Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Neuroregeneration periferik ve santral sinir sistemi çalışmak için bir Vivo Drosophila yaralanma modeli

Published: May 5, 2018 doi: 10.3791/57557
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2
1Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Pennsylvania
* These authors contributed equally

Summary

Burada, duyusal nöron - vivo içinde birleştirir dendritik arborization (da) nöron yaralanma modeli, canlı görüntüleme Drosophila , İki fotonlu lazer axotomy/dendriotomy ve güçlü sinek genetik araç, olarak bir iletişim kuralı'nı mevcut olası rehberleri ve neuroregeneration inhibitörleri süzmek için bir platform.

Abstract

Hasarlı nöronlar büyütme kapasitesi neuroregeneration ve fonksiyonel iyileşme sinir sistemi travmadan sonra yönetir. Son birkaç on yıl boyunca, çeşitli içsel ve dışsal inhibitör faktörleri axon rejenerasyon sınırlama içinde yer tespit edilmiştir. Ancak, sadece Bu inhibitör ipuçlarını kaldırma ek yasal makine varlığını gösteren başarılı rejenerasyon için yeterli değil. Drosophila melanogaster, meyve sineği örümceklerle korunmuş genler ve sinyal yollar insanlar da dahil omurgalılar ile paylaşır. Sineklerin Tanrısı güçlü genetik araç kutusu iki fotonlu lazer axotomy/dendriotomy ile birleştirerek, biz burada Drosophila duyusal nöron-dendritik arborization (da) nöron yaralanma modeli sistematik olarak roman için eleme için bir platform olarak tarif rejenerasyon düzenleyiciler. Kısaca, bu paradigma bir) hazırlanması larva, b) lezyon indüksiyon dendrite(s) veya axon(s) kullanarak bir iki fotonlu lazer, c) canlı confocal görüntüleme sonrası yaralanma ve d) veri analizi için içerir. Bizim modeli son derece tekrarlanabilir yaralanma tek etiketli nöronlar, akson ve periferik ve santral sinir sistemi iyi tanımlanmış nöronal türlerinden dendrites olanak verir.

Introduction

Merkezi sinir sistemi (MSS), bir yaralanma sonra yeniden akson ve yetersizlik hastalarda kalıcı engelli yol açabilir ve aynı zamanda geri dönüşü olmayan nörolojik açıkları nörodejeneratif hastalıkları1,2'deki bir rol oynar ,3,4,5. CNS çevre gibi yaşarsan, içsel büyüme yetenek aksonlar travmadan sonra yeniden oluşturmak mümkün olup olmadığını belirler. Oligodendrocyte, astroglial ve fibroblastic kaynakları hücre dışı etkenler engel nöronal büyüme4,6,7,8, ama bu moleküller ortadan kaldırılması gösterilmiştir Sadece5çimlenme limited için izin verir. İçsel rejenerasyon sinyalleri rejeneratif başarı5,9 etkisi ve potansiyel tedavi hedefleri temsil, ama bu işlemler moleküler düzeyde hala iyi tanımlanmış. Trofik faktör sinyal veya Pten fosfataz10gibi endojen frenler ortadan kaldırılması artışlar aksonal rejenerasyon bazı durumlarda neden olabilir. Farklı yöntemler tek tek etkili olduğu bulundu kombinasyonları da sadece11,12,13,14bugüne kadar sınırlı genel kurtarma sağlar. Bu nedenle, ek yollar hedefe yönelik tedavi tanımlamak için umutsuz bir ihtiyaç vardır. Axon büyütme girişimi ek olarak, olup olmadığını ve nasıl aksonlar reformu synapse özgüllük, doğru hedefe yeniden tel ve elde fonksiyonel iyileşme önemli cevapsız sorular vardır.

Özet olarak, geçerli axon rejenerasyon dikte makine hala çok bölük pörçük anlaşılmasıdır. Sorunun bir parçası olduğunu axon eğitim teknik zorluk içinde gerçek-zaman memelilerde rejenerasyon, pahalı, zaman alıcı ve büyük ölçekli genetik ekranlar yürütmek için zorlu bir yaklaşım. Drosophila melanogaster, öte yandan, karmaşık biyolojik soruların incelenmesi için son derece güçlü bir sistem olduğu ispatlanmıştır. Meyve sineği genler tanımlama ve çarpıcı insanlarda korunmuş yolları sinyal vesile olmuştur ve nörodejeneratif hastalıklar, büyük moleküler genetik araçları aracılığıyla gibi insan koşulları çalışma için başarılı bir model olmuştur Gen işlev15işlemek kullanılabilir. Özellikle, meyve sinekleri genlerin sinir yaralanma ve büyütme15,16dahil keşfi için ideal bir araç olarak kabul edilir. Yetişkin kafa veya larva ventral sinir kablosu (VNC) iğneler, larva VNC veya sinir ezmek ile forseps, larva nöron lazer axotomy, koku reseptör nöron kaldırma, beyin explants yaralanma ile bıçak gibi de dahil olmak üzere birkaç sinek sinirsel hasar modelleri geliştirilmiştir, ve periferik sinir lezyonu kanat kıdem15,17,18,19,20,21,22,23tarafından. Heyecan verici, son iş kullanarak Drosophila yaralanma modelleriyle yanıt vermek için sinir yaralanmaları, bazıları24 memelilerde korunmuş gösterilen sinir sistemi tarafından kullanılan hücresel ve genetik yollar bizim anlayış gelişmiş var. ,25. Yine, bu model organizma tanımlayıcı roman mekanizmaları, sinirsel onarma yardımcı programı vurgular.

Burada açıklanan bir iki fotonlu Lazer tabanlı Drosophila larva duyusal nöron yaralanma modelidir. İki fotonlu lazer ilk Zebra balığı vivo içinde 200326aksonlar kesmek için kullanılmıştır. Aynı yıl, ilk lazer dendriotomy pulsed azot lazer27kullanarak Drosophila içinde gerçekleştirildi. Kısa süre sonra birkaç C. elegans labs femtosecond lazer axon rejenerasyon28modelleri oluşturmak için kullanılan. 2007'de, Wu ve meslektaşları ile karşılaştırıldığında ve lazerler29türleri tarafından indüklenen C. elegans lazer yaralanmaları arasındaki farklar bildirdi. 2010 yılında, akson yeniden oluşturma tamamlandıktan sonra lazer axotomy ilk Drosophila30' u gerçekleşmesi için gösterildi. Bu geniş lazer yaralanma edebiyat bina, yaralanma hedeflenen sitelere kesin indüksiyon ile komşu dokulara az pertürbasyon sağlar, İki fotonlu lazer kullanarak bir sinek sinir yaralanma modeli nispeten temiz sağlayan geliştirdiğimiz Sistem neuroregeneration tek hücreli çözünürlük ile içsel ve dışsal özelliklerini incelemek için. Özellikle, biz her iki periferik sinir sistemi (PNS) bir dizi yaralanma yöntem dendritik arborization (da) duyusal nöronlar için kurduk ve CNS. Öncelikle kendi dendrite dallanma karmaşıklığı tarafından seçkin dört farklı sınıflara da nöronların gruplandırılabilir: sınıf ı IV31. Yayımlanmış çalışmalarımız da nöron rejenerasyonu memeli yaralanma modelleri fenotipik ve moleküler düzeyde benzer gösterir: da nöronların sınıf IV ile sınıf belirli rejenerasyon özelliklerini görüntülemek ama ben veya III da nöronların yenilenme içinde sergilenmesi sınıf PNS; sınıf IV da nöron aksonlar sağlam çevre içinde yeniden ama rejeneratif potansiyellerini önemli ölçüde böylece dorsal kök gangliyon (DRG) nöronlar memelilerde benzeyen MSS azaltılır; mTOR etkinlik Pten yoluyla artırılması silme veya Akt overexpression akson rejenerasyon anında CNS19içinde geliştirir. Bu yaralanma modeli kullanmak, genetik ekranlar sahne olmuştur ve RNA işleme enzim Rtca akson hasarı hücresel stres ve RNA modifikasyon20 bağlanma axon rejenerasyon, evrimsel korunmuş bir inhibitör faktörü olarak belirledik .

Sunulan paradigmada, yaralanma lazer axotomy/dendriotomy yolu ile larva sınıf IV veya III da nöronların, ppk-CD4-tdGFP veya 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo Gal80, sırasıyla etiketli indüklenen. Yaralanma 3rd INSTAR larvaları yaklaşık 48-72 saat için 2nd (h AEL) döşeme yumurta sonra gerçekleştirilir. PNS için axotomy lezyon axon ~ 20-50 µm hücre vücuttan, CNS axotomy ~ 20 µm çapında komissür Kavşağı'nda VNC adlı bir alanı için ve dendriotomy için birincil dendritik şube noktaları bölümüne hedeflenmektedir. Aynı nöron 8-24 h sonra yaralanma (AI) tam transeksiyon onaylamak için ve 48-72 h rejenerasyon değerlendirmek için AI görüntüsü. Hızlandırılmış confocal görüntüleme yoluyla zamanla dejenerasyon ve rejenerasyon yaralı vivo içinde olmuştur bireysel aksonlar/dendrites izlenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hazırlanması kültür plakaları ve şişeler

  1. Üzüm suyu Ağar kaplamalar hazırlanması
    1. Agar toz, 200 mL üzüm suyu ve 192 mL GKD2O 10 g bir kabı ve mikrodalga fırında yaklaşık 4-5 dk, zaman zaman agar tamamen eriyene kadar karıştırarak ekleyin.
    2. Yaklaşık 60 ° C'ye çözüm bir duman başlık, sakin 4,2 mL % 95 etanol ve 4.0 mL buzul Asetik asit ekleyin. GKD2O. Mix ile 400 mL çözüm hacmi de ayarlayın.
    3. Her 35-mm plaka için yaklaşık 2-3 mL çözüm ekleyin. Yaklaşık 400 mL üzüm suyu agar çözüm olmak üzere toplam 120-150 tabak olun.
    4. Plakayı serin ve agar çözüm kuvvetlendirmek 10 dakika bekleyin. Üzüm suyu Ağar kaplamalar kendi kendine mühürlü kilitli torbalar içinde paketi ve ileride kullanmak üzere 4° C'de depolayın.
  2. Drosophila kültür şişe hazırlanması
    1. Bir bıçak bir 1,5 cm yan uzunluğu üçgen Drosophila kültür şişe bir duvarda delik ve pamuk havalandırma için bir 2-2.5 cm çapında top ile delik doldurmak için kullanın.
    2. Bir üzüm suyu agar plaka ile 0.5 cm3 hakkında Maya hamur takıma şişe takın.

2. Drosophila larva topluluğu

  1. Yetişkin sinekler haçlar ayarla
    1. Yer 10 bakire kadın ve 5 erkek yetişkin uçar birlikte ile üzüm suyu agar plaka takılı bir kültür şişe.
    2. Sinekler yumurta üzüm suyu agar plaka üzerinde yatıyordu olacaktır böylece şişe dipleri 25 ° C'de yerleştirin. Maya yapıştır ile plaka günde en az bir kez değiştirin. 20'den fazla bakire kadın ve 10 adım 2.1.1 erkeklerde ile homojen bir gelişimsel sahne larvaları hasat veren bir 2-h koleksiyonu süre başlar.
    3. Kültür plaka 60 mm Petri kabına ıslak peçete ile 25° c, % 0.5 propiyonik asit çözümde batırılmış. Oksijen akışını engellemek değil doku düzenleyin.
      Not: Propionik asit çözüm çanak nem korumak ve küf oluşumunu önlemek için kullanılır.
  2. Belirli bir yaş larvaları hasat
    1. Forseps çifti Maya Yapıştır olmadan yeni bir üzüm suyu agar plakasına larva istenen sahne alanı, örneğin, 2nd 3rd INSTAR larva 48-72 saat sonra yumurta (AEL), döşeme için aktarmak için kullanın.
    2. Maya larva'nın cilt onlara izin vererek potansiyel Maya lazer axotomy ve görüntüleme ile engellemesini önlemek için yeni tabakta etrafında gezinme kaldırmak. Alternatif olarak, iyice larvalar PBS bir tabak içinde yıkama ve kısaca doku kağıt parçasına kurutma temizleyin.

3. İki fotonlu yaralanma ve Confocal görüntüleme

  1. Mikroskop Kur
    Not: mikroskop ile iki fotonlu lazer tarama confocal lazer bu deneme için kullanılan, ancak eşdeğer bir kurulum diğer sistemlerle de yeterli olacaktır. İki fotonlu lazer (930 nm) yaralanma ve Argon lazer teslim etmek için kullanılan (488 nm) GFP confocal görüntüleme için kullanıldı.
    1. Her oturumun başlangıcında İki fotonlu lazer ve/veya confocal lazer ve mikroskop açın. Görüntüleme yazılımını açın.
    2. İki fotonlu yaralanma için 930 adlı iki fotonlu lazer ile GFP görüntüleme için aşağıdaki parametreleri ayarla nm (1.950 mW).
      1. Satır tarama modu seçin. İğne deliği kadar sonuna kadar açın. ~ % 20 lazer yoğunluk artmak (390 mW).
      2. 512 x 512 çerçeve tarama olarak seçin. Maksimum tarama hızı (genellikle ile piksel Işınma Zamanı, 0,77 µs) kullanın. Ortalama numarası 1'dir ve bit derinliği 8 bit olduğundan emin olun.
      3. ~ 750 ve uzaklık 0 set kazanç.
      4. Deneysel protokol bırakmak için kolay 2 P GFP 930 ablasyon, olarak yeniden gelecekte bu önceden ayarlanmış deneyleri.
    3. Confocal görüntüleme için 488, Argon lazer ile GFP görüntüleme için aşağıdaki parametreleri ayarla nm:
      1. Satın alma sekmesini ve ardından Z-yığınıseçin.
      2. "Lazeraltında", 488 nm Argon lazer için açın.
      3. Gidin kanalları, 488 mm lazer seçin ve % 5-10 lazer gücünü arttırın. İğne deliği ve sondaj için 1-2 havadar birimi (AU) kullanın. 650 kazanç ayarlayın.
      4. Toplama modu, 1024 x 1024 çerçeve tarama kadar seçin, kullanmak en yüksek tarama hızı, ortalama sayısı 2 ve 8 Bit bit derinliği.
      5. Bu önceden belirlenmiş deneysel protokol GFP Imagingkaydedin.
  2. Larva anestezi Dietil eter ve montaj ile
    1. Bir duman başlık, 60 mm cam tabak 15 cm plastik Petri kabına yerleştirin. Kat ve doku kağıt cam tabak dibinde yatıyordu sonra doku üzerinde bir üzüm suyu agar tabak yerleştirin. Dietil eter cam tabak içine noktası burada dokulu kağıt ıslatılır ve sıvı eter tabakta kalan bir katmanı ekleyin. Ağzını her zaman tut.
    2. Halocarbon bir damla ile bir cam slayt merkezi 27 petrol hazırlayın. 4 noktalar üzerine daha sonra coverslip desteklemek için slayt, dört köşesine vakum yağ ekleyin.
    3. Forseps kullanmak kadar temizlenmiş bir larva almak ve agar plaka 60 mm cam tabak yerleştirin. Cam çanak kapağı ile kapak ve larva hareket etmeyi durdurana kadar bekleyin. PNS yaralanma/görüntülemesi için kuyruğunu seğirmesi durur larva sok. MSS için tüm larva hareketsiz, hale gelinceye kadar bekleyin özellikle baş kesimleri.
      Not: Eter pozlama zamanlaması çok önemlidir. Tartışma bakın.
    4. Dikkatle imzalat larva kadar almak ve kafa-dik halocarbon petrol slayt üzerinde damla içine yerleştirin. Bir coverslip slayt üzerine ekleyin. Hafif basınç larva (şekil 1A) dokunana kadar coverslip üzerinde aşağı doğru itin için kullanın.
    5. Böylece nöron/axon/dendrite ilgi en iyi ve en yakın mikroskop objektif yavaşça coverslip sola veya sağa larva, rulo doğru iterek larva'nın pozisyonunu ayarlayýn.
    6. Her iki tracheas görünecek şekilde PNS yaralanma için larva dorsal tarafta, binin. Daha sonra larva Sınıf III da nöron akson (şekil 1B ve 1 C), sınıf IV da nöron akson (şekil 1B ve 1E) yaralamak için 90 derece veya yaralanmasına sınıf IV da nöron dendrites () için ~ 30 derece yaralamak için soldaki ~ 30 derece alın Şekil 2A).
    7. CNS yaralanma için faiz mikroskop objektif z düzlemde yakın olan bölgedir (şekil 3A), mükemmel ventral taraftan olmak larva konumlandırın.
  3. İki fotonlu lazer yaralanma
    1. Mikroskop altında larva içeren slaydı yerleştirin ve Sahne Alanı'nda ile slayt sahibi yerine sabitleyin. Larva bulmak için kullanım 10 X (0.3 NA) amaç.
    2. Objektif yağ coverslip üzerine 1 damla eklemek, geçiş (1.3 NA) X 40 amaç ve odağı ayarlayın.
    3. Tarama moduna geçirin ve deneysel protokol 2 P GFP 930 ablasyonyeniden kullanabilirsiniz. İğne deliği ve sondaj ta açıldığında emin olun.
      Not: Yapılandırma en iyi şekilde bireysel sistemlere dayalı gerekiyor.
    4. Faiz (ROI) bölge bulmak için Live modda başlatma ve uygun zoom ile iyi bir görüntü kalitesi elde etmek için ayarları ayarlama.
      Not: Bu adımın amacı en iyi kalitede görüntü alarak yerine zarar için nöron/axon/dendrite bulmak mümkün. Bu nedenle, en az ayarlar hedef alan görselleştirmek için yeterli dozun veya photobleaching önlemek için kullanın.
    5. Kırp düğmesini-ecek var olmak elde edilebilir Live tarama, durdurun. Yol haritası hizmet sabit görüntü ver. Ekin işlevi seçin ve hedef üzerinde yaralı olmak odaklanmak için tarama penceresi ayarlamak.
    6. Yaralanma potansiyel sitesinin olarak yatırım Getirisi azaltmak. Örneğin, bir akson veya yaralanma duyarlığını sağlamak ve komşu dokulara zarar azaltmak için bir dendrite genişliğini kapsar. İstenirse, yatırım Getirisi üzerinde kırpmadan önce daha kesin yaralanma için izin zum.
    7. Yeni bir görüntü penceresini açın. İnceden inceye gözden geçirmek hız azaltmak ve lazer yoğunluk artmak. Live modda taranan doku Floresans sinyal dayalı lazer yoğunluk artışı belirlemek.
    8. Genellikle, PNS yaralanma için % 25 ve 50-%100 VNC zarar görme başlayarak iki fotonlu lazer yoğunluğu ayarlanabilir. PNS axon yaralanma için lazer yoğunluğu ~ 480 mW ve piksel olması Işınma Zamanı 8.19 μs. VNC axon yaralanma için lazer yoğunluğu ve piksel Işınma Zamanı genellikle 965-1930 mW ve 8.19 32.77 μs, sırasıyla olması.
    9. Sürekli tarama başlatır. Sürekli düğmenin üzerine hovering imleç bırakın. Resmine bir göz kulak olun ve floresan ciddi bir artış gözlenen Taramayı durdurmak.
      Not: Otomatik-floresan yaralanma sitesinde Floresans iğnenin görünümü kaynaklanmaktadır.
    10. Tekrar canlı moduna ayarların yeniden kullanarak geçiş. Sadece odak noktası ayarlayarak hedef aldı faiz bölgesini bulun.
      Not: Küçük krater, yüzük benzeri yapıda veya yaralanma yerinde tam yerelleştirilmiş enkaz görünümünü başarılı yaralanma iyi bir göstergesidir.
    11. Sonraki nöron geçin ve birden çok tek bir hayvan nöronlarda incitmek 3.3.5, adım. Veya 3.3.5 yavaş yavaş artan gücü ve/veya ilk yaralanma yetersiz olsaydı tarama hızını azaltarak süre arasındaki adımları yineleyin.
      Not: Bu da lazer güç durumda yüksek, büyük hasarlı bölgeyi sonrası yaralanma canlı tarama görüntü görünür. Çok fazla yaralanma larva ölüm sebebi.
    12. Dikkatle coverslip kaldırarak ve Maya yapıştır ile yeni bir plaka üzerine yaralı larva transfer larva kurtarmak. Birkaç mağara agar plaka üzerinde Forseps ile hendek; Alternatif olarak, agar adasını bütün tabağı tabak dışarı sürünerek larva olasılığını azaltmak için kullanmak yerine tabak içinde olun.
    13. Islak mendil (% 0.5 propiyonik asit çözüm batırılmış) ve kültür oda sıcaklığında veya 25 ° c ile 60 mm kabında plaka koymak
      Not: Larva larva aşamasında yaklaşık, oda sıcaklığında (22 ° C) 25 ° C'de göre fazladan bir gün kalır
  4. Sonrası yaralanma confocal görüntüleme
    1. Görüntü anestezi ve montaj adım 3.2, confocal lazer ile görüntüleme gibi aynı yordam kullanılarak larva hazırlanıyor tarafından istenen saat noktalarda yaralı larva.
      Not: larva aksonal yaralanma onaylamak için yaralanma (AI) sonra 24 saat ve 48 h AI (sınıf IV da nöronlar) veya 72 h rejenerasyon değerlendirmek için AI (sınıf III da nöronlar) görüntü.
    2. 10 X amacı istimal larva bulun, sonra geçiş için bir 25 X (0.8 NA) amaç. Deneysel iletişim kuralı GFP Imagingyeniden.
    3. Live düğmesini tıklatın ve daha önce yaralı aynı nöron bulmak.
    4. İlk ve son Z pozisyonları canlı tarama penceresinde ayarlayın. Dur tuşuna basın ve Z-yığın görüntü elde etmek için deneme Başlat'ı tıklatın.
      Not: bir normalleştirme noktası (axon yakınsak nokta) miktar rejenerasyon mümkündür görüntüleri yakalarken dahil olduğundan emin olun (şekil 1 d, 1F) – bu anlatılan veri analiz bölümünde daha fazla.
    5. Görüntü işlemeiçin geçiş, yeni çekilen görüntüyü seçin ve en fazla yoğunluk projeksiyon oluşturmak. Z-yığın ve maksimum yoğunluk projeksiyon görüntüleri kaydetmek.

4. veri analizi

  1. İşleme ve görüntüleme yazılımı veya ImageJ kullanarak görüntüleri ölçmek.
  2. Miktar PNS axon rejenerasyon
    1. Rejenerasyon yüzdeyüzde aksonlar lesioned akson arasında Yenileyici anlamına gelir, hesaplar. Yaralanma sitesi regrows sürece Yenileyici olarak bir akson puan.
    2. Axon uzunluğu artış olan ölçü rejenerasyon uzunluğu. ImageJ ile miktarının rejenere axon izlemek için Parçalı çizgi aracını kullanın ve ölçü birimi Çözümle açılır menüsünde rejenere axon temsil eden çizgiyi uzunluğunu elde etmek için kullanın.
    3. Yeniden oluşturma işlemi dizin, normalleştirilmiş axon uzunluğu artış olduğu hesaplanır.
      Not: Axon uzunluğu hücre beden ve noktası (DCAC)-axon uzunluğu/DCAC (şekil 1 d ve 1F) yakınsak akson arasındaki mesafeye göre normalleştirilmiş. Bu değer hesabı larva ölçekleme nedeniyle herhangi bir aksonal büyüme için yardımcı olur. Değeri yeniden oluşturma işlemi temsil eden, 0 değeri yok yenilenme anlamına gelir ve negatif bir değer geri çekilmesi anlamına gelir.
  3. Miktar dendrite rejenerasyon
    1. Açık dendrite büyütme göstermek bu kopmuş arasında da nöronların yüzde olan rejenerasyon yüzdesini, hesaplar.
      Not: Eğer yeni olumlu dendrites dışarı retrakte dendritik kök ve yaralanma sitesi ötesinde regrow gibi Dendrite büyütme attı. Yaralanma sitesi tarafından yerler ve bazı durumlarda belirlenir, kalan yaralanma kaynaklı autofluorescence nedeniyle kolayca görülebilir.
    2. Yeni dendritik şube noktaları eklenmesinden sonra yaralanma sayar şube noktaları artırmak, hesaplayın.
    3. Yaralanma sonra eklenen tüm yeni dendrites toplam uzunluğu olan Toplam dendrite uzunluğunu artırmak, hesaplayın.
  4. Miktar MSS axon rejenerasyon
    Not: bir lezyon site görüntüsü ilk kez noktada (şekil 3B) dejenerasyonu gösteriyorsa, rejenerasyon uzunluk ve hızı analizinde eklenecektir.
    1. Regrowing akson uzunluğu olan ölçü rejenerasyon uzunluğu.
      Not: bir tek lezyon sitesinin regrowing akson yaralanma önce özgün axon yol kapalı kaynaklı olarak tanımlanır.
    2. NORMALIZED yenilenme uzunluğuolan komissür kesimin - commissures ( şekil 3A ve 3B"Y") arasındaki boyuna mesafe uzunluğu rejenerasyon uzunluğa normalleştirir, hesaplayın.
      Not: Bu değer doğru larva boyutu farklılıklar etkisi için yardımcı olur.
    3. Kesimleri arasında belirli bir genotip yenilenme kapasitesi yansıtacak şekilde lesioned tüm kesimlerini Yenileyici yüzde yenilenme oranı, hesaplayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Da nöronların fark rejenerasyon periferik ve santral sinir sistemi, aynı zamanda arasında sınıf özgüllük potansiyel göstermek. Bu axon rejenerasyon (sınıf IV PNS yaralanma kullanarak) yanı sıra bu yenilenme (sınıf IV merkezi sinir sistemi yaralanma ve sınıf III PNS yaralanma ile) inhibitör olduğunu için gerekli olan roman faktörleri için ekran için benzersiz fırsatlar sağlar.

PNS Axon rejenerasyon

Örneğin, Sınıf III ve sınıf IV da nöronların rejenerasyon karakterizasyonu açıklanmıştır. Bu nöronlar bilateral her vücut segmentinde yer alır. Birden çok nöronlar aynı larva yaralı olmak; tipik olarak, 3-4 nöronlarda karın kesimleri A7-A2 sağ tarafında. Sınıf III ve sınıf IV da nöronların 19-12-Gal4, UAS-CD4tdGFP, repo-Gal80 ve ppk-CD4tdGFP, sırasıyla görüntülenir. Anestezi ve 48-72 h AEL larva olarak açıklanan, böylece ilgi da nöronların (şekil 1A ve 1B) karşı karşıya larvalar konumunu ayarlama monte. Biz genellikle Sınıf III ddaF ve sınıf IV v'ada nöronlar (şekil 1 c ve 1E) yaralama. Axotomy gerçekleştirmek ve larva açıklandığı gibi yeniden elde etmek. Kısa bir süre yaralanma (AI) sonra cerrahi ve sergi normal hareket larvalar kurtarıldı. Burada sağkalım oranı genellikle % 80 bitti. Ölü ya da hasta larva atmak. Kalan açıklandığı gibi yeniden bağlayın ve dejenerasyon değerlendirmek. 24 h AI, distal aksonlar dejenerasyon bu saat noktası19tamamlamış ve akson kök-ecek var olmak kolayca görülebilir (şekil 1 d ve 1F). 48 h AI sınıfı IV da nöronlar için veya 72 h rejenerasyon değerlendirmek için AI sınıfı III da nöronlar için aynı larva reimage. Genellikle en az 20 yaralı nöronlar deneysel koşul başına değerlendirmek hedefliyoruz. Genellikle ~ %70 kesik sınıf IV da nöronların yaralanma site (şekil 1F), Sınıf III da nöronların yeniden regrow, başarısız ise (vahşi yazın) WT hayvanlar, büyüme Koni (şekil 1 d) durdurduklarını tarafından kanıtlanan.

Dendrite rejenerasyon

Dendriotomy genellikle sınıf IV da nöronların ddaC (şekil 2A) üzerinde gerçekleştiriyoruz. Şematik çizimde görüldüğü gibi yaralanma birincil dendritik şube noktasına hedeflenmektedir. Deneyim, 48 h AEL yaralı göre yeniden ~ %50 ddaC nöronların kendi dendrites (şekil 2B). Kalan % 50, komşu dendrites istila ve boş alanı kapsar. Ayrıca, bu nöronların rejenerasyon potansiyeli bir sonraki gelişim aşamasında yaralı azalır.

MSS Axon rejenerasyon

VNC axon zarar görme, larva survival oranı önemli ölçüde değişir ve hangi yaralanma indüklenen olduğu yaş bağlıdır. Deneyime dayalı, 48-72 h AEL larvaları genellikle en yüksek hayatta kalma oranı var (> % 60) arasında farklı aşamalarında test. Bu 72 h AEL büyük o VNC yaralanma tanıtmak zor olmakla birlikte larva 48 h AEL genç kötü yaralanma sonra hayatta kalmak. Ayrıca, yaralanma, daha ön, arka komissür kesimleri ikna etmek kolaydır bu posterior segmentleri VNC ventral yüzeye daha yakın ve böylece daha lazer (şekil 3A) tarafından erişilebilir olduğu gibi.

Sınıf IV da nöron aksonlar MSS zarar için daha önce açıklandığı gibi larvaları (şekil 3A) bağlayın. Mikroskop altında merdiven benzeri yapıda axon demetleri VNC (şekil 3A) bölümünü oluşturan bulabilir ve axotomy özetlendiği gibi gerçekleştirebilirsiniz. Dejenerasyon 8 saat 24 ve 72 h AI AI ve rejenerasyon değerlendirilir doğrulanır. Şekil 3B' de gösterildiği aksonlar 8 h AI zaten dejenere başlamıştır ve akson enkaz hala etrafında yaralanma siteler bulunabilir iken 24 h AI, akson rejenerasyon görülmektedir. WT aksonlar sınırlı büyütme VNC içinde göstermek ve yaralanma (şekil 3B) tarafından oluşturulan boşluklar yeniden bağlanmak başarısız. Yaralı aksonlar rejenerasyon yeteneği ölçmek için yaralanma ölçülür sonra büyütme uzunluğu ve komissür kesimin (Y şekil 3A) uzunluğu kullanılan normalleştirme için (şekil 3 c).

Figure 1
Şekil 1: Da nöron axon rejenerasyon çevre sınıf özgüllük görüntüler. (A ve B) Şematik larvalar konumunu gösteren çizim. (C) sınıfı III da nöronların çizim şematik. (D) 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80 / +ile etiketli Sınıf III da nöronların ddaF akson regrow başarısız. (E) şeması sınıf IV da nöronların çizim. (F) aksonlar ile etiketli sınıf IV da nöronların v'ada, ppk-CD4-tdGFP / +, lezyon sitesi regrow. (D ve F) Hücre gövdesi ve noktası (DCAC) yakınsak akson arasındaki mesafe yeşil Kesikli çizgi işaretleri ise kırmızı çizgi axon uzunluğunu gösterir. Mavi nokta axon yakınsak noktasını işaretler. Ölçek çubuğu 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: Da nöron dendrite rejenerasyon. (A) sınıf IV da nöronların görsel gösterimi. (B) sınıf IV da nöron ddaC, tarafından etiketli dendrite yenilenme açıklayıcı gösterimi ppk-CD4-tdGFP / +. Lazer ablasyon birincil şube noktasına hedefleyen ve 48 h AEL yapılır. 24 h AI yaralanma neurite transeksiyon doğrulanır ve 72 h AI rejenerasyon sayılabilir. Dendrites ddaC nöronların önemli büyütme, yeni dendritik dalları boş yer döşemek için kesik kök çimlenme ile göstermek. Yeni terminal dalları sürekli gelişme bu aşamada razıyız dendrites eklenir fazlalaştı. Ölçek çubuğu 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Da nöron axon rejenerasyon VNC içinde. (A) şematik Drosophila larva çiziminin bir slayt üzerinde monte edilmiş ve mikroskop altında görüntüsü. IV da nöron aksonlar içinde görüntülenmiştir VNC içinde sınıf bir ppk-CD4tdGFP / + larva. İki aday komissür kesimi Yakınlaştırılmış görüntü ve şematik çizimde gösterilir. Her biri iki yaralanma site (kırmızı daireler) vardır. (B) 8, 24 ve 72 s yaralanma (AI) sonra yansıma bir yaralı kesimi Confocal görüntüleri. Kırmızı çizgiler regrowing akson tasvir. (C) ölçüm ve normalleştirme, aksonlar regrowing. Ölçek çubuğu 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sinek kurma geçer zaman, dişi ve erkek kullanılan sayısı genotip ve belirli deneyler için gerekli larva sayısı bağlı olarak değişebilir. WT sinekler için tipik çapraz 10 kadın ve 5 erkek kullanır. Toplama penceresi, larva yönlendirmesiyle doğruluğunu bağlı olarak daralmış. Örneğin, 2-h koleksiyon dönem larva daha homojen bir nüfus ortaya çıkarır. Bu durumda, haçlar ayarlamak için 20 veya daha fazla bakire kadın kullanmak yeterli yumurta verim yardımcı olur. İlk günden verimidir genellikle kıt, böylece yumurta ile plaka odasını ayarladıktan sonra iki veya daha fazla gün toplamak. Ne zaman daha fazla yumurta ile plaka kültür, 60 mm kabında % 0.5 propiyonik asit çözüm sadece çanak nem korumaya yardımcı olmak ama aynı zamanda küf gelişimini önlemek su yerine doku emmek için önerilir.

Larva anestezi ve montaj cihazlarý ayarlarken, eter ile plastik eriyecek çünkü bir cam tabak kullanmaya dikkat edin. Cam tabak 15 cm plastik Petri kabına bir sızıntı halinde ev sahipliği yapmaktadır. Kağıt mendil larva etkili eter buharı tarafından nakavt böylece eter dish korunmasına yardımcı olur. Kehribar şişeleri aliquots eter depolamak için bırakarak ve eter damlacıkları içinde cam damlalık ile ekleme kullanılması önerilir. Eter doldurmak ve her zaman yemek için en iyi etkisi altındaki sıvı eter tabakası tutun.

Eter pozlama zamanlaması çok önemlidir: altında anestezi larva kurtarma görüntüleme oturum ve titrek görüntüler; ortasında neden bir anestezi aşırı doz veya eter sıvı ile doğrudan temas ölümcül neden olur. Hayatta kalma ve başarı oranı en üst düzeye çıkarmak için bizim kural aşağıdaki gibidir: kuyruğu seğiriyor; durur durmaz PNS yaralanma/görüntülemesi için larva almak MSS için tüm larva hareketsiz, hale gelinceye kadar bekleyin özellikle baş kesimleri. Hatta küçük bir hareket yaralanma ve VNC aksonlar görüntüleme ile engel olacaktır. Büyük larva uyutmak için daha uzun sürer eğilimindedir. Genellikle az 2 dk 72 h AEL genç larvalar için ve larva 72 h AEL büyük için 2-5 dk sürer.

İki fotonlu lazer zarar görme yoğunluğunu ayarlarken, "Live" inceden inceye gözden geçirmek--dan alınan doku Floresans sinyal değeri belirlenir. Yaralanma olduğu gibi adım 3.3 "Sürekli" tarama tarafından tanıtıldı. Floresans yaralanma kaynaklı artış nedeniyle yaralanma yerinde autofluorescence ve neurite kıdem iyi bir göstergesi hizmet vermektedir. Genellikle, Floresans spike görmek için 1-10 s alır. Floresans yükseltilmiş bir kez tarama zamanı denetlemek için önemlidir. PNS yaralanma için taramadan hemen durdurmak için esastır. Uzun süre maruz yaralanma sitesini büyütmek ve komşu dokulara zarar. Ancak, bu tarama zamanı ayarlamak ve yaralanma şiddeti işlemek için fırsat sağlar. Başarılı bir yaralanma bir lezyon boyutu çapı 3-4 mikron daha küçük olması. VNC axon yaralanma için VNC aksonlar çok daha derin gömülü da nöron PNS karşılaştırıldığında aksonlar/dendrites, derinin altında ve böylece istemek daha yüksek yoğunluk lazer. Genellikle bir kaç saniye daha üzerinde tarama buradan. Bu bütün axon paket kesilmiş sağlamaktır. Lezyon sitelerin RADIUS komissür paket yarısından fazlasını genişliğini ise, tür yaralanma siteler olarak başarısız sayılır. Bu tür larva düşük sağkalım oranı var ve analize dahil değil.

Yenilenme yeteneği larva etap üzerinden Axon rejenerasyon için benzer. Ama bir tek dendrite kesim sonra dendrite yenilenme için potansiyel rejenerasyon 72 h AEL19sonra azalır. Böylece, akson hasarı genellikle 48 saat - 72 h AEL ve dendrite yaralanma, 48 h AEL, rejenerasyon, 120 h AEL değerlendirilmesi ile gerçekleştirilir. 24h AEL larvaları da kullanılabilir, ancak onların daha küçük boyutu göz önüne alındığında daha dikkatli işleme gerektirir. Larva 120 h daha zor Imaging yapma AEL, sonra YavruIar. Bu nedenle, bizim son nokta genellikle 120 h AEL.

İnterrelationship dejenerasyon ve rejenerasyon arasında nedir? Yeniden oluşturma işlemi bu kez noktada başlamamıştır iken 24 h AI, PNS zarar görme normalde distal axon/dendrite WT yılında Wallerian dejenerasyon tamamladı. Bu nedenle, biz WT larva dejenerasyonu kesik neurites sadece çok sınırlı bir etkisi üzerinde yeniden oluşturma işlemi, hiç Eğer inanıyorsanız. VNC zarar görme aksonlar 8 h AI zaten dejenere başlamıştır ve akson enkaz etrafında yaralanma siteler hala bulunamadı iken AI 24 h akson rejenerasyon görülmektedir. Enkaz rejenerasyon engellemek için görünmüyor. Ancak, belirli durumlarda olabilir bir çakışma veya bile dejenerasyon ve rejenerasyon arasında bir çapraz karışma mümkündür. Aslında, bu yaşlı farelerde periferik sinir hasarı sonra enkaz temizleme genç hayvanlarda daha yavaş bildirilmiştir. Kullanılazlar, nöromüsküler kavşak daha yavaş reinnervation, hangi aksonlar karşılaşma yaşlı hayvanlarda Yenileyici engelleri daha fazla sayıda ilişkilendirilebilir gözlendi. Şaşırtıcı, ancak, akson yaşlı hayvanlar üzerinden hızlı bir şekilde yeniden ve verimli enkaz32ile karşı karşıya değil nöromüsküler kavşak siteleri reinnervate. Bu enkaz Gümrükleme kolaylaştırmak rejenerasyon teşvik için potansiyel bir strateji olabilir göstermektedir.

Diğer neuroregeneration modellerle karşılaştırıldığında, sinek duyusal nöron yaralanma modeli benzersiz avantajları vardır. Fare modelleri genellikle gerçekleştirmek için ay için haftalar sürer ve büyük ölçekli genetik ekranlar yürütmek için uygun değildir; C. elegans sadece bir ilkel merkezi sinir sistemi yakından değil özetlemek memeli CNS rejenerasyon engelleri vardır; memeliler farklı, Zebra balığı CNS aksonlar sağlam yeniden. Sinekler hızlı yaşam döngüsü, sinek genetik, erişilebilirlik ve klişeleşmiş desenlendirme aksonlar/dendrites sinek duyusal nöronların ve sinek duyusal sinir hücreleri-karakteristik yenilenme özellikleri çok yönlülük içinde belirli rejenerasyon sunucu_anabilgisayar_adı PNS ve MSS-sınırlı rejenerasyon yapmak Drosophila da nöronların neuroregeneration çalışmak için çekici bir model. Ayrıca, ezilmiş fare retina ganglion hücrelerinin (RGCs) üzerinden son yıllarda yapılan çalışmalarda da nöronal alt türlerinden ayrı rejenerasyon yetkinlik ayı öneririz; diğerleri görünüşte homojen sinir pakette bulunan33regrow başarısız, ancak bazı RGC alt türlerini yeniden oluşturabilirsiniz. Bu önemli bulgu nöronal türüne özgü stratejileri rejenerasyon ve fonksiyonel iyileşme tanıtmak için istismar olmalıdır öneriyor ve güçlü akson hasarı ve sonraki rejenerasyon analiz indüksiyon içinde gerçekleştirilmesi gerektiğini savunuyor bir nöronal alt tür özgü şekilde. Ayrıca, bu yenilenme türü-özgüllük için hücresel ve moleküler belirleyicileri büyük ölçüde bilinmeyen19,33kalır. Bu nedenle, bu sorunları çözmek için ideal paradigma da nöron yaralanma modeli sunar.

Axon rejenerasyon için karşılaştırıldığında, dendrite yenilenme üzerinde odaklanan çalışmalar çok kıtlaştıracak vardır. Dendrite yaralanma, travmatik beyin hasarı, kontur ve ateş, birçok formları gibi ortaya henüz neredeyse hiçbir şey hakkında dendrites yetenek tamir ve sinirsel bağlantılar reform için bilinir. Da nöron yaralanma modeli tekrar klişeleşmiş desenlendirme, sınıf özgüllük ve zamansal yönetmelik19, bu yönde keşfetmek için görüntüler son derece erişilebilir bir sistem sağlar.

Ayrıca PNS içinde etiketli bir tek axon zarar mümkün iken şekilde yaralanma a bohça-in aksonlar lezyon içinde CNS sonuçları gerçekleştirilir kayda değer olduğunu. İstenirse, MARCM34 ya da FLP-out klon35 yaklaşım tek aksonlar MSS etiketlemek için kullanılır. Ayrıca, gliyal hücreler aynı anda (Repo-Gal4, UAS-mRFP) mRFP ile etiketlenir zaman glia süreçlerin birikimi özellikle lezyon sitesinde görülmektedir. Ayrıca, Ptp99A, kondroitin sinek homolog ifade sülfat proteoglikan (CSPG) phosphacan / PTPRZ1, lezyon sitesinde yukarı düzenlenir. Ptp99A gliyal hücrelerle birlikte yerelleştirir ve yaralanma sitesi, ne için astroglial yara izi memeliler19,36,37bildirilmiştir için benzer bir yüzük benzeri yapıda oluşturan ferahlık veriyor. Sonuç olarak, örneğin gliyal hücreler veya bağışıklık hücreleri, diğer hücre tiplerinin imleçli birleştirildiğinde da nöron yaralanma modeli yaralı bir neuron ve çevresi arasında çok hücreli etkileşimlerin vivo içinde gerçek zamanlı izleme olanak sağlar çevre.

Bu sinek larvaları duyusal nöron yaralanma modeli bizi potansiyel neuroregeneration düzenleyiciler PNS ile CNS bulmak için fırsatlar sağlar iken, hala bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, bu yüksek-den geçerek mevcut aşamada değil. Genellikle, 5-6 genotip bir kişi tarafından bir hafta içinde gösterimi. Bu tarafsız bir ekran gerçekleştirmek için optimize edilmiş olması gerekir. İkincisi, eter anestezi larva üzerinde en fazla 20 dk için birkaç dakika sürebilir gibi uzun vadeli görüntüleme için en uygun değildir. Böylece, sırasıyla axon dejenerasyon ve rejenerasyon temsilcisi olan belirli zaman noktaları görüntüleme için seçilir. Bu iletişim kuralı aksonlar tam olarak zarar için bir yol sunuyor olsa da, üçüncü olarak, çevre dokulara zarar olasılığı tamamen kullanılabileceği belirlenmemiştir. VNC içinde bu dokuların gliyal hücrelerini, akson ve diğer nöronların dendrites olabilir. Bu potansiyel bilmeniz gereken en aza indirmek için biz yaralanma siteleri en aza indirmek, mümkün olan en düşük lazer güç uygulamak ve paralel olarak hem kontrol hem de gruplar deneme için aynı yordamları gerçekleştirin. Dördüncü olarak, CNS yaralanma paradigma ayarlama, sürecinde farklı yaralanma siteleri test edildi, yakın siteleri dahil olmak üzere kullanmayı seçti axon termini ve giriş noktası aksonlar VNC. Giriş noktaları daha zor daha derin doku içinde oldukları için incitmek ve taşımak büyük olasılıkla bulundu. Böylece, bu pratik nedenlerden dolayı biz daha tutarlı, daha kontrollü ve daha büyük ölçekli deneyler için iyi geçerli yöntem-e yeğlemek için. Bir potansiyel endişe, yukarıda da belirtildiği gibi postsinaptik bileşenleri ve gliyal hücreler gibi komşu dokulara zarar imkanı vardır. Öte yandan, bu olağanüstü bir soru nasıl zarar görmüş çevre dokular dejenerasyon ve akson rejenerasyon etkisi var. Örneğin, nasıl gliyal yara axon rejenerasyon etkiler. Bu başka bir nedeni neden bizim yaralanma modeli yakından yaralanma modelleri içinde akson ve dokuların çevresinde lezyon siteleri genellikle aynı anda yaralı memelilerde benzeyebilir sunar.

Lazer yaralanma tarafından hızlandırılmış mikroskobu takip axon/dendrite yenilenme eğitim için hassas bir tahlil olduğunu. Ancak, bir ana Bu testin üzerinden <$ 10 K için düşük-uç katı hal darbe lazerler, femtosecond lazer için için $25-100 K >$ 100 K için iki fotonlu lazerler aralıkları algılanan maliyet husustur. Axotomy29,38,39,40,41,42,43için, kullanılan farklı lazer sistemleri hakkında birkaç iyi tartışmalar vardır 44 , 45. Özet olarak, geleneksel lazerler içinde kesme akson hakkında için en iyi durumda 30-50 µm yüzeyden. Özellikle hedef alan derinliği45arttıkça daha fazla kayıplar femtosecond lazer ile karşılaştırıldığında nano ve pico ikinci lazerler ile olacak. Akson VNC içinde yaralamak için hangi derinliği genellikle yaklaşık 50-100 µm, doku hasarı en aza indirmek için esastır. Bu durumda, İki fotonlu lazer idealdir hangi lazer güç olmadan ödün doku penetrasyonu ikincil doku hasarı azaltmak odak düzlemi için odaklanır. Sonuç olarak, İki fotonlu sistem masraflı ama en hassas ve doku koruma sunuyor. Ancak, eğer sadece PNS aksonlar axotomy için hedef, geleneksel... titreşim daha uygun bir alternatif olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Jessica Goldshteyn teknik destek için teşekkür ederiz. Şarkı laboratuvar çalışmalarında NIH grant R00NS088211 ve entelektüel ve Gelişme Bozuklukları Araştırma Merkezi (IDDRC) Yeni Program Geliştirme Ödülü tarafından finanse edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous Acros Organics AC615080010
Halocarbon 27 Oil Genesee Scientific 59-133
Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L VWR 97062-948 
Agar powder, Alfa Aesar, 500GM VWR AAA10752-36
Grape juice Welch’s
Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%) VWR 64-17-5
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
Propionic Acid J.T.Baker U33007
Cover Glasses: Rectangles Fisher Scientific 12-544-D 50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope Zeiss
Zen software Zeiss
Chameleon Ultra II Coherent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yakura, J. S. Recovery following spinal cord injury. , (1996).
  2. Harel, N. Y., Strittmatter, S. M. Can regenerating axons recapitulate developmental guidance during recovery from spinal cord injury? Nature reviews. Neuroscience. 7, 603-616 (2006).
  3. Jurewicz, A., Matysiak, M., Raine, C. S., Selmaj, K. Soluble Nogo-A, an inhibitor of axonal regeneration, as a biomarker for multiple sclerosis. Neurology. 68, 283-287 (2007).
  4. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7, 617-627 (2006).
  5. Sun, F., He, Z. Neuronal intrinsic barriers for axon regeneration in the adult CNS. Curr Opin Neurobiol. , (2010).
  6. Liu, B. P., Cafferty, W. B., Budel, S. O., Strittmatter, S. M. Extracellular regulators of axonal growth in the adult central nervous system. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 361, 1593-1610 (2006).
  7. Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal intrinsic mechanisms of axon regeneration. Annu Rev Neurosci. 34, 131-152 (2011).
  8. Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. Nogo limits neural plasticity and recovery from injury. Curr Opin Neurobiol. 27, 53-60 (2014).
  9. He, Z., Jin, Y. Intrinsic Control of Axon Regeneration. Neuron. 90, 437-451 (2016).
  10. Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
  11. Geoffroy, C. G., Hilton, B. J., Tetzlaff, W., Zheng, B. Evidence for an Age-Dependent Decline in Axon Regeneration in the Adult Mammalian Central Nervous System. Cell Rep. 15, 238-246 (2016).
  12. Geoffroy, C. G., et al. Effects of PTEN and Nogo Codeletion on Corticospinal Axon Sprouting and Regeneration in Mice. J Neurosci. 35, 6413-6428 (2015).
  13. Jin, D., et al. Restoration of skilled locomotion by sprouting corticospinal axons induced by co-deletion of PTEN and SOCS3. Nat Commun. 6, 8074 (2015).
  14. Wang, X., et al. Axonal regeneration induced by blockade of glial inhibitors coupled with activation of intrinsic neuronal growth pathways. Exp Neurol. 237, 55-69 (2012).
  15. Fang, Y., Bonini, N. M. Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila models of nerve injury. Annual review of cell and developmental biology. 28, 575-597 (2012).
  16. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
  17. Leyssen, M., et al. Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain. The EMBO journal. 24, 2944-2955 (2005).
  18. MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50, 869-881 (2006).
  19. Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes Dev. 26, 1612-1625 (2012).
  20. Song, Y., et al. Regulation of axon regeneration by the RNA repair and splicing pathway. Nat Neurosci. 18, 817-825 (2015).
  21. Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
  22. Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Curr Biol. 22, 590-595 (2012).
  23. Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
  24. Brace, E. J., DiAntonio, A. Models of axon regeneration in Drosophila. Exp Neurol. 287, 310-317 (2017).
  25. Hao, Y., Collins, C. Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 44, 84-91 (2017).
  26. Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).
  27. Sugimura, K., et al. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
  28. Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432, 822 (2004).
  29. Wu, Z., et al. Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15132-15137 (2007).
  30. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Mol Biol Cell. 21, 767-777 (2010).
  31. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
  32. Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33, 19480-19491 (2013).
  33. Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85, 1244-1256 (2015).
  34. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
  35. Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
  36. Buss, A., et al. NG2 and phosphacan are present in the astroglial scar after human traumatic spinal cord injury. BMC Neurol. 9, 32 (2009).
  37. McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar. J Neurosci. 19, 10778-10788 (1999).
  38. Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. J Microsc. 234, 1-8 (2009).
  39. Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Phys Rev Lett. 99, 158104 (2007).
  40. Venugopalan, V., Guerra, A. 3rd, Nahen, K., Vogel, A. Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation. Phys Rev Lett. 88, 078103 (2002).
  41. Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans. Opt Express. 16, 5963 (2008).
  42. O'Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
  43. Tsai, P. S., et al. Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems. Curr Opin Biotechnol. 20, 90-99 (2009).
  44. Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
  45. Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. J Vis Exp. , (2011).

Tags

Tıp sorunu 135 Drosophila duyusal nöron dendritik arborization nöron sinir hasarı neuroregeneration axotomy dendriotomy PNS CNS
Neuroregeneration periferik ve santral sinir sistemi çalışmak için bir <em>Vivo Drosophila</em> yaralanma modeli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, D., Li, F., Guttipatti, P.,… More

Li, D., Li, F., Guttipatti, P., Song, Y. A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System. J. Vis. Exp. (135), e57557, doi:10.3791/57557 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter