Summary
Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van echografie-geleide injectie van neuroblastoom (NB) en de Ewing sarcoom (ES) cellen (gevestigde cellijnen en patiënt afkomstige tumorcellen) op biologisch relevante sites maken van betrouwbare preklinische modellen voor kanker onderzoek.
Abstract
Preklinische testen van antikanker therapieën, is afhankelijk van relevante xenograft modellen die de aangeboren tendensen van kanker na te bootsen. Voordelen van standaard subcutane flank modellen zijn procedurele gemak en de mogelijkheid om monitor tumor progressie en reactie zonder invasieve imaging. Dergelijke modellen zijn vaak inconsistent in translationeel klinische proeven en hebben beperkte biologisch relevante kenmerken met lage neiging tot metastase, want er een gebrek aan een eigen communicatie is. Ter vergelijking: orthotopic xenograft modellen op sites van de oorspronkelijke tumor is gebleken nabootsen van de communicatie van de tumor en repliceren belangrijk ziektekenmerken zoals verre metastatische verspreiding. Deze modellen vereisen vaak vervelend chirurgische ingrepen met langdurig verdoving tijd en herstel. Om aan te pakken dit, hebben kanker onderzoekers onlangs gebruikt echografie-geleide injectie technieken om kanker xenograft modellen voor preklinische experimenten, die zorgt voor snelle en betrouwbare inrichting van weefsel geleide lymfkliertest modellen. Echografie visualisatie biedt ook een noninvasive methode voor het longitudinale beoordeling van tumor engraftment en groei. Hier beschrijven we de methode voor echografie-geleide injectie van kankercellen, gebruik makend van de bijnier voor NB en renale sub capsule voor ES. Deze minimaal invasieve benadering overwint vervelend open chirurgie implantatie van kankercellen in weefsel-specifieke locaties voor groei en metastase en voorbij morbide herstel periodes. We beschrijven het gebruik van zowel bestaande cellijnen als patiënt afgeleide cellijnen voor orthotopic injectie. Pre-en-klare commerciële kits zijn beschikbaar voor tumor dissociatie en luciferase tagging van cellen. Injectie van celsuspensie met behulp van beeld-begeleiding biedt een minimaal invasieve en reproduceerbare platform voor het maken van preklinische modellen. Deze methode wordt gebruikt om te maken van betrouwbare preklinische modellen voor andere vormen van kanker zoals lever, blaas en alvleesklier voorbeeldig voor haar onbenut potentieel voor talrijke kanker modellen.
Introduction
Dierlijke xenograft modellen zijn essentiële instrumenten voor preklinische studies van nieuwe antikanker therapieën. Standaard lymfkliertest xenografts is afhankelijk van subcutane flank innesteling van cellen, een efficiënt en gemakkelijk toegankelijke site voorziet in toezicht op de tumorgroei. Het nadeel van subcutane modellen is hun gebrek aan tumor-specifieke biologische kenmerken, die hun potentieel beperken kunnen voor het metastaseren1. Dergelijke beperkingen zijn overwonnen door het gebruik van orthotopic xenografts in welke tumor cellen worden geaccepteerd op inheemse weefsel sites, gemetastaseerde potentieel2voorzien van een relevante communicatie. Orthotopic xenograft modellen originele biologische kenmerken behouden en betrouwbare modellen voorzien preklinische drug discovery3,4. De kankercellen gebruikt voor weefsel-geleide innesteling zijn bestaande cellijnen of patiënt-afgeleide cellen van de patiënt tumoren. Xenografts vastgesteld van kanker cellijnen kunnen hoge genetische afwijking van de primaire tumor ten opzichte van patiënten afgeleide xenografts5vertonen. Gezien dit, de oprichting van patiënt-afgeleide orthotopic xenografts de voorkeur standaard geworden voor het testen van nieuwe therapeutics in kanker drugontdekking.
In de pediatrische kanker neuroblastoom (NB), orthotopic xenograft modellen recapituleren primaire tumor biologie en metastase naar typische sites van NB verspreid6,7te ontwikkelen. NB ontwikkelt in de bijnier of langs de sympathieke keten van paravertebral. De meest voorkomende methoden van orthotopic implantatie vereisen open trans-abdominale chirurgische procedures. Deze methoden zijn vaak saai, hebben hoge dierlijke morbiditeit en complexe herstel periodes. Hoge resolutie echografie is onlangs gebruikt voor weefsel-geleide implantatie van tumorcellen in de ontwikkeling van verschillende lymfkliertest modellen voor kanker onderzoek8,9. De techniek is betrouwbare, reproduceerbare, efficiënt en veilig voor de vaststelling van relevante uitgezaaide tumor xenografts10,11.
De oprichting van pediatrische kanker xenografts door echografie-geleide doel orgel lokalisatie en naald implantatie van cellijnen en patiënt afkomstige tumorcellen is aangetoond dat11. De techniek werd gebruikt voor NB gericht op de lymfkliertest bijnier. Het Ewing sarcoom (ES) is voornamelijk een ossaal kanker, vaak gezien in de lange beenderen zoals dijbeen en het bekken beenderen12. Aanvraagrapporten hebben aangetoond dat om te bepalen of de groei van een overwegend werden kanker haalbaar in renal weefsel is, een renale sub kapselvorming locatie werd gekozen voor orthotopic implantatie13. Renale sub kapselvorming cel innesteling van tumorcellen is gebruikt als een veelbelovende model te bestuderen van spontane metastasen voor ES14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alles werd gedaan in overeenstemming met de Universiteit van Michigan institutionele Review Board (HUM 00052430) en voldoet aan de procedures die zijn goedgekeurd door de Commissie van de Universiteit op gebruik en verzorging van dieren (UCUCA). De eenheid voor laboratorium voor dierlijke geneeskunde (ULAM) overzag dierenverzorgers.
Alle werk werd gedaan met de goedkeuring van de Universiteit van Michigan institutionele Review Board (HUM 00052430) en voldoet aan alle menselijke onderzoek ethiek Reglement. Menselijke cellen worden beschouwd als een potentieel biohazardous materiaal, dus volg alle speciale voorzorgsmaatregelen en passende bioveiligheid praktijken die zijn vereist voor uw instelling. NSG muizen zijn ernstig immuungecompromitteerde en vatbaar voor ziekten veroorzaakt door bacteriën die gewoonlijk worden aangetroffen in de omgeving.
Gebruik altijd strenge steriele techniek bij de voorbereiding van de materialen voor implantatie en het uitvoeren van de injecties.
1. de celkweek
- Gevestigde menselijke NB cellijnen (SH-SY5Y SK-N-BE2 en IMR32) groeien in minimaal essentiële medium, aangevuld met 10% foetale runderserum, 2 mM glutamine, 100 eenheden/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine. Een aanvulling op de cellen van de IMR32 verder met 1 mM pyruvaat en 0,075% NaHCO3. Handhaven van alle cellen bij 37 ° C, 5% CO2 en 70-80% confluence.
- Groeien menselijke ES cellijnen (TC32, A673, CHLA-25 en A4573) in RPMI medium aangevuld met 10% foetale runderserum en 6 mM L-glutamine. Handhaven van alle cellen bij 37 ° C, 5% CO2 bij 70-80% samenvloeiing.
- Stuur alle cellijnen voor verificatie.
Opmerking: Cel verificatie wordt gedaan op een externe faciliteit, verwijzen wij u naar bevestigingen.
2. voorbereiding van de primaire Tumor van de patiënt-afgeleide cellen
- Met de patiënt toestemming en instemming weggegooid oogst menselijke NB tumor weefsel van patiënten die een chirurgische resectie voor lokale controle en vervoer naar het laboratorium in weefsel opslagoplossing voor behoud.
Opmerking: Alle patiënten monsters zijn-geïdentificeerd en behandeld overeenkomstig de richtsnoeren van de institutionele Review Board. - Genereren een celsuspensie van één patiënt afkomstige kanker (UMNBL001, UMNBL002) van de tumor weefsel met behulp van een tumor dissociatie kit. Ongeveer 0,5 g tumor overbrengen in een 100 mm cel cultuur schotel met 5 mL RPMI buffer, 200 µL van enzym H, 100 µL van enzym R en 25 µL van enzym A uit de menselijke tumor dissociatie kit.
- Gehakt van de tumor in kleine stukjes (elke 2-4 mm) met behulp van schaar en pincet weefsel. Meng deze fragmenten met de oplossingen in stap 2.2.
- Pipetteer van het mengsel van de tumor in een dissociator buis en sluit de tube. Omkeren van de buis en hechten op de mouw van de dissociator van het weefsel. Op het programma h_tumor_01 uitvoeren.
- Incubeer de tumor celsuspensie verkregen boven bij 37 ° C gedurende 1 uur op een roterende rek met intermitterende verpulvering elke 15 min.
- De celsuspensie overbrengen in een nieuwe conische tube van 50 mL en voeg 10 mL van RPMI. Centrifugeer de celsuspensie bij 314 x g gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant en Suspendeer de pellet in 5 mL RPMI. Deze oplossing passeren door een zeef van 40 µm cel en het verzamelen van de gespannen oplossing in een conische buis van verse 50 mL. Deze zeef eenmaal met 5 mL van RPMI media wassen en centrifugeren van het mengsel bij 314 x g gedurende 5 min voor het verzamelen van een pellet.
- Het meten van de celdichtheid met behulp van een hemacytometer15. Opschorten van de pellet in RPMI om een eindconcentratie van 4 × 105 cellen/10 µL van bovenaf verkregen. Neem 5 µL van deze celsuspensie en 5 µL van matrigel te maken 10 µL van cel oplossing voor elke injectie.
Opmerking: Hoeveelheid RPMI gebruikt hangt af van de cel dichtheid meting. Bijvoorbeeld, als de gemeten celdichtheid van de verkregen pellet 4 x 105 cellen is, Suspendeer de pellet in 10 µL van RPMI.
3. luciferase Tagging van kankercellen
- Breng 10 mL transductie media met 5 mL van virale supernatant EF1a-Luc2-IRES-mCherry en 5 mL van de media van de cel van de stam. Voeg 7,5 µL van 1 x polybrene.
- Mix 5 × 10-6 kankercellen in signaaltransductie media en plaat in 100 mm ultra-lage bijlage plaat. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 's nachts.
Opmerking: Zoals lage bijlage platen worden gebruikt, cellen zal niet houden aan de plaat. - Na 24u, brengen de 100 mm plaat met cellen onder weefselkweek motorkap en breng het mengsel in een conische tube van 15 mL. Centrifugeer de celsuspensie bij 314 x g gedurende 5 min om de cel-pellet. Wassen van de cel pellet een keer met 1 mL 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en het opschorten van de cel pellet in 1 mL HBSS met 1% foetale runderserum (FBS).
- Sorteren luciferase cellen op basis van GFP-positieve signaal op fluorescentie-activated cell sorting (FACS) analyse. Plaat de gesorteerde cellen op 100 mm Weefselkweek behandeld schotel en handhaven bij 70-80% samenvloeiing, 37 ° C en 5% CO2 totdat vereist.
- Luciferase signaal met luciferase assay kit te bevestigen. Plaat 10 x 104 gesorteerd op cellen per putje in een illuminometer compatibel 96 goed plaat en incubeer cellen 's nachts bij 37 ° C en 5% CO2. Na 24u, breng de 96 goed plaat op kamertemperatuur en Steady-Glo reagens toevoegen aan gekweekte media in putten in 1:1 verhouding. Cellen lyse voor 5 min en lezen van luminescentie in spectrofotometer toestaan.
- Breng de schotel van 100 mm onder de motorkap van een weefselkweek. Gooi het supernatant media. Wassen van de cellen een keer met 2 mL 1 x PBS.
- Voeg toe 2 mL trypsine van 0,25% en de 100 mm schotel terugkeren naar de incubator voor 2-3 min. Na 2-3 min, Controleer verdreven cellen onder de Microscoop en 8 mL van RPMI om te deactiveren trypsine toevoegen.
- Het verzamelen van de celsuspensie in een conische tube van 15 mL en centrifuge bij 314 x g gedurende 5 min om te krijgen een pellet. Verwijder het supernatant. Wassen van de cel pellet met 1 mL 1 x PBS, Suspendeer de pellet in 5 mL van RPMI en bepalen van de celdichtheid met behulp van een hemacytometer15. Centrifugeer yhe resterende cell oplossing bij 314 x g gedurende 5 min te verkrijgen van een pellet.
- Suspendeer de pellet in RPMI tot een concentratie van 4 x 105 cellen/10 µL aan. Neem 5 µL van de celsuspensie en 5 µL van matrigel te maken 10 µL van cel oplossing voor elke injectie.
4. echografie begeleide bijnier (NB) of renale Sub Capsule (ES) implantatie
Opmerking: Alle echografie procedures worden uitgevoerd met een hoge resolutie in vivo imaging systeem. Voor de beschreven procedures, werd de transducer, die een center frequentie van 40 MHz en een bandbreedte van 22-55 MHz heeft gebruikt.
- 6-8-week-oude immuun-deficiënte NSG muizen voor alle injectie procedures gebruiken.
- Chill de matrigel en gesteriliseerde met autoclaaf Hamilton spuiten uitgerust met een 27G naald (1.25"), en 22G katheters (externe diameter van 0,9 mm, 25 mm lengte) 's nachts bij 4 ° C.
- Plaats de mobiele oplossing bereid in stap 3 op ijs.
- Anesthetize van de muizen in een inductie-kamer met 2% Isofluraan in O2 geleverd in 2 L/min.
Opmerking: Voldoende verdoving wordt bepaald met het gebrek aan actieve beweging en het onderhoud van de spontane ademhaling. - Zodra verdoofd, ontharen de rug en de flank van de dieren met behulp van haar verwijdering lotion (zoals Nair) en een scheerapparaat.
- Overbrengen in het dier het imaging platform met abdominale zijde naar beneden, waar de neus van het dier wordt geplaatst in een neuskegel en beveiligd terwijl het inademen van Isofluraan.
- Plaats optische zalf in de ogen van het dier om te voorkomen dat het drogen. Tape de muis om te voorkomen dat elke onbedoelde beweging.
- Identificeer de lymfkliertest lever, vena cava, milt, linker nier en aangrenzende linker bijnier met behulp van echografie visualisatie.
- Steriele handschoenen, masker en GLB gebruiken voor persoonlijke bescherming en onderhoud van steriele omstandigheden. Onder echografie-begeleiding, zachtjes invoegen een 22G katheter via de huid en spier terug rechtstreeks in de linker bijnier klier te voorzien in een kanaal voor cellulaire injectie. Verwijder de naald en laat de katheter op zijn plaats.
- Belasting een gekoeld Hamilton spuit uitgerust met een lijst naald met 10 µL van cell oplossing en begeleiden van de spuit stereotactically via de katheter gepositioneerd in het midden van de bijnier.
- Het injecteren van de cellen in het gerichte bijnier weefsel. Laat de naald staan voor 1-2 min om de matrigel in te stellen. Verwijder langzaam de naald, gevolgd door het verwijderen van de katheter.
- Plaats de muizen terug in hun kooi en ervoor te zorgen dat de muis voldoende bewustzijn te handhaven sternale lighouding herwint.
Opmerking: vanwege de minimaal invasieve aard van deze techniek, post procedurele pijn is minimaal, maar nog steeds gecontroleerd op een dagelijkse basis met muizen gezondheid controles. "moet worden gevolgd met een zin:"als onverwachte tekenen van pijn of leed worden geïdentificeerd in de loop van een experiment, overleg plegen met uw institutionele veterinaire hondensteun voor informatie over analgesie of andere medische zorg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de procedures die zijn gepresenteerd, werd echografie-geleide implantatie van NB cellen in de bijnier gedaan in een speciale procedure kamer is voorzien van een verwarmd chirurgische tabel. Arm en voet pads werden geplaatst voor het toezicht op lymfkliertest hartactiviteit (figuur 1A). Het dier bleef narcose onder Isofluraan met behulp van de neus inademen. Met een hoge resolutie ultrasone sonde, werd de linker nier geïdentificeerd met de bijnier klier gewoon craniale naar de nier (figuur 1B). De naald was dan gevorderd in de bijnier klier onder directe visualisatie (Figuur 1 c). Tijdens eerste gebruik van deze techniek, werd een mengsel van methyleenblauw kleurstof en matrigel gebruikt om te bevestigen correcte lokalisatie van de bijnier. Het dier werd geofferd, en het succes van de procedure werd bevestigd op necropsie door het visualiseren van de kleurstof methyleenblauw onder de bijnier capsule (Figuur 1 d).
Per echografie en bioluminescentie beeldvorming waren de modaliteiten die zijn gebruikt voor het bewaken van de engraftment- en groeisnelheid bij tumor. Bioluminescentie beeldvorming van de regio van belang als de fotonen/s/cm2/steridian (p/s/cm2/sr) werd gemeten met een minimaal aantal 106 tot 108 indicatieve van voldoende tumor grootte voor preklinische experimenten9 ( Figuur 2). Analyse met behulp van de t -test toonde statistisch significante toename in bioluminescentie geconstateerd in de periode van acht weken durende (* p< 0.05; **p< 0.001; ***p< 0.0001). Echografie imaging toegestaan noninvasive metingen van tumor oppervlakte en volume. Dit samen met bioluminescentie meting gecontroleerd zowel de engraftment van de tumor en de progressie (Figuur 3). Soortgelijke procedures werden gebruikt voor ES-cellen geïnjecteerd in de renale sub capsule (Figuur 4).
Bruto- en histologische analyse van resulterende tumoren gekenmerkt de primaire tumoren en uitzaaiingen bij de necropsie. Weefselsteekproeven zijn onderzocht voor morfologische celpatronen en gekleurd voor tumor-specifieke eiwitten markeringen (Figuur 5, Figuur 6). Primaire tumor engraftment voor NB cellijnen (IMR32 SH-SY-5Y, SK-N-BE2, UMNBL001, UMNBL002) varieerden van 62-100%, met metastasen gezien in 0-100% van de geïnjecteerde muizen. De meest robuuste metastasen werden gezien in de SK-N-BE2 (33%) en UMNBL002 (100%). Metastatische sites voor NB werden lymfeklieren, lever, longen en corticaal bot. Renale sub kapselvorming engraftment voor ES-cellijnen (A4573, A673, CHLA-25, TC-32) varieerde van 60-100%, met metastasen gezien in 0-40% van de geïnjecteerde muizen. Metastatische sites onderzocht voor ES opgenomen lymfklieren, corticale botten en longen. De meest robuuste engraftment (100%) en de metastasen (40%) werden waargenomen in TC-32 xenograft muizen.
Figuur 1 . Lymfkliertest bijnier lokalisatie en echografie-geleide NB cel implantatie. (A) hoge resolutie echografie beeldvorming van lymfkliertest buikorganen toegestaan bijnier implantatie van tumorcellen. (B) de linker nier werd geïdentificeerd. (C) de linker bijnier ligt naast de linker nier als een hypoechoic (donkere) ronde structuur. De naald was gevorderd in de bijnier gevolgd door injectie van de cel. (D) een mengsel van matrigel en kleurstof methyleenblauw werd gebruikt voor het beoordelen van de juistheid van injectie procedures. Representatieve ex vivo -imago van de linker nier en de bijnier met matrigel en methyleenblauw kleurstof op de bijnier en de capsule peri-bijnier ruimte. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van Van Noord, R.A. et al. 11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . In vivo bioluminescentie beeldvorming van tumor engraftment en groeisnelheid. (A) menselijke NB bijnier xenografts werden onderzocht voor engraftment en tumorgroei meer dan acht weken. (B) maximale bioluminescentie signaal was bepaald binnen de regio van belang. NB cellijnen (SH-SY5Y, IMR 32, SK-N-BE2) en patiënt-afgeleide cellen (UMNBL001, UMNBL002) was de uitstraling en de groei patronen na verloop van tijd toegenomen. Stijging van de bioluminescentie in de acht weken durende periode was statistisch significant (*p< 0.05; **p< 0.001; ***p< 0.0001). Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van Van Noord, R.A. et al. 11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . In vivo echografie beeldvorming van tumor engraftment en groei. Echografie beeldvorming gecontroleerd in vivo de progressie van de tumor. Echografie beelden en bijbehorende bioluminescentie beelden op één, twee en acht weken staan. Engraftment was een week gevisualiseerd in beide beeldvormende modaliteiten. Tumor oppervlakte en volume werden berekend met behulp van echografie imaging. 3D echografie Afbeeldingen gespiegeld verwijderde tumoren bij de voltooiing van de studie. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van Van Noord, R.A. et al. 11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Lymfkliertest nier lokalisatie en echografie-geleide implantatie van ES-cellen. (A) bioluminescentie werd gebruikt om te controleren van de tumor uitstraling en groei. (B-C) Dieren ontwikkeld lokaal invasieve tumoren die vervormd omringende abdominale structuren en binnengevallen in lokale structuren zoals spier. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van Van Noord, R.A. et al. 11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . Tumor Histopathologie van NB en ES xenograft tumoren. (A) NB xenograft muizen had lokaal infiltratieve primaire tumoren op de bijnier en peri-bijnier klier sites, die vervormd aangrenzende buikorganen. (B) microscopisch (20 X, bar = 50 µm), de xenograft bijnier tumoren bleek morfologische kenmerken overeen met menselijke NB (clusters van slecht gedifferentieerd hoekige om af te ronden van cellen), met inbegrip van incidentele pseudo rozet vorming (pijl). (C) Tumor weefsel toonde sterke tyrosine hydroxylase (NB tumormarker) immunoreactivity (40 X, bar = 40 µm, de positieve controle weergegeven in het linker paneel kleuring; 1:100). (D) ES xenograft tumor had histologische kenmerken overeen met infiltratieve ES (40 X, bar = 40 µm), clusters van hoekige om af te ronden epithelioid cellen gescheiden door een fijne fibro vasculaire stroma, uitwissen en de normale aangrenzende nier comprimeren (pijl; gecomprimeerde restanten van nier parenchym). (E) ES tumor weefsel toonde sterke membraan immunoreactivity voor de tumormarker ES CD99 (40 X, bar = 40 µm, de positieve controle weergegeven in het linker paneel kleuring; 1:100). Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van Van Noord, R.A. et al. 11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 . Verre metastasen ontwikkeld in xenografts opgericht door echografie-geleide injectietechniek. (A) bioluminescentie imaging weergegeven: de primaire tumor van de NB op de bijnier ruimte en metastatische foci gedetecteerd bij corticaal bot. (B) de microscopische analyse aangetoond een uitgezaaide tumor (pijl), uitwissen de beenmerg Holte en corticaal bot van de proximale dijbeen (4 X, bar = 400 µm). (C) tyrosine hydroxylase cytoplasmatische immunoreactivity van de corticaal bot NB metastatische site (40 X, bar = 40 µm). (D) microscopie van patiënt-afgeleide orthotopic xenograft (UMNBL002) met een hepatische metastase (pijl) binnen een hepatische ader (pijlpunt aantoont endotheliale cellen), en de aangrenzende lever (L) parenchym infiltreren (20 X, bar = 50 µm). (E) neuroblastoom micro metastase (pijl) binnen de longen parenchym (40 X, bar = 40 µm). Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van Van Noord, R.A. et al. 11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Echografie-geleide innesteling van cellen NB en ES is een efficiënte en veilige methode om betrouwbare lymfkliertest xenografts voor preklinische studies in de Kankerbiologie. Cruciaal voor het succes van echografie-geleide weefsel-gerichte innesteling is de aanwezigheid en beschikbaarheid van geschoold personeel met deskundigheid in het anatomisch lokaliseren van het orgel van belang en stereotactische injectie van tumorcellen.
De dissociatie van tumor weefsel bleek te zijn een cruciale stap in de ontwikkeling van het model beschreven patiënt-afgeleide xenograft. Native tumor weefsel bevat een cellulaire communicatie en omliggende stroma die de tumor opname of engraftment kan beïnvloeden. Cel telt, nadat de dissociatie-proces voltooid was, een graadmeter voor de cellulaire dichtheid in de steekproef, voorzien van 2 x 10,5 cellen/10 μL beschouwd als een optimale cel tellen voor implantatie en succesvolle tumor engraftment.
Luciferase tagging van cellen die zijn toegestaan voor de validatie van tumor engraftment en monitoring van tumorgroei door het meten van de Bioluminescentie signaal, met 106 tot 108 overwogen indicatieve van tumor opname9. Om ervoor te zorgen de succesvolle signaaltransductie, was luciferase activiteit bevestigd in vitro vóór injectie van cellen. Dit werd gedaan door immunofluorescentie, luciferase assay kits, en ook door het onderzoek van de cellen voor bioluminescentie signaal. Instellingen die worden gebruikt voor het meten van de Bioluminescentie hielden constante, consistente gegevens verstrekken tijdens de wekelijkse metingen.
Ex vivo histopathologisch analyse van tumoren bevestigd celtype en de morfologie van de resulterende tumoren met specifieke kleuring voor eiwit markeringen. Histopathologisch analyse bevestigd tumor engraftment en metastase aangetoond door echografie en bioluminescente beeldvorming.
Voordelen van echografie-geleide cellulaire innesteling zijn de niet-invasieve natuur, minimale dierlijke hersteltijd en groeiend succes in de oprichting van verschillende succesvolle xenograft modellen. Echografie imaging biedt ook een betrouwbare methode om te controleren in vivo tumor progressie en tumor volumes. In deze preklinische modellen vorderde tumoren aan lokaal invasieve ziekte met uitzaaiingen binnen 5 weken. Beperkingen omvatten de beschikbaarheid van hoge resolutie beeldvormende technologie en de mogelijkheid om consequent het lokaliseren van de doel-orgel. Beschikbaarheid van personeel met expertise in echografie beeldvorming van het orgel van belang zijn essentiële onderdelen van deze techniek.
De beschikbaarheid van hoge resolutie echografie imaging sterk toegenomen in de afgelopen tien jaar en het gebruik ervan blijft groeien niet alleen in de klinische praktijk, maar ook in het laboratoriumonderzoek. Het gebruik van echografie voor de ontwikkeling van moderne lymfkliertest xenografts is een veelbelovende toepassing, met potentieel voor het bevorderen van preklinisch onderzoeksmodellen voor kanker drugontdekking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen informatieverschaffing.
Acknowledgments
Dit werk kreeg steun van het Robert Wood Johnson Foundation/Amos medische faculteit ontwikkeling programma, Taubman Research Institute, en de sectie Pediatrische Heelkunde, The University of Michigan. De auteurs willen Kimber Converso-Baran en Dr. Marcus Jarboe bedanken voor de hulp met echografie injectie procedures en het imaging platform. We bedanken Paul Trombley voor zijn hulp met afbeeldingen van de figuur. Wij danken ook de afdeling Radiologie op de Universiteit van Michigan voor het gebruik van het Center for Molecular Imaging en de Tumor Imaging Core, die gedeeltelijk worden ondersteund door uitgebreide kanker centrum NIH, verlenen P30 CA046592. De Universiteit van Michigan fysiologie fenotypering Core die gedeeltelijk door de subsidiefinanciering uit het NIH (OD016502) en het Frankel cardiovasculair centrum wordt ondersteund. Cel lijn verificatie werd gedaan bij IDEXX RADIL Bioresearch faciliteiten, Columbia, MO. Wij danken Tammy Stoll, Dr. Rajen Mody en de Mott stevig Tumor oncologie-programma. Onze patiënten en families zijn dankbaar erkend voor hun inspiratie, moed en continue ondersteuning van ons onderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| NOD-SCID | Charles River | 394 | |
| NSG | The Jackson Laboratory | 5557 | |
| Cell Line | |||
| NB | |||
| IMR-32 | ATCC | CCL-127 | Established human neuroblastoma cell line |
| SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | Established human neuroblastoma cell line |
| SK-N-Be2 | ATCC | CRL-2271 | Established human neuroblastoma cell line |
| ES | |||
| TC32 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A673 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| CHLA-25 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A4573 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| Cell Line media | |||
| RPMI | Life Technologies | 11875-093 | |
| Matrigel | BD BioSciences | 354234 | |
| Dissociation | |||
| Dissection Tools | KentScientific | INSMOUSEKIT | |
| Human Tumor Dissociation Kit | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| Luciferase Tagging | |||
| Lenti-GFP1 virus | University of Michigan, Vector Core | Luciferase Virus | |
| Steady Glo-Luciferase Assay Kit | Promega | E2510 | |
| Bioluminescence Imaging | |||
| Ivis Spectrum Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| D-Luciferin | Promega | E160X | |
| Anesthetic | |||
| Inhaled Isoflurane | Piramal Critical Care Inc | 66794-0017-25 | |
| Ultrasound Guided Injection | |||
| Vevo 2100 High Resolution Imaging | Vevo | 2100 | |
| Hamilton Syringes (27 gauge needle) | Hamilton | 80000 | |
| 22 Gauge Angiocatheter | BD Biosciences | 381423 | |
| Optical ointment | Major Pharmaceuticals | 301909 | |
| Nair | Church & Dwight Co | Hair Removal agent | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel | Parker | Ultrasound gel | |
| Histology | |||
| CD99 | DAKO | M3601 | Primary Antibody |
| Tyrosine Hydroxylase | Sigma-Aldrich | T2928 | Primary Antibody |
| Secondary HRP-Polymer antibody | Biocare | BRR4056KG | |
| Miscelleneous | |||
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| P1000 pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| P200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| P1000 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375E | |
| P200 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Portable pipette aid | Drummond | 4-000-101 | |
| digital animal Weighing Scale | KentScientific | SCL-1015 | |
| Calipers | Fisher Scientific | 06-664-16 | |
| 6well low attachment plates | Corning | 07-200-601 | |
| 10 cm Tissue Culture Treated Dishes | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G |
References
- Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Ann Oncol. 27 (7), 1190-1198 (2016).
- Fidler, I. J., Hart, I. R. Biological diversity in metastatic neoplasms: origins and implications. Science. 217 (4564), 998-1003 (1982).
- Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation. Eur J Cancer. 40 (6), 852-857 (2004).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic Models are Necessary to Predict Therapy of Transplantable Tumors in Mice. Cancer Metastasis Rev. 17 (3), 279-284 (1998).
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).
- Khanna, C., Jaboin, J. J., Drakos, E., Tsokos, M., Thiele, C. J. Biologically relevant orthotopic neuroblastoma xenograft models: Primary adrenal tumor growth and spontaneous distant metastasis. In Vivo. 16 (2), 77-85 (2002).
- Stewart, E., et al. Development and characterization of a human orthotopic neuroblastoma xenograft. Dev Biol. 407, 344-355 (2015).
- Jäger, W., et al. Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts. J. Vis. Exp. (84), e51123 (2014).
- Teitz, T., et al. Preclinical Models for Neuroblastoma: Establishing a Baseline for Treatment. PLoS ONE. 6 (4), e19133 (2011).
- Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts retain metastatic patterns and geno- and phenotypes of patient tumours. International Journal of Cancer. 136 (5), 252-261 (2015).
- Van Noord, R. A., et al. Tissue-directed Implantation Using Ultrasound Visualization for Development of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. In Vivo. 31 (5), 779-791 (2017).
- Vormoor, B., et al. Development of a Preclinical Orthotopic Xenograft Model of Ewing Sarcoma and Other Human Malignant Bone Disease Using Advanced In Vivo Imaging. PLoS ONE. 9 (1), e85128 (2014).
- Hakky, T. S., Gonzalvo, A. A., Lockhart, J. L., Rodriguez, A. R. Primary Ewing sarcoma of the kidney: a symptomatic presentation and review of the literature. Ther Adv Urol. 5 (3), 153-159 (2013).
- Cheng, H., Clarkson, P. W., Gao, D., Pacheco, M., Wang, Y., Nielsen, T. O. Therapeutic Antibodies Targeting CSF1 Impede Macrophage Recruitment in a Xenograft Model of Tenosynovial Giant Cell Tumor. Sarcoma. 2010, 174528 (2010).
- JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
