Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att använda ultraljud-guidad injektion av neuroblastom (NB) och Ewings sarkom (ES) celler (etablerade cellinjer och patientderiverade tumörceller) på biologiskt relevanta platser för att skapa tillförlitliga prekliniska modeller för cancer forskning.
Abstract
Preklinisk testning av cancerbehandling bygger på relevanta xenograft-modeller som efterliknar de medfödda tendenserna av cancer. Fördelarna med standard subkutan flanken modeller inkluderar processuella lätthet och förmågan att övervaka tumör progression och svar utan invasiv imaging. Sådana modeller är ofta inkonsekvent i translationell kliniska prövningar och har begränsade biologiskt relevanta egenskaper med låg benägenhet att producera metastaser, som det finns en brist på en native mikromiljö. I jämförelse, har ortotop xenograft-modeller på infödda tumör platser visat att efterlikna den tumör närmiljön och replikera viktig sjukdomsegenskaper såsom avlägsen metastasering. Dessa modeller kräver ofta tråkiga kirurgiska ingrepp med narkos-tid och återställning längre. För att åtgärda detta, har cancerforskare nyligen utnyttjat ultraljud-guidad injektionstekniker för att upprätta cancer xenograft-modeller för prekliniska experiment, vilket möjliggör snabb och pålitlig inrättandet av vävnad-regisserad murina modeller. Ultraljud visualisering ger också en icke-invasiv metod för längsgående bedömning av tumör engraftment och tillväxt. Här, beskriver vi metoden för ultraljud-guidad injektion av cancerceller, utnyttja binjuren för NB och nedsatt sub capsule för ES. Detta minimalinvasiv tillvägagångssätt övervinner tråkiga öppen kirurgi implantation av cancerceller i vävnaden-specifika platser för tillväxt och metastas och avtar morbid återhämtningsperioder. Vi beskriver användningen av både etablerade cellinjer och patientens härledda cellinjer ortotop injektionsvätska. Färdiga kommersiella kit finns för tumör dissociation och luciferas taggning av celler. Injektion av cellsuspensionen med bild-vägledning ger en minimalt invasiv och reproducerbara plattform för skapandet av prekliniska modeller. Denna metod används för att skapa tillförlitliga prekliniska modeller för andra cancerformer som urinblåsa, lever och bukspottkörtel exemplifierar dess outnyttjad potential för många cancer modeller.
Introduction
Djur xenograft-modeller är viktiga verktyg för prekliniska studier av romanen cancerbehandling. Standard murina xenograft åberopa subkutan flanken implantation av celler, som ger en effektiv och lättillgänglig plats för övervakning tumörtillväxt. Nackdelen med subkutan modeller är deras brist på tumör-specifika biologiska egenskaper, vilket kan begränsa deras potential att metastasera1. Sådana begränsningar är övervinnas genom användning av ortotop xenograft i vilken tumör celler är rekonstituerades på infödda vävnad webbplatser, som ger en relevant närmiljön med metastatisk potential2. Ortotop xenograft-modeller behålla ursprungliga biologiska funktioner och ge tillförlitliga modeller för prekliniska drug discovery3,4. Cancercellerna utnyttjas för vävnad-regisserad implantation är antingen etablerade cellinjer eller patientderiverade celler från patientens tumörer. Xenograft etablerat från cancer cellinjer kan uppvisa höga genetiska skillnader från den primära tumören jämfört med patientens härledda xenograft5. Mot denna bakgrund har inrättandet av patientderiverade ortotop xenograft blivit rekommenderad standard för testning roman therapeutics i cancer drug discovery.
I den pediatric cancer neuroblastom (NB), ortotop xenograft-modeller recapitulate primärtumör biologi och utveckla metastaser till typiska platser av NB sprida6,7. NB utvecklar i binjuren eller längs kedjan paravertebral sympatisk. De vanligaste metoderna för ortotop implantation kräver öppen trans-buk kirurgiska ingrepp. Dessa metoder är ofta tråkiga, har hög djur sjuklighet och komplexa återhämtningsperioder. Högupplösta ultraljud har använts nyligen för vävnad-regisserad implantation av tumörceller i utvecklingen av flera murina modeller för cancer forskning8,9. Tekniken är pålitlig, reproducerbar, effektiv och säker för etableringen av relevanta metastaserande tumör xenograft10,11.
Inrättandet av pediatric cancer xenograft av ultraljud-styrda målet orgel lokalisering och nål implantationen av cellinjer och patientderiverade tumörceller är visat11. Tekniken utnyttjades för NB riktade mot murina binjuren. Ewings sarkom (ES) är huvudsakligen en bendefekter cancer, vanliga i långa ben såsom lårben och bäcken bena12. Fallrapporter har visat att för att avgöra om tillväxten av en huvudsakligen bendefekter cancer är genomförbart i nedsatt vävnad, en nedsatt sub kapsulära plats valdes för ortotop implantation13. Nedsatt sub kapsulära cell implantation av tumörceller har använts som en lovande modell för att studera spontana metastaser för ES14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Allt arbete utfördes i enlighet med The University of Michigan institutionella Review Board (HUM 00052430) och överensstämmer med metoder som godkänts av universitet utskottet för användning och skötsel av djur (UCUCA). Enheten för laboratorium av djur medicin (ULAM) övervakade djurvård.
Allt arbete var klar med godkännande från The University of Michigan institutionella Review Board (HUM 00052430) och överensstämmer med alla mänskliga forsknings etiska kommittén förordningar. Mänskliga celler anses vara ett biologiskt riskmaterial, så följer alla försiktighetsmått och lämpliga biosäkerhet praxis som krävs av din institution. NSG möss är allvarligt immunsupprimerade och mottagliga för sjukdomen orsakas av bakterier som vanligtvis hittas i miljön.
Använd alltid strikt steril teknik när du förbereder material för implantation och utföra injektioner.
1. cell kultur
- Växa etablerade mänskliga NB cellinjer (SH-SY5Y, SK-N-BE2 och IMR32) i minimal viktigt medium, kompletterad med 10% fetalt bovint serum, 2 mM glutamin, 100 enheter/mL penicillin och 100 μg/mL streptomycin. Komplettera IMR32 celler ytterligare med 1 mM pyruvat och 0,075% NaHCO3. Behålla alla celler vid 37 ° C, 5% CO2 och 70-80% sammanflödet.
- Odla mänskliga ES cellinjer (TC32, A673, CHLA-25 och A4573) i RPMI medium kompletteras med 10% fetalt bovint serum och 6 mM L-glutamin. Behålla alla celler vid 37 ° C, 5% CO2 på 70-80% confluence.
- Skicka alla cellinjer för autentisering.
Obs: Cell autentisering görs en utanför anläggningen, se bekräftelser.
2. beredning av primära patientderiverade tumörceller
- Med patientens samtycke och samtycke kasserad skörd mänskliga NB tumörvävnad från patienter som genomgår kirurgisk resektion för lokal kontroll och transport till laboratoriet i vävnad lagringslösning för bevarande.
Obs: Alla patientprover är avidentifierat och hanteras i enlighet med riktlinjer för institutionella Review Board. - Generera en enda patientderiverade cancer cellsuspension (UMNBL001, UMNBL002) från tumörvävnad med en tumör dissociation kit. Överföra cirka 0,5 g tumör till en 100 mm cell kultur maträtt innehållande 5 mL RPMI buffert, 200 µL av enzymet H, 100 µL av enzymet R och 25 µL av enzym A från mänskliga tumör dissociation kit.
- Finhacka tumören i små bitar (2-4 mm varje) med sax och pincett vävnad. Blanda dessa fragment med lösningarna i steg 2.2.
- Pipettera tumör blandningen i en dissociator tub och stänga röret. Vänd röret och fäster på ärmen av den vävnad dissociator. Kör på programmet h_tumor_01.
- Inkubera tumör cellsuspensionen erhållits ovan vid 37 ° C för 1 h på en roterande rack med intermittent trituration var 15 minut.
- Överföra cellsuspensionen till en ny 50 mL koniska tub och tillsätt 10 mL av RPMI. Centrifugera cellsuspension vid 314 x g i 5 min.
- Avlägsna supernatanten och centrifugerade i 5 mL RPMI. Passera denna lösning genom en 40 µm cell sil och samla ansträngda lösningen till en färsk 50 mL koniska rör. Tvätta här silen en gång med 5 mL RPMI media och centrifugera blandningen vid 314 x g i 5 min till samla en pellet.
- Mäta cell densiteten med hjälp av en hemacytometer15. Centrifugerade erhållits från ovan i RPMI att erhålla en slutlig koncentration på 4 × 105 celler/10 µL. Ta 5 µL av denna cellsuspension och 5 µL av matrigel att göra 10 µL cell lösning för varje injektion.
Obs: RPMI används beror på cell densiteten mätning. Till exempel om uppmätta cell densiteten av den erhållna pelleten är 4 x 105 celler, centrifugerade i 10 µL RPMI.
3. luciferas taggning av cancerceller
- Fyll 10 mL transduktion medier med 5 mL av viral supernatant EF1a-Luc2-IRES-mCherry och 5 mL stamceller media. Tillsätt 7,5 µL av 1 x polybrene.
- Blanda 5 × 106 cancerceller i transduktion media och tallrik i 100 mm ultra-låg attachment plate. Inkubera över natten vid 37 ° C och 5% CO2 .
Obs: Låg bifogade plattor används, celler inte fäster på plattan. - Efter 24 h, ta med 100 mm plattan som innehåller celler under vävnadsodling huva och överför blandningen in i en 15 mL koniska rör. Centrifugera cellsuspension vid 314 x g i 5 min att få cellpelleten. Tvätta cellpelleten och en gång med 1 mL 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och centrifugerade cell i 1 mL HBSS som innehåller 1% fetalt bovint serum (FBS).
- Sortera luciferas celler baserat på GFP-positiv signal på fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) analys. Plate sorterade cellerna på 100 mm vävnadsodling behandlas skålen och underhålla på 70-80% sammanflödet, 37 ° C och 5% CO2 tills krävs.
- Bekräfta luciferas signal med luciferas assay kit. Platta 10 x 104 sorterade celler per brunn i en illuminometer kompatibel 96 väl plattan och inkubera cellerna över natten vid 37 ° C och 5% CO2. Efter 24 h, 96 väl plattan till rumstemperatur och tillsätt Steady-Glo reagens odlade medier i brunnar i förhållandet 1:1. Tillåta celler att lysera för 5 min och läsa luminiscens i spektrofotometer.
- Få 100 mm skålen under en vävnadskultur huva. Kassera supernatanten media. Tvätta cellerna en gång med 2 mL 1 x PBS.
- Tillsätt 2 mL av 0,25% trypsin och återgå 100 mm skålen till inkubatorn för 2-3 min. Efter 2-3 min, kontrollera om rubbas celler under mikroskop och tillsätt 8 mL RPMI att avaktivera trypsin.
- Samla cellsuspensionen i en 15 mL koniska rör och centrifugera vid 314 x g i 5 min att få en pellet. Kassera supernatanten. Tvätta cellpelleten med 1 mL 1 x PBS, centrifugerade i 5 mL RPMI och bestämma cell densiteten med hjälp av en hemacytometer15. Centrifugera yhe återstående cell lösning vid 314 x g i 5 min att få en pellet.
- Centrifugerade i RPMI att få en koncentration av 4 x 105 celler/10 µL. Ta 5 µL cellsuspension och 5 µL av matrigel att göra 10 µL cell lösning för varje injektion.
4. ultraljud guidade binjuren (NB) eller nedsatt Sub kapsel (ES) Implantation
Obs: Alla ultraljud procedurer utförs med hjälp av en hög upplösning i vivo imaging system. För beskrivs förfarandena användes givaren, som har en center frekvens av 40 MHz och en bandbredd på 22-55 MHz.
- Utnyttja 6-8-vecka-gammal immun-brist NSG möss för alla förfaranden som injektion.
- Chill på matrigel och autoklaveras Hamilton sprutor med en 27G nål (1,25 ”), och 22G katetrar (0,9 mm ytterdiameter, 25 mm längd) under natten vid 4 ° C.
- Placera den cell lösning som beretts i steg 3 på is.
- Söva mössen i en induktion kammare med 2% isofluran i O2 levereras på 2 L/min.
Obs: Adekvat anestesi bestäms med bristen på aktiv rörelse och underhåll av spontan andning. - När sövda, depilate ryggen och flanken av djuren använder hår borttagning lotion (till exempel Svensson) och en rakapparat.
- Överföra djuret till imaging-plattformen med buken sida ner, där näsan av djuret är placerat i en noskon och säkrade samtidigt andas in isofluran.
- Placera optisk salva i djurets ögon för att förhindra uttorkning. Tejpa med musen för att förhindra oavsiktlig rörelse.
- Identifiera murina lever, vena cava, mjälte, vänster njure och intilliggande vänstra binjuren använder ultraljud visualisering.
- Använd sterila handskar, mask och cap för personligt skydd och underhåll av sterila förhållanden. Under ultraljud-vägledning, försiktigt infoga en 22G kateter genom huden och tillbaka muskler direkt i den vänstra binjuren att ge en kanal för cellulära injektionen. Ta bort nålen och lämna katetern på plats.
- Lasten en kyld Hamilton spruta med en småkalibriga nål med 10 µL cell lösning, sedan vägleda sprutan stereotactically genom katetern placeras in i centrera av binjuren.
- Injicera cellerna i den riktade adrenal vävnaden. Lämna nålen på plats för 1-2 min till tillåta matrigel att ställa in. Ta långsamt bort nålen, följt av borttagning av katetern.
- Placera mössen tillbaka in i sin bur och säkerställa att musen återfår tillräcklig medvetande för att upprätthålla sternala koordinationsrubbning.
Obs: minimalt invasiva pågrund av denna teknik, inlägget procedursmärta är minimal, men fortfarande övervakas dagligen med möss hälso kontroller ”. bör följas med en mening:” om oväntade tecken på smärta eller ångest identifieras under kursen i ett experiment, rådgör med din institutionella veterinärmedicinska stödenhet för information angående smärtlindring eller övrig sjukvård.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av procedurerna som presenteras, var ultraljud-guidad implantering av NB celler i binjuren gjort i en dedikerad förfarande rum utrustat med ett uppvärmt operationsbord. Arm och fot pads placerades för övervakning av murina hjärtaktivitet (figur 1A). Djuret var sövda under isofluran använder näsan konen inandning. Använder en högupplöst ultraljudssond, identifierades den vänstra njuren med binjuren bara kraniala till njuren (figur 1B). Nålen var sedan avancerad i binjuren under direkt visualisering (figur 1 c). Under inledande utnyttjande av denna teknik användes en blandning av metylenblått färgämne och matrigel att bekräfta korrekt lokalisering av binjuren. Djuret offrades och framgången för förfarandet bekräftades på obduktion av visualisera metylenblått färgämne under binjuren kapseln (figur 1 d).
Veckovisa ultraljud och Mareld imaging var formerna används för att övervaka tumör engraftment och tillväxt takt. Mareld avbildning av regionen av intresse mättes som fotonerna/s/cm2/steridian (p/s/cm2/sr) med ett minimalt antal 106 till 108 vägledande av adekvat tumörens storlek för prekliniska experiment9 ( Figur 2). Analys med hjälp av t -test visade statistiskt signifikant ökning av Mareld noterades under åtta-veckors perioden (* p< 0,05; **p< 0,001; ***p< 0,0001). Ultraljudsundersökningar tillåtna noninvasiv mätning av tumör och volym. Detta tillsammans med Mareld mätning övervakas både tumör engraftment och progression (figur 3). Liknande procedurer utnyttjades för ES-celler injiceras i nedsatt sub kapseln (figur 4).
Brutto- och histologisk analys av resulterande tumörer karakteriseras den primära tumörer och metastaser vid obduktion. Vävnadsprover undersöktes för morphologic cellmönster och färgas för tumör-specifika protein markörer (figur 5, figur 6). Primärtumör engraftment för NB cellinjer (IMR32, SH-SY-5Y, SK-N-BE2, UMNBL001, UMNBL002) varierade från 62-100%, med skelettmetastaser ses i 0-100% av injicerad möss. De mest robusta metastaser sågs i SK-N-BE2 (33%) och UMNBL002 (100%). Metastaserande platser för NB var lymfkörtlar, lever, lunga och kortikala benet. Nedsatt sub kapsulära engraftment för ES cellinjer (A4573, A673, CHLA-25, TC-32) varierade mellan 60-100%, med skelettmetastaser ses i 0-40% av injicerad möss. Metastaserande platser undersöks för ES ingår lymfkörtlar, kortikal ben och lungor. Den mest robusta engraftment (100%) och metastaser (40%) sågs i TC-32 xenograft möss.
Figur 1 . Murina binjuren lokalisering och ultraljud-guidad NB cell implantation. (A) hög upplösning ultraljudsundersökningar av murina bukorganen tillåtna binjuren implantation av tumörceller. (B) vänster njure identifierades. (C) den vänstra binjuren är beläget intill den vänstra njuren som en hypoechoic (mörk) runt struktur. Nålen var avancerad i binjuren följt av cell injektion. (D) en blandning av matrigel och metylenblått färgämne användes för att bedöma riktigheten av injektion förfaranden. Representativa ex vivo bilden av den vänstra njuren och binjuren med matrigel och metylenblått färgämne på binjuren kapseln och peri-binjure utrymme. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Van Noord, R.A. et al. 11. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 . In vivo Mareld avbildning av tumör engraftment och tillväxt takt. (A) mänskliga NB adrenal xenograft övervakades under engraftment och tumörtillväxt under åtta veckor. (B) maximal Mareld signal fastställdes inom regionen av intresse. NB cellinjer (SH-SY5Y, IMR 32, SK-N-BE2) och patientderiverade celler (UMNBL001, UMNBL002) hade ökat utstrålning och tillväxt mönster över tid. Ökning av Mareld under åtta-veckors perioden var statistiskt signifikant (*p< 0,05; **p< 0,001; ***p< 0,0001). Denna siffra har modifierats med tillstånd från Van Noord, R.A. et al. 11. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 . In vivo ultraljudsundersökningar av tumör engraftment och tillväxt. Ultraljudsundersökningar övervakas i vivo tumör progression. Ultraljudsbilder och motsvarande Mareld bilder på ett, två och åtta veckor visas. På en vecka, var engraftment visualiserat i båda avbildningsmetoder. Tumör och volymen beräknades med hjälp av ultraljudsundersökningar. 3D ultraljudsbilder speglas exciderad tumörer vid slutförandet av studien. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Van Noord, R.A. et al. 11. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 . Murina njure lokalisering och ultraljud-guidad implantation av ES-celler. (A) Mareld användes för att övervaka tumör utstrålning och tillväxt. (B-C) Djur utvecklat lokalt invasiva tumörer som missuppfattat kring buken strukturer och invaderade in lokala strukturer såsom muskel. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Van Noord, R.A. et al. 11. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5 . Tumör histopatologi av NB och ES xenograft tumörer. (A) hade NB xenograft möss lokalt infiltrativ primära tumörer i binjuren och peri-adrenal körtel platser, som missuppfattat intilliggande bukorganen. (B) mikroskopiskt (20 X, bar = 50 µm), xenograft binjurarna tumörer visade morphologic funktioner överensstämmer med mänskliga NB (kluster av dåligt differentierade kantiga att runda celler), inklusive enstaka pseudo rosett bildande (pil). (C) tumörvävnad visade stark tyrosin hydroxylas (NB Tumormarkör) immunoreaktivitet (40 X, bar = 40 µm, positiv kontroll färgning visas i den vänstra panelen; 1: 100). (D) ES xenograft tumör hade histologisk funktioner överensstämmer med infiltrativ ES (40 X, bar = 40 µm), kluster av kantiga att runda epithelioid celler separerade med en fin fibro vaskulär stroma, utplåna och komprimera normala intilliggande njure (pil, komprimerad resterna av njure parenkymet). (E) ES tumörvävnad visade stark membran immunoreaktivitet för ES tumör markören CD99 (40 X, bar = 40 µm, positiv kontroll färgning visas i den vänstra panelen; 1: 100). Denna siffra har modifierats med tillstånd från Van Noord, R.A. et al. 11. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6 . Fjärrmetastaser utvecklats i xenograft som inrättats genom ultraljud-styrda injektionstekniken. (A) Mareld imaging visar den primära NB tumören på binjuren utrymme och metastaserande foci upptäckas vid kortikala benet. (B) Mikroskopisk analys visat en metastaserande tumör (pil) utplåna den märg hålighet och kortikala benet i proximala lårbenet (4 X, bar = 400 µm). (C) tyrosin hydroxylas cytoplasmiska immunoreaktivitet av kortikala benet NB metastaserande webbplatsen (40 X, bar = 40 µm). (D) mikroskopi av patientderiverade ortotop xenograft (UMNBL002) med en nedsatt metastaser (pilen) inom en nedsatt ven (pilspets visar endothelial celler), och infiltrerar intilliggande levern (L) parenkymet (20 X, bar = 50 µm). (E) neuroblastom micro metastaser (pilen) inom lungparenkym (40 X, bar = 40 µm). Denna siffra har modifierats med tillstånd från Van Noord, R.A. et al. 11. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ultraljud-guidad implantation av NB och ES-celler är en effektiv och säker metod för att fastställa tillförlitliga murina xenograft för prekliniska studier i cancerbiologi. Avgörande för framgången för ultraljud-guidad vävnad-riktade implantation är närvaro och tillgänglighet av utbildad personal med kompetens inom anatomiskt lokalisera organ av intresse och stereotaktisk injektion av tumörceller.
Dissociationen av tumörvävnad visade sig vara ett avgörande steg i att utveckla den beskrivna patientderiverade xenograft-modellen. Infödda tumörvävnad finns cellulära närmiljön och omgivande stroma som kan påverka tumör upptag eller engraftment. Blodkroppar, efter dissociation processen var fullständig, förutsatt en mätare av cellulära tätheten i urvalet, med 2 x 105 celler/10 μL anses vara en optimal celltal för implantation och framgångsrika tumör engraftment.
Luciferas taggning av celler tillåts för validering av tumör engraftment och övervakning av tumörtillväxt genom att mäta Mareld signal, med 106 108 anses vägledande av tumör upptag9. För att säkerställa framgångsrika transduktion, var luciferas aktivitet bekräftad i vitro före injektion av celler. Detta skedde genom immunofluorescens, luciferas assay kit, och också utreder cellerna för Mareld signal. Inställningar som används för att mäta Mareld hölls konstant, ger konsekventa data under veckovisa mätningar.
Ex vivo histopatologisk analys av tumörer bekräftade den celltyp och morfologi av resulterande tumörer med specifik färgning för protein markörer. Histopatologisk analys bekräftat tumör engraftment och metastaser påvisas genom ultraljud och självlysande imaging.
Fördelarna med ultraljud-guidad cellulära implantation är dess icke-invasiv natur, minimal djur återhämtningstid och växande framgång i etableringen av flera framgångsrika xenograft-modeller. Ultraljudsundersökningar ger också en tillförlitlig metod för att övervaka i vivo tumör progression och tumör volymer. I dessa prekliniska modeller utvecklats tumörer till lokalt invasiv sjukdom med metastaser inom 5 veckor. Begränsningar är tillgången på hög upplösning imaging teknik och förmågan att konsekvent lokalisera målorganet. Tillgången på personal med kompetens inom ultraljudsundersökningar av organ av intresse är kritiska komponenter i denna teknik.
Tillgängligheten av högupplösta ultraljudsundersökningar har ökat betydligt inom de senaste tio åren och dess användning fortsätter att expandera inte bara i klinisk praxis, men också i laboratorieforskning. Användningen av ultraljud för utvecklingen av moderna murina xenograft är en lovande program, med potential för att främja preklinisk forskningsmodeller för cancer läkemedelsutveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga upplysningar.
Acknowledgments
Detta arbete fick stöd från Robert Wood Johnson Foundation/Amos medicinska fakulteten Development Program, Taubman Research Institute, och det avsnitt av Barnkirurgi, The University of Michigan. Författarna vill tacka Kimber Converso-Baran och Dr Marcus Jarboe för hjälpen med ultraljud injektion förfaranden och imaging-plattformen. Vi vill tacka Paul Trombley för hans hjälp med figur grafik. Vi tackar också Institutionen för radiologi på The University of Michigan för användning av The Center för molekylär Imaging och tumör Imaging kärnan, som delvis stöds av omfattande Cancer Center NIH, bevilja P30 CA046592. University of Michigan fysiologi fenotypning Core som stöds delvis av bidragsfinansiering från NIH (OD016502) och Frankel Cardiovascular Center. Cell linje autentisering gjordes på IDEXX RADIL bioforskning faciliteter, Columbia, MO. Vi tackar Tammy Stoll, Dr Rajen Mody och Mott Solid tumör onkologi Program. Våra patienter och familjer är tacksamt erkänd för sin inspiration, mod och pågående stöd av vår forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| NOD-SCID | Charles River | 394 | |
| NSG | The Jackson Laboratory | 5557 | |
| Cell Line | |||
| NB | |||
| IMR-32 | ATCC | CCL-127 | Established human neuroblastoma cell line |
| SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | Established human neuroblastoma cell line |
| SK-N-Be2 | ATCC | CRL-2271 | Established human neuroblastoma cell line |
| ES | |||
| TC32 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A673 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| CHLA-25 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A4573 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| Cell Line media | |||
| RPMI | Life Technologies | 11875-093 | |
| Matrigel | BD BioSciences | 354234 | |
| Dissociation | |||
| Dissection Tools | KentScientific | INSMOUSEKIT | |
| Human Tumor Dissociation Kit | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| Luciferase Tagging | |||
| Lenti-GFP1 virus | University of Michigan, Vector Core | Luciferase Virus | |
| Steady Glo-Luciferase Assay Kit | Promega | E2510 | |
| Bioluminescence Imaging | |||
| Ivis Spectrum Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| D-Luciferin | Promega | E160X | |
| Anesthetic | |||
| Inhaled Isoflurane | Piramal Critical Care Inc | 66794-0017-25 | |
| Ultrasound Guided Injection | |||
| Vevo 2100 High Resolution Imaging | Vevo | 2100 | |
| Hamilton Syringes (27 gauge needle) | Hamilton | 80000 | |
| 22 Gauge Angiocatheter | BD Biosciences | 381423 | |
| Optical ointment | Major Pharmaceuticals | 301909 | |
| Nair | Church & Dwight Co | Hair Removal agent | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel | Parker | Ultrasound gel | |
| Histology | |||
| CD99 | DAKO | M3601 | Primary Antibody |
| Tyrosine Hydroxylase | Sigma-Aldrich | T2928 | Primary Antibody |
| Secondary HRP-Polymer antibody | Biocare | BRR4056KG | |
| Miscelleneous | |||
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| P1000 pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| P200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| P1000 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375E | |
| P200 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Portable pipette aid | Drummond | 4-000-101 | |
| digital animal Weighing Scale | KentScientific | SCL-1015 | |
| Calipers | Fisher Scientific | 06-664-16 | |
| 6well low attachment plates | Corning | 07-200-601 | |
| 10 cm Tissue Culture Treated Dishes | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G |
References
- Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Ann Oncol. 27 (7), 1190-1198 (2016).
- Fidler, I. J., Hart, I. R. Biological diversity in metastatic neoplasms: origins and implications. Science. 217 (4564), 998-1003 (1982).
- Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation. Eur J Cancer. 40 (6), 852-857 (2004).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic Models are Necessary to Predict Therapy of Transplantable Tumors in Mice. Cancer Metastasis Rev. 17 (3), 279-284 (1998).
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).
- Khanna, C., Jaboin, J. J., Drakos, E., Tsokos, M., Thiele, C. J. Biologically relevant orthotopic neuroblastoma xenograft models: Primary adrenal tumor growth and spontaneous distant metastasis. In Vivo. 16 (2), 77-85 (2002).
- Stewart, E., et al. Development and characterization of a human orthotopic neuroblastoma xenograft. Dev Biol. 407, 344-355 (2015).
- Jäger, W., et al. Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts. J. Vis. Exp. (84), e51123 (2014).
- Teitz, T., et al. Preclinical Models for Neuroblastoma: Establishing a Baseline for Treatment. PLoS ONE. 6 (4), e19133 (2011).
- Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts retain metastatic patterns and geno- and phenotypes of patient tumours. International Journal of Cancer. 136 (5), 252-261 (2015).
- Van Noord, R. A., et al. Tissue-directed Implantation Using Ultrasound Visualization for Development of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. In Vivo. 31 (5), 779-791 (2017).
- Vormoor, B., et al. Development of a Preclinical Orthotopic Xenograft Model of Ewing Sarcoma and Other Human Malignant Bone Disease Using Advanced In Vivo Imaging. PLoS ONE. 9 (1), e85128 (2014).
- Hakky, T. S., Gonzalvo, A. A., Lockhart, J. L., Rodriguez, A. R. Primary Ewing sarcoma of the kidney: a symptomatic presentation and review of the literature. Ther Adv Urol. 5 (3), 153-159 (2013).
- Cheng, H., Clarkson, P. W., Gao, D., Pacheco, M., Wang, Y., Nielsen, T. O. Therapeutic Antibodies Targeting CSF1 Impede Macrophage Recruitment in a Xenograft Model of Tenosynovial Giant Cell Tumor. Sarcoma. 2010, 174528 (2010).
- JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
