Summary
胰岛移植是实现1型糖尿病血糖浓度的一种途径。本文主要研究了通过门静脉途径维持糖尿病小鼠正常血糖水平的移植技术。
Abstract
胰岛移植降低高血糖是非常成功的啮齿动物与化学性糖尿病。实验性胰岛移植最常见的移植部位为肾囊。然而, 由于对胰岛与血液成分的相互作用知之较少, 因此在实验性胰岛移植中利用门静脉途径也有意义。
该协议表明了门静脉胰岛移植技术在 NMRI 裸鼠。腹腔注射佐菌素 (180 毫克/千克) 诱导受体小鼠高血糖。他们被认为是糖尿病在非空腹血糖水平大于20毫摩尔/升。在移植前的某一天, 用胶原酶消化法从供体胰腺中分离出小鼠胰岛;每位糖尿病患者至少使用350个胰岛。根据胰岛的分离率, 每个受体使用两个或更多的捐献小鼠。在隔夜文化在37°c 以后, 胰岛通过门静脉被管理入接受者肝脏。手术后, 小鼠被保护在红色 Makrolon 的房子和观察, 直到是清醒的。该协议维持血糖控制120天的自体小鼠和15天的同种异体小鼠。
Introduction
胰岛移植是治疗1型糖尿病的一种很有前景的方法1。第一次尝试转移绵羊胰腺碎片到糖尿病患者是由沃森威廉斯在1893年进行。然而, 通过埃德蒙顿协议实现了临床胰岛移植的一个重大突破, 此后又制定了一系列国家计划2。过去, 在临床前模型中探讨了骨髓、网膜囊、肌内区、胃粘膜表面、脾、肾胶囊等几个部位, 但门静脉系统被认为是适宜有效的部位之一。对于临床程序3,4,5,6。
胰岛素的外源性管理可以用胰岛输液代替门静脉。这被认为是一个首选的网站, 因为氧气供应是可比的, 在当地的胰腺由于在下游的位置的汇合的门动脉和静脉。此外, 还有一个很大的表面积, 这样可以保留胰岛的三维结构, 并且可以方便地进行血管化5。在接受糖尿病的老鼠中, 2000 人或猪胰岛当量或350小鼠胰岛足以逆转高血糖状态7,8。钳水平被报告了15天在小鼠接受者模型的异种胰岛和在同种异体鼠-鼠模型, 并在120天的自体鼠对鼠移植。
与通过门静脉胰岛移植的疗效相关的因素是适当的麻醉、穿刺方法和止血9。麻醉可以诱导吸入 (5% 异氟烷) 或注射 (氯胺酮, 甲苯噻嗪, 或戊巴比妥), 这些物质往往结合。为了控制麻醉的深度和时间, 应注意鼠标的状态, 如粘膜的颜色、眼盖、角膜反射、呼吸速率和体温。重要的是要确保动物不挣扎, 它生存的行动。温度可由不同的加热装置维护, 如加热垫、红光灯泡、等.热热板已用于保持25-30 摄氏度之间的温度, 在鼠标和操作表之间, 防止发生低温。麻醉药的剂量是重要的, 因为所有这些药物都是由肝脏代谢的, 肝功能可能短暂紊乱的胰岛悬浮液注入.门静脉的理想穿刺点是第一和第二支流静脉的位置。
胰岛的数量和预期的注射量也会影响移植的结果, 因为过量的体积可能会增加剪切应力。0.2 毫升体积被认为适合胰岛移植入门静脉。穿刺伤口 (26 口径针) 诱导门静脉出血, 需要及时有效地停止。无菌纱布或手指可在穿刺部位施加最小压力, 以止血6分钟左右。结合, 门胰岛注射液是有效的, 并提供调节血糖水平的化学诱导糖尿病小鼠模型。
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Protocol
本议定书的所有程序均经德国动物福利法和准则批准。考虑使用 10-到12周的 NMRI 裸鼠和 C57Bl/6 小鼠 (捐赠者: 老女性; 收件人: 男性) 贯穿整个实验。使用 NMRI 裸鼠为胰岛隔离。根据当地动物设施规定, 将小鼠置于规定的条件下。
1. 链脲佐菌素诱导糖尿病
- 4天, 用称重机测量10至12周的 NMRI 裸鼠和 C57Bl/6 小鼠的体重。
- 根据测量的体重, 准备180毫克/千克剂量的链脲佐菌素在0.1 毫升生理盐水每只老鼠。
注: 链脲佐菌素应在使用和覆盖铝箔之前进行新的准备, 因为它是光敏的。 - 注射自体和同种异体小鼠每一个剂量的0.1 毫升链脲佐菌素 (180 毫克/千克) 腹腔使用26克针。
- 日-3,-2 和-1 收集2-4 µL 的血液通过穿刺的尾部静脉的非禁食小鼠。
- 用每条试纸的2-4 µL 测定 NMRI 裸鼠和 C57Bl/6 小鼠的血糖
注意: 在这一点上, 80% 的老鼠应该成为糖尿病 (20 毫摩尔/升)。- 在胰岛移植时使用小鼠血糖水平达到20毫摩尔/升。
2. 小鼠胰岛的分离
- 麻醉小鼠 (100 毫克/千克体重) 和甲苯噻嗪 (20 毫克/千克体重) 腹腔注射与26克针。
注: 氯胺酮和甲苯噻嗪的体积是根据动物的体重 (0.10 mL/10 g) 确定的。 - 保持小鼠仰卧位, 用聚维酮碘溶液进行消毒。通过检查踏板反射来确认正确的安乐死。
注: 万一 C57Bl/6 剃了腹部区域。 - 用细钳握住皮肤, 用剪刀做中线切口, 露出腹腔。将肠道放置在不育纱布压缩下的腹腔左侧和外腔。
- 调整胃在另一个方向, 以找到胰腺和其他相关组织。
- 到达主动脉, 做一个小切口排泄血液。使用无菌纱布进行血液吸收。
- 小心地取出肠道。将胰腺与胃和脾脏分开。
- 把胰脏放在新鲜的培养皿里。用镊子取出所有不需要的材料, 如脂肪。
- 用4毫升的胶原酶填充5毫升的注射器, 用26克针 (股票溶液: 在汉克溶液的12毫升中用30毫克胶原酶) 注入胰腺。
- 用剪刀将胰腺剁碎, 增加表面积, 改善消化, 转移到12毫升红帽管。
注: 汉克的平衡盐溶液: HBSS 10x (100 毫升), 青霉素-链霉素 (10 毫升), 庆大霉素 (1 毫升), 环丙沙星 (10 毫升), HEPES (35 毫升), 蒸馏 H2O (900 毫升) - 在颤抖的水浴中进行10分钟的消化, 37 摄氏度。在十五年代的固定时间间隔内, 对样品进行三次涡旋。
- 用手大力混合消化的胰腺3分钟, 并将其放在冰上十年代。
- 添加6毫升的冷汉克溶液, 以停止消化反应和离心机在 560 x g 在室温下3分钟。
- 在室温下取出上清液, 在10毫升的帕克/胎小牛血清 (P/FCS) 培养基中溶解颗粒。
注: P/FCS 介质: TCM-199 10x (100 毫升), FCS (50 毫升), 青霉素-链霉素 (10 毫升), HEPES (20 毫升), 蒸馏 H2O (900 毫升) - 根据光镜下的形态学 (球状, 金黄色-褐色) 识别胰岛。避免带深色中心的小岛。在光显微镜下进行双硫腙染色, 检查纯度和活性。
注: 双硫腙与锌离子结合, 为胰岛提供红色染色。 - 用1毫升的吸管在光显微镜下计数和精选胰岛, 将它们转移到含有4毫升 P/FCS 培养基的新鲜培养皿 (60 毫米 x 15 毫米)。
注: 培养皿中的P/FCS 介质的体积不应超过4毫升, 以确保氧气的可用性。 - 将孤立的胰岛在4毫升的 P/FCS 培养基中过夜, 在37摄氏度的孵化器。
3. 胰岛移植动物的制备
- 从37摄氏度孵化器中取出孤立的小岛, 并将它们放在流动工作台下。中心的胰岛与一个圆形摆动运动的培养皿。
- 用0.1 毫升的 P/FCS 培养基填充1毫升注射器 (蓝色23克针)。然后, 在0.3 毫升的汉克溶液中添加350个胰岛。将注射器保持在垂直位置, 使小岛能够安定下来。
- 将体积减小到0.05 毫升, 用褐色的26克针取代蓝色的23克针。对同一注射器, 增加0.15 毫升的 Ficoll (密度梯度培养基) 到顶端, 以达到最终体积0.2 毫升的注射器。避免气泡。
- 将注射器保持在垂直位置, 稍微旋转, 以避免胰岛结块。胰岛将在2-3 分钟内在注射器的锥形处沉淀。
- 测量受体小鼠的体重和血糖水平;血糖水平应约为20毫摩尔/升。
- 麻醉小鼠 (100 毫克/千克体重) 和甲苯噻嗪 (20 毫克/千克体重) 腹腔注射26克针。
- 将小鼠置于仰卧位, 放在暖热板上 (37 摄氏度)。通过捏脚趾来检查麻醉深度。
- 用聚维酮碘溶液 (皮肤消毒剂) 清洁腹部区域。为防止眼部干燥, 请用眼膏保湿。
注: 万一 C57Bl/6 剃了腹部区域。
4. 胰岛移植通过门静脉路线
- 0天, 从剖腹手术开始, 用钳夹住皮肤, 用剪刀做2-3 厘米长的中线切口。将无菌湿纱布放在伤口边缘周围, 保持湿润。
- 将肠道置于左侧和腹腔外的无菌纱布压缩。
注意: 在整个过程中保持肠道湿润, 预热前0.9% 氯化钠溶液或不育纱布浸泡在生理盐水中。 - 移动十二指肠并定位胰腺。通过将胰腺向上推, 找到位于腹侧部位的门静脉。使用手指和拇指暴露的门静脉, 一旦暴露, 刺穿它附近的肝脏。
- 在1分钟内, 在放大镜的检查下缓慢和稳步地将胰岛 (0.2 毫升从步骤 3.4) 注入门静脉, 以避免胰岛的任何渗漏。
注: 注射后, 应始终检查注射器中的其余胰岛。在注射器中服用1毫升的 P/FCS 介质, 冲洗成新鲜的培养皿, 并在显微镜下计数。 - 在穿刺部位放置一个不育的量规, 用食指 (穿透深度: 0.5-1 厘米) 施加压力, 以6分钟止血。
注: 注射量不应超过0.2 毫升。由于剪切应力, 体积和压力过大会破坏小岛。 - 小心地将肠道、腹膜、腹部肌肉层和筋膜放回原位。
- 使用镊子, 抬起皮肤, 用可吸收的丝缝线闭合肌肉切口, 上部皮肤层有2-3 个夹子。
- 用皮肤消毒剂清洁表面, 应用伤口治疗, 并将老鼠放在单独的笼子里。伤口治疗提供了耐水性丙烯酸酯层, 防止浸渍和继发感染。
注意: 观察老鼠, 直到他们恢复足够的意识, 提供曲马多 (每只老鼠0.2 毫克) 连同液体。在本协议中, 小鼠快速从麻醉中恢复, 曲马多管理减轻了疼痛。7天后伤口就会愈合 - 用普通的食物和水喂老鼠。食品和水的消耗和尿液排泄将增加后, 佐菌素注射液。
- 每天在自体小鼠的第一周和每周一次测量血糖水平。在同种异体小鼠中, 每周三次测量血糖水平长达15天。
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Representative Results
研究了化学诱导的糖尿病小鼠移植胰岛的能力。胰岛移植通过门静脉系统的糖尿病小鼠模型。捐助者接受率为2:1。在自体小鼠模型中, 利用两只捐献小鼠获得350个胰岛。然后将胰岛移植到糖尿病小鼠体内。移植后1天观察到血糖水平的降低, 提示移植胰岛在降低血糖水平中的作用。链脲佐菌素增加了血糖水平高达约22毫摩尔/升。胰岛移植后, 血糖水平下降到4.6 毫摩尔/升 (1 天).血糖浓度的维护时间长达121天, 如图1A 所示。体重和血糖水平大致遵循相同的模式。在佐菌素注射液和手术后, 体重下降。从2天开始, 它趋于正常, 从 25.3 g (天 4) 到 29.7 g (天 121), 如图 1B所示。
如果主要组织相容性 (MHC) 不匹配的小鼠, 从两个 C57Bl/6 (H2d) 小鼠350个胰岛移植到糖尿病 BALB/c (H2b) 小鼠。在佐菌素注射液后, 血糖增加26.6 毫摩尔/升。胰岛移植后, 血糖水平降至4.4 毫摩尔 (1 天;图 2A)。血糖浓度 (4.44 至7.2 毫摩尔) 被观察最多10天, 但在15天 (20.1 毫摩尔/升) 后未见。糖尿病小鼠的体重从26克 (天-3) 降至23克 (天 0), 进一步到21.5 克 (天 1)。移植后, 体重逐渐从23克 (2 天) 恢复到25克 (10 天)。由于 MHC 不匹配, 胰岛移植后10天血糖水平增加, 体重下降 (图 2B)。
图 1: 自体胰岛移植的效果。(A) 在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠的不同时间点测定血糖水平 (n = 3)。单个剂量的链脲佐菌素 (180 毫克/千克) 注射之前, 350 胰岛移植到每个接受者 (0 天)。血糖水平 (毫摩尔) 测量了121天 (天-3:17 @ 2.3; 天 0: 22.6 @ 1; 天 1: 4.6 @ 0.3; 天 5: 7.5 @ 0.4; 天 121: 5.3 @ 0.09)。(B) 胰岛移植后体重增加。上面的数据代表标准偏差的平均值。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 同种异体胰岛移植的疗效.(A) 在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠的不同时间点测定血糖水平 (n = 2)。在350个胰岛 (0 天) 移植前注射一剂链脲佐菌素 (180 毫克/千克)。血糖水平 (毫摩尔) 测量了15天 (天-1: 25.5 @ 5.3; 天 0: 26.6 @ 1.4; 天 2: 8 @ 0.9; 天 10: 6.2 @ 0.08; 天 15: 20.1 @ 1.6)。Normoglycemic 状态维持10天, 随后血糖浓度增加。(B) 胰岛移植前后体重的随访。数据代表标准偏差的平均值。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3:代表染色移植胰岛的图片: 用 PBS 冲洗肝脏部分 (5 µm), 块与10% 驴血清然后隔夜孵化4°c 与胰岛素原抗体 (1:500) 和血小板内皮细胞黏附分子 PECAM-1 原发性抗体 (1:100)。第二天, 用1小时的二次抗体染色, 用 PBS 冲洗, 用赫斯特和用莱卡荧光显微镜捕捉图像。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
本文对胰岛移植的门静脉路线进行了探讨。该协议在缓解糖尿病应激方面具有高效性, 为探索胰岛移植研究提供了深入的机会。该协议证实, 大约350只小岛能够逆转高血糖状态。此外, 所有的老鼠在手术过程中都没有死亡, 所有接受者的血糖控制都达到了。定期记录体重和血糖水平, 以反映移植胰岛逆转高血糖的能力、标准和功能。在 syngeneically 移植的小鼠中, 血糖水平每天在第一周和一周内测量一次。胰岛移植后, 缺氧状况及其他因素引发内皮细胞分泌血管内皮生长因子, 如 VEGF 14 天后, 从而增加肝脏血管植入, 如图 3所示。在异基因小鼠中, 血糖水平每周三次, 长达15天。15天后, 移植胰岛被排斥在同种异体模型由于免疫攻击, 除非免疫抑制剂药物被管理
在文献10、11中发布了几个胰岛隔离协议。最直接的选择是根据胶原酶消化后的大小和形态来手动选取胰岛。这是最关键的步骤之一, 选择只胰岛和避免外分泌细胞, 碎片,等.选定的胰岛应保持在37°c 过夜的孵化器, 使他们恢复从机械应力在消化过程中遇到程序。选择链脲佐菌素剂量和门静脉胰岛移植也是该协议的关键。体温应在整个手术过程中使用热板进行调节和维护。无菌纱布应在穿刺部位以最少的压力在6分钟内使用, 以避免出血。老鼠应保持观察, 直到他们恢复足够的意识。
可以修改此协议中的某些步骤。例如, 优化消化时间和胶原酶的体积可以提高不同小鼠的胰岛产量。而不是快速诱导糖尿病 (180 毫克/千克链脲佐菌素), 缓慢增加的高血糖可以诱导使用较低剂量在较长的时间内 (例如, 40 毫克/千克/天链脲菌素连续5天)。这可以提供更好的植入移植胰岛。其他部位, 如骨髓, 网膜囊, 肌肉区, 胃粘膜表面, 脾脏, 肾脏可以作为替代门静脉静脉的探索。
移植胰岛的不良植入仍然是临床试验的主要关注。其他包括缺乏捐助者、移植后维持血糖水平不一致、免疫抑制和血液介导的反应12,13。缺乏评估适当植入的方法是另一个障碍。通过磁共振或生物荧光成像对移植的胰岛进行跟踪, 可能会取代诸如葡萄糖耐受试验或 c 肽等经典方法。今后, 与胰岛一起移植的干细胞可能提供营养和免疫支持14。
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Disclosures
所有作者都宣称他们没有利益冲突。
Acknowledgments
我们想感谢 Gundula Hertl 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6 mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| BALB/c mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| NMRI nude mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| Ketamine | Bela-pharm | ||
| Xylazine | CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH | ||
| Syringe, 23G and 26G needle | BD | ||
| Petri Dish | Falcon | 303800 | |
| NaCl | Carl Roth | 351007 | |
| Sterile Gauze | Fuhrmann | 7647-14-5 | |
| Shaking Water bath | Kotterman | 1501 | |
| Scissors | Braun | 1501 | |
| Glucose Meter | One Touch | ||
| Warm Thermal Plate | Thermo Fisher | ||
| Braunol (povidone-iodide solution) | B.Braun Melsungen AG | 3864154 | |
| Liposic Edo - Sprinkled Ointment (eye ointment) | Dr. G Mann Chem.-Pharm. GmbH | ||
| Incubator | Fa. Roth | ||
| Flow Bench | Herdus | ||
| Ficoll | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| 5-0 Silk Suture Vicryl | Braun | (7.5 *1.75mm) | |
| Michel Clamps (clips) | Aesculap | BN507R | |
| P/FCS Solution | Gibco | 21180-021 | |
| TCM-199 (10x) | Gibco | 21180-021 | |
| FCS | Biowest | S1810-500 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES (1 M) | Biochrom | L 1613 | |
| Gentamycin | Ratiopharm | ||
| Ciprofloxacin | Fresenius Kabi | ||
| Hank's Solution | Gibco | 14060-040 | |
| Collagenase | Roche | 11213865001 | |
| Streptozotocin | Calbiochem | 572204 | |
| OPSITE-spray (wound healer) | Smith and nephew | 66004978 | |
| Reugular food | Altromin | ||
| Head light LED 16042 (magnifying glass) | Eschenbach | 16042 | |
| Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody | Millipore, Chemicon | CBL1337 | Dilution (1:100) |
| Donkey anti-rat secondary antibody | Dianova | 712095153 | Dilution (1:400) |
| Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody | Dako | A0564 | Dilution (1:500) |
| Donkey anti-guinea pig secondary antibody | Dianova | 706-259-148 | Dilution (1:400) |
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