Summary
Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare iniezione ultrasuono-guida del neuroblastoma (NB) e cellule (ES) il sarcoma di Ewing (stabilito linee cellulari e cellule tumorali derivate dal paziente) biologicamente rilevanti siti per creare modelli preclinici affidabili per il cancro ricerca.
Abstract
Test preclinici di terapie anticancro si basa su modelli di xenotrapianto pertinenti che imitano le tendenze innate del cancro. Modelli standard fianco sottocutaneo vantaggi procedurali facilità e la capacità di progressione del tumore monitor e risposta senza imaging invasivo. Tali modelli sono spesso incoerenti nei test clinici traslazionale e con limitate caratteristiche biologicamente rilevanti con bassa propensione a produrre metastasi, come c'è una mancanza di un microambiente nativo. In confronto, modelli di xenotrapianto ortotopici presso siti nativi del tumore sono stati indicati per imitare il microambiente tumorale e replicare le caratteristiche di malattia importante come diffusione metastatica distante. Questi modelli richiedono spesso noiose procedure chirurgiche con periodi prolungati di tempo e recupero anestetici. Per risolvere questo problema, i ricercatori del cancro hanno recentemente utilizzato tecniche di iniezione ultrasuono-guida per stabilire modelli di xenotrapianto del cancro per gli esperimenti preclinici, che permette per istituzione rapida e affidabile di tessuto-regia di modelli murini. Visualizzazione di ultrasuono fornisce anche un metodo non invasivo per la valutazione longitudinale del tumore attecchimento e crescita. Qui, descriviamo il metodo per iniezione ultrasuono-guida delle cellule tumorali, che utilizzano la ghiandola surrenale per NB e capsula renale sub per ES. Questo approccio mini-invasivo supera l'impianto noioso chirurgia a cielo aperto delle cellule tumorali nel tessuto-specifici percorsi di crescita e di metastasi e sporadicamente periodi di recupero morboso. Descriviamo l'utilizzo di linee cellulari stabilizzate e di linee cellulari derivate paziente per iniezione ortotopico. Pre-fatte kit commerciali sono disponibili per la dissociazione del tumore e luciferasi tagging delle cellule. Iniezione di sospensione cellulare utilizzando Consiglio di immagine fornisce una piattaforma come minimo dilagante e riproducibile per la creazione di modelli preclinici. Questo metodo viene utilizzato per creare modelli preclinici affidabili per altri tumori, come la vescica, fegato e pancreas, esemplificando il suo potenziale non sfruttato per numerosi modelli di cancro.
Introduction
Modelli animali dello xenotrapianto sono strumenti essenziali per studi preclinici di terapie anticancro. Gli xenotrapianti murini standard si basano sull'impianto sottocutaneo fianco delle cellule, fornire un sito efficiente e facilmente accessibile per controllare la crescita del tumore. Lo svantaggio dei modelli sottocutanei è la loro mancanza di caratteristiche biologiche del tumore-specifici, che possono limitare la loro potenziale riprodurrsi per metastasi1. Tali limitazioni sono superate mediante l'utilizzo degli xenotrapianti di orthotopic in quale tumore le cellule sono innestate in siti di tessuto nativo, fornendo un microambiente pertinente con potenziale metastatico2. Modelli di xenotrapianto ortotopici mantengono originale caratteristiche biologiche e forniscono modelli affidabili per droga preclinici discovery3,4. Le cellule tumorali utilizzate per l'impianto diretto di tessuto sono linee cellulari stabilizzate o cellule paziente-derivate da tumori di pazienti. Gli xenotrapianti stabiliti da linee cellulari del cancro possono esibire alta divergenza genetica del tumore primario rispetto al paziente gli xenotrapianti derivata5. Detto questo, l'istituzione degli xenotrapianti orthotopic paziente-derivato è diventato lo standard preferito per testare nuove terapie nella scoperta della droga di cancro.
Nel neuroblastoma (NB) di cancro pediatrico, modelli di xenotrapianto ortotopici ricapitolano biologia del tumore primario e sviluppano metastasi ai tipici siti di NB diffondere6,7. NB si sviluppa nella ghiandola adrenale o lungo la catena simpatica paravertebral. I metodi più comuni di orthotopic impianto richiedono procedure chirurgiche trans-addominale aperte. Tali metodi sono spesso noiosi, hanno un'elevata morbilità animale e periodi di recupero complesso. Ecografia ad alta risoluzione è stato recentemente utilizzato per l'impianto diretto di tessuto delle cellule del tumore nello sviluppo di diversi modelli murini per cancro ricerca8,9. La tecnica è affidabile, riproducibile, efficiente e sicuro per la creazione di tumore metastatico pertinenti xenotrapianti10,11.
L'istituzione degli xenotrapianti di cancro pediatrico di ultrasuono-guida destinazione organo ago e localizzazione impianto di linee cellulari e cellule tumorali paziente-derivato è dimostrata11. La tecnica è stata utilizzata per NB mirati alla ghiandola surrenale murina. Sarcoma di Ewing (ES) è principalmente un cancro osseo, comunemente-veduto nelle ossa lunghe come il femore e le ossa pelviche12. Rapporti di caso hanno dimostrato che per determinare se la crescita di un cancro principalmente osseous è realizzabile in tessuto renale, una posizione capsulare renale sub è stato scelto per l'impianto di orthotopic13. L'impianto delle cellule capsulare renale sub delle cellule del tumore è stata utilizzata come un promettente modello per studiare le metastasi spontanee per ES14.
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Protocol
Tutto il lavoro è stato fatto in conformità con la University of Michigan, Institutional Review Board (HUM 00052430) ed è conforme alle procedure approvate dal Comitato Università sull'uso e la cura degli animali (UCUCA). L'unità per laboratorio di medicina animale (ULAM) ha supervisionato la cura degli animali.
Tutto il lavoro è stato fatto con l'approvazione da The University of Michigan, Institutional Review Board (HUM 00052430) ed è conforme a tutte le norme di comitato etico di ricerca umana. Le cellule umane sono considerate essere un materiale potenzialmente a rischio biologico, quindi seguire tutte le precauzioni speciali e accordo con le richieste dal proprio istituto. NSG topi sono gravemente immunocompromessi e suscettibile di malattia causata da batteri che si trovano comunemente nell'ambiente.
Utilizzare sempre rigorosa tecnica sterile durante la preparazione di materiali per l'impianto ed eseguire le iniezioni.
1. coltura cellulare
- Stabilite linee cellulari umane NB (SH-SY5Y, SK-N-BE2 e IMR32) di crescere in terreno minimo essenziale, completati con 10% siero bovino fetale, la glutamina 2mm, 100 unità/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina. Integrare le cellule IMR32 ulteriormente con 1 mM di piruvato e 0,075% NaHCO3. Mantenere tutte le celle a 37 ° C, 5% CO2 e confluenza di 70-80%.
- Crescere le linee delle cellule ES umane (TC32, A673, Beyonce-25 e A4573) in medium RPMI supplementato con 10% siero bovino fetale e 6 mM L-glutammina. Mantenere tutte le celle a 37 ° C, 5% CO2 al 70-80% confluenza.
- Inviare tutte le linee cellulari per l'autenticazione.
Nota: L'autenticazione delle cellule avviene presso una struttura esterna, consultare i riconoscimenti.
2. preparazione di cellule primarie del tumore paziente-derivato
- Con il consenso del paziente e del parere conforme, vendemmia scartato tessuto di tumore umano NB da pazienti sottoposti a resezione chirurgica per controllo locale e il trasporto al laboratorio in soluzione di archiviazione di tessuto per la conservazione.
Nota: Tutti i campioni dei pazienti sono de-identificati e gestiti conformemente agli orientamenti Institutional Review Board. - Generare una sospensione di cellule di cancro singolo paziente-derivato (UMNBL001, UMNBL002) dal tessuto del tumore usando un kit di dissociazione del tumore. Trasferire circa 0,5 g di tumore a una piastra di coltura delle cellule di mm 100 contenente 5 mL di tampone di RPMI, 200 µ l di enzima H, 100 µ l di enzima R e 25 µ l di enzima A dal kit di dissociazione umane del tumore.
- Tritare il tumore in piccoli pezzi (2-4 mm) con delle forbici, pinze. Mescolare questi frammenti con le soluzioni al punto 2.2.
- Pipettare la miscela del tumore in un tubo di dissociatore e chiudere il tubo. Capovolgere la provetta e attaccarsi a manicotto del dissociatore di tessuto. Eseguire il programma h_tumor_01.
- Incubare la sospensione delle cellule del tumore ottenuta sopra a 37 ° C per 1 h su una griglia rotante con triturazione intermittente ogni 15 min.
- Trasferire la sospensione cellulare per una nuova provetta conica 50 mL e aggiungere 10 mL di RPMI. Centrifugare la sospensione cellulare a 314 x g per 5 min.
- Rimuovere il supernatante e sospendere il pellet in 5 mL di RPMI. Passare questa soluzione attraverso un colino di cella di 40 µm e raccogliere la soluzione tesa in un tubo conico di fresca 50 mL. Questo filtro una volta con 5 mL di terreno RPMI di lavare e centrifugare la miscela a 314 x g per 5 min raccogliere un pellet.
- Misurare la densità delle cellule usando un emocitometro15. Sospendere il pellet ottenuto dall'alto in RPMI per ottenere una concentrazione finale di 4 × 105 cellule/10 µ l. Prendere 5 µ l di sospensione cellulare e 5 µ l di matrigel a fare 10 µ l di soluzione di cella per ogni iniezione.
Nota: Quantità di RPMI utilizzato dipende la misura di densità cellulare. Ad esempio, se la densità delle cellule misurata del pellet ottenuti è di 4 x 105 celle, è possibile sospendere il pellet in 10 µ l di RPMI.
3. luciferase Tagging delle cellule tumorali
- Fare 10 mL di media di trasduzione con 5 mL di surnatante virale EF1a-Luc2-IRES-mCherry e 5 mL di media delle cellule staminali. Aggiungere 7,5 µ l di 1x polybrene.
- Mix 5 × 106 cellule tumorali in media di trasduzione e piastra a piastra di attacco ultra-low di 100 mm. Incubare a 37 ° C e 5% CO2 durante la notte.
Nota: Come piastre di ancoraggio basso sono utilizzati, le cellule non aderirà alla piastra. - Dopo 24 h, portare il piatto di 100 mm contenenti cellule sotto cofano di coltura del tessuto e trasferire il composto in una provetta conica da 15 mL. Centrifugare la sospensione cellulare a 314 x g per 5 min ottenere il pellet cellulare. Lavare il pellet cellulare una volta con 1 mL di tampone fosfato salino (PBS): 1x e sospendere il pellet cellulare in 1 mL di HBSS contenente 1% siero bovino fetale (FBS).
- Ordinare celle luciferasi basate sul segnale di GFP-positive sulla fluorescenza-attivato delle cellule ordinamento analisi (FACS). Piastra le cellule ordinate il 100mm coltura di tessuti trattati piatto e mantengono la confluenza di 70-80%, 37 ° C e 5% CO2 fino a quando richiesto.
- Confermare la luciferasi segnale con kit di saggio di luciferasi. Piastra 10 x 104 ordinati cellule per pozzetto in un illuminometer 96 compatibile piastra ed incubare le cellule durante la notte a 37 ° C e 5% CO2. Dopo 24 h, portare la piastra ben 96 a temperatura ambiente e aggiungere il reagente Steady-Glo ai media coltivate in pozzi in rapporto 1:1. Consentire alle cellule di lisare per 5 min e leggere luminescenza in spettrofotometro.
- Portare il piatto di 100 mm sotto una cappa di coltura del tessuto. Scartare i surnatante media. Lavare le cellule una volta con 2 mL di PBS 1X.
- Aggiungere 2 mL di tripsina 0,25% e riporre il piatto di 100 mm nell'incubatore per 2-3 min. Dopo 2-3 min, controllare per rimetterli cellule sotto il microscopio e aggiungere 8 mL di RPMI per disattivare tripsina.
- Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 314 x g per 5 min ottenere una pallina. Scartare il surnatante. Lavare il pellet cellulare con 1 mL di PBS 1X, sospendere il pellet in 5 mL di RPMI e determinare la densità delle cellule usando un emocitometro15. Centrifugare yhe restanti soluzione cella a 314 x g per 5 min ottenere una pallina.
- Sospendere il pellet in RPMI per ottenere una concentrazione di 4 x 105 cellule/10 µ l. Prendere 5 µ l di sospensione cellulare e 5 µ l di matrigel a fare 10 µ l di soluzione di cella per ogni iniezione.
4. ultrasuono guida della ghiandola surrenale (NB) o Sub renale capsula (ES) dell'impianto
Nota: Tutte le procedure di ultrasuoni vengono eseguite utilizzando un alta risoluzione in vivo imaging system. Per le procedure descritte, è stato usato il trasduttore, che ha una frequenza centrale di 40 MHz e una larghezza di banda di 22-55 MHz.
- Utilizzare topi NSG immune-carenti di 6-8-settimana-vecchio per tutte le procedure di iniezione.
- Chill il matrigel e autoclavati Siringhe Hamilton con ago 27G (1.25"), e cateteri 22G (diametro esterno 0,9 mm, 25 mm di lunghezza) durante la notte a 4 ° C.
- Posto la soluzione di cella preparata nel passaggio 3 il ghiaccio.
- Anestetizzare i topi in una camera di induzione utilizzando 2% isoflurano O2 consegnato a 2 L/min.
Nota: Un'anestesia adeguata è determinata con la mancanza di movimento attivo e il mantenimento della respirazione spontanea. - Una volta anestetizzato, depilare la schiena e il fianco degli animali utilizzando un rasoio e lozione per capelli rimozione (ad esempio Nair).
- Trasferire l'animale alla piattaforma di imaging con addominali laterali verso il basso, dove il naso dell'animale è inserito in un musetto e protetta durante l'inspirazione isoflurano.
- Posto unguento ottico negli occhi dell'animale per evitare l'essiccazione. Il mouse in luogo per impedire qualsiasi movimento involontario del nastro.
- Identificare il fegato murino, vena cava, milza, rene sinistro e ghiandola surrenale sinistra adiacente utilizzando visualizzazione di ultrasuono.
- Utilizzare guanti sterili, mascherina e cappuccio per la protezione personale e la manutenzione di condizioni di sterilità. Sotto guida ecografica, delicatamente inserire un catetere 22g attraverso la pelle e muscolo direttamente nella ghiandola surrenale sinistra per fornire un canale per iniezione cellulare. Rimuovere l'ago e lasciare il catetere in posizione.
- Carico una siringa Hamilton refrigerata con un ago piccolo calibro con 10 µ l di soluzione di cella, quindi Guida la siringa stereotactically attraverso il catetere posizionato al centro della ghiandola surrenale.
- Iniettare le cellule nel tessuto adrenale mirato. Lasciare l'ago in posizione per 1-2 min consentire il matrigel impostare. Rimuovere lentamente l'ago, seguita dalla rimozione del catetere.
- Rimettere i topi nella loro gabbia e assicurarsi che il mouse riprende conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale.
Nota: a causa della natura come minimo dilagante di questa tecnica, dolore post procedurale è minimo, ma ancora monitorati su base giornaliera con topi salute controlli. "deve essere seguita con una frase:"se inaspettati segni di dolore o angoscia sono si identificate nel corso di un esperimento, consultare con il vostro apparecchio istituzionale supporto veterinario per informazioni riguardanti l'analgesia o altre cure mediche.
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Representative Results
Utilizzando le procedure presentate, impianto ecoguidato di NB cellule nella ghiandola adrenale è stato fatto in una procedura dedicata sala attrezzata con un tavolo operatorio riscaldato. Rilievi di braccio e il piede sono stati disposti per monitoraggio attività del cuore murino (Figura 1A). L'animale è rimasto anestetizzato sotto utilizzando il cono di naso inalazione isoflurane. Usando una sonda di ultrasuono ad alta definizione, il rene di sinistra è stato identificato con la ghiandola surrenale appena craniale al rene (Figura 1B). L'ago è stato avanzato quindi nella ghiandola surrenale sotto visualizzazione diretta (Figura 1). Durante l'utilizzo iniziale di questa tecnica, una miscela di tintura del blu di metilene e matrigel è stata utilizzata per confermare la corretta localizzazione della ghiandola surrenale. L'animale è stato sacrificato, e il successo della procedura è stato confermato su autopsia visualizzando colorante blu di metilene sotto la capsula della ghiandola surrenale (Figura 1).
Settimanale di ultrasuono e bioluminescenza imaging erano le modalità usate per monitorare il tasso di attecchimento e la crescita del tumore. Formazione immagine di bioluminescenza della regione di interesse è stata misurata come fotoni/s/cm2/steridian (p/s/cm2/sr) con un numero minimo di 106 a 108 indicativo di dimensione sufficiente del tumore per esperimenti preclinici9 ( Figura 2). Analisi mediante t -test ha mostrato aumento statisticamente significativo in bioluminescenza è stata notata durante il periodo di otto settimane (* p< 0.05; * *p< 0,001; * * *p< 0,0001). Formazione immagine di ultrasuono consentito misurazioni non invasive di tumore area e volume. Questo insieme a misura di bioluminescenza monitorato attecchimento del tumore e la progressione (Figura 3). Procedure simili sono state utilizzate per ES le cellule iniettate nella capsula renale sub (Figura 4).
Analisi lordo ed istologico dei tumori risultanti caratterizzano i tumori primari e le metastasi all'autopsia. Campioni di tessuto sono stati esaminati per modelli morfologici delle cellule e macchiati per marcatori tumore-specifici della proteina (Figura 5, Figura 6). Attecchimento del tumore primario per linee cellulari NB (IMR32, SH-SY-5Y, SK-N-BE2, UMNBL001, UMNBL002) ha variato da 62-100%, con metastasi vista in 0-100% dei topi iniettati. Le metastasi più robuste sono state vedute in SK-N-BE2 (33%) e UMNBL002 (100%). Siti metastatici per NB erano linfonodi, fegato, polmone e dell'osso corticale. Il engraftment capsulare renale sub per linee di cellule ES (A4573, A673, Beyonce-25 TC-32) ha variato da 60-100%, con metastasi vista in 0-40% dei topi iniettati. Siti metastatici esaminati per ES inclusi i linfonodi, ossa corticali e polmoni. Il più robusto attecchimento (100%) e le metastasi (40%) sono state vedute in topi dello xenotrapianto TC-32.
Figura 1 . Localizzazione della ghiandola surrenale murino e NB ultrasuono-guida l'impianto delle cellule. (A) formazione immagine di ultrasuono ad alta risoluzione degli organi addominali murini ammessi ghiandola surrenale l'impianto delle cellule del tumore. (B) sinistro rene è stato identificato. (C) la ghiandola surrenale sinistra è adiacente al rene di sinistra come un hypoechoic (scuro) tondo struttura. L'ago è stato avanzato nella ghiandola surrenale seguita da iniezione di cellule. (D) una miscela di matrigel e colorante blu di metilene è stata usata per valutare l'accuratezza delle procedure di iniezione. Immagine rappresentante ex vivo del rene di sinistra e della ghiandola surrenale con tintura di matrigel e blu di metilene presso la capsula della ghiandola surrenale e lo spazio peri-adrenali. Questa figura è stata modificata con il permesso di Van Noord, R.A. et al. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . In vivo imaging di bioluminescenza del tasso di attecchimento e la crescita del tumore. (A) xenotrapianti adrenali NB umani sono stati controllati per l'attecchimento e la crescita tumorale in otto settimane. (B) segnale di bioluminescenza massima è stata determinata all'interno della regione di interesse. Linee cellulari NB (SH-SY5Y, IMR 32, SK-N-BE2) e cellule paziente-derivate (UMNBL001, UMNBL002) erano aumentato modelli radiance e crescita nel tempo. Aumento della bioluminescenza durante il periodo di otto settimane è risultata statisticamente significativa (*p< 0.05; * *p< 0,001; * * *p< 0,0001). Questa figura è stata modificata con il permesso di Van Noord, R.A. et al. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . In vivo formazione immagine di ultrasuono di attecchimento del tumore e di crescita. Formazione immagine di ultrasuono monitorati in vivo la progressione del tumore. Vengono visualizzate immagini ecografiche e immagini di bioluminescenza corrispondenti a uno, due e otto settimane. Ad una settimana, attecchimento è stato visualizzato in entrambe le modalità di formazione immagine. Volume e area del tumore sono stati calcolati usando l'imaging ad ultrasuoni. Immagini di ecografia 3D con mirroring tumori asportati al completamento dello studio. Questa figura è stata modificata con il permesso di Van Noord, R.A. et al. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Localizzazione del rene murino e ultrasuono-guida l'impianto delle cellule di ES. (A) bioluminescenza è stato utilizzato per monitorare la crescita e la radianza del tumore. (B-C) Gli animali hanno sviluppato i tumori localmente dilaganti che distorto addominale strutture circostanti ed invaso nelle strutture locali quale il muscolo. Questa figura è stata modificata con il permesso di Van Noord, R.A. et al. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . L'istopatologia del tumore dei tumori xenotrapiantati NB ed ES. (A) NB dello xenotrapianto topi hanno avuti tumori primari localmente infiltrativi presso i siti di ghiandola adrenale e peri-adrenali, che distorto organi addominali adiacenti. (B) microscopicamente (20 X, bar = 50 µm), i tumori adrenali dello xenotrapianto ha mostrato le caratteristiche morfologiche costanti con NB umano (ammassi di scarsamente differenziano angolare a cellule rotonde), compreso formazione di pseudo occasionale Rosetta (freccia). Tessuto (C) del tumore ha mostrato forte tirosina idrossilasi (marcatore tumorale NB) immunoreactivity (40 X, bar = 40 µm; controllo positivo macchiatura mostrato nel pannello di sinistra; 1: 100). (D) ES dello xenotrapianto tumore ha avuto caratteristiche istologiche costanti con ES infiltrativo (40 X, bar = 40 µm), grappoli di angolare per arrotondare le cellule epitelioidi separate da uno stroma vascolare bene fibro, cancellando e comprimendo il rene normale adiacente (freccia; compresso resti del parenchima renale). (E) tessuto del tumore ES ha mostrato il immunoreactivity membrana forte per il marcatore tumorale ES CD99 (40 X, bar = 40 µm; controllo positivo macchiatura mostrato nel pannello di sinistra; 1: 100). Questa figura è stata modificata con il permesso di Van Noord, R.A. et al. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 . Le metastasi distanti sviluppato negli xenotrapianti stabiliti dalla tecnica di iniezione ultrasuono-guida. (A) bioluminescenza imaging mostrando il tumore primario NB presso lo spazio di ghiandola surrenale e fuochi metastatici rilevati all'osso corticale. (B) al microscopio analisi ha dimostrato un tumore metastatico (freccia) cancellando la cavità midollare e corticale dell'osso del femore prossimale (4x, bar = 400 µm). (C) immunoreactivity citoplasmico di tirosina idrossilasi del sito metastatico dell'osso corticale NB (40 X, bar = 40 µm). (D) microscopia del paziente-derivato orthotopic xenograft (UMNBL002) con una metastasi epatica (freccia) all'interno di una vena epatica (punta di freccia dimostra le cellule endoteliali) e infiltrazione del parenchima del fegato adiacente (L) (20 X, bar = 50 µm). (E) metastasi micro neuroblastoma (freccia) all'interno del parenchima polmonare (40 X, bar = 40 µm). Questa figura è stata modificata con il permesso di Van Noord, R.A. et al. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Ultrasuono-guida l'impianto delle cellule NB ed ES è un metodo efficace e sicuro per stabilire gli xenotrapianti murini affidabili per studi preclinici nella biologia del cancro. Fondamentale per il successo di ultrasuono-guida del tessuto-mirati l'impianto è la presenza e la disponibilità di personale qualificato con esperienza nella localizzazione anatomica dell'organo di interesse e nella iniezione stereotactic delle cellule del tumore.
La dissociazione del tessuto del tumore si è rivelata un passo cruciale nello sviluppo del modello di xenotrapianto derivata paziente descritto. Tessuto nativo del tumore comprende un microambiente cellulare e stroma circostante che può influenzare l'assorbimento del tumore o l'attecchimento. Conteggi delle cellule, dopo il processo di dissociazione è stato completato, un misuratore di densità cellulare nel campione, dotato di 2 x 105 cellule/10 μL considerato un conteggio cellulare ottimale per l'impianto e attecchimento di successo del tumore.
Luciferasi tagging delle cellule ha permesso per la validazione di attecchimento del tumore e monitoraggio della crescita del tumore misurando il segnale di bioluminescenza, con 106 -108 essendo considerato indicativo di tumore assorbimento9. Per garantire il successo trasduzione, l'attività luciferasica è stata confermata in vitro prima dell'iniezione delle cellule. Questo è stato fatto dall'immunofluorescenza, kit di saggio di luciferasi e anche esaminando le cellule per segnale di bioluminescenza. Le impostazioni utilizzate per misurare la bioluminescenza erano tenute costante, fornendo dati coerenti durante le misurazioni settimanali.
Ex vivo l'analisi istopatologica dei tumori ha confermato il tipo di cella e la morfologia dei tumori risultanti con colorazione specifica per gli indicatori della proteina. L'analisi istopatologica ha confermato attecchimento del tumore e metastasi dimostrato dall'ecografia e imaging bioluminescenti.
Vantaggi dell'ultrasuono-guida cellulare impianto comprendono la sua natura non invasiva, tempo di recupero minimo animale e crescente successo nella creazione di diversi modelli di successo dello xenotrapianto. Formazione immagine di ultrasuono fornisce inoltre un metodo affidabile per monitorare in vivo del tumore tumore e progressione volumi. In questi modelli preclinici, tumori progredito alla malattia localmente dilagante con la metastasi in 5 settimane. Limitazioni includono la disponibilità della tecnologia di imaging ad alta risoluzione e la capacità di localizzare costantemente l'organo bersaglio. Disponibilità di personale con esperienza in formazione immagine di ultrasuono dell'organo di interesse sono componenti critici di questa tecnica.
La disponibilità di formazione immagine di ultrasuono ad alta definizione è notevolmente aumentato nell'ultimo decennio e suo uso continua ad espandersi non solo nella pratica clinica, ma anche nella ricerca di laboratorio. L'utilizzo degli ultrasuoni per lo sviluppo della moderni xenotrapianti murini è un'applicazione promettente, con potenziale per promuovere modelli di ricerca preclinica per scoperta della droga di cancro.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcuna informazioni integrative.
Acknowledgments
Questo lavoro ha ricevuto sostegno da Robert Wood Johnson Foundation/Amos medica sviluppo programma, Taubman ricerca docenti e la sezione di chirurgia pediatrica, The University of Michigan. Gli autori desiderano ringraziare Kimber Converso-Baran e Dr. Marcus Jarboe per l'assistenza con procedure di iniezione ultrasuono e la piattaforma di imaging. Ringraziamo Paul Trombley per la sua assistenza con grafica di figura. Ringraziamo anche il reparto di radiologia presso l'Università del Michigan per l'uso del centro per l'Imaging molecolare e il nucleo di Imaging del tumore, che sono in parte supportata da NIH di centro completo del cancro, concedere P30 CA046592. L'Università del Michigan fisiologia Phenotyping Core che è in parte sostenuto da finanziamenti provenienti dal NIH (OD016502) e il centro cardiovascolare Frankel. L'autenticazione di linea cellulare è stato fatto a IDEXX Rica Bioresearch strutture, Columbia, MO. Ringraziamo Tammy Stoll, Dr. Rajen Mody e il programma di oncologia tumore solido Mott. Nostri pazienti e le famiglie con gratitudine sono riconosciute per la loro ispirazione, il coraggio e il supporto continuo della nostra ricerca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| NOD-SCID | Charles River | 394 | |
| NSG | The Jackson Laboratory | 5557 | |
| Cell Line | |||
| NB | |||
| IMR-32 | ATCC | CCL-127 | Established human neuroblastoma cell line |
| SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | Established human neuroblastoma cell line |
| SK-N-Be2 | ATCC | CRL-2271 | Established human neuroblastoma cell line |
| ES | |||
| TC32 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A673 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| CHLA-25 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A4573 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| Cell Line media | |||
| RPMI | Life Technologies | 11875-093 | |
| Matrigel | BD BioSciences | 354234 | |
| Dissociation | |||
| Dissection Tools | KentScientific | INSMOUSEKIT | |
| Human Tumor Dissociation Kit | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| Luciferase Tagging | |||
| Lenti-GFP1 virus | University of Michigan, Vector Core | Luciferase Virus | |
| Steady Glo-Luciferase Assay Kit | Promega | E2510 | |
| Bioluminescence Imaging | |||
| Ivis Spectrum Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| D-Luciferin | Promega | E160X | |
| Anesthetic | |||
| Inhaled Isoflurane | Piramal Critical Care Inc | 66794-0017-25 | |
| Ultrasound Guided Injection | |||
| Vevo 2100 High Resolution Imaging | Vevo | 2100 | |
| Hamilton Syringes (27 gauge needle) | Hamilton | 80000 | |
| 22 Gauge Angiocatheter | BD Biosciences | 381423 | |
| Optical ointment | Major Pharmaceuticals | 301909 | |
| Nair | Church & Dwight Co | Hair Removal agent | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel | Parker | Ultrasound gel | |
| Histology | |||
| CD99 | DAKO | M3601 | Primary Antibody |
| Tyrosine Hydroxylase | Sigma-Aldrich | T2928 | Primary Antibody |
| Secondary HRP-Polymer antibody | Biocare | BRR4056KG | |
| Miscelleneous | |||
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| P1000 pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| P200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| P1000 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375E | |
| P200 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Portable pipette aid | Drummond | 4-000-101 | |
| digital animal Weighing Scale | KentScientific | SCL-1015 | |
| Calipers | Fisher Scientific | 06-664-16 | |
| 6well low attachment plates | Corning | 07-200-601 | |
| 10 cm Tissue Culture Treated Dishes | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G |
References
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