Drosophila hanno avanzato la nostra comprensione delle vie cellulari e genetiche utilizzati dal sistema nervoso per rispondere alle lesioni neurali, alcuni dei quali sono stati indicati per essere conservata nei mammiferi24 ,25. Ancora una volta, questo sottolinea l'utilità di questo organismo di modello per identificazione di nuovi meccanismi di riparazione neurale.

Un modello del due-fotone basato su laser Drosophila larvale neurone sensoriale lesioni è descritto qui. Un laser del due-fotone fu usato per tagliare gli assoni in zebrafish in vivo nel 200326. Nello stesso anno, il primo laser dendriotomy è stato effettuato in Drosophila utilizzando un laser pulsato azoto27. Poco dopo, diversi laboratori di c. elegans utilizzato con laser a femtosecondi per stabilire modelli di assone rigenerazione28. Nel 2007, Wu e colleghi rispetto e segnalato le differenze fra le lesioni laser in c. elegans indotte da vari tipi di laser29. Nel 2010, la rigenerazione assonale dopo lesione assonale laser era primo indicata per accadere in Drosophila30. Sulla base di questa letteratura di lesioni ampie laser, abbiamo sviluppato un modello di lesioni neurali volare utilizzando il laser del due-fotone, che permette la precisa induzione della lesione per siti mirati con minima perturbazione della vicina tessuti, fornendo un ambiente relativamente pulito sistema per lo studio di entrambe le proprietà intrinseche ed estrinseche della neurorigenerazione con cella singola ad alta risoluzione. In particolare, abbiamo stabilito un insieme di metodi di pregiudizio per i neuroni sensoriali arborization dentritico (da) in entrambi sistema nervoso periferico (PNS) e sistema nervoso centrale. Da neuroni possono essere raggruppati in quattro distinte classi distingue principalmente per la loro complessità ramificazione dendrite: classe I a IV31. Nostro lavoro pubblicato dimostra che da rigenerazione di neurone assomiglia a modelli di lesione dei mammiferi a livello molecolare e fenotipico: neuroni da visualizzare le proprietà di rigenerazione specifico di classe, con la classe IV ma non di classe I o neuroni da III che esibiscono rigenerazione nella PNS; assoni di neuroni di classe IV da rigenerano robustamente nella periferia, ma il loro potenziale rigenerativo è drasticamente ridotto nel SNC, così simile a neuroni gangliari (DRG) radice dorsale nei mammiferi; migliorante l'attività di mTOR tramite Pten eliminazione o iperespressione di Akt migliora la rigenerazione assonale nel moscerino della CNS19. Utilizzando questo modello di ferita, ci hanno suonato schermi genetici e hanno identificato l'enzima di elaborazione del RNA Rtca come fattore inibitorio evolutivamente conservato per rigenerazione dell'assone, che collega ferita dell'assone di stress cellulare e modifica di RNA20 .

Nel paradigma presentato, il pregiudizio è indotta tramite laser assotomia/dendriotomy di larvale classe IV o III da neuroni, etichettati da ppk-CD4-tdGFP o 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80, rispettivamente. La ferita viene eseguita su 2nd a 3rd instar larve a circa 48-72 h dopo (h AEL) la deposizione delle uova. PNS assotomia la lesione è destinato alla sezione dell'assone ~ 20-50 µm lontano dal corpo cellulare, per CNS assotomia ad un'area di ~ 20 µm di diametro allo svincolo commissura in VNC e per dendriotomy ai punti di ramo dendritico primario. Il neurone stesso è imaged a 8-24 h dopo la lesione (AI) per confermare il transection completo e a 48-72 h per valutare la rigenerazione. Attraverso la formazione immagine confocal time-lapse, degenerazione e rigenerazione degli assoni/dendriti individuali che sono stati feriti in vivo possono essere monitorati nel tempo.

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Protocol

1. preparazione delle piastre di coltura e delle bottiglie

  1. Preparazione delle piastre di agar di succo d'uva
    1. Aggiungere 10 g di agar in polvere, succo di uva 200ml e 192 mL ddH2O in un becher e forno a microonde per circa 4-5 minuti, mescolando in modo discontinuo fino a quando l'agar è dissolto completamente.
    2. In una cappa, raffreddare la soluzione a circa 60 ° C. Aggiungere 4,2 mL di etanolo al 95% e 4,0 mL di acido acetico glaciale. Regolare il volume totale della soluzione da 400 mL con ddH2O. Mix bene.
    3. Per ogni piatto di 35 mm, aggiungere circa 2-3 mL di soluzione. Fare circa 120-150 tavole per un totale di 400 mL di soluzione di succo d'uva agar.
    4. Attendere 10 minuti per raffreddare le piastre e solidificare la soluzione di agar. Imballare il succo d'uva piastre di agar in sacchetti ziplock self-sigillato e conservare a 4 ° C per un uso futuro.
  2. Preparazione dei flaconi per coltura della drosofila
    1. Utilizzare una lama per perforare un foro triangolare del lunghezza laterale di 1,5 cm su una parete del flacone di coltura della drosofila e riempire il foro con una sfera del diametro di 2-2.5 cm di cotone per la ventilazione.
    2. Inserire la bottiglia con una piastra di agar di succo d'uva completata con circa 0,5 cm3 di pasta di lievito.

2. raccolta delle larve di Drosophila

  1. Impostare la pagina di croci di mosche adulte
    1. Posto 10 femmine vergini e 5 maschio adulto vola insieme in un flacone di coltura collegato con una piastra di agar di succo d'uva.
    2. Mettere i fondi di bottiglia fino a 25° C, in modo che mosche deporranno le uova sulla piastra di agar di succo d'uva. Cambiare la piastra con la pasta di lievito almeno una volta al giorno. Per un periodo di raccolta 2-h, che consente la raccolta delle larve di una fase inerente allo sviluppo omogenea, iniziare con più di 20 Vergine femmine e 10 maschi al punto 2.1.1.
    3. Cultura la piastra a 25° C in una capsula Petri 60 mm con un panno umido, per esempio, imbevuta di soluzione di acido propionico del 0,5%. Disporre il tessuto in modo che non bloccare il flusso di ossigeno.
      Nota: La soluzione di acido propionico è utilizzata per mantenere l'umidità nel piatto ed evitare la crescita di muffe.
  2. Raccolta delle larve di un età specifici
    1. Utilizzare un paio di pinze per trasferire le larve della fase desiderata, ad esempio, 2nd a 3rd instar larve a 48-72 h dopo (AEL), la deposizione delle uova per una nuova piastra di agar di succo d'uva senza pasta di lievito.
    2. Rimuovere il lievito dalla pelle di larve consentendo loro di strisciare sul piatto di nuovo, per evitare che interferiscano potenziali di lievito con laser assotomia e imaging. In alternativa, pulire accuratamente le larve di lavarli in un piatto di PBS e asciugare brevemente su un pezzo di carta velina.

3. due-fotone ferita e Imaging confocale

  1. Installazione di microscopio
    Nota: Un microscopio a due fotoni laser confocale del laser è stato usato per questo esperimento, ma altri sistemi con un setup di equivalente saranno anche sufficiente. Il laser del due-fotone (930 nm) è stato utilizzato per la consegna di lesioni e un laser ad Argon (488 nm) è stato usato per formazione immagine confocal di GFP.
    1. All'inizio di ogni sessione, accendere il laser del due-fotone e/o il laser(s) confocale e il microscopio. Aprire il software di imaging.
    2. Per la ferita del due-fotone, impostare i seguenti parametri per l'imaging di GFP con il laser del due-fotone a 930 nm (1.950 mW).
      1. Selezionare la modalità di scansione di linea. Aprire completamente il foro stenopeico. Aumentare l'intensità del laser al ~ 20% (390 mW).
      2. Selezionare 512 x 512 come l'esplorazione della struttura. Utilizzare la massima velocità di scansione (in genere con il tempo di permanenza di pixel a 0,77 µs). Assicurarsi che il numero medio è 1 e profondità di bit è di 8 bit.
      3. Guadagno a ~ 750 e l'offset a 0.
      4. Salva questo pre-set protocollo sperimentale come 2P GFP 930 ablazione, consentendo facile riutilizzare in futuro gli esperimenti.
    3. Per formazione immagine confocal, impostare i seguenti parametri per l'imaging di GFP con il laser di Argon a 488 nm:
      1. Selezionare la scheda di acquisizione e quindi Z-stack.
      2. Sotto "Laser", attivare l'alimentazione per il laser di Argon 488 nm.
      3. Vai ai canali, selezionare il laser 488 mm e aumentare la potenza del laser per 5-10%. Per il foro stenopeico, utilizzare l'unità arioso di 1-2 (AU). Regolare il guadagno a 650.
      4. In Modalità di acquisizione, selezionare 1024 x 1024 come l'esplorazione della struttura, utilizzare la velocità di scansione massima, un numero medio di 2 e profondità di bit di 8 Bit.
      5. Salvare questo protocollo sperimentale pre-impostato come GFP Imaging.
  2. Anestesia di larve con etere dietilico e montaggio
    1. In una cappa aspirante, posizionare un piatto di vetro 60 mm in una capsula di Petri di plastica di 15 cm. Piega e laici un pezzo di carta velina nella parte inferiore del piatto di vetro, quindi inserire una piastra di agar di succo d'uva sul tessuto. Aggiungere etere etilico nel piatto di vetro, al punto in cui la carta velina è intrisa e c'è uno strato di etere liquido rimanente nel piatto. Tenere il coperchio in ogni momento.
    2. Preparare un vetrino con una goccia di halocarbone 27 olio nel centro. Aggiungere 4 macchie di grasso per vuoto sui quattro angoli della diapositiva, per poi sostenere il vetrino coprioggetti.
    3. Utilizzare pinze per raccogliere una larva pulita e posizionarlo sulla piastra di agar nel piatto di vetro di 60 mm. Coprire il piatto di vetro con il coperchio e attendere fino a quando la larva smette di muoversi. PNS ferita/imaging, per estrarre la larva appena la coda ferma spasmi muscolari. Per il sistema nervoso centrale, attendere fino a quando la larva intera diventa immobile, soprattutto i segmenti di testa.
      Nota: I tempi di esposizione di etere sono fondamentali. Vedere la discussione.
    4. Delicatamente prendere la larva anestetizzata e posizionarlo testa-montante nella goccia di olio halocarbone sulla diapositiva. Aggiungere un vetrino coprioggetto sopra la diapositiva. Utilizzare una leggera pressione per spingere il vetrino coprioggetto, fino a toccare la larva (Figura 1A).
    5. Regolare posizione di larva spingendo delicatamente il vetrino coprioggetti verso sinistra o verso destra per rotolare la larva, in modo che il neurone/assone/dendrite di interesse è sulla parte superiore e più vicina alla lente del microscopio.
    6. Per lesioni PNS, è possibile montare il lato dorsale della larva, in modo che entrambe le trachee sono visibili. Poi rotolare la larva ~ 30 gradi a sinistra per ferire classe III da neurone assoni (Figura 1B e 1C), 90 gradi per ferire gli di assoni di classe IV da neurone (Figura 1B e 1E) o ~ 30 gradi per ferire classe IV da neurone dendriti ( Figura 2A).
    7. Per lesione dello SNC, posizionare la larva per essere perfettamente ventrale verso l'alto (Figura 3A), in modo che la regione di interesse è più vicina alla lente del microscopio nel piano z.
  3. Ferita da due fotoni laser
    1. Porre il vetrino con la larva sotto il microscopio e fissarlo in posizione con il supporto per diapositive sul palco. Obiettivo di uso il 10 X (0,3 NA) per trovare la larva.
    2. Aggiungere 1 goccia di olio oggettiva il vetrino coprioggetto, passare al 40 X (1,3 NA) obiettivo e regolare la messa a fuoco.
    3. Passare alla modalità di scansione e riutilizzare il protocollo sperimentale 2P GFP 930 ablazione. Assicurarsi che il foro stenopeico è aperto tutta la strada.
      Nota: La configurazione deve essere ottimizzato basato sui singoli sistemi.
    4. Avviare la modalità Live per individuare l'area di interesse (ROI) e ottimizzare le impostazioni per ottenere immagini di buona qualità con lo zoom appropriato.
      Nota: Lo scopo di questo passaggio è quello di trovare il neurone/assone/dendrite di ferire, invece di prendere la migliore immagine di qualità. Di conseguenza, è possibile utilizzare le impostazioni minime sufficienti per visualizzare l'area di destinazione, al fine di evitare la sovraesposizione o photobleaching.
    5. Arrestare Live scansione, in modo che il pulsante Ritaglia diventerà disponibile. Lasciare che l'immagine ancora servire come la tabella di marcia. Selezionare la funzione di ritaglio e adattare la finestra di scansione a concentrarsi sul bersaglio per essere ferito.
    6. Ridurre il ROI per essere la dimensione del futuro sito della ferita. Ad esempio, basta coprire la larghezza di un assone o un dendrite, per garantire la precisione della ferita e ridurre i danni ai tessuti vicini. Se lo si desidera, zoomare sul ROI prima del taglio, permettendo per la ferita più precisa.
    7. Aprire una nuova finestra di imaging. Ridurre la velocità di scansione e aumentare l'intensità del laser. Determinano l'aumento nell'intensità del laser basato sul segnale di fluorescenza del tessuto scansionato in modalità Live .
    8. In genere, impostare l'intensità del due-fotone laser a partire da 25% per le lesioni PNS e 50-100% per le lesioni VNC. Per la ferita di assone PNS, garantire che l'intensità del laser è ~ 480 mW e pixel tempo di sosta è 8,19 μs. Per la ferita dell'assone VNC, assicurarsi che il tempo di permanenza di intensità e pixel laser sono solitamente 965-1930 mW e 8,19-32,77 μs, rispettivamente.
    9. Avviare la scansione continua . Lasciare il cursore mouse sopra il pulsante continua . Tenere d'occhio sull'immagine e interrompere la scansione, non appena si osserva un aumento drastico in fluorescenza.
      Nota: L'aspetto del picco di fluorescenza è dovuta auto-fluorescenza al sito di lesione.
    10. Passare alla modalità "Live" riutilizzando le impostazioni. Trovare la regione di interesse che è stato mirato solo regolando la messa a fuoco.
      Nota: Una buona indicazione della ferita di successo è l'aspetto di un piccolo cratere, struttura anulare o detriti localizzato proprio al sito di lesione.
    11. Spostare il neurone successivo e ripetere dal punto 3.3.5, a danneggiare i neuroni multipli in un singolo animale. O ripetere il punto 3.3.5 mentre gradualmente aumentando la potenza e/o riducendo la velocità di scansione se la lesione iniziale era insufficiente.
      Nota: Nel caso in cui la potenza del laser è troppo alta, una grande area danneggiata sarà visibile nell'immagine post-ferita scan in tempo reale. Troppo ferita può causare la morte della larva.
    12. Recuperare la larva con attenzione rimuovere il vetrino coprioggetto e trasferendo la larva ferita su una piastra di nuova con la pasta di lievito. Fosso diverse grotte sulla piastra di agar con il forcipe; in alternativa, è possibile rendere un'isola di agar in lastra invece di utilizzare tutta la piastra, per ridurre la possibilità della larva strisciando fuori la piastra.
    13. Mettere la piastra in una capsula di Petri 60mm con tessuto umido (imbevuto con soluzione di acido propionico del 0,5%) e la cultura a temperatura ambiente o 25° C.
      Nota: La larva rimarrà allo stadio larvale per circa un giorno extra a temperatura ambiente (22° C) rispetto ai 25° c.
  4. Formazione immagine confocal di alberino-ferita
    1. Immagine la larva ferita a intervalli di tempo desiderato preparando la larva utilizzando la stessa procedura di anestesia e montaggio come in passo 3.2, quindi delle immagini con il laser confocale.
      Nota: Immagine della larva a 24 h dopo la lesione (AI) per confermare la ferita axonal e a 48 h AI (neuroni da classe IV) o 72 h AI (neuroni da di classe III) per valutare la rigenerazione.
    2. Individuare la larva utilizzando l'obiettivo 10x, quindi passa a un 25x (0,8 NA) obiettivo. Riutilizzare il protocollo sperimentale GFP Imaging.
    3. Fare clic sul pulsante Live e trovare il neurone stesso ferito in precedenza.
    4. Impostare le posizioni di Z prime e l'ultima nella finestra di scan in tempo reale. Premere il tasto stop e fare clic su Start sperimentare per acquisire un'immagine dello stack Z.
      Nota: Assicurarsi che un punto di normalizzazione (il punto di convergenza di assone) è incluso quando si acquisiscono immagini in modo che la quantificazione di rigenerazione è possibile (Figura 1, 1F) – questo è discusso ulteriormente nella sezione di analisi di dati.
    5. Passare all'Elaborazione di immagine, selezionare l'immagine appena scattata e generare una proiezione di massima intensità. Salvare il z-stack e l'intensità massima proiezione immagini.

4. analisi dei dati

  1. Elaborare e quantificare le immagini utilizzando il software di imaging o ImageJ.
  2. Quantificazione di rigenerazione assonale nel PNS
    1. Calcolare la percentuale di rigenerazione, che si riferisce alla percentuale di rigenerante assoni tra tutti gli assoni che sono stati lesi. Punteggio ottenuto un assone come rigenerante, purché essa ricresce oltre il sito di lesione.
    2. Misura lunghezza di rigenerazione, che è l'aumento della lunghezza dell'assone. Se quantificare con ImageJ, utilizzare lo strumento Linea segmentata per tracciare l'assone rigenerata e utilizzare misura nel menu a discesa analizza per ottenere la lunghezza della linea che rappresenta l'assone rigenerata.
    3. Calcolare l' Indice di rigenerazione, che è l'aumento della lunghezza dell'assone normalizzato.
      Nota: La lunghezza dell'assone è normalizzato dalla distanza tra il corpo cellulare e l'assone convergenti punto (DCAC) – assone lunghezza/DCAC (Figura 1 e 1F). Questo valore consente di account per qualsiasi crescita assonale che è a causa di ridimensionamento larvale. Un valore positivo rappresenta la rigenerazione, un valore pari a 0 non significa nessuna rigenerazione e un valore negativo significa ritrazione.
  3. Quantificazione di rigenerazione dendrite
    1. Calcolare la percentuale di rigenerazione, che è la percentuale di neuroni da tra tutti quelli reciso che mostrano dendrite evidente ricrescita.
      Nota: Dendrite ricrescita è segnato come positivi se nuovi dendriti ricrescono fuori dallo stelo retratto dendritico e oltre il sito di lesione. Il sito di lesione è determinato da punti di riferimento e in alcuni casi, è facilmente visibile a causa il autofluorescence indotto da lesione residuo.
    2. Calcolare l' aumento dei punti di ramo, che conta l'aggiunta di nuovi punti di ramo dendritico dopo la ferita.
    3. Calcolare l' aumento della lunghezza totale dendrite, che è la lunghezza cumulativa di tutti i nuovi dendriti aggiunto dopo la ferita.
  4. Quantificazione di rigenerazione assonale nel SNC
    Nota: Se un sito di lesione mostra degenerazione nel primo punto di tempo imaged (Figura 3B), potranno essere inclusi nell'analisi della lunghezza di rigenerazione e.
    1. Misura lunghezza di rigenerazione, che è la lunghezza dell'assone ricresciuto.
      Nota: L'assone ricresciuto di un sito di singola lesione è identificato come proviene fuori del percorso di axon originale prima della lesione.
    2. Calcola la lunghezza di rigenerazione normalizzato, che normalizza la lunghezza di rigenerazione per la lunghezza del segmento commessura - la distanza longitudinale tra commissure ("Y" in Figura 3A e 3B).
      Nota: Questo valore aiuta a correggere l'effetto delle differenze di dimensione larvale.
    3. Calcolare il tasso di rigenerazione, che è la percentuale di rigenerante segmenti tra tutti i segmenti che sono stati lesi, in modo da riflettere la capacità di rigenerazione di un particolare genotipo.

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Representative Results

Neuroni da mostrano il differenziale rigenerazione potenziale tra la periferica e del sistema nervoso centrale, come pure la specificità di classe. Questo offre l'opportunità unica di screen per nuovi fattori che sono necessari per la rigenerazione dell'assone (utilizzando la classe lesioni IV PNS), come pure quelli che sono inibitori per la rigenerazione (con lesioni snc di IV classe e classe lesione III PNS).

Rigenerazione assonale nel PNS

Ad esempio, è descritta la caratterizzazione di rigenerazione dei neuroni da classe III e classe IV. Questi neuroni si trovano bilateralmente in ogni segmento del corpo. Più neuroni possono essere feriti nella larva stessa; in genere, 3-4 neuroni nel lato destro dei segmenti addominali A7-A2. Classe III e classe IV da neuroni possono essere visualizzate da 19-12-Gal4, UAS-CD4tdGFP, repo-Gal80 e ppk-CD4tdGFP, rispettivamente. Anestetizzare e montare le larve AEL di 48-72 h come descritto, regolazione della posizione delle larve da neuroni di interesse sono rivolto verso l'alto (Figura 1A e 1B). Noi di solito ferire la classe III ddaF e neuroni di v'ada di classe IV (Figura 1 e 1E). Eseguire assotomia e recuperare le larve come descritto. Subito dopo la ferita (AI), le larve avrà recuperato da chirurgia ed esposizione normale locomozione. Qui il tasso di sopravvivenza è in genere oltre l'80%. Scartare le larve che sono morti o malati. Rimontare il resto come descritto e valutare la degenerazione. A 24 h AI, gli assoni distali necessario avere completato la degenerazione a questo tempo punto19, e il gambo dell'assone sarà prontamente visibile (Figura 1 e 1F). Reimage le larve stesse alle 48 h AI neuroni da di classe IV o 72 h per neuroni da di classe III per valutare la rigenerazione. Solitamente ci proponiamo di valutare almeno 20 feriti i neuroni a condizione sperimentale. In (wild type) WT animali, considerando che in genere circa il 70% da mozzata classe IV i neuroni si sono rigenerati oltre il sito di lesione (Figura 1F), neuroni di classe III da non riuscire a ricrescere, evidenziato dal cono di crescita stallo (Figura 1).

Rigenerazione di dendrite

Eseguiamo solitamente dendriotomy su classe IV da neuroni ddaC (Figura 2A). Come mostrato nel diagramma schematico, il pregiudizio è mirato al punto di ramo dendritico primario. Basato su esperienza, quando ferito a 48 h AEL, ~ 50% dei neuroni ddaC rigenerare loro dendriti (Figura 2B). Nel restante 50%, vicini dendriti invadono e coprono lo spazio vacante. Inoltre, il potenziale di rigenerazione di questi neuroni è ridotto se feriti in una fase inerente allo sviluppo più tardi.

Rigenerazione assonale nel SNC

Per VNC assone lesioni, il tasso di sopravvivenza delle larve varia notevolmente e dipende l'età in cui sono indotto da lesioni. Basato su esperienza, larve di 48-72 h AEL in genere hanno il più alto tasso di sopravvivenza (> 60%) fra le diverse fasi provati. Larve meno di 48h AEL scarsamente sopravvivono dopo la ferita, mentre in quelli più vecchi di 72h AEL è difficile introdurre ferita in VNC. Inoltre, è più facile indurre lesioni ai segmenti commessura posteriore che anteriore, come questi segmenti posteriori del VNC sono più vicine alla superficie ventrale e quindi più accessibili da laser (Figura 3A).

Per ferire assoni di classe IV da neurone nel SNC, montare le larve come descritte in precedenza (Figura 3A). Sotto il microscopio, individuare la scala-come struttura di fasci di assoni che fanno parte del VNC (Figura 3A) ed eseguire assotomia descritta. La degenerazione è confermata a 8 h AI e rigenerazione sono valutati a 24 e 72 h AI. Come illustrato in Figura 3B, assoni a 8 h AI hanno già iniziato a degenerare e a 24 h AI, rigenerazione dell'assone è osservata mentre detriti assone possono ancora essere trovato intorno ai siti di lesione. WT assoni Visualizza limitato ricrescita in VNC e non riescono a ricollegare le lacune generate dalla ferita (Figura 3B). Per quantificare la capacità di rigenerazione degli assoni danneggiati, la lunghezza di ricrescita dopo lesioni sono misurato e la lunghezza del segmento di Commissura (Y nella Figura 3A) viene utilizzato per la normalizzazione (Figura 3).

Figure 1
Figura 1: dalla rigenerazione assonale neurone nella periferia Visualizza specificità di classe. (A e B) Disegno schematico disegno indicante la posizione delle larve. (C) disegno schematico di neuroni da di classe III. (D) assoni di classe III da neuroni ddaF, etichettati con 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80 / +, non riescono a ricrescere. (E) disegno schematico di neuroni da classe IV. (F) assoni della classe IV da neuroni v'ada, etichettati con ppk-CD4-tdGFP / +, ricrescere oltre il sito di lesione. (D, F) La linea rossa indica la lunghezza dell'assone mentre la linea tratteggiata verde segna la distanza tra il corpo cellulare e l'assone convergenti punto (DCAC). Il punto blu segna il punto di convergenza dell'assone. Barra della scala = 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Da rigenerazione di dendrite del neurone. (A) rappresentazione illustrativa dei neuroni da classe IV. (B) rappresentazione illustrativa di rigenerazione di dendrite in classe IV da neurone ddaC, etichettati da ppk-CD4-tdGFP / +. L'ablazione laser è mirato al punto di ramo primario e viene condotta a 48 h AEL. Ad una ferita di 24h AI transection del neurite è confermato, e a 72 h AI rigenerazione viene quantificata. Dendriti dei neuroni ddaC dimostrano notevole ricrescita, con nuovi rami dentritici che spuntano dal fusto reciso per affiancare lo spazio vacante. Vale la pena notare che nuovi rami terminali sono continuamente aggiunti i dendrites illesi in questa fase inerente allo sviluppo. Barra della scala = 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: rigenerazione dell'assone di Da neurone a VNC. (A) disegno schematico di una larva di Drosophila montata su una slitta ed imaged sotto il microscopio. Classe assoni di neuroni da IV in VNC visualizzati una ppk-CD4tdGFP / + della larva. Due segmenti di Commissura candidato sono mostrati nell'immagine ingrandita e il disegno schematico. Ognuno di loro ha due siti di lesione (cerchi rossi). (B) immagini Confocal di un segmento leso imaged a 8, 24 e 72 h dopo la lesione (AI). Linee rosse raffigurano gli assoni ricresciuti. (C) misura e normalizzazione di rinnovabili assoni. Barra della scala = 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Quando attraversa la configurazione di volo, il numero di femmine e maschi utilizzati può variare a seconda dei genotipi e il numero di larve necessarie per gli esperimenti specifici. Per le mosche WT, tipica croce utilizza 10 femmine e 5 maschi. La finestra di raccolta può essere ristretta, a seconda della precisione dell'età larve. Ad esempio, un periodo di 2 h raccolta produrrà le larve di una popolazione più omogenea. In questo caso, utilizzando 20 o più vergine femmine per impostare le croci aiuterà a produrre uova sufficienti. La resa dal primo giorno è generalmente scarsa, così raccogliere la piastra con le uova di due o più giorni dopo l'impostazione della camera. Quando ulteriore coltura la piastra con le uova, si consiglia di immergere il tessuto nella capsula di Petri 60mm in 0,5% soluzione di acido propionico invece di acqua, che non solo aiutano a mantenere l'umidità nel piatto, ma anche evitare la crescita di muffe.

Quando si impostano i dispositivi per anestesia di larve e di montaggio, assicurarsi di utilizzare un piatto di vetro perché etere si scioglierà attraverso materie plastiche. Il piatto di vetro è ospitato in una capsula di Petri in caso di una perdita di plastica 15 cm. La carta velina aiuta a preservare etere nel piatto in modo che la larva può essere eliminata efficacemente dai vapori di etere. È consigliabile utilizzare ambra cadere bottiglie per conservare le aliquote di etere e l'aggiunta di etere in goccioline con il contagocce di vetro. Ricostituire l'etere e mantenere sempre uno strato di etere liquido nella parte inferiore del piatto per un effetto ottimale.

I tempi di esposizione di etere è critico: sotto anestesia porterà al recupero della larva nel mezzo della sessione di imaging e traballante immagini; un sovradosaggio di anestesia, o il contatto diretto con il liquido di etere, causerà la letalità. Per massimizzare la sopravvivenza e tasso di successo, la nostra regola è la seguente: PNS ferita/imaging, per estrarre la larva appena la coda ferma spasmi muscolari; per il sistema nervoso centrale, attendere fino a quando la larva intera diventa immobile, soprattutto i segmenti di testa. Anche un lieve movimento interferirà con la ferita e la formazione immagine degli assoni VNC. Larve più anziani tendono a prendere più tempo per mettere fuori combattimento. Prende solitamente meno di 2 min per larve più giovani di 72h AEL e 2-5 min per larve di età superiore a 72 h AEL.

Quando si imposta l'intensità del laser due fotoni per infortunio, il valore è determinato dal segnale di fluorescenza del tessuto ottenuto dalla scansione "Live". Il pregiudizio è stato introdotto dall'esplorazione di "Continuo" come descritto al punto 3.3. L'aumento di fluorescenza indotta da lesione è dovuto autofluorescence al sito di lesione e serve come un buon indicatore di distacco del neurite. In genere, ci vogliono 1-10 s per vedere il picco di fluorescenza. È fondamentale per controllare il tempo di scansione una volta che è elevata fluorescenza. Per la ferita PNS, è essenziale per interrompere immediatamente la scansione. L'esposizione prolungata sarà ingrandire il sito di lesione e danneggiare i tessuti vicini. Tuttavia, questo fornisce la possibilità di regolare il tempo di scansione e manipolare la gravità della lesione. Una ferita di successo deve avere un diametro di dimensione di lesione più piccolo di 3-4 μm. Per la ferita dell'assone VNC, gli assoni VNC sono incorporati molto più profondo rispetto al neurone da PNS assoni/dendriti, che sono proprio sotto la pelle e quindi richiedono maggiore intensità del laser. Di solito lasciamo la scansione su per pochi secondi. Questo è per garantire che il pacchetto intero assone è interrotta. Se il raggio dei siti di lesione è più di metà della larghezza del fascio commessura, tali siti di lesione sono contati come non riusciti. Tali larve hanno un basso tasso di sopravvivenza e non verranno incluso nell'analisi.

Per la rigenerazione dell'assone, la capacità di rigenerazione è simile attraverso stadi larvali. Ma per la rigenerazione di dendrite dopo un taglio singolo dendrite, il potenziale di rigenerazione è ridotta dopo 72 h AEL19. Così, lesioni dell'assone sono in genere effettuato a 48h - 72h AEL e dendrite lesioni a 48h AEL, con la valutazione della rigenerazione a 120h AEL. Larve di 24h AEL possono anche essere usate, ma richiedono una gestione più attenta, data le loro dimensioni più piccole. Le larve si impupano dopo 120H AEL, rendendo più impegnativo di imaging. Pertanto, il nostro endpoint è solitamente 120 h AEL.

Qual è la correlazione fra degenerazione e rigenerazione? Per lesioni PNS, alle 24h AI, normalmente distale dell'assone/dendrite in WT ha completato degenerazione Walleriana, mentre la rigenerazione non è avviato a questo punto del tempo. Di conseguenza, crediamo che nelle larve WT, degenerazione dei neurites mozzata solo ha un impatto molto limitato sulla rigenerazione, se non del tutto. Per la ferita VNC, assoni a 8 h AI hanno già iniziato a degenerare e a 24 h AI, rigenerazione dell'assone è osservata mentre i detriti dell'assone potrebbero ancora essere trovato intorno ai siti di lesione. I detriti non sembrano bloccare la rigenerazione. Tuttavia, è possibile che in determinate circostanze, ci può essere una sovrapposizione o persino una diafonia fra degenerazione e rigenerazione. In realtà, è stato segnalato che in topi invecchiati, la clearance di detriti dopo danno periferico del nervo è più lento di quello in animali giovani. Simultaneamente, più lento reinnervazione della giunzione neuromuscolare è stato osservato, che può essere attribuito per il maggior numero di ostruzioni rigenerante assoni incontro nei vecchi animali. Sorprendentemente, tuttavia, gli assoni da animali invecchiati rigenerano rapidamente e reinnervate siti di giunzione neuromuscolare in modo efficiente quando non si confronta con detriti32. Ciò suggerisce che facilitare la clearance di detriti potrebbe essere una strategia potenziale per promuovere la rigenerazione.

Rispetto ad altri modelli di neurorigenerazione, il modello di lesione volare neurone sensoriale ha vantaggi unici. Modelli murini di solito richiedere settimane a mesi per eseguire e non sono adatti per lo svolgimento di schermi genetici su larga scala; C. elegans ha solo un sistema nervoso centrale primitivo, che non può strettamente ricapitolare le barriere di rigenerazione nel SNC dei mammiferi; diverso da mammiferi, assoni CNS zebrafish rigenerano robustamente. Il rapido ciclo di vita delle mosche, la versatilità della genetica Vola, accessibilità e stereotipata patterning di assoni/dendriti dei neuroni sensoriali volare e le proprietà di rigenerazione caratteristici dei neuroni sensoriali volare – sottotipo specifico rigenerazione nella PNS e limitata rigenerazione nel SNC – rendono Drosophila neuroni da un modello interessante per lo studio della neurorigenerazione. Inoltre, gli studi recenti da cellule di topo schiacciato retiniche del ganglio (RGCs) suggeriscono anche che i sottotipi neuronali bear competenza distinte rigenerazione; alcuni sottotipi RGC possono rigenerare, mentre altri in bundle il nervo apparentemente omogeneo non riescono a ricrescere33. Questa importante scoperta suggerisce che un neurone tipo specifiche strategie dovrebbero essere sfruttate per promuovere la rigenerazione e recupero funzionale e sostiene fortemente che l'induzione di danno dell'assone e analisi successiva rigenerazione deve essere eseguita un modo specifico del sottotipo neuronale. Inoltre, i determinanti molecolari e cellulari per questo tipo di rigenerazione-specificità rimangono in gran parte sconosciuto19,33. Di conseguenza, il modello di lesione del neurone da offre il paradigma ideale per affrontare questi problemi.

Rispetto alla rigenerazione dell'assone, studi sulla rigenerazione di dendrite di messa a fuoco sono molto scarsi. Dendrite ferita accadere, come trauma cranico, ictus e molte forme di neurodegenerazione, ancora non si sa quasi nulla circa la capacità dei dendriti per riparare e riformare connessioni neurali. Il modello di lesione del neurone da nuovo fornisce un sistema altamente accessibile che visualizza patterning stereotipata, specificità di classe e regolazione temporale19, per esplorare questa direzione.

Vale anche la pena ricordare che mentre è possibile ferire un singolo assone con etichettato nel PNS, l'infortunio di modo viene eseguita nei risultati della CNS nella lesione di un fascio di assoni. Se lo si desidera, MARCM34 o l'approccio di35 clone FLP-out può essere utilizzato per etichettare singoli assoni nel SNC. Inoltre, quando le cellule gliali sono etichettate simultaneamente con mRFP (Repo-Gal4, UAS-mRFP), l'accumulo di processi glia è osservato in particolare al luogo della lesione. Inoltre, l'espressione di Ptp99A, l'omologo di volare di condroitina solfato proteoglicano (CSPG) Fosfacano / PTPRZ1, è up-regolato al luogo della lesione. Ptp99A co-localizza con cellule gliali e circonda il sito di lesione, formando una struttura simil-anello simile a quello che è stato segnalato per le cicatrici astroglial in mammiferi19,36,37. In conclusione, il modello di lesione del neurone da, quando combinato con marcatori di altri tipi cellulari come cellule gliali o cellule del sistema immunitario, permetterà in vivo sorveglianza in tempo reale delle interazioni pluricellulari tra un neurone ferito e i suoi dintorni ambiente.

Mentre questo modello di lesione del neurone sensoriale larve di Mosca ci offre l'opportunità di trovare potenziali regolatori di neurorigenerazione sia nel PNS e CNS, ha ancora diverse limitazioni. In primo luogo, non si tratta di throughput elevato nella fase attuale. In genere, 5-6 genotipi potrebbero essere proiettati da una sola persona in una settimana. Ha bisogno di essere ottimizzato al fine di eseguire una schermata imparziale. In secondo luogo, come l'anestesia etere sulle larve può durare da diversi minuti a non più di venti minuti, non è ottima per l'imaging a lungo termine. Così, intervalli di tempo specifici che sono rispettivamente rappresentante dell'assone degenerazione e rigenerazione sono scelti per l'imaging. In terzo luogo, anche se questo protocollo sta introducendo un modo per ferire gli assoni precisamente, la possibilità di danni ai tessuti circostanti non può essere completamente eliminata. In VNC, questi tessuti possono essere cellule gliali, gli assoni e dendriti di altri neuroni. Per ridurre al minimo questo avvertimento potenziale, ridurre al minimo i siti di lesione, applichiamo il più basso possibile di potenza laser ed eseguire le stesse procedure in parallelo sia controllare e sperimentare gruppi. In quarto luogo, nel processo di creazione il paradigma di lesioni del CNS, siti di diverse lesioni sono stati testati, compresi i siti vicino a termini dell'assone che abbiamo scelto di utilizzare e il punto di ingresso degli assoni in VNC. I punti di ingresso sono stati trovati per essere più difficile da ferire perché sono più profonde nel tessuto e più probabile che spostare. Così, per questi motivi pratici, optiamo per il metodo corrente, che è più coerente e meglio controllati bene per esperimenti su larga scala. Una preoccupazione potenziale, come detto sopra, è la possibilità di ferire i tessuti vicini, come i componenti postsinaptici e cellule gliali. D'altra parte, è un eccezionale domanda come i tessuti circostanti danneggiati influenzano la degenerazione e la rigenerazione degli assoni. Ad esempio, come la cicatrice gliale colpisce la rigenerazione assonale. Questo presenta un altro motivo perché il nostro modello di lesione può assomigliano molto modelli di lesione nei mammiferi, in cui gli assoni e dei tessuti intorno ai siti di lesione solitamente sono feriti simultaneamente.

Laser lesione seguita da microscopia time-lapse è un test sensibile per lo studio della rigenerazione dell'assone/dendrite. Tuttavia, una preoccupazione principale di questo test è il costo percepito, che spazia da <$ 10K per i laser di fascia bassa impulso allo stato solido, $25-100K per laser a femtosecondi per >$ 100K per laser a due fotoni. Ci sono diverse buone discussioni su sistemi laser diversi utilizzati per assotomia29,38,39,40,41,42,43, 44 , 45. per riassumere, laser convenzionali sono ottimali per gli assoni di taglio all'interno di circa 30-50 µm dalla superficie. Ci saranno ulteriori danni collaterali con i laser secondo nano e pico, confrontato con il laser a femtosecondi, tanto più aumenta la profondità dell'area target45. Per ferire gli assoni in VNC, la profondità di cui è in genere circa 50-100 µm, è essenziale per ridurre al minimo i danni ai tessuti. In questo caso, il laser del due-fotone è ideale, che si concentra la potenza del laser per il piano focale, riducendo il danno collaterale del tessuto senza compromettere penetrazione tissutale. In conclusione, il sistema del due-fotone è costoso ma offre la migliore conservazione del tessuto e di precisione. Tuttavia, se solo gli assoni PNS sono il bersaglio per assotomia, laser a impulso convenzionale può essere un'alternativa più conveniente.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo Jessica Goldshteyn per il supporto tecnico. Lavoro in laboratorio canzone è finanziato dalla sovvenzione NIH R00NS088211 e intellettuale e disabilità dello sviluppo Research Center (IDDRC) nuovo programma Development Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous Acros Organics AC615080010
Halocarbon 27 Oil Genesee Scientific 59-133
Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L VWR 97062-948 
Agar powder, Alfa Aesar, 500GM VWR AAA10752-36
Grape juice Welch’s
Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%) VWR 64-17-5
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
Propionic Acid J.T.Baker U33007
Cover Glasses: Rectangles Fisher Scientific 12-544-D 50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope Zeiss
Zen software Zeiss
Chameleon Ultra II Coherent

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Li, D., Li, F., Guttipatti, P., Song, Y. A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System. J. Vis. Exp. (135), e57557, doi:10.3791/57557 (2018).

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