Summary
여기, 우리는 암에 대 한 신뢰할 수 있는 전 임상 모델을 만드는 생물학 관련 사이트에서 초음파 유도 신경 (NB) 및 Ewing의 육 (ES) 세포의 주입을 활용 (설립 세포 및 종양 환자에서 파생 된 셀) 프로토콜 제시 연구입니다.
Abstract
항 암 치료의 임상 시험 관련이 종이 식 모델을 암의 타고 난 경향을 모방에 의존 합니다. 표준 피하 측면 모델의 장점 절차 간편 하 고 모니터 종양 진행과 침략 적 영상 없이 응답 하는 기능을 포함합니다. 이러한 모델 자주 변환 임상 시험에서 일치 하지 않는 고 네이티브 microenvironment의 부족으로 전이 생산 하기 위해 낮은 경향으로 생물학으로 관련 된 특성을 제한 했다. 비교에서는, 기본 종양 사이트에서 orthotopic이 종이 식 모델 종양 microenvironment를 모방 하 여 먼 전이성 확산 등 중요 한 질병 특성을 복제 표시 되었습니다. 이러한 모델은 종종 지루한 수술 연장된 마 취 시간 및 회복 기간을 필요합니다. 이 해결 하기 위해 암 연구자는 최근 조직 감독 murine 모델의 신속 하 고 신뢰할 수 있는 설립에 대 한 수 있는 전 임상 실험에 대 한 암이 종이 식 모델 확립을 초음파 유도 주입 기술을 활용 하 고. 초음파 시각화는 또한 종양 engraftment 성장과의 경도 평가 대 한 비 침범 성 방법을 제공 한다. 여기, 우리는 ES에 대 한 주 및 신장이 캡슐에 아드레날린 선의 활용 암 세포의 주입 초음파 유도 하는 방법을 설명 합니다. 이 최소한 침략 적 접근 암 세포 성장 및 전이, 조직 특정 위치에서의 지루한 오픈 수술 주입을 극복 하 고 병 적인 복구 기간 상거래. 우리가 설립된 셀 라인과 orthotopic 주입에 대 한 환자 파생된 셀 라인의 사용률을 설명합니다. 미리 만든된 상업 키트 종양 분리 및 luciferase 셀의 태그에 대 한 사용할 수 있습니다. 이미지 지도 사용 하 여 세포 현 탁 액의 주입 전 임상 모델의 생성에 대 한 최소한 침략 적 하 고 재현 가능한 플랫폼을 제공 합니다. 이 메서드는 방광, 간, 췌 장 수많은 암 모델에 대 한 미 개발된 잠재력을 예증 등 다른 암에 대 한 신뢰할 수 있는 전 임상 모델을 만드는 데 이용 된다.
Introduction
동물이 종이 식 모델은 새로운 항 암 제 치료의 전 임상 연구를 위한 필수적인 도구입니다. 표준 murine xenografts 종양 성장 모니터링에 대 한 효율적이 고 쉽게 접근할 수 있는 사이트를 제공 하는 셀의 측면은 피하 주입에 의존 합니다. 피하 모델의 단점은1전이를 그들의 잠재력을 제한 수 있습니다 종양 특정 생물 학적 특성의 그들의 부족. 이러한 한계는 종양에서 세포는 전이성 잠재적인2관련 microenvironment를 제공 하는 기본 조직 위치에 engrafted orthotopic xenografts 사용 하 여 극복 됩니다. Orthotopic이 종이 식 모델 원래 생물 학적 기능을 유지 하 고 전 임상 약 발견3,4에 대 한 신뢰할 수 있는 모델을 제공. 암 세포 이식 조직 감독에 대 한 활용은 설립된 셀 라인 또는 환자 종양에서 환자에서 파생 된 셀입니다. 암 세포 선에서 설립 xenografts 환자 파생된 xenografts5에 비해 기본 종양에서 높은 유전 분기를 전시 수 있습니다. 이 감안할 때, 환자 파생 orthotopic xenografts 설립 암 약물 발견에 새로운 치료제를 테스트 하기 위한 기본 표준 되고있다.
소아 암 신경 (NB)에서 orthotopic이 종이 식 모델 기본 종양 생물학을 정리 하 고 전이 확산 주의6,7의 일반적인 사이트를 개발. NB은 아드레날린 선 또는 paravertebral 공감 체인을 개발 하고있다. Orthotopic 이식의 가장 일반적인 방법은 오픈 트랜스-복 부 수술 절차를 필요로합니다. 이러한 메서드는 종종 지루한, 높은 동물 사망률, 그리고 복잡 한 복구 기간. 고해상도 초음파 암 연구8,9에 대 한 몇 가지 murine 모델의 개발에 종양 세포의 식을 조직 감독에 대 한 최근 이용 되어 있다. 기술은 재현, 효율적, 안정적이 고 관련 전이성 종양 xenografts10,11의 설립에 대 한 안전입니다.
소아 암 xenografts 세포 선 및 환자 파생 된 종양 세포의 초음파 기반 대상 기관 현지화 및 바늘 주입에 의해의 설립 시연된11입니다. NB murine 아드레날린 선에 대상에 대 한 기술은 이용 되었다. Ewing의 육 종 (ES)은 주로 대 퇴 골과 골반 뼈12등 긴 뼈에서 일반적으로 볼 수는 뼈가 있는 암 이다. 사건 보고서는 주로 뼈가 있는 암 성장 신장 조직에서 가능 여부 확인, 하 신장 하위 capsular 위치 선정 되었다 orthotopic 이식13나타났습니다. 종양 세포의 신장 하위 capsular 세포 이식 ES14에 대 한 자연 스러운 전이 공부 하는 유망 모델으로 활용 되었습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 작업과 미시간 대학 기관 검토 위원회 (흠 00052430)에 따라 수행 되었다 사용과 관리의 동물 (UCUCA)에 대학 위원회에 의해 승인 하는 절차를 따릅니다. 단위에 대 한 실험실의 동물 의학 (ULAM) 동물 보호를 만들었다.
모든 작업과 미시간 대학 기관 검토 위원회 (흠 00052430)에서 승인 되었으며 모든 인간의 연구 윤리 위원회 규정에 따른다. 인간의 세포는 잠재적으로 유해 물질, 그래서 모든 특별 한 예방 조치 및 해당 교육 기관에 필요한 적절 한 biosafety 관행에 따라 간주 됩니다. NSG 마우스는 심하게 immunocompromised 그리고 환경에서 일반적으로 발견 되는 박테리아에 의해 발생 하는 질병에 취약.
이식 하 고 주사를 수행에 대 한 자료를 준비할 때 항상 엄격한 무 균 기술을 사용 합니다.
1. 세포 배양
- 최소한의 필수적인 매체 설립된 인간의 NB 셀 라인 (SH-SY5Y, SK-N-BE2, 및 IMR32)을 성장 10% 태아 둔감 한 혈 청, 2mm 글루타민, 100 단위/mL 페니실린, 및 100 μ g/mL 스 보완. 1 mM pyruvate와 0.075% NaHCO3IMR32 셀 추가 보충. 37 ° C, 5% CO2 , 70-80% 합류. 에서 모든 셀을 유지
- 인간의 ES 세포 선 (TC32, A673, CHLA-25, A4573) 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 6 mM L-글루타민 보충 RPMI 매체에 성장. 37 ° C, 5% CO2 70-80% 합류. 에서 모든 셀을 유지
- 인증에 대 한 모든 셀 라인을 보냅니다.
참고: 셀 인증 외부 시설에서 이루어집니다, 그리고 승인을 참조 하십시오.
2. 기본 환자 파생 된 종양 세포의 준비
- 환자 동의와 동의 수확 로컬 제어 및 보존을 위한 조직 스토리지 솔루션에 실험실에 수송을 위한 외과 절제술을 받은 환자에서 인간의 NB 종양 조직 삭제.
참고: 모든 환자 샘플은 드 식별 및 기관 검토 위원회 지침에 따라 처리. - 종양 조직 종양 분리 키트를 사용 하 여에서 한 단일 환자 유래 암 세포 현 탁 액 (UMNBL001, UMNBL002)를 생성 합니다. 포함 된 RPMI 버퍼, 효소의 효소 R 100 µ L H의 200 µ L 및 25의 5 mL 100 mm 셀 문화 접시에 종양의 약 0.5 g을 전송 인간의 종양 분리 키트에서 효소 A의 µ L.
- 작은 조각 (2-4 m m 각)으로 종양을 말하다가 위 및 조직 집게를 사용 하 여. 2.2 단계에서 솔루션이 파편을 믹스.
- Dissociator 튜브로 종양 혼합 플라스틱 고 튜브를 닫습니다. 튜브를 반전 하 고 조직 dissociator의 소매에 연결 합니다. 프로그램 h_tumor_01에서 실행 합니다.
- 간헐적인 분쇄 15 분 마다와 회전 선반에 1 시간 동안 37 ° C에 위에서 얻은 종양 세포 현 탁 액을 품 어.
- 새로운 50 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 RPMI의 10 mL를 추가 합니다. 셀 서 스 펜 션 5 분 314 x g에서 원심
- 제거는 상쾌한 고 RPMI의 5 ml에서는 펠 릿을 일시 중단. 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해이 솔루션을 전달 하 고 신선한 50 mL 원뿔 튜브로 긴장된 솔루션을 수집 합니다. 이 여과기 RPMI 미디어의 5 mL로 한번 세척 하 고 5 분 펠 릿 수집 314 x g에서 혼합물을 원심.
- Hemacytometer15를 사용 하 여 셀 밀도 측정 합니다. 4 × 105 셀/10 µ L의 최종 농도를 RPMI에 위에서 얻은 펠 릿을 일시 중단 합니다. 이 세포 현 탁 액의 5 µ L 10 µ L의 각 주입에 대 한 셀 솔루션을 만들기 위해 matrigel의 5 µ L을가지고.
참고: 사용 RPMI 양의 셀 밀도 측정에 따라 달라 집니다. 예를 들어 얻은 펠 릿의 측정된 셀 밀도 4 x 105 셀 이면 RPMI의 10 µ L에 펠 릿을 일시 중단.
3. luciferase 암 세포의 태그
- 변환 미디어 바이러스 표면에 뜨는 EF1a-Luc2-IRES-mCherry의 5 mL 및 줄기 세포 미디어의 5 mL와 10 mL을 확인 합니다. 1 x polybrene의 7.5 µ L를 추가 합니다.
- 5 × 106 암 세포 변환 미디어 믹스 100 m m의 매우 낮은 첨부 접시에 접시. 37 ° C, 5% CO2 에서 밤새 품 어.
참고: 낮은 부착 판 사용, 셀 접시에 준수 하지 것 이다. - 후 24 h, 포함 하는 조직 문화 후드 셀 100 mm 접시 가져오고 15 mL 원뿔 튜브로 혼합물을 전송. 세포 현 탁 액 셀 펠 릿을 5 분 동안 314 x g에서 원심 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1의 1 mL와 함께 한 번 셀 펠 릿을 세척 하 고 HBSS 1% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 포함의 1 mL에 셀 펠 릿을 중단.
- Luciferase 세포 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 분석에 GFP-긍정적인 신호에 따라 정렬 합니다. 플레이트 100 m m 조직 문화 취급에 정렬된 셀 접시와 70-80% 합류, 37 ° C와 5% CO2 필요할 때까지 유지.
- Luciferase 분석 결과 키트 luciferase 신호를 확인 합니다. 당 illuminometer 호환 96 잘 접시 10 x 104 정렬 셀 접시 고 37 ° C, 5% CO2에서 하룻밤 셀을 품 어. 24 시간 후 실내 온도에 96 잘 접시를 가져올 하 고 1:1 비율로 스 교양된 미디어 안정-저런 형광 시 약 추가. 5 분 동안 lyse 세포 발광 분 광 광도 계에서 읽을 수 있습니다.
- 조직 문화 후드 100 mm 접시를 가져. 표면에 뜨는 미디어를 삭제 합니다. 1 x PBS의 2 개 mL를 한번 셀을 씻어.
- 0.25 %trypsin 2 개 mL를 추가 하 고 2-3 분 인큐베이터를 100 mm 접시를 반환 합니다. 2-3 분 후 현미경 빠질된 셀에 대 한 확인 하 고 비활성화 trypsin RPMI의 8 mL를 추가 합니다.
- 세포 현 탁 액 15 mL 원뿔 튜브에 펠 릿을 5 분 동안 314 x g에서 원심 분리기를 수집 합니다. 폐기는 상쾌한. 1 x PBS의 1 mL와 함께 셀 펠 릿을 세척, RPMI의 5 ml에서는 펠 릿을 일시 중단 하 고 hemacytometer15를 사용 하 여 셀 밀도 결정 합니다. Yhe 314 x g는 펠 렛을 얻기 위해 5 분 동안에 전지 솔루션 남은 원심
- 4 x 105 셀/10 µ L의 농도를 RPMI에 펠 릿을 일시 중단 합니다. 세포 현 탁 액의 5 µ L 10 µ L의 각 주입에 대 한 셀 솔루션을 만들기 위해 matrigel의 5 µ L을가지고.
4. 초음파 유도 아드레날린 선 (NB) 또는 신장 하위 캡슐 (ES) 이식
참고: 모든 초음파 절차는 높은 해상도 vivo에서 이미징 시스템을 사용 하 여 수행 됩니다. 설명 된 절차에 대 한 변환기를 40 m h z의 중심 주파수와 22-55 MHz의 대역폭 사용 되었다.
- 6 8 주 오래 된 면역 결핍 NSG 쥐 모든 주입 절차를 활용 합니다.
- 진정 matrigel 및 압력가 해밀턴 주사기 27 G 바늘 (1.25"), 장착 및 22 G 카 (0.9 m m 외부 직경, 25 m m 길이) 4 ° c.에서 하룻밤
- 장소 준비 얼음에 3 단계에서 셀 솔루션.
- O2 2 L/min에서 isoflurane 2%를 사용 하 여 유도 챔버에서 마우스 anesthetize
참고: 적절 한 마 취는 활성 운동 부족과 자발적인 호흡의 유지 보수와 함께 결정 됩니다. - 일단 마 취, depilate 뒤 및 머리 제거 로션 (예: Nair)는 면도기를 사용 하 여 동물의 측면.
- 전송 동물 복 부 측면과 이미징 플랫폼, 동물의 코는 nosecone에 배치 하 고 isoflurane 흡입 하는 동안 보안은.
- 건조를 방지 하기 위해 동물의 눈에 광 연 고를 배치 합니다. 실수로 움직임을 방지 하기 위해에서 마우스를 테이프.
- Murine 간, 베 나 정 맥, 비장, 왼쪽된 신장, 및 인접 한 왼쪽된 부 신 동맥 초음파 시각화를 사용 하 여 식별 합니다.
- 멸 균 장갑, 마스크와 모자를 사용 하 여 개인 보호 및 살 균 조건의 유지 보수에 대 한. 초음파-가이드에서 부드럽게 피부를 통해 22 G 카 테 터를 삽입 하 고 다시 근육 세포 주입을 위한 채널을 제공 하도록 왼쪽된 부 신 동맥에 직접. 바늘을 제거 하 고 장소에 테를 떠나.
- 부하 냉장된 해밀턴 주사기 작은-내경 바늘 10 µ L 셀 솔루션의와 함께 장착 후 부 신 동맥의 중심에 위치 하는 카 테 터를 통해 stereotactically 주사기를 안내.
- 대상된 부 신 조직으로 세포를 주사. 바늘 matrigel 설정할 수 있도록 1-2 분을 위한 장소에 둡니다. 천천히 바늘, 카 테 터 제거 다음 제거 합니다.
- 다시 그들의 감 금 소에 쥐를 놓고 마우스 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복을 보장 합니다.
참고:이 기법은 최소한 침략 적 특성상 포스트 절차 통증은 최소한의 하지만 여전히 쥐 건강 검사. 매일 모니터링 "는 문장으로 지켜져야 한다:"만약 통증이 나 조 난의 예기치 않은 징후는 과정에서 확인 된 실험의 진통 또는 다른 의료 서비스에 대 한 정보 기관 수의 지원 단위와 상의 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
제시 하는 절차를 사용 하 여, 초음파 유도 주입 주의 세포의 아드레날린 선으로 온수 수술 테이블을 갖춘 전용된 프로시저 룸에서 이루어졌다. 팔과 발 패드 murine 심장 활동 (그림 1A)를 모니터링 하기 위한 배치 했다. 동물 마 취 isoflurane 원뿔 흡입을 사용 하 여 아래에 남아 있었다. 고해상도 초음파 프로브를 사용 하 여 왼쪽된 신장 신장 (그림 1B)에 그냥 두개골 아드레날린 선으로 확인 되었다. 바늘 다음 직접 시각화 (그림 1C)에서 아드레날린 선으로 전진 되었다. 초기이 기술 활용, 동안 methylene 청색 염료 혼합 matrigel 부 신 동맥의 올바른 지역화를 확인 사용 되었다. 동물을 희생 하 고 프로시저의 성공 부 신 캡슐 (그림 1D) 아래 methylene 청색 염료를 시각화 하 여 검 시에 확인 되었다.
주간 초음파 및 생물 발광 영상 종양 engraftment와 성장 속도 모니터링 하는 데 사용 하는 형식 이었다. 관심 영역의 생물 발광 영상 10의 최소 수와 광자/s/cm2/steridian (p/s/cm2/sr)로 측정 했다6 전 임상 실험9 ( 에 대 한 적절 한 종양 크기의 108 표시 그림 2). 생물 발광에 통계적으로 유의 한 증가 보였다 t-검정을 사용 하 여 분석 8 주 기간 동안 지적 했다 (* p< 0.05; * *p< 0.001; * * *p< 0.0001). 초음파 이미징 종양 영역 및 볼륨의 비 침범 성 측정 허용. 생물 발광 측정 함께이 모니터링 종양 engraftment 및 진행 (그림 3). 유사한 절차는 신장 하위 캡슐 (그림 4)에 주입 하는 ES 세포에 대 한 활용 했다.
총 및 조직학 분석 결과 종양의 특징 기본 종양과 전이 검 시에서. 조직 샘플 morphologic 셀 패턴 검사 되었고 종양 관련 단백질 마커 (그림 5, 그림 6)에 대 한 스테인드. NB 셀 라인 (IMR32, SH-SY-5Y, SK-N-BE2, UMNBL001, UMNBL002)에 대 한 1 차 종양 engraftment 62-100%에서 0-100에서 본 전이와 원거리 주입 된 쥐의 %. 가장 강력한 전이 SK-N-BE2 (33%)와 UMNBL002에서 볼 수 있었다 (100%). NB에 대 한 전이성 사이트 림프절, 간, 폐, 외피 뼈 했다. ES 세포 라인 (A4573, A673, CHLA-25, TC-32) 0-40에서 본 전이 함께 60-100%에서 ranged 신장 하위 capsular engraftment 주입 된 쥐의 %. ES에 대 한 검사는 전이성 사이트 림프절, 외피 뼈와 폐 포함. 가장 강력한 engraftment (100%)와 전이 (40%) TC-32이 종이 식 쥐에서 보였다.
그림 1 . Murine 아드레날린 선 현지화 및 NB 초음파-유도 세포 이식. (A) 고해상도 초음파 이미징 murine 복 부 장기의 부 신 종양 세포의 식을 허용. (B) 왼쪽된 신장 확인 되었습니다. (C) 왼쪽된 부 신 동맥은 왼쪽된 신장에 인접 한 구조 라운드 hypoechoic (어두운)으로 있습니다. 바늘은 아드레날린 선 세포를 주입 하 여 뒤에 전진 되었다. (D) matrigel와 methylene 청색 염료의 혼합 주입 절차의 정확도 평가 하기 위해 사용 되었다. 대표 비보 전 이미지 왼쪽된 신장과 부 신 캡슐 및 페리-부 신 공간 matrigel와 methylene 청색 염료와 아드레날린 선. 이 수치는 반 노드, 허가 수정 되었습니다 R.A. 외. 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . Vivo에서 종양 engraftment과 성장 속도의 생물 발광 영상. (A) 인간의 주의 부 신 xenografts engraftment 및 종양 성장에 대 한 8 주 동안 감시 되었다. (B) 최대한 생물 발광 신호는 관심의 영역 내에 결정 했다. NB 셀 라인 (SH-SY5Y, IMR 32, SK-N-BE2) 및 환자 파생 셀 (UMNBL001, UMNBL002) 시간이 지남에 빛남 및 성장 패턴을 증가 했다. 8 주 동안 생물 발광의 증가 통계적으로 유의 한 (*p< 0.05; * *p< 0.001; * * *p< 0.0001). 이 수치는 반 노드, 허가 수정 되었습니다 R.A. 외. 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . Vivo에서 초음파 이미징의 성장과 종양 engraftment. 초음파 영상 모니터링 종양 진행 vivo에서 . 초음파 이미지와 1, 2 및 8 주에 해당 생물 발광 이미지 표시 됩니다. 1 주일에 engraftment 두 이미징 형식에서 구상 했다. 종양 위치와 볼륨은 초음파 이미징 사용 하 여 하는 것을 계산 했다. 3D 초음파 이미지 미러 삭제 종양 연구의 완료에. 이 수치는 반 노드, 허가 수정 되었습니다 R.A. 외. 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . Murine 신장 현지화 및 ES 세포의 초음파 유도 주입. (A) 생물 발광 종양 빛남 및 성장 모니터링 하는 데 사용 되었다. (B-C) 동물 복 부 구조를 둘러싼 왜곡 및 근육 등 현지 구조에 침공 로컬로 침략 적인 종양 개발. 이 수치는 반 노드, 허가 수정 되었습니다 R.A. 외. 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . NB와 ES이 종이 식 종양의 종양 histopathology. (A) NB이 종이 식 쥐 인접 한 복 부 장기를 왜곡 부 신 및 페리-부 신 선 사이트에서 로컬로 infiltrative 기본 종양을 했다. (B) 미세 (20 X, 바 = 50 µ m),이 종이 식 부 신 종양 형태 론 적 특징을 보여준 인간의 주의와 일치 (제대로의 클러스터 분화 세포를 각도), 가끔 의사로 제트 형성 (화살표)를 포함 하 여. (C) 종양 조직 보여준 강한 티로신 hydroxylase (NB 종양 마커) immunoreactivity (40 X, 바 = 40 µ m, 긍정적인 컨트롤 왼쪽된 패널에 표시 된 얼룩, 1: 100). (D)에 종이 식 종양 조직학 특징 infiltrative ES와 일치 했다 (40 X, 바 = 40 µ m), 미세 섬유 혈관 stroma, effacing 및 정상 인접 한 신장 압축 구분 epithelioid 세포를 각도의 클러스터 (화살표 압축; 신장 실질의 나머지)입니다. (E) ES 종양 조직을 보여 ES 종양 마커 CD99 강한 막 immunoreactivity (40 X, 바 = 40 µ m, 긍정적인 컨트롤 왼쪽된 패널에 표시 된 얼룩, 1: 100). 이 수치는 반 노드, 허가 수정 되었습니다 R.A. 외. 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 . 먼 전이 xenografts 초음파 유도 주입 기술에 의해 설립에 개발. (A) 생물 발광 부 신 공간 및 외피 뼈에서 전이성 foci에서 기본 NB 종양을 보여주는 영상. (B) 현미경 분석 시연 전이성 종양 (화살표) 골 수 구멍 및 근 위 대 퇴 골의 피 질 골을 effacing (4 X, 바 = 400 µ m). (C) 티로신 hydroxylase 외피 뼈 NB 전이성 사이트의 세포질 immunoreactivity (40 X, 바 = 40 µ m). (간 정 맥 내에서 간 전이 (화살표)와 환자 파생 orthotopic이 종이 식 (UMNBL002)의 D) 현미경 검사 법 (화살촉 보여줍니다 내 피 세포), 인접 한 간 (L) 실질을 침투 하 고 (20 X, 바 = 50 µ m). (E) 신경 미세 전이 (화살표) 폐 실질 내 (40 X, 바 = 40 µ m). 이 수치는 반 노드, 허가 수정 되었습니다 R.A. 외. 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NB 및 ES 세포의 주입 초음파 기반 암 생물학에서 전 임상 연구에 대 한 안정적인 murine xenografts를 설정 하는 효율적이 고 안전한 방법입니다. 초음파 유도의 성공에 중요 한 조직 대상으로 이식 존재와 해부학 관심의 기관 현지화 및 종양 세포의 정위 적 주사에 전문성을 갖춘 훈련 된 인원의 가용성 이다.
종양 조직의 분리 설명된 환자 파생이 종이 식 모델을 개발 하는 중요 한 단계로 판명. 기본 종양 조직 세포 microenvironment 및 주변 기질 종양 통풍 관 또는 engraftment에 영향을 미칠 수 있습니다 포함 되어 있습니다. 셀 계산, 분리 과정 완전 하 던 후, 주입 및 성공적인 종양 engraftment 최적의 셀 수를 고려 하는 2 x 105 셀/10 μ와 샘플에서 세포 밀도의 계기를 제공 합니다.
Luciferase 종양 engraftment의 유효성 검사에 대 한 허용 하는 셀의 태그 및 10 생물 발광 신호를 측정 하 여 종양 성장의 모니터링 106 8 종양 이해9를 나타내는 것으로 간주 되 고. 성공적인 변환 되도록 luciferase 활동 확인 했다 생체 외에서 세포의 주입 전에. 이것은 면역 형광 검사, luciferase 분석 결과 키트, 및 생물 발광 신호에 대 한 셀을 검사 하 여 이루어졌다. 생물 발광을 측정 하는 데 사용 하는 설정은 일정, 주간 측정 하는 동안 일관 된 데이터를 제공 유지 했다.
종양의 ex vivo histopathological 분석 셀 유형 및 단백질 표식에 대 한 특정 얼룩과 결과 종양의 형태를 확인 했다. Histopathological 분석 종양 engraftment 전이 초음파와 발광 영상에 의해 증명 확인.
초음파-유도 세포 이식의 장점에는 비-침략 적 자연, 최소한의 동물 복구 시간, 그리고 몇 가지 성공이 종이 식 모델의 설립에서 성장 성공 포함 됩니다. 초음파 이미징 vivo에서 종양 진행 및 종양 볼륨을 모니터링 하는 데 신뢰할 수 있는 방법을 제공 합니다. 이러한 전 임상 모델에서 종양 5 주 이내 전이 함께 로컬 침략 적인 질병에 점진 하 고. 한계는 고해상도 이미징 기술의 가용성 및 지속적으로 대상 기관을 지역화 하는 기능을 포함 합니다. 관심의 기관의 초음파 영상에 전문성을 갖춘 직원의 기술의 중요 한 요소입니다.
고해상도 초음파 이미징의 여부는 실질적으로 지난 10 년간 증가 했다 고 사용 임상 연습 뿐만 아니라 실험실 연구에 확장 하는 계속 됩니다. 현대 murine xenografts의 개발에 대 한 초음파의 이용 암 약물 발견에 대 한 전 임상 연구 모델을 발전에 대 한 잠재력을 가진 유망한 응용 프로그램입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자 아무 공개 있다.
Acknowledgments
이 작품은 로버트 우드 존슨 재단/아 모스 의료 교수 개발 프로그램, Taubman 연구소, 그리고 섹션 소아 수술, 미시간 대학에서 지원을 받았다. 저자는 Kimber Converso Baran와 닥터 마커 스 Jarboe 초음파 주입 절차와 지원 및 이미징 플랫폼에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 우리를 통해 그의 그림 그래픽 폴 Trombley 감사합니다. 우리는 또한 분자 이미징 및 종양 이미징 코어 종합 암 센터 NIH에 의해 부분에서 지원 되는 센터의 사용에 대 한 미시간 대학에서 방사선과 부서 감사 P30 CA046592 부여 합니다. 미시간 생리학 형질 코어 NIH (OD016502)와 프 랭 클 순환기 센터에서 교부에 의해 부분에서 지원 되는 대학. 셀 라인 인증 IDEXX RADIL Bioresearch 시설, 컬럼비아, 미주리에서 수행 되었다 우리 태 미 스 톨 박사 Rajen Mody, 모트 고체 종양 종양학 프로그램 감사합니다. 우리의 환자와 가족은 기꺼이 그들의 영감, 용기, 그리고 우리의 연구의 지속적인 지원에 대 한 인정 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| NOD-SCID | Charles River | 394 | |
| NSG | The Jackson Laboratory | 5557 | |
| Cell Line | |||
| NB | |||
| IMR-32 | ATCC | CCL-127 | Established human neuroblastoma cell line |
| SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | Established human neuroblastoma cell line |
| SK-N-Be2 | ATCC | CRL-2271 | Established human neuroblastoma cell line |
| ES | |||
| TC32 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A673 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| CHLA-25 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A4573 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| Cell Line media | |||
| RPMI | Life Technologies | 11875-093 | |
| Matrigel | BD BioSciences | 354234 | |
| Dissociation | |||
| Dissection Tools | KentScientific | INSMOUSEKIT | |
| Human Tumor Dissociation Kit | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| Luciferase Tagging | |||
| Lenti-GFP1 virus | University of Michigan, Vector Core | Luciferase Virus | |
| Steady Glo-Luciferase Assay Kit | Promega | E2510 | |
| Bioluminescence Imaging | |||
| Ivis Spectrum Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| D-Luciferin | Promega | E160X | |
| Anesthetic | |||
| Inhaled Isoflurane | Piramal Critical Care Inc | 66794-0017-25 | |
| Ultrasound Guided Injection | |||
| Vevo 2100 High Resolution Imaging | Vevo | 2100 | |
| Hamilton Syringes (27 gauge needle) | Hamilton | 80000 | |
| 22 Gauge Angiocatheter | BD Biosciences | 381423 | |
| Optical ointment | Major Pharmaceuticals | 301909 | |
| Nair | Church & Dwight Co | Hair Removal agent | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel | Parker | Ultrasound gel | |
| Histology | |||
| CD99 | DAKO | M3601 | Primary Antibody |
| Tyrosine Hydroxylase | Sigma-Aldrich | T2928 | Primary Antibody |
| Secondary HRP-Polymer antibody | Biocare | BRR4056KG | |
| Miscelleneous | |||
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| P1000 pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| P200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| P1000 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375E | |
| P200 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Portable pipette aid | Drummond | 4-000-101 | |
| digital animal Weighing Scale | KentScientific | SCL-1015 | |
| Calipers | Fisher Scientific | 06-664-16 | |
| 6well low attachment plates | Corning | 07-200-601 | |
| 10 cm Tissue Culture Treated Dishes | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G |
References
- Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Ann Oncol. 27 (7), 1190-1198 (2016).
- Fidler, I. J., Hart, I. R. Biological diversity in metastatic neoplasms: origins and implications. Science. 217 (4564), 998-1003 (1982).
- Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation. Eur J Cancer. 40 (6), 852-857 (2004).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic Models are Necessary to Predict Therapy of Transplantable Tumors in Mice. Cancer Metastasis Rev. 17 (3), 279-284 (1998).
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).
- Khanna, C., Jaboin, J. J., Drakos, E., Tsokos, M., Thiele, C. J. Biologically relevant orthotopic neuroblastoma xenograft models: Primary adrenal tumor growth and spontaneous distant metastasis. In Vivo. 16 (2), 77-85 (2002).
- Stewart, E., et al. Development and characterization of a human orthotopic neuroblastoma xenograft. Dev Biol. 407, 344-355 (2015).
- Jäger, W., et al. Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts. J. Vis. Exp. (84), e51123 (2014).
- Teitz, T., et al. Preclinical Models for Neuroblastoma: Establishing a Baseline for Treatment. PLoS ONE. 6 (4), e19133 (2011).
- Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts retain metastatic patterns and geno- and phenotypes of patient tumours. International Journal of Cancer. 136 (5), 252-261 (2015).
- Van Noord, R. A., et al. Tissue-directed Implantation Using Ultrasound Visualization for Development of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. In Vivo. 31 (5), 779-791 (2017).
- Vormoor, B., et al. Development of a Preclinical Orthotopic Xenograft Model of Ewing Sarcoma and Other Human Malignant Bone Disease Using Advanced In Vivo Imaging. PLoS ONE. 9 (1), e85128 (2014).
- Hakky, T. S., Gonzalvo, A. A., Lockhart, J. L., Rodriguez, A. R. Primary Ewing sarcoma of the kidney: a symptomatic presentation and review of the literature. Ther Adv Urol. 5 (3), 153-159 (2013).
- Cheng, H., Clarkson, P. W., Gao, D., Pacheco, M., Wang, Y., Nielsen, T. O. Therapeutic Antibodies Targeting CSF1 Impede Macrophage Recruitment in a Xenograft Model of Tenosynovial Giant Cell Tumor. Sarcoma. 2010, 174528 (2010).
- JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
