Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנצל מונחה אולטרה סאונד הזרקה של נוירובלסטומה (NB) ותאים של יואינג סרקומה (ES) (שהוקמה שורות תאים ותאים סרטניים נגזר החולה) באתרים הרלוונטיים ביולוגית ליצירת במודלים פרה אמין עבור סרטן מחקר.
Abstract
בדיקה פרה של טיפולים נגד סרטן מסתמכת על מודלים xenograft רלוונטי המחקים את נטיות מולדת של סרטן. היתרונות של דגמים סטנדרטיים האגף תת עורית כוללות הקלות פרוצדוראליות ואת היכולת התקדמות הגידול צג, התגובה ללא פולשני הדמיה. מודלים כאלה לעיתים קרובות אינם עקביים בניסויים קליניים translational, יש מוגבל המאפיינים הרלוונטיים ביולוגית עם נטייה נמוכה כדי לייצר גרורות, כפי שיש מחסור microenvironment מקורי. לשם השוואה, orthotopic דגמים xenograft באתרי גידול יליד הראו לחקות את microenvironment הגידול ואף לשכפל את מאפייני המחלה חשוב כגון התפשטות גרורתית מרוחקת. מודלים אלה דורשות לעתים קרובות ניתוחים מייגע עם תקופות זמן ושחזור הרדמה ממושכות. כדי לטפל בבעיה זו, סרטן חוקרים נעזרו לאחרונה הזרקת מונחה אולטרה סאונד טכניקות כדי ליצור מודלים xenograft סרטן לניסויים פרה, המאפשר הקמת מודלים מאתר מכוון רקמות מהיר ואמין. הדמיית אולטרה סאונד מספק גם שיטה לא פולשנית להערכת האורך של engraftment גידול וצמיחה. כאן, נתאר את שיטת להזרקה מונחה אולטרה סאונד של תאים סרטניים, ניצול בלוטת יותרת הכליה עבור NB ו- sub כליות כמוסה עבור ES. בגישה פולשנית זו גוברת על ניתוח פתוח מייגע ההשתלה של תאים סרטניים במיקומים רקמות ספציפיות עבור הצמיחה, גרורות, abates ותקופות התאוששות חולנית. אנו מתארים את הניצול של שורות תאים הוקמה והן שורות תאים נגזר החולה להזרקה orthotopic. ערכות מוכנות מראש מסחריים זמינים עבור גידול דיסוציאציה ותיוג לוציפראז של תאים. הזרקה של הבולם התא באמצעות תמונה-ההדרכה מספק פלטפורמה מינימלית פולשנית, לשחזור להקמת במודלים פרה. שיטה זו מנוצל ליצירת במודלים פרה אמין עבור סוגי סרטן אחרים כגון שלפוחית השתן, המשמשים שלה פוטנציאל לא ממומש עבור מודלים רבים של סרטן הכבד והלבלב.
Introduction
מודלים xenograft בעלי חיים הם כלי חיוני עבור מחקרים פרה של טיפולים נגד סרטן. Xenografts מאתר סטנדרטי להסתמך על האגף תת עורית ההשתלה של תאים, מתן אתר נגיש ויעיל עבור ניטור הגידול. החיסרון של מודלים תת עורית הוא היעדרם של מאפייני וחיסונים גידול ספציפי, אשר עשוי להגביל את הפוטנציאל שלהן גרורות1. הגבלות יש להתגבר על ידי שימוש xenografts orthotopic ב איזה גידול התאים הם engrafted באתרים רקמה מקורית, מתן של microenvironment רלוונטי עם פוטנציאל גרורתי2. מודלים xenograft Orthotopic לשמור על תכונות ביולוגיות המקורי ולספק מודלים אמינים סמים פרה-גילוי-3,-4. התאים הסרטניים מנוצל להשתלה רקמות מכוון הם שורות תאים הוקמה או תאים החולה נגזר מן המטופל גידולים. Xenografts הוקמה מתוך שורות תאים סרטן עשוי להפגין סטייה גנטית גבוהה מן הגידול העיקרי לעומת xenografts נגזר החולה5. נתון זה, הקמת xenografts orthotopic נגזר החולה הפך תקן המועדפת לבדיקת הריפוי בגילוי סרטן סמים.
סרטן ילדים נוירובלסטומה (NB), מודלים xenograft orthotopic מסכם את הדברים הגידול העיקרי ביולוגיה, לפתח גרורות לאתרים טיפוסי של NB להפיץ6,7. NB מתפתח בבלוטת יותרת הכליה או לאורך השרשרת סימפטי הבין-חולייתיים. השיטות הנפוצות ביותר של orthotopic-השרשה מחייבים הליכים כירורגיים הטרנס-בטן פתוחה. שיטות כאלה לעיתים מייגע, יש תחלואה גבוהה בעלי חיים, ותקופות התאוששות מורכבים. אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה יש לאחרונה נעזרו מכוון רקמות ההשתלה של תאים סרטניים בשלבי פיתוח של מספר מודלים מאתר סרטן מחקר8,9. הטכניקה היא אמין לשחזור, יעיל, בטוח להקמתה של גידול גרורתי הרלוונטיים xenografts10,11.
הקמת סרטן ילדים xenografts על ידי המטרה מונחה אולטרסאונד איברים ההשתלה לוקליזציה ואת המחט של שורות תאים ותאים סרטניים נגזר החולה הוא והפגינו11. הטכניקה היה מנוצל עבור NB ממוקד בלוטת יותרת הכליה מאתר. סרקומה ע ש יואינג (ES) היא בעיקר סרטן osseous, לעתים קרובות העצמות הארוכות כמו עצם הירך ו עצמות האגן12. הדו חות הראו כי כדי לקבוע אם הצמיחה של סרטן בעיקר osseous ריאלי ברקמת הכליה, במיקום הסיבה sub כליות נבחרה עבור orthotopic-השרשה13. יש כבר מנוצל כליות תת תא הסיבה ההשתלה של תאים סרטניים כמודל מבטיח ללמוד גרורות ספונטנית ES14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל העבודה נעשתה על פי אוניברסיטת מישיגן הועד המוסדי (00052430 לזמזם) ותואם לשגרות אושרה על ידי הוועדה האוניברסיטה על שימוש, טיפול בבעלי חיים (UCUCA). יחידת עבור המעבדה של בעלי חיים רפואה (אולם) השגיח טיפול בבעלי חיים.
כל העבודה נעשתה באישור של אוניברסיטת מישיגן הועד המוסדי (לזמזם 00052430), תואמת לכל תקנות ועדת האתיקה מחקר אנושי. תאים אנושיים נחשבים להיות חומר העלול ותברואה, אז תעקוב אחרי כל באמצעי זהירות מיוחדים ושיטות אבטחה המתאימה הנדרשים על ידי המוסד שלך. NSG עכברים הם immunocompromised קשות להיות רגישים למחלה הנגרמת על ידי חיידקים הנמצאים בדרך כלל הסביבה.
השתמש תמיד קפדנית סטרילי טכניקה בעת הכנת חומרי השרשה וביצוע הזריקות.
1. תרבית תאים
- לגדול ויצר אנושי NB שורות תאים (SH-SY5Y, SK-N-BE2 ו IMR32) אמצעי חיוני מינימלי, בתוספת 10% סרום שור עוברית, גלוטמין 2 מ מ, 100 יחידות/mL פניצילין, סטרפטומיצין μg/mL 100. תוספת IMR32 תאים נוספים עם 1 מ מ פירובט ו- 0.075% NaHCO3. לשמור על כל התאים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו- 70-80% הנהרות.
- לגדול האנושי ES שורות תאים (TC32, A673, CHLA-25 ו A4573) בינוני RPMI בתוספת 10% סרום שור בעובר ו 6 מ"מ-גלוטמין. לשמור על כל התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ב 70-80% הנהרות.
- לשלוח כל שורות תאים עבור אימות.
הערה: תא האימות נעשה על מתקן חיצוני, עיין תודות.
2. הכנה של תאי הגידול העיקרי נגזר החולה
- עם החולה והסכמתו ובהסכמה, קציר שנמחקו רקמה אנושית הגידול NB של חולים שעברו כריתה כירורגית עבור בקרה מקומיות ותחבורה ציבורית המעבדה בפתרון אחסון רקמות לשימור.
הערה: כל דוגמאות החולה בטל מזוהה, מטופלים לפי הנחיות הועד המוסדי. - צור השעיה תא יחיד נגזר חולה סרטן (UMNBL001, UMNBL002) של רקמת הגידול באמצעות ערכת דיסוציאציה הגידול. להעביר לצלחת תרבות תא 100 מ מ המכיל 5 מ ל מאגר RPMI, 200 µL של האנזים H, µL 100 של האנזים R ו- 25 כ 0.5 g של גידול µL של אנזים A הערכה דיסוציאציה גידול אנושי.
- מינצ הגידול לחתיכות קטנות (2-4 מ מ כל אחד) באמצעות רקמות מלקחיים ומספריים. מערבבים קטעים אלה עם הפתרונות בשלב 2.2.
- Pipette את תערובת הגידול לתוך צינור dissociator וסגור את הצינור. היפוך הצינור וחבר בשרוול של dissociator הרקמה. להפעיל תוכנית h_tumor_01.
- דגירה התליה תא הגידול לקבלו מעל 37 ° C עבור h 1 על מתלה מסתובב עם trituration לסירוגין כל 15 דקות.
- התליה תא להעביר צינור חרוטי 50 מ"ל ולהוסיף 10 מ"ל של RPMI. Centrifuge התליה תא ב g 314 x במשך 5 דקות.
- הסר את תגובת שיקוע, להשעות את צניפה ב 5 מ של RPMI. פתרון זה עוברים מסננת תא 40 µm ולאסוף את הפתרון מאומצות לתוך צינור חרוטי מ"ל. רוחצים זו מסננת פעם אחת עם 5 מ של התקשורת RPMI את centrifuge את התערובת ב g 314 x עבור 5 דקות כדי לאסוף גלולה.
- מודדים את צפיפות התאים באמצעות hemacytometer15. להשעות את צניפה להשיג מלמעלה RPMI בריכוז סופי של 4 × 105 תאים/10 µL. לוקחים 5 µL של ההשעייה תא µL 5 של matrigel כדי להפוך µL 10 של התא פתרון עבור כל זריקה.
הערה: כמות RPMI נעשה שימוש תלויה מדידת צפיפות התאים. לדוגמה, אם צפיפות תא נמדד בגדר שהושג 4 x 105 תאים, להשעות את צניפה ב 10 µL של RPMI.
3. לוציפראז תיוג של תאים סרטניים
- להפוך 10 מ"ל של התמרה חושית מדיה עם 5 מ של נגיפי supernatant EF1a-Luc2-IRES-mCherry, 5 מ של תאי גזע מדיה. להוסיף 7.5 µL של 1 x polybrene.
- מערבבים 5 × 106 תאים סרטניים התמרה חושית מדיה וצלחת בצלחת 100 מ מ קובץ מצורף נמוך במיוחד. דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 בן לילה.
הערה: צלחות מצורף נמוכה משמשים, התאים לא דוגלים צלחת. - לאחר 24 שעות, להביא את הצלחת 100 מ מ המכיל תאים מתחת תרביות רקמה המנוע ולהעביר את התערובת לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. Centrifuge התליה תא ב g 314 x עבור 5 דקות להביא בגדר התא. רוחצים בגדר תא פעם אחת עם 1 מ"ל של 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) את להשעות בגדר תא ב 1 מ"ל של HBSS המכיל 1% סרום שור עוברית (FBS).
- מיין תאים לוציפראז בהתבסס על אות ה-GFP-חיוביות על תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) ניתוח. צלחת התאים הממוינים על תרביות רקמה 100 מ מ מטופלים דיש ולתחזק ב 70-80% הנהרות, 37 ° C ו- 5% CO2 עד הנדרש.
- לאשר לוציפראז האות עם ערכת assay לוציפראז. דגירה תאים בן לילה על 37 ° C ו 5% CO2, ואוהבים צלחת צלחת 10 x 10 תאים4 ממוין לפי בעיר illuminometer 96 תואם. לאחר 24 שעות, להביא את הצלחת היטב 96 לטמפרטורת החדר ומוסיפים יציב-Glo ריאגנט מדיה בתרבית בבארות ביחס 1:1. מאפשרים לתאים lyse עבור 5 דקות ולקרוא הארה ב ספקטרופוטומטרים.
- להביא את המנה 100 מ מ תחת ברדס תרביות רקמה. למחוק את התקשורת supernatant. לשטוף את התאים פעם אחת עם 2 מ ל 1 x PBS.
- להוסיף 2 מ של 0.25% טריפסין וחוזרים המנה 100 מ מ החממה למשך 2-3 דקות. לאחר 2-3 דקות, לבדוק אם התאים ונדרש תחת מיקרוסקופ ולהוסיף 8 מ של RPMI לבטל את הפעלתה של טריפסין.
- לאסוף את התליה תא צינור חרוטי 15 מ"ל, צנטריפוגה ב g 314 x עבור 5 דקות כדי לקחת גלולה. למחוק את תגובת שיקוע. לשטוף בגדר תא עם 1 מ"ל של PBS 1 x, להשעות את צניפה ב 5 מ של RPMI וקבע את צפיפות התאים באמצעות hemacytometer15. צנטריפוגה yhe שנותרו פתרון תא g 314 x עבור 5 דקות כדי להשיג גלולה.
- להשעות את צניפה ב RPMI בריכוז של 4 x 105 תאים/10 µL. לוקחים 5 µL של התליה תא µL 5 של matrigel כדי להפוך µL 10 של התא פתרון עבור כל זריקה.
4. אולטרסאונד מודרכת בלוטת יותרת הכליה (NB) או Sub כליות השרשה כמוסה (ES)
הערה: כל הפרוצדורות האולטרסאונד מתבצעות באמצעות יישום ברזולוציה גבוהה ויוו מערכת הדמיה. ההליכים המתוארים, שימש המתמר, אשר יש תדר מרכז של 40 מגה-הרץ של הפס של 22-55 מגה-הרץ.
- לנצל 6-8-בת שבוע חיסונית לקויה NSG עכברים עבור כל שגרות הזרקה.
- להרגיע את matrigel ואת בלוק מזרקים המילטון מצויד עם מחט 27G (1.25"), קטטרים 22 גרם (בקוטר חיצוני 0.9 מ מ, 25 מ מ אורך) לילה ב 4 º C.
- המקום הפתרון תא מוכן בשלב 3 על קרח.
- עזים ומתנגד העכברים בתא אינדוקציה שימוש איזופלוריין 2% ב- O2 וכשאשר 2 ל'/min.
הערה: הרדמה נאותה נקבע עם חוסר תנועה פעיל ותחזוקה של נשימה ספונטנית. - ברגע מרדימים, depilate האגף של בעלי החיים באמצעות קרם להסרת שיער (כגון Nair) שייבר ומאחור.
- העברת החיה פלטפורמת הדמיה עם צד הבטן למטה, איפה האף של החיה ימוקם nosecone, מאובטחת תוך שאיפה איזופלוריין.
- הצב משחה אופטי בעיניים של בעל החיים כדי למנוע התייבשות. קלטת את העכבר במקום כדי למנוע כל תנועה בהיסח הדעת.
- לזהות את הכבד מאתר, הנבוב, הטחול, הכליות, הסמוך בלוטת יותרת הכליה השמאלית בעזרת ויזואליזציה אולטרסאונד.
- השתמש בכפפות סטריליות, מסכה, כובע הגנה אישית ותחזוקה של תנאים סטריליים. בהנחיית אולטרסאונד, בעדינות נחדיר קטטר 22 גרם דרך העור, חזרה השריר ישירות לתוך בלוטת יותרת הכליה השמאלית כדי לספק ערוץ להזרקה הסלולר. הסר את המחט ולהשאיר את הקתטר במקומו.
- עומס מזרק המילטון צוננת מצויד עם מחט small-bore עם 10 µL של פתרון תא ולאחר מכן להנחות את המזרק stereotactically דרך הקטטר ממוקם לתוך המרכז של בלוטת יותרת הכליה.
- להזריק את התאים לתוך רקמת הכליה יישוב. להשאיר את המחט במקום למשך 1-2 דקות לאפשר את matrigel להגדיר. הסר את המחט, ואחריו הסרת הקטטר.
- הצב והעכברים בחזרה לכלוב שלהם ולהבטיח כי העכבר להכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות.
הערה: בשל אופיו פולשנית של טכניקה זו, כאב פוסט פרוצדורלי הוא מינימלי, אבל עדיין בפיקוח על בסיס יומי עם עכברים בריאות בדיקות. "צריכה להיות מלווה עם משפט:"אם לא צפוי סימני כאב או מצוקה מזוהים במהלך הקורס של ניסוי, התייעץ עם היחידה שלך תמיכה מוסדית וטרינרית לקבלת מידע בנוגע שיכוך כאבים או טיפול רפואי אחר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות ההליכים שהוצגו, מונחה אולטרה סאונד ההשתלה של תאים NB לתוך בלוטת יותרת הכליה נעשה הליך ייעודי חדר מאובזר בשולחן מחומם כירורגי. מגיני זרוע ורגל הונחו לניטור פעילות הלב מאתר (איור 1 א'). בעל החיים נשאר anesthetized תחת איזופלוריין באמצעות אינהלציה האף חרוט. באמצעות החללית אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה, הכליה השמאלית מזוהה עם בלוטת יותרת הכליה רק הגולגולת אל הכליה (איור 1B). המחט היה מתקדם ואז לתוך בלוטת יותרת הכליה תחת פריט חזותי ישיר (איור 1C). במהלך הניצול הראשוני של טכניקה זו, תערובת של צבע כחול מתילן matrigel שימש כדי לאשר נכונות לוקליזציה של בלוטת יותרת הכליה. החיה הוקרב ולאחר ההצלחה של ההליך היה מאושר necropsy דמיין לצבוע מתילן כחול מתחת הקפסולה בלוטת יותרת הכליה (איור 1D).
אולטרסאונד שבועי והדמיה ביולומינסנציה היו שיטות המשמשים לניטור קצב הגידול engraftment וצמיחה. ביולומינסנציה הדמיה של האזור בעל עניין נמדד כמו פוטונים/s/ס מ2/steridian (p/s/ס מ2/sr) עם ספירה מינימלית של 106 עד 108 . מצביע על גודל הגידול נאותה עבור ניסויים פרה9 ( איור 2). ניתוח באמצעות t -test הראו עלייה משמעותית מבחינה סטטיסטית ביולומינסנציה צוין על התקופה 8 שבועות (* p< 0.05; * *p< 0.001; * * *p< 0.0001). אולטראסאונד הדמיה מותר המידות לא פולשנית של אזור הגידול ואמצעי אחסון. זה יחד עם מדידה ביולומינסנציה פיקוח הן engraftment הגידול והתקדמות (איור 3). נהלים דומים נוצלו עבור תאים ES מוזרק הקפסולה sub כליות (איור 4).
ניתוח ברוטו, היסטולוגית של גידולים הנובעת מאופיין העיקרי של גרורות ב necropsy. דגימות רקמה בדק עבור תבניות מורפולוגיות תא, מוכתם כל סמני הגידול הספציפי חלבונים (איור 5, איור 6). הגידול העיקרי engraftment עבור שורות תאים NB (IMR32, SH-סיי-5Y, SK-N-BE2, UMNBL001, UMNBL002) נע בין 62-100%, עם גרורות לראות ב 0-100% של עכברים מוזרק. הגרורה החזקה ביותר נראו SK-N-BE2 (33%) ו UMNBL002 (100%). אתרים גרורתי NB היו בלוטות הלימפה, כבד, ריאות, עצם קורטיקלית. סאב כליות engraftment דרכים עבור שורות תאים ES (A4573, A673, CHLA-25, TC-32) נע בין 60-100%, עם גרורות לראות ב 0-40% של עכברים מוזרק. אתרי גרורתי לגילוי ES כללו את בלוטות הלימפה, עצמות בקליפת המוח והריאות. Engraftment הכי חזקים (100%) ואת גרורות (40%) נראו בעכברים xenograft TC-32.
איור 1 . בלוטת יותרת הכליה מאתר לוקליזציה ו NB מונחה אולטרה סאונד תא ההשתלה. (א) רזולוציה גבוהה אולטראסאונד הדמיה של אברי הבטן מאתר מותר בלוטת יותרת הכליה ההשתלה של תאים סרטניים. (ב) הכליות זוהה. (ג) בלוטת יותרת הכליה השמאלית הינו ממוקם בסמוך אל הכליה השמאלית כמו hypoechoic (כהה) סביב מבנה. המחט היה מתקדם לתוך בלוטת יותרת הכליה ואחריו הזרקת תאים. (ד) תערובת של matrigel וצבע כחול מתילן שימש כדי להעריך את הדיוק של הזרקת הליכים. נציג שמחוץ תמונה של הכליה השמאלית של בלוטת יותרת הכליה עם צבע matrigel, מתילן כחול בלוטת יותרת הכליה כמוסה וחלל פרי-יותרת הכליה. דמות זו שונתה באישור ואן נורד, ע ר ואח. 11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . אין ויוו ביולומינסנציה הדמיה של engraftment הגידול וקצב הצמיחה. (א) xenografts יותרת הכליה אדם NB נוטרו engraftment ואת הגידול מעל שמונה שבועות. (ב) האות ביולומינסנציה מקסימלי נקבע בתוך האזור של ריבית. שורות תאים NB (SH-SY5Y, IMR 32, SK-N-BE2) ותאים נגזר החולה (UMNBL001, UMNBL002) גברה דפוסי radiance וצמיחה לאורך זמן. לודיג ביולומינסנציה על התקופה 8 שבועות היה משמעותי מבחינה סטטיסטית (*p< 0.05; * *p< 0.001; * * *p< 0.0001). דמות זו שונתה באישור ואן נורד, ע ר ואח. 11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . אין ויוו אולטראסאונד הדמיה של engraftment גידול וצמיחה. אולטראסאונד הדמיה פיקוח ויוו התקדמות הגידול. מוצגות תמונות אולטרסאונד ותמונות ביולומינסנציה המתאימים אחת, שתיים, שמונה שבועות. ב. שבוע אחד, engraftment היה מדמיין ב שתי שיטות הדמיה. גידול השטח והנפח חושבו באמצעות אולטראסאונד הדמיה. תמונות אולטרסאונד תלת-ממד שיקוף גידולים נכרת לאחר סיום המחקר. דמות זו שונתה באישור ואן נורד, ע ר ואח. 11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . כליות מאתר לוקליזציה, מונחה אולטרה סאונד ההשתלה של תאים ES- (א) ביולומינסנציה שימש כדי לפקח על הגידול radiance וצמיחה. (בג) חיות לפתח גידולים פולשניים מקומית מעוות סביב מבנים בטן ולא פלש לתוך מבנים מקומיים כגון שרירים. דמות זו שונתה באישור ואן נורד, ע ר ואח. 11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 . הגידול histopathology של גידולים xenograft NB ו- ES- (א) עכברים xenograft NB היו גידולים ראשי מקומי infiltrative באתרים בלוטת יותרת הכליה ובלוטת יותרת הכליה-פרי, אשר מעוות סמוך אברי הבטן. (B) מאכל (20 X, בר = 50 מיקרומטר), גידולים האדרנל xenograft הראו תכונות מורפולוגיות בקנה אחד עם האדם NB (אשכולות תחזוקה עלובה הבדיל זוויתי כדי לעגל תאים), כולל פסאודו אקראי רוזט היווצרות (חץ). (ג) גידול רקמות הראה טירוזין חזקה hydroxylase (סמן הגידול NB) immunoreactivity (40 X, בר = 40 µm; בקרה חיובית מכתים שמוצג בחלונית השמאלית מטריים). (ד) ES xenograft הגידול היה עקבי עם infiltrative ES היסטולוגית תכונות (40 X, בר = 40 µm), אשכולות של זוויתי כדי לעגל epithelioid תאים מופרדים על-ידי stroma וסקולרית fibro משובחים, effacing ודחיסה ושיבתן סמוכים (חץ; דחוס שרידים של הכליה parenchyma). (ה) ES גידול רקמות הראה immunoreactivity ממברנה חזקה עבור סמן הגידול ES CD99 (40 X, בר = 40 µm; בקרה חיובית מכתים שמוצג בחלונית השמאלית מטריים). דמות זו שונתה באישור ואן נורד, ע ר ואח. 11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 . גרורות מרוחקות שפותחה ב- xenografts הוקם על ידי טכניקת ההזרקה מונחה אולטרסאונד. (א) ביולומינסנציה הדמיה מציג הגידול העיקרי NB שטח בלוטת יותרת הכליה, מוקדים גרורתי זוהה ליד עצם קורטיקלית. (ב) ניתוח מיקרוסקופי הראו גידול גרורתי (חץ) effacing את חלל מוח ואת עצם קורטיקלית של עצם הירך צינתור (4 X, בר = מיקרומטר 400). (ג) טירוזין hydroxylase cytoplasmic immunoreactivity של אתר גרורתי בשתל קליפת העצם שקצרנו NB (40 X, בר = 40 µm). (ד) מיקרוסקופיה של החולה, נגזר orthotopic xenograft (UMNBL002) עם גרורות בכבד (חץ) בתוך וריד הכבד (ראש חץ מדגים תאי אנדותל,), חדירה parenchyma סמוכים הכבד (L) (20 X, בר = 50 מיקרומטר). (ה) נוירובלסטומה מיקרו גרורות (חץ) בתוך parenchyma הריאה (40 X, בר = 40 µm). דמות זו שונתה באישור ואן נורד, ע ר ואח. 11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מונחה אולטרה סאונד ההשתלה של תאים NB ו- ES היא שיטה יעילה ובטוחה להקים אמין xenografts מאתר ללימודי פרה בביולוגיה סרטן. קריטי להצלחת מונחה אולטרה סאונד ממוקדות רקמות השרשה הוא הנוכחות ואת הזמינות של צוות מיומן עם מומחיות אנטומית לאתר. את האיבר של עניין, הזרקת סטיאוטטי של תאים סרטניים.
הדיסוציאציה של רקמת גידול הוכיח צעד מכריע בפיתוח המודל שתואר החולה נגזר xenograft. רקמת הגידול מקורית כולל microenvironment הסלולר משתית שמסביב זה עשוי להשפיע על ספיגת הגידול או engraftment. תא סופרת, לאחר תהליך דיסוציאציה הושלמה, סיפק לאמוד של צפיפות הסלולר במדגם, 2 x 105 תאים/10 μL נחשב של ספירת התאים אופטימלית השרשה, גידול מוצלח engraftment.
לוציפראז תיוג של תאים המותר עבור האימות של גידול engraftment וניטור של הגידול על ידי מדידת אות ביולומינסנציה, עם 106 עד 108 להיחשב מעידה על גידול ספיגת9. כדי להבטיח התמרה חושית מוצלח, פעילות לוציפראז היה אושרו במבחנה לפני הזרקת תאים. הדבר נעשה על ידי immunofluorescence, ערכות לוציפראז assay, וגם על-ידי בדיקת התאים ביולומינסנציה האות. הגדרות למדידת ביולומינסנציה הוחזקו קבועה, מתן נתונים עקבי במהלך המדידות שבועי.
Ex-vivo ניתוח histopathological של גידולים אישר את סוג התא ואת המורפולוגיה של גידולים תוצאות עם צביעת ספציפי עבור סמני חלבונים. ניתוח histopathological אישר הגידול engraftment של גרורות הפגינו על ידי אולטרסאונד והדמיה זוהרים.
יתרונות מונחה אולטרה סאונד השרשה הסלולר כוללים שלה אופי פולשני, זמן התאוששות בעלי חיים מינימלית, והצלחה הגוברת להקמת מספר מודלים מוצלחים xenograft. אולטראסאונד הדמיה מספק גם שיטה אמינה לפקח ויוו הגידול התקדמות הגידול לאמצעי אחסון. במודלים אלו פרה, גידולים התקדמה למחלה פולשנית באופן מקומי עם גרורות בתוך חמישה שבועות. מגבלות כוללים את הזמינות של טכנולוגיית דימות ברזולוציה גבוהה ואת היכולת למקם באופן עקבי את איבר המטרה. הזמינות של כוח אדם באמצעות מומחיות אולטראסאונד הדמיה של האיבר עניין הם מרכיבים קריטיים של טכניקה זו.
הזמינות של דימות ברזולוציה גבוהה גדל באופן משמעותי בתוך העשור האחרון, השימוש שלה ממשיכה להרחיב לא רק בתרגול קליני, אלא גם במחקר מעבדה. הניצול של אולטרסאונד לפיתוח xenografts מאתר מודרני הוא יישום מבטיח, עם פוטנציאל לקידום מחקר פרה מודלים עבור גילוי תרופות לסרטן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש אין גילויים.
Acknowledgments
עבודה זו קיבלה תמיכה את רוברט ווד ג'ונסון קרן/עמוס סגל פיתוח תוכנית, טאובמן מכון המחקר הרפואי, ואת סעיף של כירורגיה ילדים, אוניברסיטת מישיגן. המחברים רוצים להודות קימבר והלקסיקוגרפיה-ברן וד ר מרקוס Jarboe עבור הסיוע בהליכים הזרקת אולטרסאונד ולמערכת הדמיה. אנו מודים פול טראמבלי לסיוע שלו עם איור גרפיקה. אנו מודים גם את מחלקת רדיולוגיה ב אוניברסיטת מישיגן לשימוש של המרכז הדמיה מולקולרית והליבה הגידול הדמיה, אשר נתמכים חלקית על ידי מקיף סרטן מרכז NIH, להעניק P30 CA046592. האוניברסיטה של מישיגן פיזיולוגיה Phenotyping ליבה נתמך בחלקו על ידי מענק למימון NIH (OD016502) ואל מרכז לב וכלי דם פרנקל. תא קו אימות נעשתה במתקני Bioresearch RADIL IDEXX, קולומביה אנו מודים סטול תמי, ד ר Rajen Mody, התוכנית אונקולוגיה מוט גידול מוצק. חולים ומשפחות שלנו בתודה הודה שלהם השראה, אומץ, ותמיכה שוטפת של המחקר שלנו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| NOD-SCID | Charles River | 394 | |
| NSG | The Jackson Laboratory | 5557 | |
| Cell Line | |||
| NB | |||
| IMR-32 | ATCC | CCL-127 | Established human neuroblastoma cell line |
| SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | Established human neuroblastoma cell line |
| SK-N-Be2 | ATCC | CRL-2271 | Established human neuroblastoma cell line |
| ES | |||
| TC32 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A673 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| CHLA-25 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A4573 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| Cell Line media | |||
| RPMI | Life Technologies | 11875-093 | |
| Matrigel | BD BioSciences | 354234 | |
| Dissociation | |||
| Dissection Tools | KentScientific | INSMOUSEKIT | |
| Human Tumor Dissociation Kit | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| Luciferase Tagging | |||
| Lenti-GFP1 virus | University of Michigan, Vector Core | Luciferase Virus | |
| Steady Glo-Luciferase Assay Kit | Promega | E2510 | |
| Bioluminescence Imaging | |||
| Ivis Spectrum Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| D-Luciferin | Promega | E160X | |
| Anesthetic | |||
| Inhaled Isoflurane | Piramal Critical Care Inc | 66794-0017-25 | |
| Ultrasound Guided Injection | |||
| Vevo 2100 High Resolution Imaging | Vevo | 2100 | |
| Hamilton Syringes (27 gauge needle) | Hamilton | 80000 | |
| 22 Gauge Angiocatheter | BD Biosciences | 381423 | |
| Optical ointment | Major Pharmaceuticals | 301909 | |
| Nair | Church & Dwight Co | Hair Removal agent | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel | Parker | Ultrasound gel | |
| Histology | |||
| CD99 | DAKO | M3601 | Primary Antibody |
| Tyrosine Hydroxylase | Sigma-Aldrich | T2928 | Primary Antibody |
| Secondary HRP-Polymer antibody | Biocare | BRR4056KG | |
| Miscelleneous | |||
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| P1000 pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| P200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| P1000 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375E | |
| P200 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Portable pipette aid | Drummond | 4-000-101 | |
| digital animal Weighing Scale | KentScientific | SCL-1015 | |
| Calipers | Fisher Scientific | 06-664-16 | |
| 6well low attachment plates | Corning | 07-200-601 | |
| 10 cm Tissue Culture Treated Dishes | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G |
References
- Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Ann Oncol. 27 (7), 1190-1198 (2016).
- Fidler, I. J., Hart, I. R. Biological diversity in metastatic neoplasms: origins and implications. Science. 217 (4564), 998-1003 (1982).
- Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation. Eur J Cancer. 40 (6), 852-857 (2004).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic Models are Necessary to Predict Therapy of Transplantable Tumors in Mice. Cancer Metastasis Rev. 17 (3), 279-284 (1998).
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).
- Khanna, C., Jaboin, J. J., Drakos, E., Tsokos, M., Thiele, C. J. Biologically relevant orthotopic neuroblastoma xenograft models: Primary adrenal tumor growth and spontaneous distant metastasis. In Vivo. 16 (2), 77-85 (2002).
- Stewart, E., et al. Development and characterization of a human orthotopic neuroblastoma xenograft. Dev Biol. 407, 344-355 (2015).
- Jäger, W., et al. Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts. J. Vis. Exp. (84), e51123 (2014).
- Teitz, T., et al. Preclinical Models for Neuroblastoma: Establishing a Baseline for Treatment. PLoS ONE. 6 (4), e19133 (2011).
- Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts retain metastatic patterns and geno- and phenotypes of patient tumours. International Journal of Cancer. 136 (5), 252-261 (2015).
- Van Noord, R. A., et al. Tissue-directed Implantation Using Ultrasound Visualization for Development of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. In Vivo. 31 (5), 779-791 (2017).
- Vormoor, B., et al. Development of a Preclinical Orthotopic Xenograft Model of Ewing Sarcoma and Other Human Malignant Bone Disease Using Advanced In Vivo Imaging. PLoS ONE. 9 (1), e85128 (2014).
- Hakky, T. S., Gonzalvo, A. A., Lockhart, J. L., Rodriguez, A. R. Primary Ewing sarcoma of the kidney: a symptomatic presentation and review of the literature. Ther Adv Urol. 5 (3), 153-159 (2013).
- Cheng, H., Clarkson, P. W., Gao, D., Pacheco, M., Wang, Y., Nielsen, T. O. Therapeutic Antibodies Targeting CSF1 Impede Macrophage Recruitment in a Xenograft Model of Tenosynovial Giant Cell Tumor. Sarcoma. 2010, 174528 (2010).
- JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
