Summary
زرع البنكرياس جزيرة ليلى وسيلة لتحقيق نورموجليسيميا في مرض السكري من النوع 1. تركز هذه المقالة على تقنية زرع الأعضاء من خلال توجيه إينترابورتال للحفاظ على مستويات السكر العادي في الفئران السكري.
Abstract
زرع البنكرياس جزيرة ليلى للحد من ارتفاع السكر في الدم ناجحة للغاية في القوارض بالسكري المستحث كيميائيا. هو موقع الزرع الأكثر شيوعاً في جزيرة تجريبي زرع كبسولة الكلي. ومع ذلك، كما هو معروف أقل حول تفاعل جزيرات البنكرياس مع مكونات الدم، أيضا يجعل الشعور باستخدام نهج الوريد البابي في زرع جزيرة التجريبية.
هذا البروتوكول يوضح أسلوب زرع جزيرة إينترابورتال في الفئران عارية الرنين. يتم حقن بالستريبتوزوتوسين (180 مغ/كغ) إينترابيريتونيلي للحث على ارتفاع السكر في الدم في الفئران المستفيدة. أنها تعتبر كمرضى السكري على مستوى جلوكوز دم غير صيام أكبر من 20 ملمول/لتر. يوم واحد قبل الزرع، جزيرات البنكرياس الماوس يتم عزل من البنكرياس المانحين بالهضم كولاجيناز؛ وتستخدم كحد أدنى الجزر 350 كل مستلم السكري. اعتماداً على محصول عزلة جزيرة ليلى، تستخدم اثنين أو أكثر من الفئران المانحة كل مستلم. بعد الحصول على الثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، تدار الجزر الصغيرة في الكبد المستفيدة عن طريق الوريد البابي. بعد الجراحة، ومحمية في الحمراء Makrolon منازل الفئران ولاحظ حتى مستيقظا. يحتفظ هذا البروتوكول مراقبة نسبة السكر في الدم لمدة 120 يوما في الفئران سينجينيك و 15 يوما في الفئران متمكنة.
Introduction
زرع جزيرة ليلى نهج واعدة لعلاج النوع 1 السكري1. وكان يؤديها أول محاولة لتحويل جزء من البنكرياس الأغنام إلى مريض السكري "ويليامز واتسون" في عام 1893. ومع ذلك، تحقق إنجازا كبيرا في زرع جزيرة السريرية لبروتوكول إدمنتون، وبعد ذلك، كانت سلسلة من البرامج الوطنية للبلدان المتقدمة النمو2. في الماضي، تم استكشاف العديد من المواقع، مثل نخاع العظام والحقيبة أومينتال، المنطقة العضلي، وسطح المخاطية المعدة، الطحال، وكبسولة الكلي، في نماذج الإكلينيكية، ولكن النظام الوريدي المدخل يعتبر واحداً من موقع مناسب وفعال للبرامج السريرية3،4،،من56.
يمكن أن يكون محل الإدارة الخارجية للأنسولين بضخ جزيرة صغيرة في الوريد البابي. يعتبر هذا موقع مفضل لأن الإمداد بالأكسجين مماثلة لتلك في البنكرياس الأصلية نظراً لموقع مجرى النهر من التقاء مدخل الشريان والوريد. وعلاوة على ذلك، هناك مساحة كبيرة، حتى يمكن الحفاظ على هيكل ثلاثي الأبعاد للجزر، والأوعية الدموية يمكن أن تكون ميسرة5. ماوس السكري المتلقية أو شبه جزيرة الإنسان أو الخنزير 2,000 الماوس 350 الجزر الصغيرة كافية لعكس اتجاه7،الدولة هايبرجليسيميك8. كما أبلغ عن مستويات يوجليسيميك لمدة 15 يوما في طراز الماوس المستفيدة من الجزر إكسينوجينيك وفي طراز الماوس إلى ماوس متمكنة، وأكثر من 120 يوما في سينجينيك الماوس لزرع الأعضاء.
العوامل ذات الصلة بفعالية زرع الجزيرة عن طريق الوريد البابي هي مناسبة التخدير، أسلوب الثقب، والارقاء9. التخدير يمكن أن يكون الناجم عن استنشاق (5% إيسوفلوراني) أو حقن (الكيتامين أو إكسيلازيني أو بينتوباربيتال)، وغالباً ما يتم الجمع بين هذه المواد. للتحكم عمق ووقت التخدير، ينبغي إيلاء اهتمام دولة الماوس، مثل لون الغشاء المخاطي وغطاء العين، ومنعكس القرنية، ومعدل التنفس، ودرجة حرارة الجسم. من المهم التأكد من أن الحيوان لا تكافح وبقائها في العملية. يمكن الحفاظ درجة الحرارة بأجهزة التدفئة المختلفة، مثل منصات التدفئة، المصابيح الحمراء، وقد تم استخدام لوحة الحرارية الحارة إلخ A للحفاظ على درجة حرارة 25-30 درجة مئوية بين الماوس والجدول العملية، مما يمنع حدوث انخفاض درجة حرارة الجسم. جرعات المسكنات هامة، كما كل منهم يستقلبان في الكبد، وقد تكون وظيفة الكبد اضطرابه عابر بضخ تعليق جزيرة ليلى. النقطة ثقب مثالية الوريد البابي هو الموقف بين الوريد رافد الأولى والثانية.
العدد من الجزر الصغيرة، وحجم الحقن المقصود أيضا التأثير على نتيجة عملية الزرع، كوحدة تخزين مفرطة قد تزيد من إجهاد القص. وحدة تخزين 0.2 مل يعتبر مناسباً للزرع جزيرة صغيرة في الوريد البابي. •اجراء الجرح (26-قياس الإبرة) الحث على النزف من الوريد البابي، الذي يحتاج إلى وقفه بطريقة فعالة وفي الوقت المناسب. ويمكن تطبيق شاش معقم أو إصبع مع الحد الأدنى من الضغط في موقع البزل لحوالي 6 دقائق لوقف النزيف. الحقن المتخذة من جزيرة ليلى معا، المدخل الفعال وتنص اللائحة على مستويات الجلوكوز في الدم في نماذج الماوس السكري المستحث كيميائيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كافة الإجراءات في هذا البروتوكول أقرها قانون رعاية "الحيوان الألمانية" والمبادئ التوجيهية. النظر في استخدام 10-12 أسبوع الرنين عارية الفئران والفئران C57Bl/6 (المانحة: أنثى القديمة؛ والمتلقي: الذكور) في جميع أنحاء هذه التجارب. استخدام الفئران عارية الرنين لعزله جزيرة ليلى. الحفاظ على الفئران تحت شروط محددة وفقا للوائح مرفق الحيوانات المحلية.
1-تنظيم دورات تعريفية لمرض السكري من بالستريبتوزوتوسين
- في يوم-4، قياس أوزان الجسم من 10 إلى 12 أسبوع من العمر الرنين عارية الفئران والفئران C57Bl/6 استخدام آلة وزنها.
- استناداً إلى وزن الجسم المقاسة، إعداد جرعة 180 مغ/كغ من بالستريبتوزوتوسين في 0.1 مل من المحلول الملحي للماوس.
ملاحظة: بالستريبتوزوتوسين ينبغي طازجة أعد قبل الاستخدام ومغطاة برقائق الألومنيوم، كما أنها حساسة للضوء. - حقن الفئران سينجينيك ومتمكنة كل إينترابيريتونيلي باستخدام إبرة 26-ز بجرعة وحيدة من 0.1 مل بالستريبتوزوتوسين (180 مغ/كغ).
- اليوم-3، جمع-2 و-1 2-4 ميليلتر من الدم من خلال ثقب الأوردة ذيل الفئران غير صامت.
- استخدام 2-4 ميليلتر من عينة الدم كل شريط الاختبار لقياس نسبة الجلوكوز في الدم في الفئران عارية الرنين والفئران C57Bl/6
ملاحظة: عند هذه النقطة، 80% الفئران ينبغي أن يصبح السكري (20 ملمول/لتر).- استخدام الفئران لزرع جزيرة ليلى عندما تصل مستويات جلوكوز الدم إلى 20 ملمول/لتر.
2-عزل جزيرات البنكرياس من الفئران
- تخدير الفئران مع الكيتامين (100 مغ/كغ من وزن الجسم) وإكسيلازيني (20 مغ/كغ من وزن الجسم) عن طريق الحقن داخل مع إبرة 26-ز.
ملاحظة: تم تحديد وحدات التخزين من الكيتامين وإكسيلازيني وفقا لاوزان الجسم من الحيوانات (0.10 مل/10 غرام). - تبقى الفئران في موقف ضعيف وتعقيمها بمحلول بوفيدون. تأكيد القتل الرحيم السليم عن طريق فحص دواسة المعاكسة.
ملاحظة: في حالة C57Bl/6 حلق منطقة البطن. - عقد الجلد مع الملقط الجميلة وجعل شق خط الوسط مع مقص لفضح تجويف البطن. ضع مكان الأمعاء إلى اليسار وخارج تجويف البطن في ضغط شاش معقم.
- ضبط المعدة في اتجاه آخر لتحديد موقع البنكرياس وغيرها المرتبطة الأنسجة.
- الوصول إلى الشريان الاورطي وجعل قطع صغيرة نزيف الدم. استخدام شاش معقم لامتصاص الدم.
- بعناية إزالة الأمعاء. فصل البنكرياس من المعدة والطحال.
- المكوس البنكرياس ووضعه في طبق بتري طازجة. قم بإزالة جميع المواد غير المرغوب فيها، مثل الدهون، واستخدام الملقط.
- ملء حقنه 5 مل مع 4 مل كولاجيناز والبنكرياس بحقن بإبرة 26-ز (الأسهم الحل: 30 ملغ كولاجيناز في 12 مل من محلول هانك في).
- فرم البنكرياس مع مقص لزيادة المساحة السطحية لتحسين الهضم ونقل إلى أنبوب كاب أحمر 12 مل.
ملاحظة: هانك متوازنة الحل الملح: حبس 10 × (100 مل)، المقطر البنسلين-ستربتوميسين (10 مل)، مع الجنتامايسين (1 مل)، سيبروفلوكساسين (10 مل)، حبيس (35 مل)، ح2س (900 مل) - أداء هضم لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي تهتز. دوامة العينة ثلاث مرات على فترات منتظمة لمدة 15 ثانية.
- مزيج البنكرياس هضمها بقوة باليد لمدة 3 دقائق ووضعه على الجليد لمدة 10 ق.
- إضافة 6 مل من محلول الباردة هانك التوقف عن رد فعل الهضم وأجهزة الطرد المركزي في 560 x ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة المادة طافية وحل بيليه في 10 مل من العجل باركر/الجنين المصل (P/FCS) المتوسطة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: P/FCS المتوسطة: الطب الصيني التقليدي-199 10 × (100 مل)، المقطر FCS (50 مل)، البنسلين-ستربتوميسين (10 مل)، حبيس (20 مل)، ح2س (900 مل) - تحديد الجزر استناداً على مورفولوجيا (كروي، اللون الذهبي والبنى) تحت مجهر خفيفة. تجنب الجزر الصغيرة مع مراكز الظلام. البحث عن النقاء والبقاء بأداء ديثيزوني تلطيخ تحت مجهر خفيفة.
ملاحظة: ديثيزوني بربط أيون الزنك ويوفر حمراء اللون وصمة عار للجزر. - استخدام ماصة 1 مل لعد و handpick الجزر تحت مجهر خفيفة ونقلها إلى طبق بتري طازجة (60 ملم × 15 ملم) التي تحتوي على 4 مل ف/FCS متوسطة.
ملاحظة: الحجم ف/FCS المتوسطة في طبق بتري لا ينبغي أن تتجاوز 4 مل من أجل ضمان توافر الأكسجين. - الحفاظ الجزر الصغيرة المعزولة في 4 مل ف/FCS متوسطة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة.
3-إعداد الحيوانات لزرع جزيرة ليلى
- إزالة الجزر المنعزلة من حاضنة 37 درجة مئوية ووضعها تحت مقعد في تدفق. مركز الجزر بحركة دائرية يتأرجح طبق بيتري.
- ملء 1 مل حقنه (إبرة 23-ز الأزرق) مع 0.1 مل متوسطة ف/FCS. ثم أضف الجزر 350 في 0.3 مل من محلول هانك. الاحتفاظ حقنه في وضع عمودي للسماح للجزر الصغيرة تسوية.
- إنقاص حجم الصوت إلى 0.05 مل واستبدال الإبرة 23-ز الأزرق بإبرة 26-ز بني. لنفس المحاقن، إضافة 0.15 مل فيكل (الكثافة المتوسطة الانحدار) إلى أعلى للوصول إلى وحدة تخزين نهائي لمل 0.2 في المحاقن. تجنب فقاعات الهواء.
- الاحتفاظ حقنه في وضع عمودي وتناوب عليه قليلاً لتجنب التثاقل من الجزر الصغيرة. سوف تستقر الجزر الصغيرة في المخروط لحقنه داخل 2-3 دقيقة.
- قياس الجسم الوزن والدم مستويات الجلوكوز الفئران المستفيدة؛ يجب أن تكون مستويات السكر في الدم حوالي 20 ملمول/لتر.
- تخدير الفئران مع الكيتامين (100 مغ/كغ من وزن الجسم) وإكسيلازيني (20 مغ/كغ من وزن الجسم) عن طريق الحقن داخل مع إبرة 26-ز.
- وضع الفئران في موقف ضعيف على لوحة حرارية حارة (37 درجة مئوية). تحقق من عمق التخدير معسر إصبع القدم.
- تنظيف منطقة البطن بمحلول بوفيدون (مطهر الجلد). لمنع العيون من التجفيف، الاحتفاظ بها رطبة مع مرهم العين.
ملاحظة: في حالة C57Bl/6 حلق منطقة البطن.
4-جزيرة زرع طريق إينترابورتال
- في اليوم 0، تبدأ فتح البطن بعقد الجلد بالملقط وصنع سم 2-3-شق خط الوسط طويلة مع مقص. ضغط المكان شاش رطب عقيمة حول حواف الجرح للحفاظ على رطوبة.
- ضع مكان الأمعاء إلى اليسار وخارج تجويف البطن في ضغط شاش معقم.
ملاحظة: إبقاء الأمعاء رطبة طوال فترة الإجراءات مع محلول كلوريد الصوديوم 0.9% المعالجون مسبقاً أو شاش معقم انخفض في المحلول الملحي العادي. - نقل العفج وتحديد موقع البنكرياس. قم بتحديد موقع الوريد البابي موجودة في موقع البطني عن طريق دفع البنكرياس إلى الأعلى. استخدام الإصبع والإبهام لفضح الوريد البابي، وعندما يتعرض، ثقب قرب الكبد.
- داخل 1 دقيقة، حقن ببطء واطراد الجزيرات (0.2 مل من الخطوة 3، 4) في الوريد البابي تحت تفتيش مكبرة لتجنب أي تسرب للجزر الصغيرة.
ملاحظة: بعد الحقن، دائماً التحقق من الجزر الصغيرة المتبقية في المحاقن. أخذ 1 مل ف/FCS وسائط الإعلام في حقنه، تدفق إلى طبق بتري الطازجة والعد تحت مجهر. - وضع مقياس عقيمة في موقع الثقب والضغط بالسبابة (عمق الاختراق: 0.5-1 سم) لمدة 6 دقائق وقف النزيف.
ملاحظة: يجب أن لا يتجاوز حجم حقن 0.2 مل. الصوت والضغط المفرط يمكن أن تلحق الضرر الجزر بسبب إجهاد القص. - بعناية بوضع مكان الأمعاء، والصفاق والعضلات البطن طبقة اللفافة إلى موقف.
- استخدام الملقط، رفع الجلد، وإغلاق شق العضلات مع خياطة الحرير قابلة للامتصاص، وطبقة الجلد العليا مع مقاطع 2-3.
- تنظيف السطح مع مطهر الجلد وتطبيق المداوي جرح ووضع الفئران في أقفاص فردية. الجرح المداوي يوفر طبقة أكريلاتي للماء وحماية من تعطن والعدوى الثانوية.
ملاحظة: مراقبة الفئران حتى قد وعيه كافية، وتوفير ترامادول (0.2 ملغ في الماوس) جنبا إلى جنب مع السوائل. في هذا البروتوكول، الفئران المستردة من التخدير بسرعة وتخفيض الإدارة ترامادول الألم. بعد 7 أيام، وينبغي أن التئام الجرح. - تغذية الفئران بالماء والطعام العادية. سيتم زيادة إفراز البول واستهلاك الأغذية والمياه بعد حقن بالستريبتوزوتوسين.
- قياس مستويات السكر في الدم كل يوم الأسبوع الأول وبعد ذلك مرة واحدة في الأسبوع في الفئران سينجينيك. في الفئران متمكنة، قياس مستويات الجلوكوز في الدم ثلاث مرات في أسبوع لمدة تصل إلى 15 يوما.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ودرس الكفاءات الجزيرات المزروعة في الفئران السكري المستحث كيميائيا. تم زرع الجزر عبر نظام وريدي المدخل في نموذج الفئران السكري. كانت بين المانح والمتلقي نسبة 2:1. في طراز الماوس سينجينيك، استخدمت اثنين من الفئران الجهات المانحة للحصول على 350 من الجزر الصغيرة. ثم تم زرعها في الجزر الصغيرة في الفئران السكري. لوحظ انخفاض في مستوى السكر في الدم في يوم 1 بعد الزرع، مما يشير إلى دور لزرع جزيرات البنكرياس في تخفيض مستوى السكر في الدم. بالستريبتوزوتوسين زيادة مستوى السكر في الدم تصل إلى حوالي 22 ملمول/لتر. لوحظ انخفاض في مستوى السكر في الدم إلى 4.6 mmol/لتر (اليوم الأول) بعد زرع جزيرة ليلى (الشكل 1A). وأبقى نورموجليسيميا ليصل إلى 121 يوما، كما هو مبين في الشكل 1 ألف. مستوى الجلوكوز الوزن والدم في الجسم تقريبا يتبع نفس النمط. وبعد حقن بالستريبتوزوتوسين والجراحة، انخفض وزن الجسم. من اليوم فصاعدا 2، أنها تميل إلى الارتفاع نحو عادي، من 25.3 ز (يوم 4) إلى 29.7 ز (121 يوم)، كما هو مبين في الشكل 1 باء.
في حالة هيستوكومباتيبيليتي الرئيسية (MHC) غير متطابقة الفئران، الجزر 350 من اثنين من الفئران C57Bl/6 (H2د) تم زرعها في السكري بالب/c (H2ب) الفئران. بعد الحقن بالستريبتوزوتوسين، زيادة جلوكوز الدم يصل إلى 26.6 mmol/l. بعد زرع جزيرة ليلى، انخفض مستوى السكر في الدم إلى 4.4 mmol/لتر (اليوم 1؛ الشكل 2 (أ)). ولوحظ نورموجليسيميا (4.44 إلى 7.2 مليمول/لتر) لمدة تصل إلى 10 أيام، ولكن ليس بعد 15 يوما (20.1 ملمول/لتر). وزن الجسم السكري الفئران انخفضت من 26 ز (اليوم-3) إلى 23 ز (يوم 0) وإلحاقا 21.5 ز (اليوم الأول). بعد زرع الأعضاء، استعادة وزن الجسم تدريجيا من ز 23 (اليوم 2) إلى 25 جرام (يوم 10). سبب MHC-عدم تطابق، زيادة مستوى السكر في الدم وانخفاض وزن الجسم 10 أيام بعد زرع جزيرة ليلى (الشكل 2).
الشكل 1 : تأثير زرع جزيرة سينجينيك- (أ) مستوى الجلوكوز في الدم وتم قياس في نقاط زمنية مختلفة في الفئران السكري الناجم عن بالستريبتوزوتوسين (n = 3). تم حقن جرعة واحدة من بالستريبتوزوتوسين (180 مغ/كغ) قبل زرع الجزيرات 350 لكل مستلم (يوم 0). وتم قياس مستوى الجلوكوز في الدم (مليمول/لتر) لتصل إلى 121 يوما (يوم-3: 17 ± 2.3؛ واليوم 0: 22.6 ± 1؛ ويوم 1: 4.6 ± 0.3؛ واليوم 5: 7.5 ± 0.4؛ واليوم 121: 5.3 ± 0.09). (ب) زيادة في وزن الجسم بعد زرع جزيرة ليلى. البيانات الواردة أعلاه تمثل ± متوسط الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تأثير زرع جزيرة متمكنة. (أ) مستوى الجلوكوز في الدم وتم قياس في نقاط زمنية مختلفة في الفئران السكري الناجم عن بالستريبتوزوتوسين (n = 2). تم حقن جرعة واحدة من بالستريبتوزوتوسين (180 مغ/كغ) قبل زرع جزيرات البنكرياس 350 (يوم 0). وتم قياس مستوى الجلوكوز في الدم (مليمول/لتر) لمدة تصل إلى 15 يوما (يوم-1: 25.5 ± 5.3؛ واليوم 0: 26.6 ± 1.4؛ ويوم 2:8 ± 0.9؛ واليوم 10: 6.2 ± 0.08؛ ويوم 15: 20.1 ± 1.6). وأبقى نورموجليسيميك الدولة لمدة تصل إلى 10 أيام، وبعد ذلك، زادت تركيزات الجلوكوز في الدم. (ب) متابعة وزن الجسم قبل وبعد زرع جزيرة ليلى. وتمثل البيانات ± متوسط الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : صورة إيمونوستينينج الممثل لزرع جزيرات البنكرياس في الكبد: يغسل المقطع الكبد (5 ميكرون) مع برنامج تلفزيوني، كتلة مع المصل حمار 10% تليها الحضانة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع أضداد الأنسولين الأساسي (1: 500) والصفائح الدموية خلايا بطانية التصاق جزيء بيكم-1 الابتدائي جسم (1: 100). يغسل مع برنامج تلفزيوني، وصمة عار في مواجهة مع هويشت وصمة عار مع الأجسام المضادة الثانوية ح 1، وفي اليوم التالي والتقاط الصور مع إيكا مجهر فلوري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة هو استكشاف الطريق إينترابورتال من زرع جزيرة ليلى. هذا البروتوكول هو ذات كفاءة عالية في تخفيف التوتر السكري ويوفر فرصة متعمقة لاستكشاف جزيرة زرع الدراسات. هذا البروتوكول يؤكد أن حوالي 350 من الجزيرات مورين قادرون على عكس الدولة هايبرجليسيميك. وعلاوة على ذلك، أي من الفئران توفي أثناء الإجراء، ومراقبة نسبة السكر في الدم وقد تحقق في كافة المستلمين. وسجلت مستويات السكر في الدم والوزن الجسم بانتظام ليعكس الكفاءة ومعيار، ووظيفة من الجزيرات المزروعة في عكس اتجاه ارتفاع السكر في الدم. تم قياس مستويات الجلوكوز في الدم في الفئران زرع سينجينيكالي، كل يوم في الأسبوع الأول وبعد ذلك مرة واحدة في أسبوع. بعد زرع الجزيرات وشرط التاكسج تؤدي العوامل خلايا بطانية إفراز العوامل برو-الأوعية مثل VEGF بعد 14 يوما ومن ثم زيادة انجرافتمينت الأوعية الدموية في الكبد كما هو مبين في الشكل 3. تم قياس مستويات الجلوكوز في الدم في الفئران متمكنة، ثلاث مرات في أسبوع لمدة تصل إلى 15 يوما. بعد 15 يوما، رفضت الجزيرات المزروعة في النموذج متمكنة بسبب هجوم المناعة، ما لم تتم إدارتها العقاقير المثبطة للمناعة
وهناك العديد من البروتوكولات عزلة الجزيرة نشرت في الأدب10،11. الأكثر مباشرة لاختيار الجزيرات يدوياً على أساس حجمها ومورفولوجيا بعد الهضم كولاجيناز. هذا واحد من أهم الخطوات لتحديد فقط من الجزر وتجنب إفرازات الخلايا، الحطام، والجزر الصغيرة المحددة إلخ ينبغي أن تبقى عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في حاضنة للسماح لهم بالتعافي من الإجهاد الميكانيكي أثناء الهضم الإجراء. اختيار الجرعة بالستريبتوزوتوسين وزرع جزيرة إينترابورتال أيضا عنصر أساسي في هذا البروتوكول. وينبغي تنظيم درجة حرارة الجسم والحفاظ على استخدام لوحة حرارية طوال العملية الجراحية. وينبغي تطبيق شاش معقم مع ضغط الحد الأدنى لمدة 6 دقيقة في الموقع من ثقب لتجنب النزيف. وينبغي إبقاء الفئران تحت الملاحظة حتى أنهم يستعيد وعيه كافية.
يمكن تعديل بعض الخطوات في هذا البروتوكول. على سبيل المثال، قد يزيد الاستفادة المثلى الوقت الهضم، وحجم كولاجيناز العائد من الجزر الصغيرة في سلالات مختلفة من الفئران. بدلاً من الاستقراء السريع لمرض السكري (بالستريبتوزوتوسين 180 مغ/كغ)، ببطء زيادة ارتفاع السكر في الدم يمكن أن يتسبب استخدام أقل جرعة على مدى فترة ممتدة من الزمن (مثلاً، 40 مغ/كغ/يوم بالستريبتوزوتوسين لمدة 5 أيام على التوالي). ويمكن أن يوفر انجرافتمينت أفضل من الجزيرات المزروعة. ويمكن استكشاف مواقع أخرى، مثل نخاع العظام، والحقيبة أومينتال، المنطقة العضلي، سطح المخاطية المعدة، والطحال، والكلى كبدائل لهذا السياق إينترابورتال.
انجرافتمينت الفقيرة من الجزيرات المزروعة لا تزال مصدر قلق كبير في التجارب السريرية. وتشمل الآخرين نقصا من الجهات المانحة، وعدم الاتساق في الحفاظ على مستويات الجلوكوز في الدم بعد الزرع، والكبت المناعي، وردود الفعل بوساطة الدم12،13. عدم وجود أساليب لتقييم engraftment السليم عقبة أخرى. يمكن أن تتبع الجزيرات المزروعة بالرنين المغناطيسي أو التصوير بالإضاءة الحيوية ربما تحل محل الأساليب الكلاسيكية مثل اختبار تحمل الجلوكوز أو ج-الببتيد. في المستقبل، قد توفر الخلايا الجذعية زرع جنبا إلى جنب مع الجزر الصغيرة الغذائية والأدوية دعم14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
أن تعلن جميع المؤلفين أن لديهم لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نعترف جاندالا Hertl لتقديم الدعم لها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6 mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| BALB/c mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| NMRI nude mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| Ketamine | Bela-pharm | ||
| Xylazine | CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH | ||
| Syringe, 23G and 26G needle | BD | ||
| Petri Dish | Falcon | 303800 | |
| NaCl | Carl Roth | 351007 | |
| Sterile Gauze | Fuhrmann | 7647-14-5 | |
| Shaking Water bath | Kotterman | 1501 | |
| Scissors | Braun | 1501 | |
| Glucose Meter | One Touch | ||
| Warm Thermal Plate | Thermo Fisher | ||
| Braunol (povidone-iodide solution) | B.Braun Melsungen AG | 3864154 | |
| Liposic Edo - Sprinkled Ointment (eye ointment) | Dr. G Mann Chem.-Pharm. GmbH | ||
| Incubator | Fa. Roth | ||
| Flow Bench | Herdus | ||
| Ficoll | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| 5-0 Silk Suture Vicryl | Braun | (7.5 *1.75mm) | |
| Michel Clamps (clips) | Aesculap | BN507R | |
| P/FCS Solution | Gibco | 21180-021 | |
| TCM-199 (10x) | Gibco | 21180-021 | |
| FCS | Biowest | S1810-500 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES (1 M) | Biochrom | L 1613 | |
| Gentamycin | Ratiopharm | ||
| Ciprofloxacin | Fresenius Kabi | ||
| Hank's Solution | Gibco | 14060-040 | |
| Collagenase | Roche | 11213865001 | |
| Streptozotocin | Calbiochem | 572204 | |
| OPSITE-spray (wound healer) | Smith and nephew | 66004978 | |
| Reugular food | Altromin | ||
| Head light LED 16042 (magnifying glass) | Eschenbach | 16042 | |
| Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody | Millipore, Chemicon | CBL1337 | Dilution (1:100) |
| Donkey anti-rat secondary antibody | Dianova | 712095153 | Dilution (1:400) |
| Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody | Dako | A0564 | Dilution (1:500) |
| Donkey anti-guinea pig secondary antibody | Dianova | 706-259-148 | Dilution (1:400) |
References
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), a007823 (2012).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- Cantarelli, E., et al. Bone marrow as an alternative site for islet transplantation. Blood. 114 (20), 4566-4574 (2009).
- Echeverri, G. J., et al. Endoscopic gastric submucosal transplantation of islets (ENDO-STI): technique and initial results in diabetic pigs. American Journal of Transplantation. 9 (11), 2485-2496 (2009).
- Korsgren, O., et al. Optimising islet engraftment is critical for successful clinical islet transplantation. Diabetologia. 51 (2), 227-232 (2008).
- Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. British Journal of Surgery. 95 (12), 1449-1461 (2008).
- Lingwal, N., et al. Inhibition of gelatinase B (matrix metalloprotease-9) activity reduces cellular inflammation and restores function of transplanted pancreatic islets. Diabetes. 61 (8), 2045-2053 (2012).
- Chen, C., et al. Improved intraportal islet transplantation outcome by systemic IKK-beta inhibition: NF-kappaB activity in pancreatic islets depends on oxygen availability. American Journal of Transplantation. 11 (2), 215-224 (2011).
- Wang, Y., Wang, T., Zhang, L. Three aspects are critical for carrying out intraportal islet transplants successfully in a diabetes mouse model. Experimental and Clinical Transplantation. 10 (3), 302-304 (2012).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments. (88), e50374 (2014).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Rother, K. I., Harlan, D. M. Challenges facing islet transplantation for the treatment of type 1 diabetes mellitus. Journal of Clinical Investigation. 114 (7), 877-883 (2004).
- Su, Z., et al. Small islets are essential for successful intraportal transplantation in a diabetes mouse model. Scandinavian Journal of Immunology. 72 (6), 504-510 (2010).
- Rekittke, N. E., Ang, M., Rawat, D., Khatri, R., Linn, T. Regenerative Therapy of Type 1 Diabetes Mellitus: From Pancreatic Islet Transplantation to Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 22 (2016).
