Summary
Здесь мы представляем протокол, с помощью дрозофилы сенсорного нейрона - дендритных арборизация (da) нейронных травмы модель, которая сочетает в себе в естественных условиях живут изображений, два фотона лазерного axotomy/dendriotomy и мощный летать генетических элементов, как Платформа для отбора потенциальных промоутеров и ингибиторов neuroregeneration.
Abstract
Количество поврежденных нейронов отрастания управляет neuroregeneration и функциональное восстановление после травмы нервной системы. За последние несколько десятилетий были определены различные внутренние и внешние ингибирующих факторов в ограничение регенерации аксона. Однако просто удалив эти ингибирующих сигналов недостаточно для успешной регенерации, указывающие на дополнительные механизма регулирования. Drosophila melanogaster, плодовая муха, разделяет эволюционно сохранены генов и сигнальных путей с позвоночных животных, включая человека. Сочетание мощного генетических элементов мух с двух фотона лазерного axotomy/dendriotomy, мы опишем здесь дрозофилы сенсорные нейрон – дендритных арборизация (da) модель нейрона травмы как платформы для систематического досмотра для Роман Регенерация регуляторы. Вкратце эта парадигма включает в себя) подготовку личинки, индукция b) поражением dendrite(s) или axon(s) с использованием двух фотона лазерного, c) живой конфокальный изображений после травмы и d) анализа данных. Наша модель позволяет высокую воспроизводимость травмы одного помечены нейронов, аксонов и дендритов четко определенных нейронов подтипы, в периферической и центральной нервной системы.
Introduction
Неспособность аксоны восстанавливаться после травмы центральной нервной системы (ЦНС), может привести к постоянной инвалидности в больных, а также играет роль в необратимое неврологического дефицита в нейродегенеративных заболеваний1,2 ,3,4,5. CNS окружающей среды, а также способность внутреннего роста нейронов, определяет ли аксоны способны восстанавливаться после травмы. Было показано, что внеклеточных факторов от олигодендроциты, астроглиальных и фибробластический источников препятствуют нейрональных роста4,6,7,8, но ликвидации этих молекул разрешает только для ограниченной прорастания5. Внутренней регенерации сигналы могут влиять регенеративной успеха5,9 и представляют потенциальных терапевтических целей, но эти процессы еще не четко на молекулярном уровне. Увеличение трофического фактора сигнализации или ликвидация эндогенных тормоза, например Pten фосфатазы10, может привести к аксональное регенерации в определенных обстоятельствах. Комбинации различных методов оказывается индивидуально эффективной обеспечивают также только ограниченное общее восстановление на сегодняшний день11,12,,1314. Таким образом есть отчаянная необходимость определить дополнительные пути для целенаправленной терапии. Помимо начала отрастания аксона ли и как аксоны повторно провод правильную цель, реформы синапса специфичность и добиться восстановления функций являются важные нерешенные вопросы.
Таким образом нынешнее понимание механизма, диктуя регенерации аксона до сих пор весьма фрагментарно. Частью проблемы является технической сложности изучения аксона регенерации в организме млекопитающих в режиме реального времени, подход, который является дорогостоящим, длительным и сложным для проведения крупномасштабных генетических экраны. Drosophila melanogaster, с другой стороны, оказалась исключительно мощные системы для изучения сложных биологических вопросов. Плодовая муха сыграла важную роль в определении генов и сигнальные пути, которые поразительно сохраняются в организме человека и была успешной моделью для изучения человека условий, таких как нейродегенеративных заболеваний, через инструменты огромной молекулярной генетики доступно для манипулирования генов функция15. В частности дрозофил считаются идеальным инструментом для обнаружения генов, участвующих в нейронных травмы и отрастания15,16. Были разработаны несколько моделей летать нейронных травмы, включая взрослых руководитель или личинок воспалении брюшины шнур (VNC) ножом с иглами, личинок VNC или раздавить нерва с щипцами, личинок нейрон лазер axotomy, удаление нейрон обонятельного рецептора, мозг эксплантов травмы, и поражения периферических нервов, крыло выходное15,17,18,19,20,21,,2223. Возбуждающе последние работы используя дрозофилы травмы модели продвинули наше понимание клеточной и генетической путей, используемых в нервной системе реагировать нейронных травмы, некоторые из которых было показано, быть сохранены в млекопитающих24 ,25. Опять же это подчеркивает полезность этой модели организма для определения новых механизмов нейронных ремонта.
Описанные здесь — это двух Фотон лазерных дрозофилы личиночной сенсорных нейронах травмы модель. Двух фотона лазерного был впервые использован для резки аксоны в zebrafish в естественных условиях в 2003 году26. В том же году первый dendriotomy лазера была исполнена в дрозофилы с помощью лазерной импульсной азота27. Вскоре после этого несколько C. elegans лаборатории используется для определения модели регенерации аксона28фемтосекундных лазеров. В 2007 году Ву и коллеги по сравнению и сообщил различия между лазерной травм в C. elegans индуцированных различные виды лазеров29. В 2010 году регенерации аксона после лазерной axotomy был впервые показан в дрозофилы30. Опираясь на эту литературу травмы обширная лазерная, мы разработали модель fly нейронных травмы с помощью двух Фотон лазер, который позволяет точно индукции травмы на целевые сайты с минимальными возмущений соседних тканей, обеспечивая относительно чистым системы для изучения внутренние и внешние свойства neuroregeneration с одной ячейкой резолюции. В частности, мы создали набор методов травмы для сенсорных нейронов дендритных арборизация (da) в обоих периферической нервной системы (ПНС) и ЦНС. Да нейроны могут быть сгруппированы в четыре различных класса, главным образом отличают их сложности разветвления дендритов: класс I до IV31. Наша опубликованные работы показывает, что да нейрон регенерации напоминает млекопитающих травмы модели на фенотипическую и молекулярном уровне: Да нейронов отображать свойства класса конкретных регенерации, с класса IV, но не класса I или III да нейронов экспонируется регенерации в ПНС; Класс IV да нейрон аксоны регенерировать надежно на периферии, но их регенеративный потенциал резко сократилось в ЦНС, таким образом, напоминающие Спинной корень нейроны ганглии (DRG) млекопитающих; повышение активности mTOR через Pten удаления или Akt гиперэкспрессия способствует регенерации аксона в лету ЦНС19. Используя эту модель травмы, мы выполняют генетических экраны и определили обработки фермент РНК Rtca как эволюционно сохранены тормозящий фактор для регенерации аксона, связывание аксона травмы клеточного стресса и изменения РНК20 .
В представленных парадигме травмы индуцируется через лазерной axotomy/dendriotomy личинок класса IV или III да нейронов, обозначены ППК CD4-tdGFP или 19-12-Gal4, бас-CD4-tdGFP, репо Gal80, соответственно. Травмы осуществляется на 2-й до 3rd instar личинок на около 48-72 ч после откладки яиц (h AEL). Для ПНС axotomy поражения предназначена для секции аксона ~ 20-50 мкм от клеток тела, для ЦНС axotomy площадью ~ 20 мкм в диаметре на стыке спайки в VNC и dendriotomy точки первичных дендритных филиала. Же нейрон отображаемого в 8-24 ч после травмы (AI), для подтверждения полного перерезка и на 48-72 ч AI для оценки регенерации. Через промежуток времени конфокальная томография, со временем может контролироваться дегенерация и регенерации отдельных аксоны/дендритов, которые были потерпевшего в естественных условиях .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка культуры пластин и бутылки
- Подготовка плиты агара виноградного сока
- Добавьте 10 g агар порошок, 200 мл виноградного сока и 192 мл ddH2O в стакан и СВЧ для около 4-5 мин, помешивая периодически до тех пор, пока полностью не растворится агар.
- В Зонта охладьте вниз решение около 60 ° C. Добавление 4.2 мл этанола 95% и 4,0 мл уксусной кислоты кристаллизированной. Отрегулируйте общий объем раствора до 400 мл с ddH2O. Mix хорошо.
- Для каждой пластины 35-мм добавьте около 2-3 мл раствора. Сделайте около 120-150 пластины для в общей сложности 400 мл раствора агар виноградный сок.
- Ждать 10 минут для охлаждения плит и затвердеть агар решение. Пакет виноградный сок плиты агара в самостоятельной запечатанном ziplock мешки и хранить при 4 ° C для использования в будущем.
- Подготовка дрозофилы культуры бутылок
- Используйте лезвия ударить стороне 1,5 см Длина треугольной отверстие на одной стене дрозофилы культуры бутылки и заполнить отверстие с 2-2,5 см диаметр шар хлопка для вентиляции.
- Подключите бутылку с табличкой агар виноградный сок, дополнена около 0,5 см3 пасты дрожжей.
2. сбор личинок дрозофилы
- Настройка кресты взрослых мух
- 10 место девственной женщины и 5 взрослых мужчин летит вместе в бутылке культуры, подключено с тарелкой агар виноградный сок.
- Поместите дно бутылки при 25° C, так что мухи будет откладывать яйца на тарелке агар виноградный сок. Измените пластину с пастой из дрожжей по крайней мере один раз в день. На период 2-h коллекции, который позволяет уборки личинки однородных стадии развития, начните с более чем 20 девственной женщин и 10 мужчин на этапе 2.1.1.
- Культура пластины при 25° C в чашке Петри 60-мм с влажной ткани, например, смоченной в растворе пропионовой кислоты 0,5%. Организовать ткани, так что он не блокирует поток кислорода.
Примечание: Пропионовой кислоты раствор используется для поддержания влажности в блюдо и избежать рост плесени.
- Личинки урожая определенного возраста
- Используйте пару щипцы для переноса личинок желаемого стадии, например, 2-й до 3rd instar личинок в 48-72 ч после откладки яиц (AEL), к новой пластинкой агар виноградный сок без дрожжей пасты.
- Удаление дрожжей из личинки кожи, позволяя им обхода вокруг на новой пластины, чтобы предотвратить потенциальные вмешательства дрожжей с лазерной axotomy и изображений. Кроме того тщательно очистите личинки, мыть их в блюдо PBS и сушки кратко на кусок оберточной бумаги.
3. два Фотон травмы и конфокальная томография
- Настройка микроскопа
Примечание: Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп с двух фотона лазерного был использован для эксперимента, но другие системы с эквивалентной установки также будет достаточно. Двух Фотон лазер (930 Нм) использовался для доставки травмы и Аргонового лазера (488 нм) был использован для конфокальная томография GFP.- В начале каждой сессии, включите два фотона лазерного или конфокальной laser(s) и Микроскоп. Откройте изображений программное обеспечение.
- Для двух Фотон травмы, установите следующие параметры для визуализации GFP с двух Фотон лазера на 930 Нм (1950 МВт).
- Выберите режим сканирования линии. Откройте всю дорогу обскуры. Увеличение интенсивности лазерного ~ 20% (390 МВт).
- Выберите 512 x 512 как кадр сканирования. Используйте максимальный скорость сканирования (обычно с пиксель продолжительность на 0,77 МКС). Убедитесь, что среднее число 1 и разрядность 8 бит.
- Усиления ~ 750, и смещение до 0.
- Сохранить этот предварительный набор экспериментальный протокол как 2 P GFP 930 абляции, что позволяет легко использовать повторно в будущем экспериментов.
- Для конфокальная томография, установите следующие параметры для визуализации GFP с Аргонового лазера на 488 нм:
- Выберите вкладку приобретения и затем Z-стека.
- Под «лазер» включите питание для 488 нм Аргонового лазера.
- Перейти в каналы, выберите лазер 488 мм и увеличить мощность лазера до 5-10%. Для точечным Используйте светлые блок 1-2 (АС). Отрегулируйте усиление до 650.
- В Режиме приобретениявыберите 1024 x 1024 сканирования кадра, используйте максимальную скорость, среднее количество 2 и разрядность 8 бит.
- Сохраните этот предустановленных экспериментальный протокол как GFP Imaging.
- Личинки анестезии с диэтиловым эфиром и монтажа
- В Зонта Поместите блюдо 60-мм стекла в 15-см пластиковой чашке Петри. Складки и кладут кусок оберточной бумаги в нижней части стекла блюдо, затем поместите плита агара виноградного сока на ткани. Добавьте диэтиловый эфир в стеклянную посуду, до точки, где папиросной бумаги промокли и есть слой жидкого эфира, оставаясь в блюдо. Держите крышку на на все времена.
- Подготовка стекла слайд с одной капли галоидоуглеводородов 27 нефти в центре. Добавьте 4 пятна вакуумных смазки на четырех углах слайда, чтобы позднее поддержки coverslip.
- Используйте корнцанг подобрать larva уборка и поместите его на плите агар в 60-мм стеклянную посуду. Обложка блюдо стекла с крышкой и подождать до тех пор, пока личинка перестает двигаться. Для ПНС травмы/изображений как только его хвост останавливается твичинг вывезти личинка. Для ЦНС, подождите, пока весь личинка становится неподвижно, особенно головы сегментов.
Примечание: Время эфира воздействия имеет решающее значение. См. - Тщательно подобрать наркотизированных личинка и поместите его голову в вертикальном положении в каплю масла галоидоуглеводородов на слайде. Добавьте coverslip поверх слайда. Используйте нежное давление надавите на coverslip, пока он не коснется личинка (рис. 1A).
- Отрегулируйте положение личинка нажатием нежно coverslip к левой или правой ролл личинка, так, что нейрон/аксона/дендритов интерес на вершине и ближе к объектива микроскопа.
- Для ПНС травмы смонтируйте личинка спинной стороне вверх, так что видны оба трахеи. Затем ролл личинка ~ 30 градусов влево для класса III да нейрон аксоны (рис. 1B и 1 C), 90 градусов для ранив класса IV да нейрон аксоны (рис. 1B и 1E) или ~ 30 градусов для ранив дендритов нейронов () класса IV да Рисунок 2A).
- Для травмы ЦНС положение личинка быть совершенно вентральной стороне вверх (рис. 3A), так что региона интерес ближе к объектива микроскопа в плоскости z.
- Травмы, два фотона лазерного
- Поместите слайд с личинки под микроскопом и закрепите его на месте с слайд владельца на сцене. Цель использования 10 X (0,3 NA) чтобы найти личинки.
- Переход к 40 X (1.3 NA), добавьте 1 каплю объективных масла на coverslip цель и настроить фокус.
- Переключитесь в режим сканирования и повторно использовать экспериментальный протокол 2 P GFP 930 абляции. Убедитесь, что отверстие открыт всю дорогу.
Примечание: Настройки необходимо быть оптимизированы на основе индивидуальных систем. - Запустите режим Live найти региона интерес (ROI) и тонкую настройку параметров для достижения хорошее качество изображения с соответствующим увеличением.
Примечание: Цель этого шага заключается в том, чтобы найти нейрон/аксона/дендритов травмировать, а не принимая лучшее качество изображения. Таким образом используйте минимальные параметры достаточно, чтобы визуализировать целевой области, с целью избежать чрезмерного или Фотообесцвечивание. - Остановите проверку Live , таким образом, чтобы кнопка культур станут доступны. Пусть все еще изображения служат в качестве «дорожной карты». Выберите функцию культур и настроить окно сканирования сосредоточиться на цели получают ранения.
- Сокращение ROI будет размер потенциальных сайта травмы. Например просто перекрывать ширину аксон или дендритов, для обеспечения точности травмы и уменьшать ущерб, наносимый соседние ткани. При желании, увеличьте рентабельность перед кадрированием, позволяет для более точного травмы.
- Откройте новое окно визуализации. Уменьшить скорость сканирования и увеличения интенсивности лазера. Определите увеличение интенсивности лазера на основе сигнала флуоресценции ткани, проверяемых в режиме Live .
- Как правило задайте два фотона лазерного света, начиная с 25% для ПНС травмы и 50-100% для VNC травмы. ПНС аксона травмы, убедитесь, что интенсивность лазерного ~ 480 МВт и пиксель время задержки является 8.19 МКС. Для VNC аксона травмы обеспечить продолжительность лазерной интенсивности и пикселей обычно 965-1930 МВт и 8.19-32.77 МКС, соответственно.
- Начало непрерывного сканирования. Оставьте курсор при наведении на кнопку непрерывно . Храните закрыть глаза на изображении и остановить сканирование, как только наблюдается резкое увеличение флуоресценции.
Примечание: Внешний вид пика флуоресценции обусловлено auto флуоресценции в месте травмы. - Переключитесь обратно в режим Live путем повторного использования параметров. Найти область интереса, который только что был мишенью фокусировки.
Примечание: Хорошим показателем успешной травмы является появление небольшой кратер, кольцо как структура или локализованные мусор прямо на месте травмы. - Перейти к следующему нейрон и повторите шаг 3.3.5, нанести несколько нейронов в одном животном. Или повторить шаг 3.3.5 при постепенно увеличить мощность и/или снижение скорости сканирования, если первоначальной травмы был недостаточным.
Примечание: В случае, что мощность лазера является слишком высокой, большой поврежденной области будет в изображении живой сканирования после травмы. Слишком много травмы может привести к смерти личинка. - Восстановите личинка, тщательно удалив coverslip и передачи потерпевшим личинка на новую пластину с пастой из дрожжей. Дитч несколько пещер на пластину агар с щипцами; Кроме того сделать остров агар в пластину вместо целую тарелку, чтобы уменьшить возможность обхода из плиты личинка.
- Положите пластину в чашке Петри 60-мм с мокрой ткани (смоченной 0,5% пропионовой кислоты) и культуры при комнатной температуре или 25° C.
Примечание: Личинка останется в личиночной стадии приблизительно дополнительный день при комнатной температуре (22° C) по сравнению с 25° c.
- После травмы конфокальная томография
- Изображения раненых личинка в нужное время точках путем подготовки личинка, используя ту же процедуру анестезии и монтажа как 3.2 шаг, затем изображений с Конфокальная лазерная.
Примечание: Изображение личинка на 24 ч после травмы (AI) для подтверждения аксональное травмы и 48 h AI (класс IV да нейроны) или 72 h AI (класс III да нейроны) оценить регенерации. - Найдите личинка, используя цель 10 X, а затем переключиться на 25 X (0.8 NA) цели. Повторное использование экспериментальный протокол, GFP Imaging.
- Нажмите кнопку Live и найти же нейрон, ранены ранее.
- Установите первый и последний Z позиции в окне живой сканирования. Нажмите кнопку stop и нажмите кнопку начать эксперимент получить изображение Z-стека.
Примечание: Убедитесь, что нормализации (точка аксон сходящихся) включен, когда захват изображения так, что количественная оценка регенерации возможен (рис. 1 d, 1F) – этот вопрос обсуждается более подробно в разделе анализ данных. - Переключиться на Обработке изображений, выберите изображение, только что принятым и генерировать проекция максимальной интенсивности. Сохраните как z стека, так и максимальной интенсивности проекции изображения.
- Изображения раненых личинка в нужное время точках путем подготовки личинка, используя ту же процедуру анестезии и монтажа как 3.2 шаг, затем изображений с Конфокальная лазерная.
4. анализ данных
- Процесс и количественно изображений с помощью программного обеспечения обработки изображений или ImageJ.
- Количественная оценка регенерации аксона в ПНС
- Вычислите процент регенерации, которая относится к % регенерации аксоны среди всех аксонов, которые были пораженного. Оценка аксон как регенерирующее, пока он отрастает за пределами места повреждения.
- Мера длины регенерации, которая является увеличение длины аксон. При количественной оценке с ImageJ, инструмент Сегментирована линия проследить регенерации аксона и использовать меру в раскрывающемся меню Analyze для получения длины строки, представляющие регенерации аксона.
- Рассчитайте Индекс регенерации, которая является увеличение длины нормализованных аксон.
Примечание: Длина Axon нормируется расстояние между тела клетки и аксон, сходящихся точки (DCAC) – Длина/DCAC аксона (рис. 1 d и 1F). Это значение позволяет учетной записи для любого аксональное роста, что обусловлено личиночной масштабирования. Положительное значение представляет регенерации, значение 0 означает не регенерации и отрицательное значение означает втягивание.
- Количественная оценка дендритов регенерации
- Рассчитайте процент регенерации, что процент нейронов да среди всех тех, кто разорвала показывают очевидных дендритов отрастания.
Примечание: Dendrite отрастания оценивается как позитивные, если новые дендритов вырастить из от отозванные дендритных стволовых и за пределами места повреждения. Места повреждения определяется, достопримечательности и в некоторых случаях, легко видимый из-за остаточного травмы индуцированной аутофлюоресценция. - Рассчитайте увеличение точек филиала, который подсчитывает добавлением новых точек дендритных филиала после травмы.
- Рассчитайте увеличение длины всего дендритов, который является совокупный длина всех новых дендритов, добавлены после травмы.
- Рассчитайте процент регенерации, что процент нейронов да среди всех тех, кто разорвала показывают очевидных дендритов отрастания.
- Количественная оценка регенерации аксона в ЦНС
Примечание: Если сайт поражения показывает дегенерации в первой точке времени, отображаемого (рис. 3B), она будет включена в анализ регенерации длины и скорости.- Мера длины регенерации, который является длина немного отрастут аксон.
Примечание: Немного отрастут аксона одного поражения сайта определяется как она исходит от первоначального маршрута аксона до травмы. - Рассчитайте Длина нормализованные регенерации, которая нормализует регенерации Длина Длина сегмента спайки - продольное расстояние между спаек («Y» в рисунке 3а и 3Б).
Примечание: Это значение помогает устранить эффект личиночной размер различия. - Вычислить скорость регенерации, что процент регенерировать сегментов среди всех сегментов, которые были пораженного, чтобы отразить регенеративная способность конкретного генотипа.
- Мера длины регенерации, который является длина немного отрастут аксон.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Да нейронов шоу дифференциального регенерации потенциал между периферической и центральной нервной системы, а также специфики класса. Это обеспечивает уникальные возможности для новых факторов, которые требуются для регенерации аксона (с помощью класса IV PNS травмы), а также те, которые ингибирующее для регенерации (с травмы ЦНС IV класса и класса III PNS травмы).
Регенерации аксона в ПНС
В качестве примера описан характеристика регенерации класса III и класса IV да нейронов. Эти нейроны расположены на двустороннем уровне в каждом сегменте тела. Несколько нейронов может быть ранен в же личинка; как правило 3-4 нейронов в правой части брюшной полости сегментов A7-A2. Класс III и класса IV да нейроны могут быть визуализированы на 19-12-Gal4, бла-CD4tdGFP, репо Gal80 и ППК CD4tdGFP, соответственно. Анестезировать и смонтировать 48-72 ч AEL личинки, как описано, регулируя положение личинок, так что да нейронов интерес вверх (рис. 1A и 1B). Мы обычно травмировать ddaF класса III и IV класса v'ada нейронов (Рисунок 1 c и 1E). Выполнить axotomy и восстановить личинки, как описано. Вскоре после травмы (AI) личинки будет оправились от хирургии и выставку нормального передвижения. Выживаемость здесь, как правило, составляет более 80%. Выбросите личинки, которые являются мертвыми или больными. Перемонтировать остаток, как описано и оценить дегенерации. 24 h AI дистальной аксоны должны завершить дегенерации в это время пункт19, и аксон стволовых будет легко видимой (рис. 1 d и 1F). Reimage же личинки на 48 h AI для класса IV да нейронов или 72 h AI для класса III да нейронов оценить регенерации. Мы обычно направлены на оценку по меньшей мере 20 раненых нейронов в экспериментальной условие. В WT (дикого типа) животных, тогда как обычно ~ 70% да разорвала класса IV, которую нейронов будет заново за пределами места повреждения (Рисунок 1F), класс III да нейроны не вырастить, свидетельствует рост конуса сваливания (рис. 1 d).
Дендритов регенерации
Мы обычно выполняют dendriotomy на класс IV да нейронов ddaC (рис. 2A). Как показано в схематической диаграмме, травмы пристрелно к точке первичного дендритных филиала. Основываясь на опыте, когда травму на 48 ч AEL, ~ 50% ddaC нейронов регенерировать их дендритов (рис. 2B). В оставшиеся 50% соседних дендритов вторгнуться и охватывают вакантных площадей. Кроме того потенциал регенерации этих нейронов уменьшается, если ранения на позднее стадии развития.
Регенерации аксона в ЦНС
Для VNC аксона травмы выживаемость личинок существенно варьируется и зависит от возраста, в котором индуцируется травмы. Основываясь на опыте, личинки 48-72 ч AEL обычно имеют самый высокий показатель выживания (> 60%) среди различных этапов испытания. Личинки моложе 48 h AEL плохо выжить после травмы, в то время как в тех, кто старше 72 h AEL трудно представить травмы в VNC. Кроме того, это проще вызвать травмы на задней спайки сегментов чем передней, как эти заднего сегментов VNC ближе к вентральной поверхности и таким образом более доступным лазером (Рисунок 3А).
Травмировать класса IV да аксоны нейронов в ЦНС, смонтируйте личинки как описано выше (рис. 3A). Под микроскопом найдите лестница как структура аксона расслоений, составляющих часть VNC (Рисунок 3А) и выполнить axotomy, как описано. Дегенерация подтвержденных в 8 ч AI и регенерации оцениваются в 24 и 72 h AI. Как показано на рисунке 3B, аксоны в 8 h AI уже начал вырождаться, и 24 h AI, регенерации аксона наблюдается Хотя Аксон мусора еще можно найти вокруг сайты травмы. Аксоны WT Показать ограниченное отрастания в VNC и не подключить пробелов, порожденных травмы (рис. 3B). Для количественной оценки способности регенерации раненых аксонов, волоски длиной после травмы измеряется и длину сегмента спайки (Y в рисунке 3A) используется для нормализации (рис. 3 c).
Рисунок 1: Да регенерации аксона нейрон в периферии отображает специфику класса. (A и B) Схема, рисунок, показывающий положение личинок. (C) схема, чертеж класса III да нейронов. (D) аксоны класса III да ddaF нейронов, помечены 19-12-Gal4, бас-CD4-tdGFP, репо Gal80 / +, не восстанавливаются. (E) схема, чертеж класса IV да нейронов. (F) аксоны v'ada нейронов да класса IV, помечены ППК CD4-tdGFP / +, вырастить за пределами сайта поражения. (D и F) Красная линия показывает длину аксона хотя зеленой пунктирной линией знаменует расстояние между тела клетки и аксон, сходящихся точки (DCAC). Синяя точка отмечает точку конвергенции аксон. Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Да нейрон дендритов регенерации. (A) иллюстративный представление класса IV да нейронов. (B) иллюстративный представление дендритов регенерации в класс IV да нейрон ddaC, обозначены ППК CD4-tdGFP / +. Лазерная абляция предназначен для точку основного филиала и проводится на 48 ч AEL. На 24 h AI травмы подтверждается перерезка neurite, и на 72 h AI количественно регенерации. Дендритов нейронов ddaC демонстрируют значительные отрастания, с новой дендритных ветвями, прорастания из разъединенных ствола для мозаичного заполнения вакантных площадей. Стоит отметить, что новый терминал ветви постоянно добавляются ранен дендритов на этой стадии развития. Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Да регенерации аксона нейрон в VNC. (A) схематический чертеж larva дрозофилы монтируется на слайде и образы под микроскопом. Класс IV да аксоны нейронов в VNC, визуализируется в ППК CD4tdGFP / + личинки. Два кандидата спайки сегменты приводятся в увеличенное изображение и схематический чертеж. Каждый из них имеет две травмы сайтов (красные круги). (B) конфокальный изображения одного потерпевшего сегмента, отображаемого на 8, 24 и 72 ч после травмы (МА). Красные линии показывают немного отрастут аксоны. (C) измерение и нормализации отрастут аксоны. Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При настройке покупать кресты, количество самок и самцов используемые может варьироваться в зависимости от генотипов и количество личинок, необходимые для конкретных экспериментов. Для WT мух типичный кросс использует 10 женщин и 5 мужчин. Окно коллекции может быть сокращен, в зависимости от точности требуемого возраста личинок. Например 2-h коллекции период даст личинок более однородной популяции. В этом случае использование 20 или более девственница самок настроить кресты поможет принести достаточно яйца. Доходность от первого дня обычно хватает, поэтому собирать пластину с яйцами два или более дней после настройки камеры. Когда дальнейшего культивирования пластину с яйцами, рекомендуется замочить ткань в 60-мм Петри в 0,5% растворе пропионовой кислоты вместо воды, которая будет не только помогают поддерживать влажность в блюдо, но также избежать роста плесени.
При настройке устройства для личинок анестезии и монтажа, убедитесь, что использовать стеклянную посуду, потому что эфира будет расплава через пластмасс. Стеклянную посуду размещается в 15-см пластик Петри в случае утечки. Папиросной бумаги помогает сохранить эфира в блюдо, так что личинка может быть эффективно выбил паров эфира. Рекомендуется использование янтаря снижается бутылки для хранения аликвоты эфира и добавления эфира в капельки с дозатором стекла. Пополнять эфир и всегда держать слой жидкого эфира в нижней части блюдо для оптимального эффекта.
Время эфира воздействия важно: недостаточная анестезия приведет к восстановлению личинка в середине сессии изображений и дрожание изображения; анестезия при передозировке или прямой контакт с жидкостью эфира, вызовет летальность. Чтобы максимизировать выживания и успеха, наши правило выглядит следующим образом: для ПНС травмы/изображений, вывезти личинка, как только его хвост останавливается подергивания; для ЦНС, подождите, пока весь личинка становится неподвижно, особенно головы сегментов. Даже небольшое движение будет вмешиваться с травмой и изображений VNC аксонов. Старые личинки, как правило, занять больше времени, чтобы выбить. Обычно это занимает менее 2 мин для личинок моложе 72 h AEL и 2-5 мин для личинок старше 72 h AEL.
При настройке интенсивности двух Фотон лазера для травмы, значение определяется сигнала флуоресценции ткани, полученные из проверки «Live». Травмы вводится «Непрерывное» сканирования как шаг 3.3. Травмы индуцированной увеличение флуоресценции обусловлено аутофлюоресценция на месте травмы и служит хорошим индикатором разрыва neurite. Как правило это занимает 1-10 s чтобы увидеть пика флуоресценции. Очень важно контролировать время сканирования, когда возводится флуоресценции. Для ПНС травмы важно, чтобы остановить сканирование немедленно. Длительное воздействие будет увеличить сайт травмы и повреждения соседних тканей. Однако это предоставить возможность корректировать время сканирования и манипулировать тяжести травмы. Успешный травмы должны иметь диаметр поражения размер меньше, чем 3-4 мкм. Для VNC аксона травмы, аксоны VNC внедренных гораздо глубже, по сравнению с da нейронов ПНС аксоны/дендритов, которые находятся прямо под кожей и поэтому требуют более лазерной интенсивности. Обычно мы оставить сканирования на несколько секунд. Это необходимо для того, что весь Аксон расслоение разорваны. Если радиус поражения сайтов является более половины ширины пучка спайки, такие сайты травмы, учитываются как неудачной. Такие личинки имеют низкой выживаемости и не быть включены в анализ.
Для регенерации аксона способность регенерации похож на личиночных стадиях. Но для регенерации дендритов после отключения одного дендритов, регенерации потенциал уменьшается после 72 ч AEL19. Таким образом аксон травмы обычно выполняется на 48-72 ч AEL и дендритов травмы на 48 ч AEL, с оценкой регенерации в 120h AEL. Личинки 24h AEL может также использоваться, но они требуют более бережного обращения, учитывая их меньшего размера. Личинки окукливаются после 120 h AEL, делая изображение более сложной. Таким образом наша конечная точка обычно 120 h AEL.
Какова взаимосвязь между дегенерация и регенерации? Обычно для ПНС травмы, на 24 ч AI, дистальной аксона/дендритов в WT завершил Валлерова дегенерации при регенерации не запущен в данный момент времени. Поэтому мы считаем, что в WT личинки, дегенерация разорвала невритов только имеет весьма ограниченное воздействие на регенерацию, если на всех. Для VNC травмы аксоны в 8 h AI уже начал вырождаться, и 24 h AI, регенерации аксона наблюдается Хотя Аксон мусора может все еще можно найти вокруг сайты травмы. Мусор, как представляется, не блокировать регенерации. Однако вполне возможно, что при определенных обстоятельствах, возможно дублирование или даже перекрестных помех между дегенерация и регенерации. В самом деле сообщалось, что в возрасте мышей, Распродажа мусора после повреждения периферических нервов медленнее, чем у молодых животных. Сопутствующе обстоятельств медленнее Реиннервация нервно-Джанкшен было отмечено, которая может объясняться на большее количество препятствий, восстанавливающий аксоны встреча у старых животных. Удивительно однако, аксоны возрасте животные быстро восстанавливаться и reinnervate нервно-Джанкшен сайты эффективно когда не сталкивается с мусором32. Это свидетельствует о том, что содействие разминированию мусора может быть потенциальной стратегии регенерации.
По сравнению с другими моделями neuroregeneration, модель травмы летать сенсорные нейрон имеет уникальные преимущества. Модели мыши обычно принимают недель до месяцев для выполнения и не подходят для проведения крупномасштабных генетических экраны; C. elegans имеет только примитивные центральной нервной системы, которая не может повторить тесно регенерации барьеров в млекопитающих ЦНС; в отличие от млекопитающих, данио рерио ЦНС аксоны регенерировать энергично. Быстрое жизненный цикл мух, универсальность летать генетики, доступности и стереотипных патронирования аксоны/дендритов летать сенсорных нейронов, и характерные регенерации свойств летать сенсорных нейронов – подтип конкретных регенерации в ПНС и ограниченные регенерации в ЦНС – сделать дрозофилы да нейронов привлекательная модель для изучения neuroregeneration. Кроме того последние исследования из клеток сетчатки ганглия щебень мыши (РГК) также показывают, что нейрональных подтипы несут собственный регенерации компетенции; Некоторые подтипы RGC может регенерировать, тогда как другие в казалось бы однородных нерва расслоение не вырастить33. Этот важный вывод свидетельствует о том, что следует использовать нейрональных конкретного типа стратегии содействия регенерации и восстановления функций и решительно утверждает, что индукция аксона травмы и последующей регенерации анализа должна быть выполнена в нейрональных подтип конкретным образом. Кроме того клеточном и молекулярном детерминанты для этого типа специфика регенерации остаются во многом неизвестным19,33. Таким образом да модель нейрона травмы предлагает идеальный парадигмы для решения этих проблем.
По сравнению с регенерации аксона, исследования, посвященные дендритов регенерации гораздо реже. Дендритов травмы происходят, например, черепно-мозговой травмы, инсульта и многие формы нейродегенеративные, но почти ничего не известно о дендритов способность восстановить и реформировать нейронных связей. Да модель нейрона травмы снова обеспечивает весьма доступной системы, которая отображает стереотипных патронирования, специфика класса и временные правила19, чтобы исследовать это направление.
Также стоит отметить, что хотя можно травмировать Приклеенные этикетку один Аксон в ПНС, травмы путь выполняется в результатах ЦНС в поражения пучок аксоны. При желании, MARCM34 или ФЛП-клон35 подхода может использоваться для обозначения единый аксоны в ЦНС. Кроме того когда глиальные клетки помечены одновременно с mRFP (репо-Gal4, бла mRFP), конкретно на месте поражения наблюдается накопление глии процессов. Кроме того, выражение Ptp99A, муха дрозофила гомолога хондроитина сульфат протеогликана (CSPG) phosphacan / PTPRZ1, регулируется вверх на месте поражения. Ptp99A совместного локализуется с глиальные клетки и окружает места повреждения, образуя кольцо как структуру, похожую на то, что было сообщено астроглиальных рубцов в млекопитающих19,,3637. В заключение да модель нейрона травмы, в сочетании с маркерами других типов клеток, таких как глиальные клетки или клетки иммунной системы, позволит в естественных условиях в реальном времени наблюдения многоклеточных взаимодействий между потерпевшим нейрон и его окрестностей окружающей среды.
Хотя эта модель повреждения сенсорного нейрона летать личинки дает нам возможность найти потенциальных neuroregeneration регуляторы в ЦНС и ПНС, она все еще имеет несколько ограничений. Во-первых это не высокую пропускную способность на нынешнем этапе. Как правило 5-6 генотипов может проверяться одним человеком в течение одной недели. Она должна быть оптимизирована для выполнения объективной экран. Во-вторых как эфирным наркозом на личинок может длиться от нескольких минут до не более 20 мин, оно не является оптимальным для долгосрочное изображений. Таким образом конкретное время точек, которые являются репрезентативными дегенерация аксона и регенерации соответственно выбираются для отображения. В-третьих даже несмотря на то, что этот протокол вводит способ точно нанести аксонов, возможность повреждения окружающих тканей не могут быть полностью исключены. В VNC эти ткани может быть глиальные клетки, аксонов и дендритов других нейронов. Чтобы свести к минимуму этот потенциал предостережение, мы минимуму травмы сайты, применять низкие возможности питания лазера и выполнить те же процедуры параллельно как управления, так и экспериментировать групп. В-четвертых в процессе создания парадигмы травмы ЦНС, были протестированы различные травмы сайты, включая сайты близко к Термини аксона, которые мы выбрали для использования и точка входа аксонов в VNC. Точки входа были найдены быть труднее повредить, потому что они глубже в ткани и более вероятно, чтобы двигаться. Таким образом для таких практических соображений, мы выбрать для текущего метода, который является более последовательным, лучше управляемой и хорошо для крупных экспериментов. Одной из потенциальных проблем, как указано выше, является возможность поражения соседних тканей, таких как постсинаптических компоненты и глиальных клеток. С другой стороны это выдающийся вопрос как повреждения окружающих тканей влияют на вырождение и регенерации аксонов. К примеру как глиальный рубец влияет на регенерации аксона. Это представляет еще одна причина, почему наша модель травмы может напоминают модели травмы в млекопитающих, в которых аксонов и тканей вокруг участков поражения обычно получают одновременно.
Лазерная травмы следуют покадровой микроскопии является чувствительной assay для изучения регенерации аксона/дендритов. Однако один основной задачей этот assay является воспринимается стоимость, которая колеблется от <$ 10K для низкобюджетных твердотельных импульсных лазеров, $25-100K для фемтосекундных лазеров для >$ 100K для двух Фотон лазеров. Есть несколько хороших дискуссий о различных лазерных систем, используемых для axotomy29,,3839,40,41,,4243, 44 , 45. Подводя итоги, обычные лазеры являются оптимальными для резки аксоны в о 30-50 мкм от поверхности. Там будет больше сопутствующий ущерб с нано- и Пико второй лазеры, по сравнению с фемтосекундного лазера, особенно с увеличением глубины целевой области45. Для ранив аксоны в VNC, глубина которой обычно является около 50-100 мкм, важно, чтобы свести к минимуму повреждения тканей. В этом случае два фотона лазерного идеально, который фокусируется мощность лазера до фокальной плоскости, сокращения ущерба залога ткани без ущерба для проникновения в ткани. В заключение системе двух фотон является дорогостоящим, но предлагает лучшее сохранение точности и тканей. Однако если только ПНС аксоны являются мишенью для axotomy, обычных импульсных лазеров может быть более доступной альтернативой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Джессика Гольдштейн для технической поддержки. Работа в лаборатории песня финансируется NIH Грант R00NS088211 и интеллектуальный и отклонениями в исследовательский центр (IDDRC) новой программы развития премии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous | Acros Organics | AC615080010 | |
| Halocarbon 27 Oil | Genesee Scientific | 59-133 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L | VWR | 97062-948 | |
| Agar powder, Alfa Aesar, 500GM | VWR | AAA10752-36 | |
| Grape juice | Welch’s | ||
| Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%) | VWR | 64-17-5 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Propionic Acid | J.T.Baker | U33007 | |
| Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12-544-D | 50 mm X 22 mm |
| Zeiss LSM 880 laser scanning microscope | Zeiss | ||
| Zen software | Zeiss | ||
| Chameleon Ultra II | Coherent |
References
- Yakura, J. S. Recovery following spinal cord injury. , (1996).
- Harel, N. Y., Strittmatter, S. M. Can regenerating axons recapitulate developmental guidance during recovery from spinal cord injury? Nature reviews. Neuroscience. 7, 603-616 (2006).
- Jurewicz, A., Matysiak, M., Raine, C. S., Selmaj, K. Soluble Nogo-A, an inhibitor of axonal regeneration, as a biomarker for multiple sclerosis. Neurology. 68, 283-287 (2007).
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7, 617-627 (2006).
- Sun, F., He, Z. Neuronal intrinsic barriers for axon regeneration in the adult CNS. Curr Opin Neurobiol. , (2010).
- Liu, B. P., Cafferty, W. B., Budel, S. O., Strittmatter, S. M. Extracellular regulators of axonal growth in the adult central nervous system. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 361, 1593-1610 (2006).
- Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal intrinsic mechanisms of axon regeneration. Annu Rev Neurosci. 34, 131-152 (2011).
- Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. Nogo limits neural plasticity and recovery from injury. Curr Opin Neurobiol. 27, 53-60 (2014).
- He, Z., Jin, Y. Intrinsic Control of Axon Regeneration. Neuron. 90, 437-451 (2016).
- Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
- Geoffroy, C. G., Hilton, B. J., Tetzlaff, W., Zheng, B. Evidence for an Age-Dependent Decline in Axon Regeneration in the Adult Mammalian Central Nervous System. Cell Rep. 15, 238-246 (2016).
- Geoffroy, C. G., et al. Effects of PTEN and Nogo Codeletion on Corticospinal Axon Sprouting and Regeneration in Mice. J Neurosci. 35, 6413-6428 (2015).
- Jin, D., et al. Restoration of skilled locomotion by sprouting corticospinal axons induced by co-deletion of PTEN and SOCS3. Nat Commun. 6, 8074 (2015).
- Wang, X., et al. Axonal regeneration induced by blockade of glial inhibitors coupled with activation of intrinsic neuronal growth pathways. Exp Neurol. 237, 55-69 (2012).
- Fang, Y., Bonini, N. M. Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila models of nerve injury. Annual review of cell and developmental biology. 28, 575-597 (2012).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Leyssen, M., et al. Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain. The EMBO journal. 24, 2944-2955 (2005).
- MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50, 869-881 (2006).
- Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes Dev. 26, 1612-1625 (2012).
- Song, Y., et al. Regulation of axon regeneration by the RNA repair and splicing pathway. Nat Neurosci. 18, 817-825 (2015).
- Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
- Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Curr Biol. 22, 590-595 (2012).
- Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
- Brace, E. J., DiAntonio, A. Models of axon regeneration in Drosophila. Exp Neurol. 287, 310-317 (2017).
- Hao, Y., Collins, C. Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 44, 84-91 (2017).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).
- Sugimura, K., et al. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
- Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432, 822 (2004).
- Wu, Z., et al. Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15132-15137 (2007).
- Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Mol Biol Cell. 21, 767-777 (2010).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33, 19480-19491 (2013).
- Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85, 1244-1256 (2015).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Buss, A., et al. NG2 and phosphacan are present in the astroglial scar after human traumatic spinal cord injury. BMC Neurol. 9, 32 (2009).
- McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar. J Neurosci. 19, 10778-10788 (1999).
- Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. J Microsc. 234, 1-8 (2009).
- Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Phys Rev Lett. 99, 158104 (2007).
- Venugopalan, V., Guerra, A. 3rd, Nahen, K., Vogel, A. Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation. Phys Rev Lett. 88, 078103 (2002).
- Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans. Opt Express. 16, 5963 (2008).
- O'Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Tsai, P. S., et al. Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems. Curr Opin Biotechnol. 20, 90-99 (2009).
- Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
- Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. J Vis Exp. , (2011).
