Summary
Burada, biyolojik ilgili sitelerdeki kanser için güvenilir preklinik modelleri oluşturmak için bir protokol ultrason destekli enjeksiyon Nöroblastom (NB) ve Ewing sarkomu (ES) hücre yararlanmak için (hücre satırları ve hasta kaynaklı tümör hücreleri kurulu) mevcut araştırma.
Abstract
Preklinik antikanser terapiler test kanser doğuştan gelen eğilimleri taklit ilgili xenograft modellerde dayanır. Yordam kolaylığı ve yeteneği monitör tümör ilerleme ve yanıt invaziv görüntüleme olmadan standart subkutan kanat modelleri avantajları şunlardır. Modelleri gibi çoğu kez translasyonel klinik deneylere tutarsız ve yerel bir microenvironment eksikliği olduğu biyolojik ilgili özellikleri metastaz, üretmek için düşük meyil ile sınırlı. Buna karşılık, orthotopic xenograft modelleri yerli tümör sitelerdeki tümör microenvironment taklit ve uzak metastatik yaymak gibi önemli hastalık özellikleri çoğaltmak için gösterilmiştir. Bu modeller genellikle sıkıcı cerrahi anestezik zaman ve kurtarma takmaktan ile gerektirir. Bu sorunu çözmek için kanser araştırmacılar son zamanlarda kanser xenograft modeller için doku Yönetmen: fare modelleri hızlı ve güvenilir kurulması için sağlar preklinik deneyler kurmak için ultrason destekli enjeksiyon teknikleri kullanılan. Ultrason görselleştirme de boyuna değerlendirme tümör engraftment ve büyüme için invaziv bir yöntem sağlar. Burada, böbreküstü bezi NB ve böbrek alt kapsülü kullanmak için ES için kanser hücrelerinin ultrason destekli enjeksiyon yöntemi açıklanmaktadır. Bu minimal invaziv yaklaşım sıkıcı açık cerrahi implantasyon kanser hücrelerinin büyüme ve metastaz doku özel konumlarda üstesinden gelir ve marazi kurtarma dönemleri azaliyor. Biz kurulan hücre satırları ve hasta türetilmiş hücre satırları orthotopic enjeksiyon için kullanımını açıklar. Tümör ayrılma ve luciferase hücrelerinin etiketleme için önceden hazırlanmış ticari kitleri mevcuttur. Görüntü Kılavuzu kullanarak hücre süspansiyon enjeksiyon preklinik modellerinin oluşturulması için minimal invaziv ve tekrarlanabilir bir platform sağlar. Bu yöntem, mesane, karaciğer ve pankreas delinmemiş potansiyeline çok sayıda kanser modelleri için örnekli gibi diğer kanserler için güvenilir preklinik modelleri oluşturmak için kullanılmaktadır.
Introduction
Hayvan xenograft modelleri roman antikanser terapiler preklinik çalışmaları için gerekli araçları vardır. Subkutan kanat implantasyon hücrelerinin tümör büyümesini izlemek için bir verimli ve kolay erişilebilir sitesi sağlayan standart fare xenografts güveniyor. Subkutan modelleri1metastaz potansiyellerini sınırlayabilir tümör özgü biyolojik özellikleri onların eksikliği dezavantajdır. Gibi sınırlamalar tarafından hangi tümör hücreleri metastatik potansiyel2ile ilgili bir microenvironment sağlayan yerel doku sitelerdeki engrafted orthotopic xenografts kullanımı üstesinden vardır. Orthotopic xenograft modelleri orijinal biyolojik özellikleri korumak ve güvenilir modelleri preklinik ilaç bulma3,4için sağlar. Doku yönetmen implantasyon için kullanılan kanser hücrelerinin kurulan hücre hatları veya hasta kaynaklı hücrelerden hasta tümör vardır. Xenografts kanser hücre satırlarından kurulan hasta türetilmiş xenografts5' e göre birincil tümör üzerinden yüksek genetik sapma sergileyebilirler. Bu göz önüne alındığında, hasta kaynaklı orthotopic xenografts kurulması roman tedavi kanser ilaç bulma gelen test etmek için tercih edilen standart haline gelmiştir.
Pediatrik kanser Nöroblastom (NB), orthotopic xenograft modelleri birincil tümör biyolojisi özetlemek ve metastaz yaymak NB6,7tipik sitelere geliştirmek. NB böbreküstü bezi veya paravertebral sempatik zinciri boyunca gelişir. Orthotopic implantasyonu en yaygın yöntem açık trans-abdominal cerrahi işlemler gerektirir. Tür yöntemler genellikle sıkıcı, yüksek hayvan hastalık ve karmaşık kurtarma dönemleri yoktur. Yüksek çözünürlüklü ultrason son zamanlarda doku yönetmen implantasyonu tümör hücreleri kanser araştırma8,9için birkaç fare modelleri geliştirilmesi için kullanılmıştır. Güvenilir, tekrarlanabilir, verimli ve güvenli ilgili metastatik tümör xenografts10,11kurulması için tekniğidir.
Pediatrik kanser xenografts ultrason destekli hedef organ yerelleştirme ve iğne implantasyon hücre satırları ve hasta kaynaklı tümör hücreleri tarafından kurulması gösterdiği11olduğunu. Teknik fare böbreküstü bezinin hedef NB için kullanılmıştır. Ewing sarkomu (ES) ağırlıklı olarak uyluk kemiği ve pelvik kemik12gibi uzun kemiklerde yaygın olarak görülen bir kemik kanseri var. Olgu sunumları büyüme ağırlıklı olarak kemik kanseri böbrek dokusunda uygulanabilir olup olmadığını belirlemek için bir böbrek alt kapsüler yerde orthotopic implantasyon13için seçildi olduğunu göstermiştir. Tümör hücreleri böbrek alt kapsüler hücre implantasyonu spontan Metastazlari ES14için çalışmaya gelecek vaat eden bir model olarak kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm iş The University of Michigan Kurumsal değerlendirme Komitesi (HUM 00052430) uygun olarak yapıldığını ve kullanımı ve bakımı hayvanlar (UCUCA) üniversite Komitesi tarafından onaylanmış yordamlar için uygundur. Birim için laboratuvar, hayvan Tıp (ULAM) hayvan bakımı konusunda çalışmalar yaptı.
Tüm çalışma onayı ile University of Michigan kurumsal İnceleme Kurulu (HUM 00052430) yapıldı ve bütün insan Araştırma Etik Komitesi düzenlemeler için uygundur. İnsan hücreleri potansiyel biyolojik bir malzeme olması, bu yüzden tüm özel önlemler ve kurum tarafından gerekli uygun Biyogüvenlik uygulamaları takip için kabul edilir. NSG fareler ağır immün ve yaygın ortamda bulunan bakteriler neden hastalığa duyarlı değildir.
Her zaman sıkı steril tekniği malzeme implantasyon ve enjeksiyonları gerçekleştirmek için hazırlanırken kullanın.
1. hücre kültürü
- Kurulan insan NB hücre hatları (SH-SY5Y, SK-N-BE2 ve IMR32) en az gerekli ortamı, büyümek % 10 fetal Sığır serum, 2 mM glutamin, 100 adet/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile desteklenmiştir. IMR32 hücreleri daha fazla 1 mM pyruvate ve %0.075 NaHCO3ek. 37 ° C, % 5 CO2 ve % 70-80 izdiham. tüm hücreleri korumak
- İnsan ES Hücre hatlarında (TC32, A673, CHLA-25 ve A4573) RPMI orta % 10 fetal Sığır serum ve 6 mM L-glutamin ile desteklenmiş büyümek. 37 ° c, % 5 CO%2 70-80 izdiham. , tüm hücreleri korumak
- Kimlik doğrulama için tüm hücre satırlarını göndermek.
Not: Bir dış tesisinde hücre kimlik doğrulaması yapılır, bildirimleri için bakınız.
2. birincil hasta kaynaklı tümör hücreleri hazırlanması
- Hasta izni ve onayı ile hasat insan NB tümör dokusu yerel kontrol ve koruma için doku depolama çözümü laboratuvarda ulaşım için cerrahi rezeksiyon geçiren hastaların atılır.
Not: Tüm hasta numuneleri de-tespit ve Kurumsal değerlendirme komitesi kılavuzlarınıza uygun olarak ele. - Bir tek hasta kaynaklı kanser hücre süspansiyon (UMNBL001, UMNBL002) bir tümör ayrılma kit kullanarak tümör doku oluşturmak. Tümör yaklaşık 0,5 g 5 mL RPMI arabellek, enzim H, enzim R 100 µL 200 µL ve 25 de içeren bir 100 mm hücre kültür yemek için aktarım µL enzim A insan tümör ayrılma Takımı'ndan.
- Küçük parçalar halinde (2-4 mm her) tümör kıyma makas ve doku forseps kullanarak. Bu parçaları adım 2.2 çözümlerinde karıştırın.
- Dissociator tüp içine tümör karışımı pipette ve tüp kapatın. Tüp ters çevir ve doku dissociator kol ekleyin. Program h_tumor_01 üzerinde çalıştırın.
- Aralıklı toz her 15 dk ile dönen bir raf üzerinde 1 h için 37 ° C'de yukarıda elde tümör hücre süspansiyon kuluçkaya.
- Hücre süspansiyon için yeni 50 mL konik tüp aktarmak ve RPMI 10 mL ekleyin. Hücre süspansiyon vasıl 314 x g 5 dk santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant kaldırmak ve Pelet 5 mL RPMI askıya alma. Bu çözüm 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek ve gergin çözüm taze 50 mL konik tüp içine toplamak. Bu süzgeç bir kez 5 mL RPMI medya ile yıkayın ve bir Pelet toplamak 5 min için 314 x g karisimin santrifüj kapasitesi.
- Hemacytometer15kullanarak hücre yoğunluğu ölçmek. Yukarıdan RPMI içinde 4 × 105 hücreleri/10 µL son bir konsantrasyon elde etmek için elde edilen Pelet askıya alma. Bu hücre süspansiyon 5 µL alıp her enjeksiyon için hücre çözümü 10 µL yapmak için matrigel 5 µL.
Not: Hücre yoğunluğu ölçüm üzerinde kullanılan RPMI bağlıdır. Örneğin, elde edilen Pelet ölçülen hücre yoğunluğu 4 x 105 hücreleri ise, Pelet RPMI 10 µL içinde askıya.
3. luciferase kanser hücrelerinin etiketleme
- 10 mL 5 mL de viral süpernatant EF1a-Luc2-DDE'ler-mCherry ve kök hücre medya 5 mL ile iletim ortamının olun. 1 x polybrene 7.5 µL ekleyin.
- 5 × 106 kanser hücreleri iletim medya ve plaka 100 mm Ultra düşük ek plaka karıştırın. 37 ° C ve % 5 CO2 adlı gecede kuluçkaya.
Not: düşük ek plakaları kullanılan olarak hücreleri plaka için uygun olmaz. - 24 saat sonra doku kültürü başlık altında hücreleri içeren 100 mm tabak getir ve karışımı 15 mL konik tüp içine aktarın. Hücre süspansiyon hücre pelet almak 5 min için 314 x g, santrifüj kapasitesi. Bir kez 1 mL 1 x fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile hücre Pelet yıkama ve hücre pelet 1 mL % 1 fetal Sığır serum (FBS) içeren HBSS askıya alma.
- Luciferase hücreleri floresan aktif hücre (FACS) analiz sıralama GFP pozitif sinyal dayalı sıralama. 100 mm doku kültürü tedavi sıralanmış hücrelerdeyse çanağı ve % 70-80 izdiham, 37 ° C ve gerekli kadar % 5 CO2 korumak plaka.
- Luciferase sinyal luciferase tahlil kiti ile onaylayın. Bir illuminometer uyumlu 96 bir kuyu başına plaka 10 x 104 sıralı hücre plaka iyi ve hücreleri gecede saat 37 ° C ve % 5 CO2kuluçkaya. 24 saat sonra 96 iyi plaka oda sıcaklığına getirmek ve sabit-Glo reaktif Wells 1:1 oranında kültürlü medya ekleyin. Hücreleri 5 min için koşullar ve ışıldama spektrofotometre içinde okumak için izin.
- 100 mm çanak doku kültürü başlık altında getir. Süpernatant medya atmak. Hücreler 2 mL 1 x PBS ile yıkayın.
- 2 mL % 0.25 tripsin ekleyin ve 100 mm bulaşık kuluçka makinesi 2-3 dakika için geri dönün. 2-3 dk sonra mikroskop altında yerinden çıkar hücreleri denetleyin ve tripsin devre dışı bırakmak için RPMI 8 mL ekleyin.
- 15 mL konik tüp ve santrifüj 314 x g bir pelet almak 5 min için de hücre süspansiyon toplamak. Süpernatant atmak. 1 mL 1 x PBS ile hücre Pelet yıkama, Pelet 5 mL RPMI askıya alma ve hemacytometer15kullanarak hücre yoğunluğu belirlemek. Hücre çözümü 314 x g bir Pelet elde etmek 5 min için de kalan yhe santrifüj kapasitesi.
- Pelet 4 x 105 hücreleri/10 µL bir konsantrasyon elde etmek için RPMI içinde askıya alma. Hücre süspansiyon 5 µL alıp her enjeksiyon için hücre çözümü 10 µL yapmak için matrigel 5 µL.
4. böbrek üstü bezi (NB) veya böbrek alt Kapsülü (ES) implantasyon ultrason destekli
Not: Tüm ultrason yordamları kullanarak görüntüleme sistemi bir yüksek çözünürlüklü vivo içinde gerçekleştirilir. Açıklanan yordamları için 40 MHz merkezi sıklığını ve 22-55 MHz bant genişliği vardır dönüştürücü kullanıldı.
- 6-8-hafta-yaşlı bağışıklık eksikliği NSG fareler tüm enjeksiyon yordamları için kullanmaktadır.
- Matrigel ve autoclaved Hamilton şırınga 27 G iğne ile (1,25") ile donatılmış ve 22G kateterler (0.9 mm dış çapı, 25 mm uzunluk) 4 ° C'de gece
- Adım 3 buz üzerinde hazırlanan hücre çözümü yerleştirin.
- 2 L/dak teslim O%2 2 isoflurane kullanılarak bir indüksiyon odası farelerde anestezi.
Not: Yeterli anestezi etkin hareket eksikliği ve spontan solunum Bakımı ile belirlenir. - Bir kez anestezi, sırt ve kanat saç Temizleme losyonu (örneğin Nair) ve bir tıraş makinesi kullanarak hayvanların depilate.
- Hayvan görüntüleme platformu ile karın yan aşağı, burada hayvan burun bir nosecone yerleştirilir ve isoflurane teneffüs edilmesi sırasında güvenli aktarın.
- Optik merhem kurutma önlemek için hayvanın gözlerinin içine yerleştirin. Fare yerine yanlışlıkla herhangi bir hareketi engellemek için teyp.
- Fare karaciğer, vena cava, dalak, sol böbrek ve bitişik sol böbreküstü bezi ultrason görselleştirme kullanarak tanımlayın.
- Steril eldiven, maske ve kap kişisel koruma ve bakım Steril koşullar için kullanın. Ultrason rehberliği altında yavaşça deri yoluyla 22 G kateter takın ve hücresel enjeksiyon için bir kanal sağlamak için sol böbreküstü bezi içine doğrudan kas geri. İğneyi çıkarın ve kateter yerde bırakın.
- Yük bir soğutulmuş Hamilton şırınga hücre çözümü 10 µL ile küçük bir iğne ile donatılmış, sonra şırınga stereotactically böbreküstü bezi ortasına konumlandırılmış kateter aracılığıyla rehberlik.
- Hücreleri hedeflenen adrenal dokusu içine enjekte. İğne matrigel ayarlamak izin vermek 1-2 min için bir yerde bırakın. Yavaş yavaş iğne kateterin kaldırma tarafından takip, kaldırın.
- Fareler onların kafes yerleştirin ve fare sternal recumbency korumak için yeterli bilincinin tekrar yerine geleceğinden emin olun.
Not: Bu teknik minimal invaziv doğası gereği, en az, ama hala günlük ile fareler sağlık kontrolleri. izlenen sonrası yordam ağrı "bir cümle ile takip edilmelidir:"beklenmeyen belirtileri ağrı veya acı sırasında belirlenen Eğer bir deney, senin hayvan hastalıklarıyla ilgili kurumsal destek birimi analjezi veya diğer tıbbi bakım ile ilgili bilgi için başvurun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sunulan yordamları kullanarak, ultrason destekli implantasyon NB hücrelerinin böbrek üstü bezi içine ısıtılmış bir cerrahi tablo ile donatılmış bir özel yordamın Oda yapıldı. Kol ve ayak pedleri fare kalp etkinlik (Şekil 1A) izlemek için yerleştirildi. Hayvan imzalat burun konisi inhalasyon kullanarak isoflurane altında kaldı. Bir yüksek çözünürlüklü ultrason sonda kullanarak, sol böbrek böbrek (Şekil 1B) sadece kafatası böbreküstü bezi ile tespit edilmiştir. İğne sonra doğrudan görselleştirme (Şekil 1 c) altında böbreküstü bezi içine ileriydi. Bu teknik ilk kullanımı sırasında metilen mavisi boya ve matrigel karışımı doğru yerelleştirme böbreküstü bezinin onaylamak için kullanıldı. Hayvan kurban edildi ve yordamı başarısı üzerinde Nekropsi metilen mavisi boya böbreküstü bezi kapsül (Şekil 1 d) altında görselleştirme tarafından onaylandı.
Haftalık ultrason ve bioluminescence görüntüleme tümör engraftment ve büyüme hızı izlemek için kullanılan yöntemleri vardı. Bioluminescence görüntüleme ilgi bölgesinin en az sayısını 10 ile fotonlar/s/cm2/steridian (p/s/cm2/sr) ölçülen6 -108 gösterge preklinik deneyler9 ( için yeterli tümör boyutu Şekil 2). İstatistiksel olarak anlamlı artış gösterdi bioluminescence içinde t -testi kullanılarak analiz sekiz haftalık dönemde dikkat çekti (* p< 0,05; **p< 0,001; ***p< 0.0001). Ultrason görüntüleme tümör alan ve hacim noninvaziv ölçümleri izin. Bunun yanı sıra bioluminescence ölçüm izlenen tümör engraftment ve ilerleme (Şekil 3). Benzer yordamları (Şekil 4) böbrek alt kapsüle enjekte ES hücreler için kullanılmıştır.
Sonuç tümör brüt ve histolojik analizler birincil tümörleri ve Nekropsi, metastaz ile karakterizedir. Doku örnekleri morfolojik hücre desenleri için muayene ve lekeli tümör özel protein işaretleri (Şekil 5, Şekil 6). NB hücre hatları (IMR32, SH-SY-5Y, SK-N-BE2, UMNBL001, UMNBL002) için birincil tümör engraftment arasında değişiyordu % 62-100, 0-100 arasında görülen metastaz ile enjekte farelerin %. En sağlam Metastazlari SK-N-BE2 (% 33) ve UMNBL002 görüldü (% 100). NB için metastatik lenf bezleri, karaciğer, akciğer ve kortikal kemik olduğunu. Böbrek alt kapsüler engraftment ES hücre hatları (A4573, A673, CHLA-25, TC-32) % 60-100, 0-40 içinde görülen metastaz ile değişmektedir için enjekte farelerin %. Metastatik siteleri için ES muayene lenf düğümleri, kortikal kemik ve akciğerler dahil. En sağlam engraftment (% 100) ve Metastazlari (% 40) TC-32 xenograft farelerde görüldü.
Resim 1 . Fare böbreküstü bezi lokalizasyonu ile ultrason destekli NB hücre implantasyonu. (A) yüksek çözünürlüklü ultrason görüntüleme fare karın organları, böbrek üstü bezi implantasyon tümör hücrelerinin izin. (B) sol böbrek tespit edilmiştir. (C) sol böbreküstü bezi bitişik sol böbrek yapısı yuvarlak bir hypoechoic (karanlık) olarak bulunur. İğne hücre enjeksiyonu ile takip böbreküstü bezi içine ileriydi. (D) matrigel ve metilen mavisi boya karışımı enjeksiyon yordamlar doğruluğunu değerlendirmek için kullanıldı. Sol böbrek ve böbrek üstü bezi matrigel ve metilen mavisi boya böbreküstü bezi kapsül ve peri-böbreküstü alanı temsilcisi ex vivo görüntüsü. Bu rakam Van Noord, izniyle değiştirildi R.A. ve ark. 11. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Vivo tümör engraftment ve büyüme oranı bioluminescence görüntüleme. (A) insan NB adrenal xenografts engraftment ve tümör büyümesi için sekiz hafta boyunca takip. (B) maksimal bioluminescence sinyal faiz bölge içinde tespit edilmiştir. NB hücre hatları (SH-SY5Y, IMR 32, SK-N-BE2) ve hasta kaynaklı hücreler (UMNBL001, UMNBL002) parlaklık ve büyüme kalıpları zamanla artmıştı. Bioluminescence sekiz haftalık dönemde artış istatistiksel olarak anlamlı (*p< 0,05; **p< 0,001; ***p< 0.0001). Bu rakam Van Noord, izniyle değiştirildi R.A. ve ark. 11. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Vivo ultrason görüntüleme tümör engraftment ve büyüme. Ultrason görüntüleme vivo içinde tümör ilerleme izlenir. Ultrason ve karşılık gelen bioluminescence görüntüleri bir, iki, sekiz hafta gösterilir. Bir hafta, engraftment her iki görüntüleme yöntemleri görselleştirildiği. Tümör alan ve hacim ultrason Imaging'i kullanma hesaplanır. 3D ultrason çalışma bitiminde eksize tümörler yansıyor. Bu rakam Van Noord, izniyle değiştirildi R.A. ve ark. 11. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Fare böbrek yerelleştirme ve ultrason destekli ES Hücre implantasyonu. (A) bioluminescence tümör parlaklık ve büyüme izlemek için kullanıldı. (B-C) Hayvanlar karın yapıları çevreleyen bozuk ve kas gibi yerel yapılarına işgal yerel olarak invaziv tümörlerin geliştirdi. Bu rakam Van Noord, izniyle değiştirildi R.A. ve ark. 11. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 . Tümör histopatoloji NB ve ES xenograft tümörlerin. (A) NB xenograft fareler yerel olarak infiltrative birincil tümörleri bitişik karın organları bozuk adrenal ve peri-böbreküstü bezi sitelerinde vardı. (B) mikroskobik (20 X, 50 µm çubuk =), xenograft adrenal tümör morfolojik özellikler insan NB ile tutarlı gösterdi (kötü kümeleri farklılaşmış hücreler yuvarlak köşeli), ara sıra sözde rozet formasyonu (ok) dahil olmak üzere. (C) tümör doku gösterdi güçlü tirozin hidroksilaz (NB tümör marker) immunoreactivity (40 X, çubuk = 40 µm; pozitif kontrol sol panelinde gösterilen boyama; 1: 100). (D) ES xenograft tümör histolojik özellikleri ile infiltrative ES tutarlı (40 X, çubuk = 40 µm), kümeleri epithelioid hücreleri yuvarlak köşeli effacing ve normal bitişik böbrek sıkıştırarak bir iyi fibro vasküler stroma tarafından ayrılmış (ok; sıkıştırılmış ««böbrek parankimi kalıntıları). (E) ES tümör doku gösterdi güçlü membran immunoreactivity ES tümör marker CD99 için (40 X, çubuk = 40 µm; pozitif kontrol sol panelinde gösterilen boyama; 1: 100). Bu rakam Van Noord, izniyle değiştirildi R.A. ve ark. 11. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 . Uzak metastaz geliştirilen içinde ultrason destekli enjeksiyon tekniği ile kurulan xenografts. (A) bioluminescence böbreküstü bezi alan ve metastatik foci kortikal kemik tespit birincil NB tümöre gösterilen görüntüleme. (B) mikroskopik analiz gösterdi iliği kavite ve Proksimal femur kemik effacing metastatik tümör (ok) (4 X, çubuk = 400 µm). (C) tirozin hidroksilaz sitoplazmik immunoreactivity kortikal kemik NB metastatik sitesinin (40 X, çubuk = 40 µm). (D) mikroskopi hasta kaynaklı orthotopic xenograft (UMNBL002) ile hepatik ven içinde karaciğer metastazı (ok) (ok ucu endotel hücreleri gösterir) ve (L) bitişik karaciğer parankimi infiltre (20 X, 50 µm çubuk =). (E) akciğer parankimi içinde Nöroblastom mikro metastaz (ok) (40 X, çubuk = 40 µm). Bu rakam Van Noord, izniyle değiştirildi R.A. ve ark. 11. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ultrason destekli implantasyon NB ve ES hücre kanser biyolojide preklinik çalışmaları için güvenilir fare xenografts kurmak için verimli ve güvenli bir yöntemdir. Ultrason destekli başarısı için kritik doku hedefli implantasyon varlığı ve uzmanlık anatomik olarak faiz organı yerelleştirme ve tümör hücrelerinin stereotaksik enjeksiyon ile eğitimli personel durumu olduğunu.
Tümör dokusunun ayrılma açıklanan hasta kaynaklı xenograft modeli geliştirmek çok önemli bir adım olduğu ortaya çıktı. Yerel tümör doku bir hücresel microenvironment ve tümör alımı veya engraftment etkileyen çevre stroma içerir. Hücre hücresel yoğunluk örnek bir göstergesi 2 x 105 hücreleri/10 μL implantasyon ve başarılı tümör engraftment için bir optimum hücre sayısı olarak kabul ile sağlanan ayrılma işlemi tamamlanmış oldu sonra sayar.
Hücrelerinin tümör engraftment doğrulamak için izin luciferase etiketleme ve 10 ile bioluminescence sinyali ölçerek tümör büyüme izleme6 -108 tümör alımını9/ gösterge kabul ediliyor. Başarılı iletim sağlamak için onaylı vitro hücre enjeksiyon önce luciferase etkinliği oldu. Bu ayirt, luciferase tahlil kitleri ve aynı zamanda bioluminescence sinyal için hücreleri inceleyerek tarafından yapıldı. Bioluminescence ölçmek için kullanılan ayarlar haftalık ölçümler sırasında tutarlı veri sağlayan sabit tutuldu.
Ex vivo histopatolojik analiz tümör hücre tipi ve morfoloji belirli protein işaretler için boyama ile sonuç tümör doğruladı. Histopatolojik analiz tümör engraftment ve ultrason ve kollarındaki görüntüleme tarafından gösterilen metastaz doğruladı.
Onun non-invaziv doğası, çok az hayvan kurtarma süresini ve artan başarı başarılı xenograft modelleri çeşitli kurulması hücresel implantasyon ultrason destekli avantajları şunlardır. Ultrason görüntüleme de vivo içinde tümör ilerleme ve tümör birimleri izlemek için güvenilir bir yöntem sağlar. Bu preklinik modellerin tümörler 5 hafta içinde metastaz ile yerel olarak invaziv hastalık ilerledi. Sınırlamaları yüksek çözünürlükte görüntüleme teknolojisi kullanılabilirliğini ve tutarlı bir şekilde hedef organ yerelleştirmek yeteneği içerir. Kullanılabilirlik ultrason görüntüleme organ ilgi alanındaki uzmanlığı ile personelin bu teknik kritik bileşenlerdir.
Yüksek çözünürlüklü ultrason görüntüleme durumu önemli ölçüde son on yıl içinde artmıştır ve kullanımı sadece klinik pratikte aynı zamanda Laboratuvar araştırma genişletmeye devam ediyor. Modern fare xenografts gelişimi için ultrason kullanımı preklinik araştırma modelleri kanser ilaç keşfi için ilerlemek için potansiyeli olan umut verici bir uygulamadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir açıklamalar var.
Acknowledgments
Bu eser Robert Wood Johnson Vakfı/Amos tıbbi öğretim geliştirme programı, Taubman Araştırma Enstitüsü ve bölüm, çocuk cerrahisi, The University of Michigan destek aldı. Yazarlar Kimber'la Converso-Baran ve Dr. Marcus Jarboe yardımı ile ultrason enjeksiyon yordamlar ve görüntüleme platformu için teşekkür etmek istiyorum. Paul Trombley şekil grafik ile onun yardım için teşekkür. Ayrıca merkezi kullanım kısmen olarak kapsamlı Kanser Merkezi NIH tarafından desteklenen, tümörü Imaging Core, moleküler görüntüleme ve için için Radyoloji Bölümü, University of Michigan teşekkür P30 CA046592 verin. Üniversitenin NIH (OD016502) ve Frankel dolaşım merkezi hibe fon tarafından kısmen desteklenir Michigan fizyolojisi fenotipleme çekirdek. Hücre satır kimlik doğrulama IDEXX RADIL Bioresearch özellikleri, Columbia, Mo yapıldı Tammy Stoll, Dr Rajen Mody ve Mott Solid tümör Onkoloji Program teşekkür ederim. Bizim hastalar ve aileleri minnetle onların ilham, cesaret ve bizim araştırma devam eden destek için kabul vardır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| NOD-SCID | Charles River | 394 | |
| NSG | The Jackson Laboratory | 5557 | |
| Cell Line | |||
| NB | |||
| IMR-32 | ATCC | CCL-127 | Established human neuroblastoma cell line |
| SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | Established human neuroblastoma cell line |
| SK-N-Be2 | ATCC | CRL-2271 | Established human neuroblastoma cell line |
| ES | |||
| TC32 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A673 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| CHLA-25 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A4573 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| Cell Line media | |||
| RPMI | Life Technologies | 11875-093 | |
| Matrigel | BD BioSciences | 354234 | |
| Dissociation | |||
| Dissection Tools | KentScientific | INSMOUSEKIT | |
| Human Tumor Dissociation Kit | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| Luciferase Tagging | |||
| Lenti-GFP1 virus | University of Michigan, Vector Core | Luciferase Virus | |
| Steady Glo-Luciferase Assay Kit | Promega | E2510 | |
| Bioluminescence Imaging | |||
| Ivis Spectrum Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| D-Luciferin | Promega | E160X | |
| Anesthetic | |||
| Inhaled Isoflurane | Piramal Critical Care Inc | 66794-0017-25 | |
| Ultrasound Guided Injection | |||
| Vevo 2100 High Resolution Imaging | Vevo | 2100 | |
| Hamilton Syringes (27 gauge needle) | Hamilton | 80000 | |
| 22 Gauge Angiocatheter | BD Biosciences | 381423 | |
| Optical ointment | Major Pharmaceuticals | 301909 | |
| Nair | Church & Dwight Co | Hair Removal agent | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel | Parker | Ultrasound gel | |
| Histology | |||
| CD99 | DAKO | M3601 | Primary Antibody |
| Tyrosine Hydroxylase | Sigma-Aldrich | T2928 | Primary Antibody |
| Secondary HRP-Polymer antibody | Biocare | BRR4056KG | |
| Miscelleneous | |||
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| P1000 pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| P200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| P1000 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375E | |
| P200 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Portable pipette aid | Drummond | 4-000-101 | |
| digital animal Weighing Scale | KentScientific | SCL-1015 | |
| Calipers | Fisher Scientific | 06-664-16 | |
| 6well low attachment plates | Corning | 07-200-601 | |
| 10 cm Tissue Culture Treated Dishes | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G |
References
- Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Ann Oncol. 27 (7), 1190-1198 (2016).
- Fidler, I. J., Hart, I. R. Biological diversity in metastatic neoplasms: origins and implications. Science. 217 (4564), 998-1003 (1982).
- Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation. Eur J Cancer. 40 (6), 852-857 (2004).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic Models are Necessary to Predict Therapy of Transplantable Tumors in Mice. Cancer Metastasis Rev. 17 (3), 279-284 (1998).
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).
- Khanna, C., Jaboin, J. J., Drakos, E., Tsokos, M., Thiele, C. J. Biologically relevant orthotopic neuroblastoma xenograft models: Primary adrenal tumor growth and spontaneous distant metastasis. In Vivo. 16 (2), 77-85 (2002).
- Stewart, E., et al. Development and characterization of a human orthotopic neuroblastoma xenograft. Dev Biol. 407, 344-355 (2015).
- Jäger, W., et al. Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts. J. Vis. Exp. (84), e51123 (2014).
- Teitz, T., et al. Preclinical Models for Neuroblastoma: Establishing a Baseline for Treatment. PLoS ONE. 6 (4), e19133 (2011).
- Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts retain metastatic patterns and geno- and phenotypes of patient tumours. International Journal of Cancer. 136 (5), 252-261 (2015).
- Van Noord, R. A., et al. Tissue-directed Implantation Using Ultrasound Visualization for Development of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. In Vivo. 31 (5), 779-791 (2017).
- Vormoor, B., et al. Development of a Preclinical Orthotopic Xenograft Model of Ewing Sarcoma and Other Human Malignant Bone Disease Using Advanced In Vivo Imaging. PLoS ONE. 9 (1), e85128 (2014).
- Hakky, T. S., Gonzalvo, A. A., Lockhart, J. L., Rodriguez, A. R. Primary Ewing sarcoma of the kidney: a symptomatic presentation and review of the literature. Ther Adv Urol. 5 (3), 153-159 (2013).
- Cheng, H., Clarkson, P. W., Gao, D., Pacheco, M., Wang, Y., Nielsen, T. O. Therapeutic Antibodies Targeting CSF1 Impede Macrophage Recruitment in a Xenograft Model of Tenosynovial Giant Cell Tumor. Sarcoma. 2010, 174528 (2010).
- JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
