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Cancer Research

अल्ट्रासाउंड निर्देशित ऊतक के उपयोग-जैविक रूप से प्रासंगिक मेटास्टेटिक ट्यूमर की स्थापना के लिए सेलुलर आरोपण निर्देशित Xenografts

doi: 10.3791/57558 Published: May 25, 2018

Summary

यहां, हम neuroblastoma के अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद (एनबी) और Ewing के सार्कोमा (ES) कोशिकाओं (स्थापित सेल लाइनों और रोगी-व्युत्पंन ट्यूमर कोशिकाओं) जैविक रूप से प्रासंगिक साइटों पर कैंसर के लिए विश्वसनीय नैदानिक मॉडल बनाने के लिए अनुसंधान.

Abstract

विरोधी उपचारों के नैदानिक परीक्षण प्रासंगिक xenograft मॉडल है कि कैंसर की जंमजात प्रवृत्तियों नकल पर निर्भर करता है । मानक चमड़े के नीचे पार्श्व मॉडल के लाभ प्रक्रियात्मक आसानी और आक्रामक इमेजिंग के बिना ट्यूमर प्रगति और प्रतिक्रिया की निगरानी करने की क्षमता शामिल हैं । इस तरह के मॉडल अक्सर शोधों नैदानिक परीक्षणों में असंगत हैं और मेटास्टेसिस का उत्पादन करने के लिए कम proclivity के साथ जैविक रूप से प्रासंगिक विशेषताओं को सीमित किया है, क्योंकि इसमें एक देशी microenvironment की कमी है । इसकी तुलना में, देशी ट्यूमर साइटों पर orthotopic xenograft मॉडल ट्यूमर microenvironment नकल और दूर मेटास्टेटिक प्रसार जैसे महत्वपूर्ण रोग विशेषताओं को दोहराने के लिए दिखाया गया है । इन मॉडलों अक्सर लंबी संवेदनाहारी समय और वसूली अवधि के साथ थकाऊ शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है । इस पते के लिए, कैंसर शोधकर्ताओं ने हाल ही में अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन तकनीक का उपयोग किया है के लिए नैदानिक प्रयोगों के लिए कैंसर xenograft मॉडल की स्थापना, जो ऊतक के तेजी से और विश्वसनीय स्थापना-निर्देशित murine मॉडल के लिए अनुमति देता है । अल्ट्रासाउंड दृश्य भी ट्यूमर engraftment और विकास के अनुदैर्ध्य आकलन के लिए एक इनवेसिव विधि प्रदान करता है । यहाँ, हम अल्ट्रासाउंड के लिए विधि का वर्णन-निर्देशित इंजेक्शन कैंसर कोशिकाओं के, नायब और ES के लिए गुर्दे उप कैप्सूल के लिए अधिवृक्क ग्रंथि का उपयोग. यह न्यूनतम इनवेसिव दृष्टिकोण विकास और मेटास्टेसिस के लिए ऊतक विशिष्ट स्थानों में कैंसर कोशिकाओं के थकाऊ खुला सर्जरी आरोपण पर काबू पाता है, और रुग्ण वसूली अवधि थमी । हम दोनों की स्थापना की सेल लाइनों और रोगी व्युत्पंन orthotopic इंजेक्शन के लिए सेल लाइनों के उपयोग का वर्णन । पूर्व निर्मित वाणिज्यिक किट ट्यूमर पृथक्करण और कोशिकाओं के luciferase टैगिंग के लिए उपलब्ध हैं । सेल निलंबन के इंजेक्शन छवि का उपयोग कर-मार्गदर्शन नैदानिक मॉडल के निर्माण के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव और reproducible मंच प्रदान करता है. इस विधि मूत्राशय, जिगर और अग्ंयाशय कई कैंसर मॉडल के लिए अपनी अप्रयुक्त क्षमता exemplifying जैसे अंय कैंसर के लिए विश्वसनीय नैदानिक मॉडल बनाने के लिए उपयोग किया जाता है ।

Introduction

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पशु xenograft मॉडल उपंयास विरोधी चिकित्सा के लिए नैदानिक अध्ययन के लिए आवश्यक उपकरण हैं । मानक murine xenografts ट्यूमर के विकास की निगरानी के लिए एक कुशल और आसानी से सुलभ साइट प्रदान करने, कोशिकाओं के चमड़े के नीचे पार्श्व आरोपण पर भरोसा करते हैं । चमड़े के नीचे के मॉडल के नुकसान उनके ट्यूमर की कमी-विशिष्ट जीवविज्ञान विशेषताओं है, जो अपनी क्षमता को सीमित कर सकते है metastasize1। ऐसी सीमाएं orthotopic xenografts के उपयोग से दूर होती हैं, जिसमें ट्यूमर कोशिकाएं देशी ऊतक साइटों पर engrafted हैं, मेटास्टेटिक संभावित2के साथ प्रासंगिक microenvironment प्रदान करते हैं । Orthotopic xenograft मॉडल मूल जैविक सुविधाओं को बनाए रखने और नैदानिक दवा डिस्कवरी3,4के लिए विश्वसनीय मॉडल प्रदान करते हैं । ऊतक-निर्देशित आरोपण के लिए उपयोग की जाने वाली कैंसर की कोशिकाओं या तो रोगी ट्यूमर से सेल लाइनों या रोगी व्युत्पंन कोशिकाओं की स्थापना कर रहे हैं । Xenografts कैंसर सेल लाइनों से स्थापित की प्राथमिक ट्यूमर से उच्च आनुवंशिक फर्क प्रदर्शन कर सकते है व्युत्पंन Xenografts5रोगी की तुलना में । इसे देखते हुए, रोगी की स्थापना-व्युत्पंन orthotopic xenografts कैंसर की दवा खोज में उपंयास चिकित्सीय परीक्षण के लिए पसंदीदा मानक बन गया है ।

बाल चिकित्सा कैंसर neuroblastoma (एनबी) में, orthotopic xenograft मॉडल दोहराऊंगा प्राथमिक ट्यूमर जीव विज्ञान और एनबी प्रसार के विशिष्ट साइटों के लिए मेटास्टेसिस विकसित6,7। एनबी अधिवृक्क ग्रंथि में या paravertebral सहानुभूति श्रृंखला के साथ विकसित करता है । orthotopic आरोपण के सबसे आम तरीकों खुले ट्रांस पेट शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं की आवश्यकता है । इस तरह के तरीकों अक्सर थकाऊ रहे हैं, उच्च पशु रुग्णता है, और जटिल वसूली अवधि । उच्च संकल्प अल्ट्रासाउंड कैंसर अनुसंधान8,9के लिए कई murine मॉडल के विकास में ट्यूमर कोशिकाओं के ऊतक-निर्देश आरोपण के लिए हाल ही में उपयोग किया गया है । तकनीक विश्वसनीय, reproducible, कुशल है, और प्रासंगिक मेटास्टेटिक ट्यूमर की स्थापना के लिए सुरक्षित है xenografts10,11

अल्ट्रासाउंड के द्वारा बाल चिकित्सा कैंसर xenografts की स्थापना-निर्देशित लक्ष्य अंग स्थानीयकरण और सेल लाइनों और रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर कोशिकाओं के सुई आरोपण11का प्रदर्शन किया है. तकनीक एनबी murine अधिवृक्क ग्रंथि को लक्षित करने के लिए उपयोग किया गया था । है Ewing सार्कोमा (ES) मुख्य रूप से एक osseous कैंसर है, आमतौर पर ऐसी फीमर और श्रोणि हड्डियों के रूप में लंबी हड्डियों में देखा12। मामले की रिपोर्ट से पता चला है कि एक मुख्य रूप से osseous कैंसर के विकास कि क्या गुर्दे के ऊतकों, एक गुर्दे उप संपुटी स्थान में व्यवहार्य है निर्धारित करने के लिए orthotopic आरोपण13के लिए चुना गया था । गुर्दे उप संपुटी कोशिका आरोपण ट्यूमर कोशिकाओं का एक होनहार मॉडल ES14के लिए सहज मेटास्टेसिस अध्ययन के रूप में उपयोग किया गया है ।

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Protocol

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सभी काम मिशिगन संस्थागत समीक्षा बोर्ड के विश्वविद्यालय के अनुसार किया गया था (हम ०००५२४३०) और उपयोग और जानवरों की देखभाल पर विश्वविद्यालय समिति द्वारा अनुमोदित प्रक्रियाओं के अनुरूप (UCUCA). पशु चिकित्सा (ुलाम) की प्रयोगशाला के लिए इकाई का ipo एनिमल केयर ।

सभी काम मिशिगन संस्थागत समीक्षा बोर्ड के विश्वविद्यालय से अनुमोदन के साथ किया गया था (हम ०००५२४३०) और सभी मानव अनुसंधान नैतिकता समिति विनियमों के अनुरूप । मानव कोशिकाओं को एक संभावित रूप से खतरनाक सामग्री माना जाता है, इसलिए सभी विशेष सावधानियों और उचित सुरक्षा प्रथाओं है कि आपके संस्थान के लिए आवश्यक है का पालन करें । एनएसजी चूहों गंभीर रूप से प्रतिरक्षा और आमतौर पर पर्यावरण में पाए जाने वाले बैक्टीरिया की वजह से बीमारी के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं ।
हमेशा कड़ाई बाँझ तकनीक जब प्रत्यारोपण के लिए सामग्री की तैयारी और इंजेक्शन प्रदर्शन का उपयोग करें ।

1. सेल संस्कृति

  1. विकसित मानव एनबी सेल लाइनों (एसएच-SY5Y, SK-N-BE2, और IMR32) न्यूनतम आवश्यक माध्यम में, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 मिमी glutamine, १०० इकाइयों/एमएल पेनिसिलिन, और १०० μg/एमएल streptomycin के साथ पूरक । IMR32 कोशिकाओं के साथ आगे 1 मिमी पाइरूवेट और ०.०७५% NaHCO3पूरक । ३७ ° c, 5% कं2 और 70-80% संगम पर सभी कोशिकाओं को बनाए रखें
  2. RPMI मध्यम में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 6 मिमी L-glutamine के साथ पूरक मानव ES सेल लाइनों (TC32, A673, CHLA-25, और A4573) बढ़ाएँ. ३७ ° c पर सभी कोशिकाओं को बनाए रखने, 5% सह2 पर 70-80% संगम
  3. प्रमाणन के लिए सभी कक्ष पंक्तियां भेजें ।
    नोट: सेल प्रमाणीकरण एक बाहर की सुविधा पर किया जाता है, कृपया पावती का संदर्भ लें ।

2. प्राथमिक रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर कोशिकाओं की तैयारी

  1. रोगी सहमति और असेंट के साथ, फसल संरक्षण के लिए ऊतक भंडारण समाधान में प्रयोगशाला के लिए स्थानीय नियंत्रण और परिवहन के लिए शल्य चिकित्सा लकीर के दौर से गुजर रोगियों से मानव एनबी ट्यूमर ऊतक खारिज कर दिया ।
    नोट: सभी रोगी नमूनों को संस्थागत समीक्षा बोर्ड के दिशानिर्देशों के अनुसार डे-पहचान और हैंडल किया जाता है ।
  2. एक ट्यूमर पृथक्करण किट का उपयोग ट्यूमर ऊतक से एक ही रोगी-व्युत्पन्न कैंसर कोशिका निलंबन (UMNBL001, UMNBL002) उत्पन्न. एक १०० मिमी सेल संस्कृति RPMI बफर के 5 मिलीलीटर के ट्यूमर के लगभग ०.५ जी हस्तांतरण, २०० एंजाइम एच के µ एल, एंजाइम आर के १०० µ एल और मानव ट्यूमर पृथक्करण किट से एंजाइम ए के 25 µ एल ।
  3. छोटे टुकड़ों में ट्यूमर कीमा (2-4 mm प्रत्येक) कैंची और ऊतक संदंश का उपयोग कर । इन टुकड़ों को २.२ चरण में समाधान के साथ मिक्स ।
  4. एक dissociator ट्यूब में ट्यूमर मिश्रण पिपेट और ट्यूब बंद । ट्यूब उलटा और ऊतक dissociator की आस्तीन पर देते हैं । प्रोग्राम h_tumor_01 पर चलाएं ।
  5. ट्यूमर सेल निलंबन आंतरायिक trituration हर 15 मिनट के साथ एक घूर्णन रैक पर 1 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस से ऊपर प्राप्त की मशीन ।
  6. एक नया ५० एमएल शंकु ट्यूब करने के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण और RPMI के 10 मिलीलीटर जोड़ें । 5 मिनट के लिए ३१४ x g पर सेल निलंबन केंद्रापसारक ।
  7. supernatant निकालें और RPMI के 5 मिलीलीटर में गोली निलंबित । एक ४० µm सेल छलनी के माध्यम से इस समाधान दर्रा और एक ताजा ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में तनावपूर्ण समाधान इकट्ठा । RPMI मीडिया के 5 मिलीलीटर के साथ एक बार इस छलनी धोने और 5 मिनट के लिए ३१४ x g पर मिश्रण केंद्रापसारक एक गोली इकट्ठा ।
  8. एक hemacytometer15का उपयोग कर सेल घनत्व को मापने. निलंबित RPMI में ऊपर से प्राप्त करने के लिए 4 × 105 कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 10 µ l इस सेल के सस्पेंशन और 5 µ l के matrigel के 5 µ को हर इंजेक्शन के लिए सेल सॉल्यूशन का 10 µ l बना लें ।
    नोट: प्रयुक्त RPMI की मात्रा कोशिका घनत्व माप पर निर्भर करता है । उदाहरण के लिए, यदि प्राप्त गोली के मापा कोशिका घनत्व 4 x 105 कोशिकाओं है, RPMI के 10 µ एल में गोली निलंबित ।

3. कैंसर कोशिकाओं की Luciferase टैगिंग

  1. transduction मीडिया के 10 मिलीलीटर वायरल supernatant EF1a के 5 मिलीलीटर-Luc2-आयरेस-mCherry और स्टेम सेल मीडिया के 5 मिलीलीटर के साथ बनाओ । 1x polybrene के ७.५ µ l को जोड़ें ।
  2. १०० मिमी अल्ट्रा कम लगाव प्लेट में transduction मीडिया और प्लेट में 5 × 106 कैंसर कोशिकाओं को मिलाएं । ३७ ° c और 5% सह2 रात भर में मशीन ।
    नोट: कम संलग्नक प्लेटों का उपयोग किया जाता है के रूप में, कोशिकाओं थाली का पालन नहीं होगा.
  3. 24 घंटे के बाद, १०० मिमी प्लेट युक्त ऊतक संस्कृति हूड के तहत कोशिकाओं को लाने और एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में मिश्रण हस्तांतरण । 5 मिनट के लिए ३१४ x g पर सेल निलंबन के लिए सेल गोली मिल केंद्रापसारक । 1x फॉस्फेट के 1 मिलीलीटर-खारा (पंजाब) के साथ एक बार सेल गोली धो और 1% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त HBSS के 1 मिलीलीटर में सेल गोली निलंबित ।
    1. प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) विश्लेषण पर GFP-धनात्मक सिग्नल के आधार पर luciferase कक्षों को सॉर्ट करें । प्लेट १०० मिमी ऊतक संस्कृति पर क्रमबद्ध कोशिकाओं का इलाज किया पकवान और बनाए रखने में 70-80% संगम, ३७ ° c और 5% सह आवश्यक तक2 .
  4. luciferase परख किट के साथ luciferase संकेत की पुष्टि करें । प्लेट 10 x 104 एक illuminometer संगत ९६ अच्छी तरह से थाली और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% CO2पर रात भर कोशिकाओं में अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं को हल । 24 घंटे के बाद, कमरे के तापमान के लिए ९६ अच्छी तरह से थाली लाने और 1:1 अनुपात में कुओं में संस्कृतिपूर्ण मीडिया को संभल-Glo रिएजेंट जोड़ें । कक्षों को 5 मिनट के लिए लाइसे करने दें और spectrophotometer में luminescence पढ़ें ।
  5. एक ऊतक संस्कृति हूड के तहत १०० mm पकवान लाओ । supernatant मीडिया छोड़ें । 1x पंजाबियों के 2 मिलीलीटर के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें ।
  6. ०.२५% trypsin के 2 मिलीलीटर जोड़ें और 2-3 मिनट के लिए मशीन के लिए १०० mm पकवान वापस । 2-3 मिनट के बाद, माइक्रोस्कोप के तहत बेदखल कोशिकाओं के लिए जांच करें और trypsin को निष्क्रिय करने के लिए RPMI के 8 मिलीलीटर जोड़ें ।
  7. एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में सेल निलंबन लीजिए और 5 मिनट के लिए ३१४ x g पर एक गोली प्राप्त करने के लिए केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें । 1x पंजाबियों के 1 मिलीलीटर के साथ सेल गोली धो, RPMI के 5 मिलीलीटर में गोली निलंबित और सेल घनत्व का निर्धारण एक hemacytometer15का उपयोग कर । एक गोली प्राप्त करने के लिए 5 मिनट के लिए ३१४ x g पर सेल समाधान शेष पर अफरातफरी ।
  8. RPMI में गोली निलंबित 4 x 105 कोशिकाओं की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 10 µ l सेल सस्पेंशन के 5 µ l को ले और प्रत् येक इंजेक्शन के लिए सेल सॉल्यूशन का 10 µ l बनाने के लिए matrigel के 5 µ l

4. अल्ट्रासाउंड निर्देशित अधिवृक्क ग्रंथि (एनबी) या गुर्दे उप कैप्सूल (ES) आरोपण

नोट: सभी अल्ट्रासाउंड प्रक्रियाओं vivo इमेजिंग सिस्टम में एक उच्च संकल्प का उपयोग किया जाता है । वर्णित प्रक्रियाओं के लिए, transducer, जो ४० मेगाहर्ट्ज की एक केंद्र आवृत्ति और 22-55 मेगाहर्ट्ज की एक बैंडविड्थ का इस्तेमाल किया गया था ।

  1. सभी इंजेक्शन प्रक्रियाओं के लिए 6-8 सप्ताह पुरानी प्रतिरक्षा की कमी एनएसजी चूहों का उपयोग ।
  2. सर्द matrigel और autoclaved हैमिल्टन सीरिंज एक 27G सुई (१.२५ "), और 22G कैथेटर (०.९ मिमी बाहरी व्यास, 25 मिमी लंबाई) पर रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस के साथ लगे ।
  3. सेल समाधान बर्फ पर चरण 3 में तैयार प्लेस ।
  4. Anesthetize एक प्रेरण में 2% isoflurane का उपयोग कर चैंबर में चूहों2 2 एल पर दिया/
    नोट: पर्याप्त संज्ञाहरण सक्रिय आंदोलन की कमी और सहज श्वसन के रखरखाव के साथ निर्धारित किया जाता है ।
  5. एक बार anesthetized, बालों को हटाने लोशन (जैसे नायर) और एक शेविंग का उपयोग कर पशुओं के पीछे और पार्श्व depilate ।
  6. जानवरों की नाक एक nosecone में रखा जाता है और जबकि isoflurane श्वास जबकि सुरक्षित पेट की ओर नीचे, के साथ इमेजिंग मंच के लिए पशु स्थानांतरण ।
  7. सुखाने को रोकने के लिए पशुओं की आंखों में ऑप्टिकल मरहम लगाएं । किसी भी अनजाने मूवमेंट को रोकने के लिए माउस को स् टेप करें ।
  8. अल्ट्रासाउंड दृश्य का उपयोग कर murine जिगर, वेना कावा, तिल्ली, बाएँ गुर्दे, और आसंन छोड़ दिया अधिवृक्क ग्रंथि की पहचान करें ।
  9. व्यक्तिगत संरक्षण और बाँझ शर्तों के रखरखाव के लिए बाँझ दस्ताने, मुखौटा और टोपी का प्रयोग करें । अल्ट्रासाउंड के तहत मार्गदर्शन, धीरे से त्वचा के माध्यम से एक 22G कैथेटर डालने और पीठ मांसपेशी सीधे बाईं अधिवृक्क ग्रंथि में सेलुलर इंजेक्शन के लिए एक चैनल प्रदान करने के लिए । सुई निकालें और कैथेटर जगह में छोड़ दें ।
  10. एक ठंडा हैमिल्टन सिरिंज सेल समाधान के 10 µ एल के साथ एक छोटे से बोर सुई के साथ लगे लोड, तो अधिवृक्क ग्रंथि के केंद्र में तैनात कैथेटर के माध्यम से सिरिंज stereotactically गाइड.
  11. लक्षित अधिवृक्क ऊतक में कोशिकाओं इंजेक्षन. matrigel सेट करने के लिए अनुमति देने के लिए 1-2 मिनट के लिए जगह में सुई छोड़ दें । धीरे सुई हटाने, कैथेटर के हटाने के बाद ।
  12. चूहों को वापस अपने पिंजरे में रखें और सुनिश्चित करें कि माउस को कड़ी recumbency बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त करता है ।
    नोट: इस तकनीक के ंयूनतम इनवेसिव प्रकृति के कारण, प्रक्रियात्मक दर्द के बाद कम है, लेकिन अभी भी चूहों स्वास्थ्य की जांच के साथ एक दैनिक आधार पर नजर रखी । "एक वाक्य के साथ पालन किया जाना चाहिए:" अगर दर्द या संकट के अप्रत्याशित संकेत पाठ्यक्रम के दौरान की पहचान कर रहे है एक प्रयोग के, analgesia या अंय चिकित्सा देखभाल के बारे में जानकारी के लिए अपने संस्थागत पशु चिकित्सा सहायता इकाई के साथ परामर्श करें ।

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Representative Results

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प्रस्तुत प्रक्रियाओं का उपयोग, अल्ट्रासाउंड-अधिवृक्क ग्रंथि में नायब कोशिकाओं के निर्देशित आरोपण एक समर्पित प्रक्रिया एक गर्म शल्य तालिका के साथ सुसज्जित कमरे में किया गया था. murine हृदय गतिविधि (चित्र 1a) की निगरानी के लिए आर्म और फुट पैड रखे गए थे. पशु isoflurane के तहत anesthetized नाक शंकु साँस लेना का उपयोग कर रहे । एक उच्च संकल्प अल्ट्रासाउंड जांच का उपयोग कर, बाईं गुर्दे अधिवृक्क ग्रंथि के साथ की पहचान की थी सिर्फ गुर्दे (चित्रा 1b) को कपाल । सुई तो प्रत्यक्ष दृश्य (चित्रा 1C) के तहत अधिवृक्क ग्रंथि में उन्नत किया गया था । इस तकनीक के प्रारंभिक उपयोग के दौरान, methylene नीले रंग और matrigel का एक मिश्रण अधिवृक्क ग्रंथि के सही स्थानीयकरण की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. पशु बलिदान किया गया था, और प्रक्रिया की सफलता necropsy पर अधिवृक्क ग्रंथि कैप्सूल के नीचे methylene नीले रंग visualizing द्वारा पुष्टि की गई थी (चित्र 1 d) ।

साप्ताहिक अल्ट्रासाउंड और bioluminescence इमेजिंग ट्यूमर engraftment और विकास दर की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया मोडल थे । ब्याज के क्षेत्र के Bioluminescence इमेजिंग फोटॉनों के रूप में मापा गया था/s/cm2/steridian (p/s/cm2/sr) 106 से 108 के लिए पर्याप्त ट्यूमर आकार का संकेत के साथ ंयूनतम गणना के साथ9 ( चित्रा 2) । विश्लेषण t-परीक्षण का उपयोग करके दिखाया सांख्यिकीय उल्लेखनीय वृद्धि bioluminescence में आठ सप्ताह की अवधि पर नोट किया गया था (* p< 0.05; * *p< 0.001; * * *p< 0.0001) । अल्ट्रासाउंड इमेजिंग ट्यूमर क्षेत्र और मात्रा की इनवेसिव माप की अनुमति दी । bioluminescence माप के साथ यह दोनों ट्यूमर engraftment और प्रगति पर नजर रखी (चित्रा 3). इसी तरह की प्रक्रियाओं ES कोशिकाओं गुर्दे उप कैप्सूल में इंजेक्शन के लिए उपयोग किया गया (चित्रा 4).

परिणामी ट्यूमर के सकल और ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण प्राथमिक ट्यूमर और necropsy पर मेटास्टेसिस विशेषता । ऊतक के नमूनों सुघड़ सेल पैटर्न और ट्यूमर के लिए दाग-विशिष्ट प्रोटीन मार्करों (चित्रा 5, चित्रा 6) के लिए जांच की गई । एनबी सेल लाइनों के लिए प्राथमिक ट्यूमर engraftment (IMR32, एसएच-SY-5Y, SK-N-BE2, UMNBL001, UMNBL002) 62-100% से लेकर, मेटास्टेसिस इंजेक्शन चूहों के 0-100% में देखा के साथ । सबसे दमदार मेटास्टेसिस एसके-एन-BE2 (३३%) और UMNBL002 (१००%) में देखा गया । एनबी के लिए मेटास्टेटिक साइटों लिम्फ नोड्स, जिगर, फेफड़े और cortical हड्डी थे । ES सेल लाइनों के लिए गुर्दे उप संपुटी engraftment (A4573, A673, CHLA-25, टीसी-३२) 60-100% से लेकर, मेटास्टेसिस इंजेक्शन चूहों के 0-40% में देखा के साथ. ES के लिए जांच की मेटास्टेटिक साइटों लिम्फ नोड्स, cortical हड्डियों और फेफड़ों शामिल थे । इसमें सबसे दमदार engraftment (१००%) और मेटास्टेसिस (४०%) टीसी-३२ xenograft चूहों में देखे गए ।

Figure 1
चित्र 1 . Murine अधिवृक्क ग्रंथि स्थानीयकरण और अल्ट्रासाउंड निर्देशित एनबी सेल आरोपण । (क) murine उदर अंगों के उच्च संकल्प अल्ट्रासाउंड इमेजिंग ट्यूमर कोशिकाओं के अधिवृक्क ग्रंथि आरोपण की अनुमति दी । (ख) बांयी किडनी की पहचान की गई । (ग) बाईं अधिवृक्क ग्रंथि एक hypoechoic (डार्क) दौर संरचना के रूप में बाईं गुर्दे के निकट स्थित है । सुई अधिवृक्क ग्रंथि सेल इंजेक्शन के बाद में उन्नत किया गया था. (घ) matrigel और methylene नीले रंग का मिश्रण इंजेक्शन प्रक्रियाओं की सटीकता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । matrigel और अधिवृक्क ग्रंथि कैप्सूल और पेरि-अधिवृक्क अंतरिक्ष में methylene नीले रंग के साथ छोड़ दिया गुर्दे और अधिवृक्क ग्रंथि के प्रतिनिधि पूर्व vivo छवि. यह आंकड़ा वान नूर, आर ए. एटअल से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । 11. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2 . vivo में ट्यूमर engraftment और विकास दर की bioluminescence इमेजिंग । (क) मानव एनबी अधिवृक्क xenografts आठ सप्ताह से अधिक engraftment और ट्यूमर के विकास के लिए निगरानी की गई । (ख) अधिकतम bioluminescence संकेत ब्याज के क्षेत्र के भीतर निर्धारित किया गया था । एनबी सेल लाइंस (एसएच-SY5Y, स्पैक्ट्रम ३२, SK-N-BE2) और रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं (UMNBL001, UMNBL002) समय के साथ चमक और विकास के पैटर्न में वृद्धि हुई थी । आठ-सप्ताह की अवधि में bioluminescence की वृद्धि सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण थी (*p< 0.05; * *p< 0.001; * * *p< 0.0001) । यह आंकड़ा वान नूर, आर ए. एटअल से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । 11. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3 . vivo में ट्यूमर engraftment और विकास के अल्ट्रासाउंड इमेजिंग । अल्ट्रासाउंड इमेजिंग vivo में ट्यूमर प्रगति पर नजर रखी । एक, दो और आठ सप्ताह में अल्ट्रासाउंड छवियों और इसी bioluminescence छवियों को दिखाया जाता है । एक सप्ताह में, engraftment दोनों इमेजिंग मोडलों में visualized था । ट्यूमर क्षेत्र और मात्रा अल्ट्रासाउंड इमेजिंग का उपयोग कर की गणना की गई । 3 डी अल्ट्रासाउंड छवियों अध्ययन के पूरा होने पर उत्पाद के ट्यूमर को प्रतिबिंबित । यह आंकड़ा वान नूर, आर ए. एटअल से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । 11. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4 . Murine गुर्दे स्थानीयकरण और ES कोशिकाओं के अल्ट्रासाउंड निर्देशित आरोपण । (क) Bioluminescence ट्यूमर चमक और विकास पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया गया था । (बी-सी) जानवरों के आसपास पेट संरचनाओं विकृत और इस तरह की मांसपेशी के रूप में स्थानीय संरचनाओं में हमला है कि स्थानीय इनवेसिव ट्यूमर विकसित की है । यह आंकड़ा वान नूर, आर ए. एटअल से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । 11. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5 . एनबी और ES xenograft ट्यूमर के ट्यूमर histopathology । (क) नायब xenograft चूहों अधिवृक्क और पेरि-अधिवृक्क ग्रंथि साइटों, जो आसन्न उदर अंगों विकृत में स्थानीय रूप से घुसपैठ प्राथमिक ट्यूमर था. (ख) Microscopically (20X, बार = ५० µm), xenograft अधिवृक्क ट्यूमर मानव नायब (खराब विभेदित कोणीय कोशिकाओं के समूहों), सामयिक छद्म सुघड़ गठन (तीर) सहित के अनुरूप सुविधाओं दिखाया rosette । (ग) ट्यूमर ऊतक मजबूत tyrosine hydroxylase दिखाया (एनबी ट्यूमर मार्कर) immunoreactivity (40X, बार = ४० µm; सकारात्मक नियंत्रण धुंधला बाएं पैनल में दिखाया; 1:100) । (घ) es xenograft ट्यूमर था histologic घुसपैठ ES (40X, बार = ४० µm) के अनुरूप सुविधाओं, कोणीय के समूहों epithelioid एक ठीक fibro संवहनी स्ट्रोमा, effacing और संपीड़ित सामांय आसंन गुर्दे से अलग कोशिकाओं गोल करने के लिए (तीर; संपीड़ित गुर्दे पैरेन्काइमा के अवशेष) । (ङ) es ट्यूमर के ऊतकों को es ट्यूमर मार्कर CD99 के लिए मजबूत झिल्ली immunoreactivity दिखाया (40X, बार = ४० µm; सकारात्मक नियंत्रण धुंधला बाएं पैनल में दिखाया; 1:100) । यह आंकड़ा वान नूर, आर ए. एटअल से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । 11. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6 . दूर मेटास्टेसिस अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन तकनीक द्वारा स्थापित xenografts में विकसित की है । (क) Bioluminescence इमेजिंग अधिवृक्क ग्रंथि अंतरिक्ष में प्राथमिक एनबी ट्यूमर दिखा रहा है और मेटास्टेटिक cortical हड्डी पर पाया घावों । (ख) सूक्ष्म विश्लेषण एक मेटास्टेटिक ट्यूमर का प्रदर्शन (तीर) effacing मज्जा गुहा और समीपस्थ फीमर की cortical हड्डी (4x, बार = ४०० µm) । (ग) Tyrosine hydroxylase cytoplasmic immunoreactivity की cortical अस्थि एनबी मेटास्टेटिक स्थल (40X, बार = ४० µm) । (घ) रोगी के माइक्रोस्कोप-व्युत्पंन orthotopic xenograft (UMNBL002) के साथ एक यकृत मेटास्टेसिस (तीर) के भीतर एक यकृत नस (arrowhead endothelial कोशिकाओं को दर्शाता है), और आसंन जिगर घुसपैठ (एल) पैरेन्काइमा (20X, बार = ५० µm) । (ङ) Neuroblastoma माइक्रो मेटास्टेसिस (arrow) फेफड़ों के भीतर पैरेन्काइमा (40X, bar = ४० µm). यह आंकड़ा वान नूर, आर ए. एटअल से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । 11. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

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एनबी और ES कोशिकाओं के अल्ट्रासाउंड निर्देशित आरोपण कैंसर जीव विज्ञान में नैदानिक अध्ययन के लिए विश्वसनीय murine xenografts स्थापित करने के लिए एक कुशल और सुरक्षित तरीका है । अल्ट्रासाउंड निर्देशित ऊतक की सफलता के लिए महत्वपूर्ण लक्षित आरोपण उपस्थिति और anatomically में विशेषज्ञता के साथ प्रशिक्षित कर्मियों की उपलब्धता है ब्याज के अंग और ट्यूमर कोशिकाओं के स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन में स्थानीयकृत ।

ट्यूमर ऊतक के पृथक्करण वर्णित रोगी-व्युत्पंन xenograft मॉडल विकसित करने में एक महत्वपूर्ण कदम साबित हुआ । देशी ट्यूमर ऊतक एक सेलुलर microenvironment और आसपास के स्ट्रोमा कि ट्यूमर को प्रभावित कर सकते है या engraftment शामिल हैं । सेल गिनती, पृथक्करण प्रक्रिया पूरी होने के बाद, नमूने में सेलुलर घनत्व का एक गेज प्रदान की, 2 x 105 कोशिकाओं के साथ/μL आरोपण और सफल ट्यूमर engraftment के लिए एक इष्टतम सेल गिनती माना जाता है ।

कोशिकाओं के Luciferase टैगिंग ट्यूमर engraftment और bioluminescence संकेत को मापने के द्वारा ट्यूमर के विकास की निगरानी के सत्यापन के लिए अनुमति दी, 106 से 108 के साथ ट्यूमर का संकेत9माना जा रहा है । सफल transduction सुनिश्चित करने के लिए, luciferase गतिविधि की पुष्टि की गई इन विट्रो से पहले कोशिकाओं के इंजेक्शन के लिए. यह इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा किया गया था, luciferase परख किट, और भी bioluminescence संकेत के लिए कोशिकाओं का परीक्षण करके । bioluminescence मापने के लिए इस्तेमाल किया सेटिंग्स लगातार रखा गया था, साप्ताहिक माप के दौरान सुसंगत डेटा प्रदान.

ट्यूमर के पूर्व vivo histopathological विश्लेषण कोशिका प्रकार और प्रोटीन मार्करों के लिए विशिष्ट दाग के साथ परिणामी ट्यूमर की आकृति विज्ञान की पुष्टि की । Histopathological विश्लेषण ट्यूमर engraftment और मेटास्टेसिस अल्ट्रासाउंड और bioluminescent इमेजिंग द्वारा प्रदर्शन की पुष्टि की ।

अल्ट्रासाउंड-निर्देशित सेलुलर आरोपण के लाभ अपने गैर इनवेसिव प्रकृति, कम जानवर वसूली समय, और कई सफल xenograft मॉडल की स्थापना में बढ़ती सफलता में शामिल हैं । अल्ट्रासाउंड इमेजिंग भी vivo ट्यूमर प्रगति और ट्यूमर की मात्रा में निगरानी करने के लिए एक विश्वसनीय विधि प्रदान करता है । इन नैदानिक मॉडल में, ट्यूमर 5 सप्ताह के भीतर मेटास्टेसिस के साथ स्थानीय इनवेसिव रोग के लिए प्रगति की । सीमाएं उच्च रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग तकनीक की उपलब्धता और लक्ष्य अंग को लगातार स्थानीयकृत करने की क्षमता शामिल हैं । ब्याज के अंग के अल्ट्रासाउंड इमेजिंग में विशेषज्ञता के साथ कर्मियों की उपलब्धता इस तकनीक के महत्वपूर्ण घटक हैं ।

उच्च संकल्प अल्ट्रासाउंड इमेजिंग की उपलब्धता काफी पिछले दशक के भीतर वृद्धि हुई है और इसके उपयोग के लिए न केवल नैदानिक अभ्यास में लेकिन यह भी प्रयोगशाला अनुसंधान में विस्तार जारी है । आधुनिक murine xenografts के विकास के लिए अल्ट्रासाउंड के उपयोग के कैंसर की दवा खोज के लिए नैदानिक अनुसंधान मॉडल आगे बढ़ाने के लिए क्षमता के साथ एक होनहार आवेदन है ।

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Disclosures

लेखकों ने कोई खुलासे नहीं किए हैं ।

Acknowledgments

इस काम रॉबर्ट वुड जॉनसन फाउंडेशन/अमोस चिकित्सा संकाय विकास कार्यक्रम, Taubman अनुसंधान संस्थान, और बाल चिकित्सा सर्जरी, मिशिगन विश्वविद्यालय के खंड से समर्थन प्राप्त किया । लेखक Kimber Converso-बारां और डॉ मार्कस Jarboe अल्ट्रासाउंड इंजेक्शन प्रक्रियाओं और इमेजिंग मंच के साथ सहायता के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम चित्र ग्राफिक्स के साथ उनकी सहायता के लिए पॉल Trombley धंयवाद । हम भी आणविक इमेजिंग और ट्यूमर इमेजिंग कोर, जो भाग में व्यापक कैंसर केंद्र NIH, अनुदान P30 CA046592 द्वारा समर्थित है के लिए केंद्र के उपयोग के लिए मिशिगन विश्वविद्यालय में रेडियोलॉजी विभाग का धंयवाद । मिशिगन फिजियोलॉजी Phenotyping कोर के विश्वविद्यालय है कि भाग में NIH (OD016502) और Frankel हृदय केंद्र से अनुदान के द्वारा समर्थित है । सेल लाइन प्रमाणीकरण IDEXX RADIL अनुसंधान सुविधाओं पर किया गया था, कोलंबिया, मो । हम छलनी Stoll, डॉ राजेन मॉडि और Mott ठोस ट्यूमर ऑन्कोलॉजी कार्यक्रम का धंयवाद । हमारे रोगियों और परिवारों को कृतज्ञता उनकी प्रेरणा, साहस, और हमारे अनुसंधान के चल रहे समर्थन के लिए स्वीकार कर रहे हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice
NOD-SCID Charles River 394
NSG The Jackson Laboratory 5557
Cell Line 
NB
IMR-32 ATCC CCL-127 Established human neuroblastoma cell line
SH-SY5Y ATCC CRL-2266 Established human neuroblastoma cell line
SK-N-Be2 ATCC CRL-2271 Established human neuroblastoma cell line
ES
TC32  COGcell.ORG Established human Ewing's Sarcoma cell line
A673 COGcell.ORG Established human Ewing's Sarcoma cell line
CHLA-25 COGcell.ORG Established human Ewing's Sarcoma cell line
A4573 COGcell.ORG Established human Ewing's Sarcoma cell line
Cell Line media
RPMI Life Technologies 11875-093
Matrigel BD BioSciences 354234
Dissociation
Dissection Tools KentScientific INSMOUSEKIT
Human Tumor Dissociation Kit  MACS Miltenyi Biotec 130-095-929
gentleMACS dissociator MACS Miltenyi Biotec 130-093-235
gentleMACS C tubes MACS Miltenyi Biotec 130-096-334
Cell Strainer Corning 431751
Luciferase Tagging
Lenti-GFP1 virus University of Michigan, Vector Core Luciferase Virus
Steady Glo-Luciferase Assay Kit Promega E2510
Bioluminescence Imaging
Ivis Spectrum Imaging System PerkinElmer 124262
D-Luciferin Promega E160X
Anesthetic
Inhaled Isoflurane  Piramal Critical Care Inc 66794-0017-25
Ultrasound Guided Injection
Vevo 2100 High Resolution Imaging Vevo 2100
Hamilton Syringes (27 gauge needle) Hamilton 80000
22 Gauge Angiocatheter BD Biosciences 381423
Optical ointment Major Pharmaceuticals 301909
Nair Church & Dwight Co Hair Removal agent
Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel Parker Ultrasound gel
Histology
CD99 DAKO M3601 Primary Antibody
Tyrosine Hydroxylase Sigma-Aldrich T2928 Primary Antibody
Secondary HRP-Polymer antibody Biocare BRR4056KG
Miscelleneous
10 mL Pipettes Fisher Scientific 13-676-10J
5 mL Pipettes Fisher Scientific 13-676-10H
1.5 mL Microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
P1000 pipette Eppendorf 3120000062
P200 pipette Eppendorf 3120000054
P1000 pipette tips Fisher Scientific 21-375E
P200 pipette tips Fisher Scientific 21-375D
Portable pipette aid Drummond 4-000-101
digital animal Weighing Scale  KentScientific SCL-1015
Calipers Fisher Scientific 06-664-16
6well low attachment plates Corning 07-200-601
10 cm Tissue Culture Treated Dishes Fisher Scientific FB012924
Polybrene Sigma-Aldrich TR-1003-G

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References

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अल्ट्रासाउंड निर्देशित ऊतक के उपयोग-जैविक रूप से प्रासंगिक मेटास्टेटिक ट्यूमर की स्थापना के लिए सेलुलर आरोपण निर्देशित Xenografts
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Thomas, T. T., Chukkapalli, S., Van Noord, R. A., Krook, M., Hoenerhoff, M. J., Dillman, J. R., Lawlor, E. R., Opipari, V. P., Newman, E. A. Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. J. Vis. Exp. (135), e57558, doi:10.3791/57558 (2018).More

Thomas, T. T., Chukkapalli, S., Van Noord, R. A., Krook, M., Hoenerhoff, M. J., Dillman, J. R., Lawlor, E. R., Opipari, V. P., Newman, E. A. Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. J. Vis. Exp. (135), e57558, doi:10.3791/57558 (2018).

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