Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Utnyttelse av ultralyd guidet vev-rettet mobilnettet implantasjon for etablering av biologisk relevante metastatisk svulst Xenografts

doi: 10.3791/57558 Published: May 25, 2018

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å bruke ultralyd-guidede injeksjon av neuroblastom (NB) og ewings sarkomspesialitet (ES) celler (etablert linjer og pasient-avledede kreftceller) på biologisk relevante nettsteder å lage pålitelige prekliniske modeller for kreft forskning.

Abstract

Prekliniske testing av anticancer terapi er avhengig av relevante xenograft modeller som etterligner medfødt tendenser av kreft. Fordelene med standard subkutan flanke modeller inkluderer fremgangsmåter for letthet og skjermen svulst progresjon og uten invasiv bildebehandling. Slike modeller er ofte inkonsekvent i translasjonsforskning kliniske forsøk og har begrenset biologisk relevante egenskaper med lav proclivity å produsere metastasering, som det er en mangel på en innebygd microenvironment. Til sammenligning har orthotopic xenograft modeller på opprinnelige svulsten nettsteder vist å etterligne svulst microenvironment og gjenskape viktig sykdom egenskaper som fjerntliggende metastatisk spredning. Disse modellene krever ofte kjedelig kirurgiske prosedyrer med lengre bedøvende tid og utvinning perioder. Du løser problemet, har kreftforskere nylig benyttet ultralyd-guidede injeksjon teknikker for å etablere kreft xenograft modeller for prekliniske eksperimenter, som gir rask og pålitelig etablering av vev-rettet murine modeller. Ultralyd visualisering gir også en noninvasive metode for langsgående vurdering av svulst engraftment og vekst. Her beskriver vi metoden for ultralyd-guidede injeksjon av kreftceller, utnytte binyrene NB og nyre sub kapsel for ES. Denne minimal invasiv tilnærming overvinner kjedelig åpen kirurgi implantasjon av kreftceller i vevet-spesifikke steder for vekst og metastasering, og abates sykelig utvinning perioder. Vi beskriver bruken av både etablerte linjer og pasienten avledede cellelinjer for orthotopic injeksjon. Pre-laget kommersielle kits er tilgjengelig for svulst dissosiasjon og luciferase merking av celler. Injeksjon av cellen hjuloppheng med bilde-veiledning gir en minimalt invasiv og reproduserbar plattform for etablering av prekliniske modeller. Denne metoden benyttes for å opprette pålitelige prekliniske modeller for andre kreftformer som blæren, lever og bukspyttkjertel exemplifying sin uutnyttet potensial for mange kreft modeller.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dyr xenograft modeller er viktige verktøy for prekliniske studier av romanen anticancer terapi. Standard murine xenografts er avhengige av subkutan flanke implantering av celler, gir en effektiv og lett tilgjengelig stedet for overvåking tumor vekst. Ulempen av subkutan modeller er deres mangel på svulst-spesifikke biologiske egenskaper, noe som kan begrense sitt potensial til metastase1. Slike begrensninger er overvunnet ved bruk av orthotopic xenografts i som tumor celler er engrafted på eget vev steder, gir en relevant microenvironment med metastatisk potensial2. Orthotopic xenograft modeller opprettholde opprinnelige biologiske egenskaper og gi pålitelig modeller for prekliniske drug discovery3,4. Kreftceller benyttes for vev-rettet implantasjon er etablert linjer eller pasient-avledede celler fra pasienten svulster. Xenografts opprettet fra kreftcelle linjer kan ha høy genetisk avvik fra den primære svulsten forhold til pasienten avledede xenografts5. Gitt dette, blitt etablering av pasient-avledede orthotopic xenografts foretrukket standard for testing romanen therapeutics i kreft stoffet funnet.

Pediatrisk kreft neuroblastom (NB), orthotopic xenograft modeller recapitulate primære svulst biologi og utvikle metastasering til typiske nettsteder NB spre6,7. NB utvikler i binyrene eller langs paravertebral sympatisk kjeden. De vanligste metodene for orthotopic implantasjon krever åpne trans-abdominale kirurgiske prosedyrer. Slike metoder er ofte kjedelig, har høy dyr sykelighet og komplekse utvinning perioder. Høyoppløselig ultralyd har nylig blitt utnyttet for vev-rettet implantasjon av kreftceller i utviklingen av flere murine modeller for kreft forskning8,9. Teknikken er pålitelig, reproduserbare, effektiv og sikker for etablering av aktuelle metastatisk svulst xenografts10,11.

Etableringen av pediatriske kreft xenografts ved ultralyd-guidede målet orgel lokalisering og nål implantering av linjer og pasient-avledede kreftceller er demonstrert11. Teknikken ble benyttet for NB rettet mot murine binyrene. Ewings sarkomspesialitet (ES) er hovedsakelig en osseous kreft, ofte sett i lange bein som femur og bekkenet bein12. Case rapporter har vist at for å avgjøre om veksten av en hovedsakelig osseous kreft er mulig i nyre vev, en nyre sub capsular plassering ble valgt for orthotopic implantasjon13. Nyre sub capsular celle implantasjon av kreftceller blitt benyttet som en lovende modell å studere spontan metastaser for ES14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alt arbeidet ble gjort i samsvar med The University of Michigan institusjonelle Review Board (HUM 00052430) og overholder prosedyrer godkjent av universitetet på bruk og vare på dyrene (UCUCA). Enheten for laboratoriet av dyr medisin (ULAM) overså dyr omsorg.

Alt arbeidet ble gjort med godkjenning fra The University of Michigan institusjonelle Review Board (HUM 00052430) og overholder alle menneskelige forskning etikk komiteen forskrifter. Menneskeceller anses å være en potensielt biofarlig materiale, så følg alle forsiktighetsregler og riktig biosikkerhet praksis som kreves av institusjonen. NSG mus er alvorlig nedsatt immunforsvar og utsatt for sykdom forårsaket av bakterier som vanligvis finnes i miljøet.
Bruk alltid strenge steril teknikk når forberede materialet for implantasjon og utføre injeksjoner.

1. celle kultur

  1. Vokse etablerte menneskelige NB linjer (SH-SY5Y, SK-N-BE2 og IMR32) i minimal viktig medium, supplert med 10% fosterets bovin serum, 2 mM glutamin, 100 enheter/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin. Supplere IMR32 celler videre med 1 mM pyruvate og 0.075% NaHCO3. Opprettholde alle celler på 37 ° C, 5% CO2 og 70-80% samløpet.
  2. Vokse menneskelige ES linjer (TC32, A673, CHLA-25 og A4573) i RPMI medium med 10% fosterets bovin serum og 6 mM L-glutamin. Opprettholde alle cellene på 37 ° C, 5% CO2 på 70-80% samløpet.
  3. Sende alle linjer for godkjenning.
    Merk: Cellen godkjenning er gjort på en utenfor anlegget, se takk.

2. forberedelse av primære pasient-avledede kreftceller

  1. Pasienten samtykke og samtykke forkastet høsting menneskelige NB tumor vev fra pasienter som gjennomgår kirurgisk resection kontroll og transport til laboratoriet i vev lagringsløsning for bevaring.
    Merk: Alle pasientprøvene de identifiseres og håndtert institusjonelle Review Board retningslinjer.
  2. Generere en enkelt pasient-avledede kreft cellen suspensjon (UMNBL001, UMNBL002) fra tumor vev ved hjelp av en svulst dissosiasjon kit. Overføre ca 0,5 g svulst til en 100 mm celle kultur parabol med 5 mL av RPMI buffer, 200 µL av enzym H, 100 µL av enzym R og 25 µL av enzym A fra menneskelige svulst dissosiasjon kit.
  3. Hakke svulst i små biter (2-4 mm hver) ved hjelp av saks og tissue tang. Bland disse fragmentene med løsningene i trinn 2.2.
  4. Pipetter svulst blandingen inn i et dissociator rør og Lukk røret. Invertere røret og fest på omslaget til vev dissociator. Kjøre på programmet h_tumor_01.
  5. Inkuber svulst celle suspensjon fikk over ved 37 ° C i 1 time i en roterende reol med intermitterende føden hvert 15 min.
  6. Overføre celle suspensjon til en ny 50 mL konisk tube og legge 10 mL av RPMI. Sentrifuge celle suspensjon 314 x g i 5 min.
  7. Fjern nedbryting og avbryte pellet 5 mL av RPMI. Denne løsningen passere en 40 µm celle sil og samle anstrengt løsningen i en fersk 50 mL konisk rør. Vask denne sil gang med 5 mL av RPMI media og sentrifuge blandingen 314 x g i 5 min å samle pellets.
  8. Måle celle tettheten ved hjelp av en hemacytometer15. Utsette pellets innhentet fra oven i RPMI å få en endelig konsentrasjon av 4 × 105 celler/10 µL. Ta 5 µL av denne cellen suspensjon og 5 µL av matrigel å gjøre 10 µL av cellen løsning for hver injeksjon.
    Merk: Mengden RPMI brukes, avhenger av cellen tetthet målingen. For eksempel hvis målt celle tettheten av innhentet pellets er 4 x 105 celler, avbryte pellet 10 µL av RPMI.

3. luciferase merking av celler

  1. Gjøre 10 mL signaltransduksjon media med 5 mL av viral supernatant EF1a-Luc2-IRES-mCherry og 5 mL av stilk cellen media. Legge til 7,5 µL av 1 x polybrene.
  2. Bland 5 × 106 celler i signaltransduksjon media og plate i 100 mm ultra lav vedlegg plate. Ruge på 37 ° C og 5% CO2 over natten.
    Merk: Lav vedlegg plater brukes, celler vil ikke overholder plate.
  3. Etter 24 timer, ta 100 mm platen inneholder celler under vev kultur panseret og overføre blandingen i en 15 mL konisk rør. Sentrifuge celle suspensjon 314 x g i 5 minutter å få det cellen pellet. Vask celle pellet gang med 1 mL 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS) og suspendere celle pellet i 1 mL av HBSS med 1% fosterets bovin serum (FBS).
    1. Sortere luciferase cellene basert på GFP-positive signalet fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) analyse. Platen sorterte cellene på 100 mm vev kultur behandlet rett og opprettholde på 70-80% samløpet, 37 ° C og 5% CO2 til nødvendig.
  4. Bekrefte luciferase signal med luciferase analysen kit. Plate 10 x 104 sortert celler per brønn i en illuminometer kompatibel 96 godt plate og ruge celler overnatting på 37 ° C og 5% CO2. Etter 24 timer, ta 96 godt platen til romtemperatur og legger Steady-Glo reagens kulturperler medier i brønner i 1:1 ratio. Lar celler å lyse i 5 minutter og lese luminescence i spektrofotometeret.
  5. Få 100 mm rett under vev kultur hette. Kast supernatant media. Vask cellene gang med 2 mL 1 x PBS.
  6. Legg 2 mL 0,25% trypsin og tilbake 100 mm rett til inkubator for 2-3 minutter. Etter 2-3 min, sjekk for forskyves celler under mikroskop og legge til 8 mL RPMI å deaktivere trypsin.
  7. Samle celle suspensjon i en 15 mL konisk rør og sentrifuger 314 x g i 5 min å få pellets. Kast nedbryting. Vask celle pellets med 1 mL 1 x PBS, avbryte pellet 5 mL av RPMI og bestemme cellen tettheten ved hjelp av en hemacytometer15. Sentrifuge yhe gjenværende cell løsningen på 314 x g i 5 min å få pellets.
  8. Avbryte pellet RPMI å få en konsentrasjon av 4 x 105 celler/10 µL. Ta 5 µL av cellen suspensjon og 5 µL av matrigel å gjøre 10 µL av cellen løsning for hver injeksjon.

4. ultralyd guidet binyrene (NB) eller nyre Sub Capsule (ES) implantasjon

Merk: Alle ultralyd prosedyrer utføres med en høy oppløsning i vivo imaging system. For den beskrevne prosedyrer, ble svingeren, som har en senterfrekvensen 40 MHz og en båndbredde på 22 – 55 MHz brukt.

  1. Bruk 6-8-uke-gamle immun mangelfull NSG mus for alle injeksjon prosedyrer.
  2. Chill matrigel og autoklaveres Hamilton sprøyter med en 27G nål (1,25"), og 22G katetre (0,9 mm ytre diameter, 25 mm lengde) overnatting på 4 ° C.
  3. Sett celle løsningen i trinn 3 på is.
  4. Bedøve mus i en induksjon kammer med 2% isoflurane i O2 levert på 2 L/min.
    Merk: Tilstrekkelig anestesi bestemmes med mangel på aktiv bevegelse og vedlikehold av spontane åndedrett.
  5. Når anesthetized, epilere meg rygg og flanken av dyrene hår fjerning lotion (for eksempel Nair) og en barbermaskin.
  6. Overføre dyret tenkelig plattformen med abdominal side ned, der nesen av dyret er plassert i en nosecone og sikret mens inhaling isoflurane.
  7. Plasser optisk salve i dyrets øyne å hindre tørking. Tape musen i stedet for å unngå eventuelle utilsiktede bevegelser.
  8. Identifisere murine leveren, vena cava, milt, venstre nyre, og tilstøtende venstre binyrene bruker ultralyd visualisering.
  9. Bruk sterilt hansker, maske og cap for personlig verneutstyr og vedlikehold av sterile forhold. Under ultralyd-veiledning, forsiktig inn et 22G kateter gjennom huden og tilbake muskel direkte i venstre binyrene å gi en kanal for mobilnettet injeksjon. Fjern nålen og la kateter på plass.
  10. Last kjølt Hamilton sprøyte utstyrt med en små-bar nål 10 µL av cell løsningen, så guide sprøyten stereotactically gjennom kateter plassert i sentrum av binyrene.
  11. Injisere cellene til målrettet adrenal vevet. La nålen i stedet for 1-2 min å tillate matrigel å sette. Fjern sakte nålen, etterfulgt av fjerningen av kateter.
  12. Plasser musene tilbake til deres bur og sikre at musen gjenvinner tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency.
    Merk: på grunn av minimal invasiv natur denne teknikken, innlegg fremgangsmåter for smerte er minimal, men fortsatt overvåkes på daglig basis med mus helse sjekker. "bør følges med en setning:"Hvis uventede tegn på smerte eller ubehag identifisert i løpet i et eksperiment, konsulter institusjonell veterinær støtteenheten informasjon om analgesi eller andre helsetjenester.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bruke prosedyrer presentert, ble ultralyd-guidede implantering av NB celler i binyrene gjort i en dedikert prosedyren rom utstyrt med oppvarmede kirurgisk bord. Arm og foten pads plassert for overvåking murine hjerte aktivitet (figur 1A). Dyret forble bedøvet under isoflurane bruker forpart innånding. Bruke en høy oppløsning ultralyd probe, ble venstre nyre identifisert med binyrene bare skallen til nyrene (figur 1B). Nålen ble deretter Avansert i binyrene under direkte visualisering (figur 1 c). Første utnyttelse av denne teknikken, ble en blanding av methylene blåfarge fargestoff og matrigel brukt til å bekrefte riktig lokalisering av binyrene. Dyret ble ofret, og suksessen til prosedyren ble bekreftet på obduksjon ved å visualisere methylene blåfarge fargestoff under binyrene kapselen (figur 1 d).

Ukentlig ultralyd og bioluminesens imaging var modaliteter som brukes til å overvåke svulst engraftment og vekst rate. Bioluminescens bildebehandling i regionen rundt ble målt som fotoner/s/cm2/steridian (p/s/cm2/sr) med minimal antall 106 til 108 indikativ av tilstrekkelig tumor størrelse prekliniske eksperimenter9 ( Figur 2). Analyse ved hjelp av t -test viste statistisk signifikant økning i bioluminescens ble notert i åtte ukers periode (* p< 0,05; **p< 0,001; ***p< 0,0001). Ultralyd imaging tillatt noninvasive målinger av svulst areal og volum. Dette sammen med bioluminescens måling overvåket både svulst engraftment og progresjon (Figur 3). Lignende fremgangsmåter som ble benyttet for ES celler injisert i nyre sub kapselen (Figur 4).

Brutto og histologiske analyse av resulterende svulster preget primære svulster og metastaser ved obduksjon. Vevsprøver undersøkt for morfologiske celle mønstre og farget for svulst-spesifikke protein markører (figur 5, figur 6). Primære svulst engraftment for NB linjer (IMR32, SH-SY-5Y, SK-N-BE2, UMNBL001, UMNBL002) varierte fra 62-100%, med metastaser sett i 0-100% av injisert mus. De mest robuste metastaser ble sett i SK-N-BE2 (33%) og UMNBL002 (100%). Metastatisk nettsteder for NB var lymfeknuter, lever, lunge og kortikalt benvev. Nyre sub capsular engraftment for ES linjer (A4573, A673, CHLA-25, TC-32) varierte fra 60-100%, med metastaser sett i 0-40% av injisert mus. Metastatisk nettsteder undersøkt for ES inkludert lymfeknuter, kortikale bein og lungene. Den mest robuste engraftment (100%) og metastaser (40%) ble sett i TC-32 xenograft mus.

Figure 1
Figur 1 . Murine binyrene lokalisering og ultralyd-guidede NB celle implantasjon. (A) høy oppløsning ultralyd imaging murine abdominal organer tillatt binyrene implantasjon av kreftceller. (B) venstre nyre ble identifisert. (C) venstre binyrene ligger ved siden av venstre nyre som en hypoechoic (mørke) rundt struktur. Nålen var avansert i binyrene etterfulgt av celle injeksjon. (D) en blanding av matrigel og methylene blåfarge fargestoff ble brukt til å vurdere nøyaktigheten av injeksjon prosedyrer. Representant ex vivo bildet av den venstre nyre og binyrene med matrigel og methylene blåfarge fargestoff binyrene capsule og peri-adrenalin plass. Dette tallet er endret med tillatelse fra Van Noord, R.A. et al. 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . I vivo bioluminescens imaging svulst engraftment og vekst rate. (A) human NB adrenal xenografts var overvåket for engraftment og tumor vekst over åtte uker. (B) maksimal bioluminescens signalet ble bestemt i området rundt. NB linjer (SH-SY5Y, IMR 32, SK-N-BE2) og pasient-avledede celler (UMNBL001, UMNBL002) hadde økt utstråling og vekst over tid. Økning av bioluminescens i åtte ukers periode var statistisk signifikant (*p< 0,05; **p< 0,001; ***p< 0,0001). Dette tallet er endret med tillatelse fra Van Noord, R.A. et al. 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . I vivo ultralyd imaging av svulst engraftment og vekst. Ultralyd imaging overvåket i vivo svulst progresjon. Ultralyd bildene og tilsvarende bioluminescens bilder på én, to og åtte uker vises. På en uke, var engraftment visualisert i begge tenkelig modaliteter. Svulst areal og volum ble beregnet ved hjelp av ultralyd imaging. 3D ultralyd bildene speilet forbrukeravgift svulst studien er ferdig. Dette tallet er endret med tillatelse fra Van Noord, R.A. et al. 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Murine nyre lokalisering og ultralyd-guidede implantering av ES celler. (A) bioluminescens ble brukt til å overvåke svulst utstråling og vekst. (ABC) Dyr utviklet lokalt invasjonen svulst det som forvrengt rundt abdominal strukturer og invaderte i lokale strukturer som muskel. Dette tallet er endret med tillatelse fra Van Noord, R.A. et al. 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . Svulst histopatologi av NB og ES xenograft svulster. (A) NB xenograft musene hadde lokalt infiltrasjon primære svulster i adrenal og peri-adrenalin kjortelen steder, som forvrengt tilstøtende abdominal organer. (B) mikroskopisk (20 X, bar = 50 µm), xenograft adrenal svulstene viste morfologiske funksjoner forenlig med menneskelig NB (klynger av dårlig differensiert kantete runde celler), inkludert sporadisk pseudo rosett dannelse (pil). (C) Tumor vev viste sterke tyrosin hydroksylase (NB svulst markør) immunoreactivity (40 X, bar = 40 µm, positiv kontroll flekker vist i panelet til venstre; 1: 100). (D) ES xenograft svulst hadde histologic funksjoner samsvar med infiltrasjon ES (40 X, bar = 40 µm), klynger av kantete runde epithelioid celler atskilt med en fin fibro vaskulær stroma, effacing og komprimere normal tilstøtende nyre (pilen, komprimert restene av nyre parenchyma). (E) ES tumor vev viste sterke membran immunoreactivity for ES svulst markør CD99 (40 X, bar = 40 µm, positiv kontroll flekker vist i panelet til venstre; 1: 100). Dette tallet er endret med tillatelse fra Van Noord, R.A. et al. 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 . Fjernmetastaser utviklet i xenografts etablert av ultralyd-guidede injeksjon teknikk. (A) bioluminescens imaging viser den primære NB svulsten binyrene plass og metastatisk foci oppdaget på kortikalt benvev. (B) microscopic analyse demonstrert en metastatisk svulst (pil) effacing margtransplantasjon hulrom og kortikalt benvev av proksimale femur (4 X, bar = 400 µm). (C) tyrosin hydroksylase cytoplasmatiske immunoreactivity til kortikalt benvev NB metastatisk området (40 X, bar = 40 µm). (D) mikroskopi av pasient-avledede orthotopic xenograft (UMNBL002) med en hepatic metastasering (pil) i en hepatic blodåre (pilspiss viser endotelceller), og infiltrere den tilstøtende leveren (L) parenchyma (20 X, bar = 50 µm). (E) neuroblastom mikro metastasering (pil) i lunge parenchyma (40 X, bar = 40 µm). Dette tallet er endret med tillatelse fra Van Noord, R.A. et al. 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ultralyd-guidede implantasjon av NB og ES celler er en effektiv og trygg metode å etablere pålitelig murine xenografts for prekliniske studier i kreft biologi. Avgjørende for suksessen til ultralyd-guidede vev målrettede implantasjon er tilstedeværelse og tilgjengeligheten av opplært personale med ekspertise i å lokalisere anatomisk orgelet rundt og i stereotactic injeksjon av kreftceller.

Av tumor vev viste seg for å være et viktig skritt i utviklingen av beskrevet pasient-avledede xenograft modellen. Native tumor vev inkluderer en cellulær microenvironment og omkringliggende stroma som kan påvirke svulst opptak eller engraftment. Cellen teller, etter dissosiasjon prosessen var ferdig, ga en målestokk av mobilnettet tetthet i utvalget, 2 x 105 celler/10 μL vurdert en optimal celletall implantasjon og vellykket svulst engraftment.

Luciferase merking av celler som er tillatt for validering av svulst engraftment og overvåking av tumor vekst ved å måle bioluminescens signal, med 106 til 108 vurderes indikativ av svulst opptak9. For å sikre vellykket signaltransduksjon, ble luciferase aktivitet bekreftet i vitro før injeksjon av celler. Dette ble gjort av immunofluorescence, luciferase analysen kits, og også ved å undersøke celler for bioluminescens signal. Innstillinger som brukes til å måle bioluminescens ble holdt konstant, gi konsekvente data under ukentlige målinger.

Ex vivo histopathological analyse av svulster bekreftet celle type og morfologi av resulterende svulster med spesifikk farging for protein markører. Histopathological analyse bekreftet svulst engraftment og metastasering demonstrert av ultralyd og bioluminescent bildebehandling.

Fordelene med ultralyd-guidede mobilnettet implantasjon inkluderer sin ikke-invasiv Art, minimal dyr utvinning tid og voksende suksess i etableringen av flere vellykkede xenograft modeller. Ultralyd imaging gir også en pålitelig metode for å overvåke i vivo svulst progresjon og tumor volumer. I disse prekliniske modeller kommet svulster til lokalt invasiv sykdom med metastasering innen 5 uker. Begrensninger omfatter tilgjengeligheten av høy oppløsning bildeteknologi og muligheten til å konsekvent lokalisere målet orgel. Tilgjengeligheten av personell med ekspertise i ultralyd imaging av orgelet rundt er kritiske komponenter i denne teknikken.

Tilgjengeligheten av høyoppløselige ultralyd imaging har økt betydelig i det siste tiåret og dens bruk fortsetter å utvide ikke bare i klinisk praksis, men også i laboratorium forskning. Utnyttelsen av ultralyd for utviklingen av moderne murine xenografts er et lovende program, med potensial for videre prekliniske forskning modeller for kreft stoffet funnet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen avsløringer.

Acknowledgments

Dette arbeidet fikk støtte fra den Robert Wood Johnson Foundation/Amos medisinske fakultetet utvikling programmet, Taubman Research Institute, og del av Pediatric kirurgi, The University of Michigan. Forfatterne ønsker å takke Kimber periode-Baran og Dr. Marcus Jarboe for hjelp med ultralyd injeksjon prosedyrer og tenkelig plattformen. Vi takker Paul Trombley for hans hjelp med figur grafikk. Vi takker også avdeling for radiologi på The University of Michigan for bruk av The Center for molekylær Imaging og Tumor Imaging kjernen, støttes delvis av omfattende Cancer Center NIH, gi P30 CA046592. Universitetet i Michigan fysiologi Phenotyping kjerne som støttes delvis av gi finansiering fra NIH (OD016502) og Frankel Kretsløpssystem Center. Cellen linje godkjenning ble gjort på IDEXX RADIL Bioresearch fasiliteter, Columbia, har Mo Vi takker Tammy Stoll, Dr. Rajen Mody og Mott Solid Tumor onkologi Program. Våre pasienter og familier er takknemlig anerkjent for inspirasjon, mot, og pågående støtte fra vår forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice
NOD-SCID Charles River 394
NSG The Jackson Laboratory 5557
Cell Line 
NB
IMR-32 ATCC CCL-127 Established human neuroblastoma cell line
SH-SY5Y ATCC CRL-2266 Established human neuroblastoma cell line
SK-N-Be2 ATCC CRL-2271 Established human neuroblastoma cell line
ES
TC32  COGcell.ORG Established human Ewing's Sarcoma cell line
A673 COGcell.ORG Established human Ewing's Sarcoma cell line
CHLA-25 COGcell.ORG Established human Ewing's Sarcoma cell line
A4573 COGcell.ORG Established human Ewing's Sarcoma cell line
Cell Line media
RPMI Life Technologies 11875-093
Matrigel BD BioSciences 354234
Dissociation
Dissection Tools KentScientific INSMOUSEKIT
Human Tumor Dissociation Kit  MACS Miltenyi Biotec 130-095-929
gentleMACS dissociator MACS Miltenyi Biotec 130-093-235
gentleMACS C tubes MACS Miltenyi Biotec 130-096-334
Cell Strainer Corning 431751
Luciferase Tagging
Lenti-GFP1 virus University of Michigan, Vector Core Luciferase Virus
Steady Glo-Luciferase Assay Kit Promega E2510
Bioluminescence Imaging
Ivis Spectrum Imaging System PerkinElmer 124262
D-Luciferin Promega E160X
Anesthetic
Inhaled Isoflurane  Piramal Critical Care Inc 66794-0017-25
Ultrasound Guided Injection
Vevo 2100 High Resolution Imaging Vevo 2100
Hamilton Syringes (27 gauge needle) Hamilton 80000
22 Gauge Angiocatheter BD Biosciences 381423
Optical ointment Major Pharmaceuticals 301909
Nair Church & Dwight Co Hair Removal agent
Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel Parker Ultrasound gel
Histology
CD99 DAKO M3601 Primary Antibody
Tyrosine Hydroxylase Sigma-Aldrich T2928 Primary Antibody
Secondary HRP-Polymer antibody Biocare BRR4056KG
Miscelleneous
10 mL Pipettes Fisher Scientific 13-676-10J
5 mL Pipettes Fisher Scientific 13-676-10H
1.5 mL Microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
P1000 pipette Eppendorf 3120000062
P200 pipette Eppendorf 3120000054
P1000 pipette tips Fisher Scientific 21-375E
P200 pipette tips Fisher Scientific 21-375D
Portable pipette aid Drummond 4-000-101
digital animal Weighing Scale  KentScientific SCL-1015
Calipers Fisher Scientific 06-664-16
6well low attachment plates Corning 07-200-601
10 cm Tissue Culture Treated Dishes Fisher Scientific FB012924
Polybrene Sigma-Aldrich TR-1003-G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Ann Oncol. 27, (7), 1190-1198 (2016).
  2. Fidler, I. J., Hart, I. R. Biological diversity in metastatic neoplasms: origins and implications. Science. 217, (4564), 998-1003 (1982).
  3. Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation. Eur J Cancer. 40, (6), 852-857 (2004).
  4. Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic Models are Necessary to Predict Therapy of Transplantable Tumors in Mice. Cancer Metastasis Rev. 17, (3), 279-284 (1998).
  5. Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69, (8), 3364-3373 (2009).
  6. Khanna, C., Jaboin, J. J., Drakos, E., Tsokos, M., Thiele, C. J. Biologically relevant orthotopic neuroblastoma xenograft models: Primary adrenal tumor growth and spontaneous distant metastasis. In Vivo. 16, (2), 77-85 (2002).
  7. Stewart, E., et al. Development and characterization of a human orthotopic neuroblastoma xenograft. Dev Biol. 407, 344-355 (2015).
  8. Jäger, W., et al. Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts. J. Vis. Exp. (84), e51123 (2014).
  9. Teitz, T., et al. Preclinical Models for Neuroblastoma: Establishing a Baseline for Treatment. PLoS ONE. 6, (4), e19133 (2011).
  10. Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts retain metastatic patterns and geno- and phenotypes of patient tumours. International Journal of Cancer. 136, (5), 252-261 (2015).
  11. Van Noord, R. A., et al. Tissue-directed Implantation Using Ultrasound Visualization for Development of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. In Vivo. 31, (5), 779-791 (2017).
  12. Vormoor, B., et al. Development of a Preclinical Orthotopic Xenograft Model of Ewing Sarcoma and Other Human Malignant Bone Disease Using Advanced In Vivo Imaging. PLoS ONE. 9, (1), e85128 (2014).
  13. Hakky, T. S., Gonzalvo, A. A., Lockhart, J. L., Rodriguez, A. R. Primary Ewing sarcoma of the kidney: a symptomatic presentation and review of the literature. Ther Adv Urol. 5, (3), 153-159 (2013).
  14. Cheng, H., Clarkson, P. W., Gao, D., Pacheco, M., Wang, Y., Nielsen, T. O. Therapeutic Antibodies Targeting CSF1 Impede Macrophage Recruitment in a Xenograft Model of Tenosynovial Giant Cell Tumor. Sarcoma. 2010, 174528 (2010).
  15. JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. JoVE. Cambridge, MA. (2018).
Utnyttelse av ultralyd guidet vev-rettet mobilnettet implantasjon for etablering av biologisk relevante metastatisk svulst Xenografts
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thomas, T. T., Chukkapalli, S., Van Noord, R. A., Krook, M., Hoenerhoff, M. J., Dillman, J. R., Lawlor, E. R., Opipari, V. P., Newman, E. A. Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. J. Vis. Exp. (135), e57558, doi:10.3791/57558 (2018).More

Thomas, T. T., Chukkapalli, S., Van Noord, R. A., Krook, M., Hoenerhoff, M. J., Dillman, J. R., Lawlor, E. R., Opipari, V. P., Newman, E. A. Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. J. Vis. Exp. (135), e57558, doi:10.3791/57558 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter