Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 利用超声引导注射神经母细胞瘤 (NB) 和尤文的肉瘤 (ES) 干细胞 (已建立的细胞系和病人派生的肿瘤细胞) 在生物相关的网站, 以创建可靠的前模型癌症研究。
Abstract
抗癌疗法的临床前试验依赖于类似于癌症先天倾向的异种异体模型。标准皮下侧面模型的优点包括程序性缓解和监测肿瘤进展和反应的能力, 没有侵袭性成像。这种模型往往是不一致的转化临床试验, 并具有有限的生物学相关特性与低倾向于产生转移, 因为缺乏一个本土的微环境。相比之下, 原生肿瘤部位的同种异体原位移植模型可以模拟肿瘤微环境, 复制远处转移扩散等重要疾病特征。这些模型往往需要繁琐的手术程序, 延长麻醉时间和恢复期。为了解决这一问题, 癌症研究人员最近利用超声引导注射技术建立了用于临床前实验的癌症异种模型, 从而可以快速可靠地建立组织导向的小鼠模型。超声可视化也为肿瘤植入和生长的纵向评估提供了一种无创的方法。在这里, 我们描述了超声引导下注射癌细胞的方法, 利用肾上腺的 NB 和肾亚胶囊的 ES。这种微创方法克服了在组织特定部位的癌细胞在生长和转移中的繁琐开放性手术植入, 并消退了病态恢复期。我们描述了已建立的细胞系和病人的细胞系在原位注射的应用。预先制作的商业套件可用于肿瘤离解和荧光素酶标记细胞。用图像引导注射细胞悬浮液为临床前模型的建立提供了一个微创和可再生的平台。该方法用于为其他癌症 (如膀胱、肝脏和胰腺) 建立可靠的前置模型, 以此为许多癌症模型的未开发潜力提供依据。
Introduction
动物移植模型是新的抗癌治疗的前期研究的基本工具。标准的小鼠移植依赖于皮下侧植入细胞, 为监测肿瘤的生长提供了一个有效的、易于访问的场所。皮下模型的缺点是缺乏肿瘤特异性的生物学特性, 这可能限制其转移1的潜能。这种限制是通过使用同种异体原位移植来克服的, 肿瘤细胞被嫁接在当地的组织部位, 提供一个相关的微环境与转移电位2。同种异体原位移植模型保持原有的生物学特性, 为临床前药物发现提供可靠的模型3,4。用于组织定向植入的癌细胞要么是建立的细胞系, 要么是病人肿瘤的患者源细胞。从癌细胞系建立的异位移植可能表现出与原发性肿瘤的遗传差异很大, 与患者派生的移植性5相比。鉴于此, 建立患者源性同种异体原位移植已成为检测肿瘤药物发现新疗法的首选标准。
在儿科癌神经母细胞瘤 (nb), 原位移植模型重述原发肿瘤生物学和发展转移到典型的站点的 NB 传播6,7。NB 发育在肾上腺或沿旁交感神经链。最常见的原位植入方法需要开放的跨腹部手术程序。这种方法往往繁琐, 动物发病率高, 恢复期复杂。高分辨率超声最近被用于组织定向植入肿瘤细胞的发展, 几个小鼠模型的癌症研究8,9。该技术是可靠的, 可重复的, 高效的, 并安全的建立相关的转移瘤移植10,11。
以超声引导靶器官定位和针植入细胞系和患者源性肿瘤细胞为例, 建立儿童肿瘤移植术11。该技术用于小鼠肾上腺的 NB 靶向。尤文的肉瘤主要是一种骨癌, 常见于长骨, 如股骨和骨盆骨12。病例报告表明, 为了确定一个主要的骨癌的生长是否可行的肾脏组织, 一个肾亚囊的位置被选择为原位植入13。肿瘤细胞的肾小球囊细胞植入术是研究 ES14自发转移的一个有希望的模型。
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Protocol
所有工作都是按照密歇根大学机构审查委员会 (嗡嗡声 00052430) 进行的, 符合大学动物使用和照料委员会 (UCUCA) 批准的程序。动物医学实验室 (乌拉姆) 的单位监督动物护理。
所有工作都是在密歇根大学机构审查委员会 (嗡嗡声 00052430) 的批准下完成的, 符合所有人类研究伦理委员会的规定。人类细胞被认为是一种潜在的 biohazardous 材料, 因此请遵循您的机构所需的所有特殊预防措施和适当的生物安全做法。核供应的小鼠严重免疫力低下, 易受环境中常见细菌引起的疾病的影响。
在准备植入和执行注射材料时, 应始终使用严格的无菌技术。
1. 细胞培养
- 生长建立的人 NB 细胞线 (SH-SY5Y, SK-N-BE2 和 IMR32) 在最小的基本培养基, 补充10% 胎牛血清, 2 毫米谷氨酰胺, 100 单位/毫升青霉素, 100 微克/毫升链霉素。补充 IMR32 细胞进一步与1毫米丙酮酸和 0.075% NaHCO3。维护37°c、5% CO2和70-80% 汇流的所有单元格.
- 在 RPMI 培养基中培养人类 ES 细胞系 (TC32、A673、CHLA-25 和 A4573), 辅以10% 胎牛血清和6毫米 l-谷氨酰胺。保持所有单元格在37°c, 5% CO2在70-80% 汇合.
- 发送所有单元格行以进行身份验证。
注: 单元格认证在外部设备上进行, 请参阅确认。
2. 原发性病人源性肿瘤细胞的制备
- 在患者同意和同意下, 收获被丢弃的人的 NB 肿瘤组织从手术切除的患者为地方控制和运输到实验室在组织存贮解答保存。
注: 所有患者样本均根据机构审查委员会的指导方针被取消鉴定和处理。 - 用肿瘤分离试剂盒从肿瘤组织中生成单个患者衍生的癌细胞悬浮液 (UMNBL001、UMNBL002)。将大约0.5 克肿瘤转移到100毫米细胞培养皿中, 含有5毫升的 RPMI 缓冲器, 200 µL 酶 H, 100 µL 酶 R 和25µL 酶 a 从人类肿瘤离解试剂盒。
- 使用剪刀和组织钳将肿瘤切成小块 (每2-4 毫米)。将这些片段与步骤2.2 中的解决方案混合在一起。
- 将肿瘤混合物注入 dissociator 管并关闭管。把管子倒置, 贴在组织 dissociator 的袖子上。在程序 h_tumor_01 上运行。
- 在每15分钟间歇研磨的旋转机架上孵化37摄氏度以上的肿瘤细胞悬浮液1小时。
- 将细胞悬浮液转移到新的50毫升圆锥管上, 加入10毫升的 RPMI。离心机细胞悬浮在 314 x g 为5分钟。
- 取出上清液, 在5毫升的 RPMI 中悬浮颗粒。通过40µm 细胞过滤器的解决方案, 并收集到一个新鲜的50毫升圆锥管的紧张的解决方案。用5毫升的 RPMI 介质清洗此过滤器, 并将混合物在 314 x g 处用5分钟来收集颗粒。
- 使用 hemacytometer15测量单元格密度。悬浮在 RPMI 中获得的颗粒, 以获得最终浓度为 4 x 105 cells/10 µL。采取5µL 的细胞悬浮和5µL 的胶, 使10µL 的细胞溶液的每一个注射。
注: 使用的 RPMI 量取决于细胞密度的测量。例如, 如果获得的颗粒的测量细胞密度为 4 x 105单元格, 则在 RPMI 的10µL 中悬浮颗粒。
3. 细胞荧光素酶标记癌细胞
- 使10毫升的传导介质与5毫升的病毒上清 EF1a-Luc2-IRES-mCherry 和5毫升的干细胞培养基。添加7.5 µL 1x 凝聚胺。
- 在转导介质中混合 5 x 106癌细胞, 在100毫米超低附着板中加入平板。在37摄氏度和 5% CO2上孵化过夜。
注: 当使用低附着板时, 细胞不会粘附在板上。 - 24小时后, 将含有细胞的100毫米板置于组织培养罩下, 将混合物转化为15毫升锥形管。离心机的细胞悬浮在 314 x g 5 分钟得到细胞颗粒。用1毫升的1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 清洗细胞颗粒, 并在1毫升的 HBSS 中悬浮细胞颗粒, 其中含有1% 胎牛血清 (血清)。
- 基于 GFP-阳性信号对荧光活化细胞分选 (资产管制) 分析进行分类。将排列的细胞在100毫米组织培养处理皿上, 在70-80% 汇流、37°c 和 5% CO2之前保持, 直到需要为止。
- 用荧光素酶检测试剂盒确认荧光素酶信号。板 10 x 104在一个照度计兼容96井板和孵化细胞一夜地在37°c 和 5%CO2 的每井被排序的细胞。24小时后, 将96井板带入室温, 并在1:1 配比的水井中加入稳定格洛试剂。允许细胞溶解5分钟, 并在分光光度计中读出发光。
- 把 100 mm 的盘子放在组织培养罩下。丢弃上清介质。用2毫升 1x PBS 清洗细胞一次。
- 添加2毫升0.25% 胰蛋白酶, 并返回100毫米菜的孵化器为2-3 分钟。2-3 分钟后, 检查脱落细胞显微镜下, 并添加8毫升的 RPMI 停用胰蛋白酶。
- 收集细胞悬浮在15毫升圆锥管和离心机在 314 x g 5 分钟得到一个球团。放弃上清。用1毫升的 1x PBS 清洗细胞颗粒, 将颗粒悬浮在5毫升的 RPMI 中, 并使用 hemacytometer15确定细胞密度。离心机 yhe 剩余细胞溶液在 314 x g 5 分钟获得颗粒。
- 在 RPMI 中暂停颗粒, 以获得浓度为 4 x 105 cells/10 µL。采取5µL 的细胞悬浮和5µL 的胶, 使10µL 的细胞溶液的每一个注射。
4. 超声引导肾上腺 (NB) 或肾亚胶囊 (ES) 植入术
注意: 所有超声过程都是使用高分辨率的体内成像系统进行的。为被描述的规程, 传感器, 有40兆赫的中心频率和22-55 兆赫带宽使用了。
- 在所有注射过程中利用6-8 周的免疫缺陷小鼠。
- 冷胶和蒸压哈密尔顿注射器装有27G 针 (1.25), 和22G 导管 (0.9 毫米外径, 25 毫米长度) 隔夜在4摄氏度。
- 将在步骤3中准备的单元解决方案放在冰上。
- 麻醉使用2% 异氟醚在 O2中的诱导腔内的小鼠, 以2升/分的交货。
注: 充分的麻醉是由于缺乏主动运动和维持自发性呼吸而决定的。 - 一旦麻醉, 脱毛的背部和侧面的动物使用脱毛乳液 (如奈尔) 和剃须刀。
- 将动物转移到腹部侧面的成像平台上, 将动物的鼻子放到 nosecone 中, 并在吸入异氟醚时得到保护。
- 将光学软膏放在动物的眼睛里以防止干燥。将鼠标贴在原处以防止任何无意的移动。
- 应用超声可视化法识别小鼠肝脏、腔静脉、脾、左肾及相邻的左肾上腺。
- 使用无菌手套, 口罩和帽子的个人保护和维护的无菌条件。在超声引导下, 轻轻地插入一个22G 导管通过皮肤和背部肌肉直接进入左肾上腺, 提供一个通道的细胞注射。取出针头, 把导管放到位。
- 装上装有10µL 细胞溶液的小口径针头的冷冻哈密尔顿注射器, 然后通过导管定位到肾上腺中心, 引导注射器 stereotactically。
- 将细胞注入靶向肾上腺组织。把针放到位1-2 分钟, 让胶设置。慢慢取出针头, 然后取出导管。
- 把老鼠放回笼子里, 确保老鼠恢复足够的意识来维持胸骨卧床。
注意: 由于这种技术的微创性质, 术后疼痛是极小的, 但仍然监测每天的基础上与小鼠的健康检查. "应该跟着一个句子:" 如果在课程中发现意外的疼痛或窘迫的迹象在一项实验中, 请咨询您的机构兽医支持单位, 以了解有关镇痛或其他医疗护理的信息。
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Representative Results
使用所提出的程序, 超声引导的铌细胞植入肾上腺是在一个专门的程序室, 配备了一个加热手术表。手臂和脚垫被放置监测鼠心脏活动 (图 1A)。用鼻锥吸入法在异氟醚下麻醉动物。使用高分辨率超声探头, 左肾被发现与肾上腺刚刚头骨的肾脏 (图 1B)。针在直接可视化 (图 1C) 下进入肾上腺。在该技术的初步应用中, 用亚甲蓝染料和胶的混合物来确认肾上腺的正确定位。动物被牺牲, 并且过程的成功被证实了在尸检通过形象化亚甲基蓝色染料在肾上腺胶囊之下 (图 1D)。
每周超声和生物发光成像是用来监测肿瘤植入和生长速率的方法。对感兴趣区域的生物发光成像测量为光子/s/厘米2/steridian (p/秒/厘米2/sr), 其最小计数为 106到 108为临床前实验提供足够的肿瘤大小9 (图 2)。使用t测试的分析显示, 在八周的时间内, (p< 0.05; **p< 0.001; ***p< 0.0001) 在生物发光方面有统计学意义的显著增加。超声成像允许无创测量肿瘤面积和体积。这连同生物发光测量监测肿瘤植入和进展 (图 3)。采用类似的程序, 将 ES 细胞注入肾亚胶囊 (图 4)。
尸检原发性肿瘤和转移瘤的主要和组织学分析。组织样本检查的形态学细胞模式和染色的肿瘤特异蛋白标记 (图 5,图 6)。原发性肿瘤植入为 NB 细胞系 (IMR32, SH-SY-5Y, SK-N-BE2, UMNBL001, UMNBL002) 不等于 62-100%, 与转移看到0-100% 的注射小鼠。最强健的转移见于 SK-N-BE2 (33%) 和 UMNBL002 (100%)。病灶转移部位为淋巴结、肝、肺和皮质骨。ES 细胞系的肾亚囊植入 (A4573、A673、CHLA-25、TC-32) 从60-100% 不等, 在0-40% 的注射小鼠中可见转移。为 ES 检查的转移部位包括淋巴结、皮质骨和肺部。最强健的植入 (100%) 和转移 (40%) 被发现在 TC-32 移植小鼠。
图 1.小鼠肾上腺定位和超声引导下的铌细胞植入.(A) 高分辨率超声成像的小鼠腹部器官允许肾上腺植入肿瘤细胞。(B) 发现左肾。(C) 左肾上腺位于左肾相邻, 为回声 (暗) 圆形结构。针被推进入肾上腺, 其次是细胞注射。(D) 采用胶和亚甲基蓝染料混合物来评估注射程序的准确性。代表的左肾和肾上腺的代表性前体图像, 胶和亚甲蓝染料在肾上腺囊和围肾上腺空间。此数字已通过 Van Noord、R.A. et al的许可进行修改。11.请单击此处查看此图的更大版本.
图 2.体内肿瘤植入和生长速率的生物荧光成像.(A) 对八周内植入和肿瘤生长的人 NB 肾上腺移植进行监测。(B) 在感兴趣的区域内确定了最大的生物发光信号。铌细胞系 (SH-SY5Y、IMR 32、SK-N-BE2) 和患者源细胞 (UMNBL001、UMNBL002) 随着时间的推移增加了辐射和生长模式。八周期间生物发光的增加有统计学意义 (*p< 0.05; **p< 0.001; **p< 0.0001)。此数字已通过 Van Noord、R.A. et al的许可进行修改。11.请单击此处查看此图的更大版本.
图 3.体内肿瘤植入和生长的超声成像.超声成像监测体内肿瘤进展。超声图像和相应的生物发光图像在一, 八周显示。在一周内, 植入在两种成像方式中都被形象化。应用超声显像计算肿瘤面积和体积。3D. 超声图像在研究完成后镜像切除肿瘤。此数字已通过 Van Noord、R.A. et al的许可进行修改。11.请单击此处查看此图的更大版本.
图 4.小鼠肾脏定位和超声引导植入 ES 细胞.(A) 生物发光用于监测肿瘤的辐射和生长。(B)动物开发局部侵袭性肿瘤, 扭曲周围的腹部结构, 侵入局部结构如肌肉。此数字已通过 Van Noord、R.A. et al的许可进行修改。11.请单击此处查看此图的更大版本.
图 5.NB 和 ES 异种肿瘤的肿瘤组织病理学.(A) NB 异种异体小鼠在肾上腺和周围肾上腺部位局部浸润原发肿瘤, 扭曲邻近的腹部器官。(B) 显微镜下 (20X, 棒 = 50 µm), 异种肾上腺肿瘤表现为与人 NB (分化的角向圆形细胞群) 一致的形态学特征, 包括偶尔的伪玫瑰形成 (箭头)。(C) 肿瘤组织显示强酪氨酸羟化酶 (NB 肿瘤标志物) 免疫反应 (40X, 棒 = 40 µm; 阳性对照染色显示在左面板; 1:100)。(D) ES 异种瘤的组织学特征与浸润 ES (40X, 棒 = 40 µm), 由细纤维血管基质分离的角向圆形上皮细胞簇, 谦逊和压缩正常相邻肾脏 (箭头; 压缩肾实质残留物)。es 肿瘤组织对 es 肿瘤标志物 CD99 (40X、棒 = 40 µm) 有较强的膜免疫反应; 左侧面板显示阳性对照染色; 1:100)。此数字已通过 Van Noord、R.A. et al的许可进行修改。11.请单击此处查看此图的更大版本.
图 6.经超声引导注射技术建立的移植瘤远端转移.(A) 生物发光成像显示肾上腺空间的原发性 NB 肿瘤和皮质骨中检测到的转移灶。(B) 显微分析表明, 转移性肿瘤 (箭头) 使股骨近端的骨髓腔和皮质骨 (4X, 酒吧 = 400 µm) 谦逊。(C) 皮质骨铌转移部位的酪氨酸羟化酶细胞质免疫反应 (40X, 酒吧 = 40 µm)。(D) 经肝静脉内肝转移 (箭头) 的患者源性同种异体原位移植 (UMNBL002) 显微术 (箭头显示内皮细胞), 浸润邻近肝 (L) 实质 (20X, 酒吧 = 50 µm)。(E) 神经母细胞瘤微转移 (箭) 在肺实质 (40X, 酒吧 = 40 µm)。此数字已通过 Van Noord、R.A. et al的许可进行修改。11.请单击此处查看此图的更大版本.
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Discussion
超声引导下的铌和 ES 细胞植入术是建立可靠的小鼠移植物在肿瘤生物学基础研究中的有效和安全的方法。对超声引导组织靶向植入的成功至关重要的是, 训练有素的人员在解剖性地定位了感兴趣的器官和在立体定向注射肿瘤细胞方面具有专门知识。
肿瘤组织的分离被证明是发展描述的患者衍生异体移植模型的关键步骤。原生肿瘤组织包括细胞微环境和周围基质, 可能会影响肿瘤的摄取或植入。细胞计数, 在离解过程完成之后, 提供了一个测量细胞密度在样品, 与 2 x 105 cells/10 ul 认为最佳的细胞计数为植入和成功的肿瘤植入。
荧光素酶标记细胞可以通过测量生物发光信号来验证肿瘤的植入和肿瘤生长的监测, 106到 108被认为是肿瘤摄取9的指示。为了确保成功的转导, 荧光素酶活性在注射细胞前被确认为体外。这是由免疫荧光, 荧光素酶检测试剂盒, 也通过检查细胞的生物发光信号。用于测量生物发光的设置保持恒定, 在每周测量期间提供一致的数据。
体外肿瘤病理学分析证实了蛋白标记物特异染色后肿瘤的细胞类型和形态. 病理学分析证实肿瘤植入和转移显示的超声和生物发光成像。
超声引导细胞植入的优点包括非侵入性、最小的动物恢复时间, 以及在建立几个成功的异种移植模型方面的成功。超声成像还为监测体内肿瘤进展和肿瘤体积提供了可靠的方法。在这些临床前模型中, 肿瘤在5周内转移到局部侵袭性疾病。限制因素包括高分辨率成像技术的可用性和持续定位目标器官的能力。有兴趣的器官的超声成像专业人才的可用性是这项技术的关键组成部分。
在过去十年中, 高分辨率超声成像的可用性大大增加, 它的使用不仅在临床实践中, 而且在实验室研究中不断扩大。利用超声技术发展现代小鼠移植是一个有前景的应用, 具有促进肿瘤药物发现的临床前研究模式的潜力。
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Disclosures
作者没有披露。
Acknowledgments
这项工作得到了罗伯特伍德约翰逊基金会/阿莫斯医学教师发展计划, Taubman 研究所, 和美国密歇根大学儿科手术科的支持。作者希望感谢金柏 Converso-巴兰和马库斯博士 Jarboe 为协助与超声注射程序和成像平台。我们感谢保罗. 特朗布利为图图形提供的帮助。我们还感谢密歇根大学放射科使用的分子影像学中心和肿瘤影像核, 这部分是由综合癌症中心 NIH (P30 CA046592) 支持的。密歇根大学生理学分型核心部分由 NIH (OD016502) 和法兰克心血管中心资助。IDEXX RADIL 生物学研究设施, 哥伦比亚, 密苏里州进行了细胞线认证。我们感谢苔米斯托尔, Rajen 博士和莫特固体肿瘤肿瘤学项目。我们的病人和家人感谢他们的启发, 勇气和持续的支持我们的研究。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| NOD-SCID | Charles River | 394 | |
| NSG | The Jackson Laboratory | 5557 | |
| Cell Line | |||
| NB | |||
| IMR-32 | ATCC | CCL-127 | Established human neuroblastoma cell line |
| SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | Established human neuroblastoma cell line |
| SK-N-Be2 | ATCC | CRL-2271 | Established human neuroblastoma cell line |
| ES | |||
| TC32 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A673 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| CHLA-25 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A4573 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| Cell Line media | |||
| RPMI | Life Technologies | 11875-093 | |
| Matrigel | BD BioSciences | 354234 | |
| Dissociation | |||
| Dissection Tools | KentScientific | INSMOUSEKIT | |
| Human Tumor Dissociation Kit | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| Luciferase Tagging | |||
| Lenti-GFP1 virus | University of Michigan, Vector Core | Luciferase Virus | |
| Steady Glo-Luciferase Assay Kit | Promega | E2510 | |
| Bioluminescence Imaging | |||
| Ivis Spectrum Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| D-Luciferin | Promega | E160X | |
| Anesthetic | |||
| Inhaled Isoflurane | Piramal Critical Care Inc | 66794-0017-25 | |
| Ultrasound Guided Injection | |||
| Vevo 2100 High Resolution Imaging | Vevo | 2100 | |
| Hamilton Syringes (27 gauge needle) | Hamilton | 80000 | |
| 22 Gauge Angiocatheter | BD Biosciences | 381423 | |
| Optical ointment | Major Pharmaceuticals | 301909 | |
| Nair | Church & Dwight Co | Hair Removal agent | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel | Parker | Ultrasound gel | |
| Histology | |||
| CD99 | DAKO | M3601 | Primary Antibody |
| Tyrosine Hydroxylase | Sigma-Aldrich | T2928 | Primary Antibody |
| Secondary HRP-Polymer antibody | Biocare | BRR4056KG | |
| Miscelleneous | |||
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| P1000 pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| P200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| P1000 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375E | |
| P200 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Portable pipette aid | Drummond | 4-000-101 | |
| digital animal Weighing Scale | KentScientific | SCL-1015 | |
| Calipers | Fisher Scientific | 06-664-16 | |
| 6well low attachment plates | Corning | 07-200-601 | |
| 10 cm Tissue Culture Treated Dishes | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G |
References
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