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Medicine

Intraportal 이식 마우스 모델에서 췌 장 독도의

doi: 10.3791/57559 Published: May 5, 2018

Summary

췌 장 섬 이식 타입-1 당뇨병에 normoglycemia를 달성 하는 방법입니다. 이 문서는 당뇨병 쥐의 정상적인 포도 당 수준을 유지 하는 intraportal 경로 통해 이식 기술에 초점을 맞추고.

Abstract

췌 장 섬 이식 혈당을 줄이기 위해 화학적으로 유도 된 당뇨병 설치류에서 매우 성공적 이다. 실험적인 섬 이식에 가장 일반적인 이식 사이트 신장 캡슐 이다. 그러나,로 적은 혈액 성분과 췌 장 독도의 상호 작용에 대 한 알려져 있다, 그것은 또한 의미가 실험 섬 이식에서 문맥 접근 방식을 활용 하 있습니다.

이 프로토콜에서는 NMRI 누드 마우스에는 intraportal 섬 이식 기법을 보여 줍니다. Streptozotocin (180 mg/kg)은 받는 사람 쥐에서 혈당을 유도 하기 위해 intraperitoneally 주입 하 고 있다. 그들은 20 mmol/l. 보다 큰 비 단식 혈액 포도 당 수준에서 당뇨병 환자로 간주 됩니다. 1 일 이전에 이식, 마우스 췌 장 독도 콜라 소화;에 의해 기증자 췌 격리 최소 350 독도 당뇨병 받는 당 활용 됩니다. 섬 격리 수율에 따라, 두 개 이상의 기증자 마우스 받는 사람 마다 활용 됩니다. 37 ° C에서 야간 문화, 후 독도 문맥을 통해 받는 사람 간으로 관리 됩니다. 수술 후, 쥐 빨간색 Makrolon 주택에 보호 및 관찰까지 깨어 있다. 이 프로토콜 syngeneic 마우스에 120 일 및 15 일 수용자 쥐에 glycemic 통제를 유지 한다.

Introduction

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섬 이식1타입-1 당뇨병 치료 하는 유망한 접근 이다. 당뇨병 환자로 양 췌 장 부분을 전송 하는 첫 번째 시도 1893 년에 왓슨 윌리엄스에 의해 수행 되었다. 그러나, 임상 작은 섬 이식에 중요 한 돌파구에 드 몬 튼 프로토콜 달성 했으며 이후, 국가 프로그램의 일련의 개발된2. 과거에는, 골 수, omental 주머니, 근육 지역, 위 점 막 표면, 비장, 신장 캡슐 등 여러 사이트 전 임상 모델에서 탐구 했다 하지만 포털 정 맥 시스템은 적합 하 고 효과적인 사이트 중 하나로 간주 됩니다. 대 한 임상 프로그램3,4,,56.

인슐린의 외 인 관리 섬 포털 정 맥으로 주입 하 여 교체하실 수 있습니다. 산소 공급은 하류 위치 네이티브 췌에 포털 동맥과 정 맥의 합류에의 하기 때문에 선호 하는 사이트는 것입니다. 또한, 거기는 큰 표면적은 독도의 3 차원 구조를 유지 수 있습니다, 그리고 vascularization 촉진된5수 있습니다. 받는 사람 당뇨병 마우스, 2000 또는 돼지 섬 등가물 또는 350 마우스에서 독도 hyperglycemic 국가7,8반대로 적절 한 있습니다. Euglycemic 레벨 syngeneic 마우스 대 마우스 이식에서 120 일 이상 xenogeneic 독도 수용자 마우스 마우스 모델에서 마우스 받는 모델에 15 일 동안 보고 했다.

문맥을 통해 섬 이식의 효능 관련 요소는 적절 한 마 취, 펑크, 그리고 hemostasis9의 방법. 마 취는 흡입 (5 %isoflurane) 또는 주입 (마 취 제, xylazine, 또는 pentobarbital)에 의해 유도 될 수 있다 그리고 물질 자주 결합. 깊이의 제어 및 마 취의 시간에 대 한 마우스, 점 막, 눈 뚜껑, 각 막 반사, 호흡 속도, 그리고 체온의 색 등의 상태에 관심을 지불 합니다. 그것은 동물 고군분투 하지 하 고 그것은 작동 살아 난다는 것이 중요입니다. 온도 유지 될 수 있다 난방 패드, 등 다른 난방 장치에 의해 레드 전구, A 따뜻한 열 플레이트 마우스와의 발생을 방지 하는 작업 테이블을 25-30 ° C의 온도 유지 하는 데 사용 되었습니다. 저체온증입니다. 마 취약의 복용량은 중요 하다, 그들 모두는 간장에 의해 대사는 하 고 간 기능을 뚜렷이 섬 서 스 펜 션. 의 주입에 의해 무질서 수 있습니다. 문맥에 대 한 이상적인 펑크 점은 첫 번째 및 두 번째 지류 정 맥 사이 위치입니다.

독도 의도 주입 볼륨의 수 또한 영향을 미칠는 이식의 결과 과도 한 볼륨 전단 응력을 증가 수 있습니다. 0.2 mL 볼륨 포털 정 맥으로 작은 섬 이식에 대 한 적절 한 간주 됩니다. 찌른 상처 (26-게이지 바늘) 신속 하 고 효과적인 방식으로 중지 하는 문맥에서 출혈을 유도 합니다. 멸 균 거 즈 나 손가락은 출혈을 멈추게 하는 약 6 분 빵 꾸의 사이트에 최소한의 압력으로 적용할 수 있습니다. 찍은 함께, 포털 섬 주입 효과적 이며 화학적으로 유도 된 당뇨병 마우스 모델에서 혈액 포도 당 수준 이상의 레 귤 레이 션을 제공 합니다.

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Protocol

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이 프로토콜의 모든 절차는 독일 동물 복지 법률과 지침에 의해 승인 되었습니다. 10 월에 12 주 된 NMRI 누드 마우스 C57Bl/6 마우스를 사용 하 여 고려 (기증자: 오래 된 여성, 받는 사람: 남성) 실험을 통해. 섬 격리 NMRI 누드 마우스를 사용 합니다. 로컬 동물 시설 규정에 따라 정의 된 조건 하에서 생쥐를 유지 합니다.

1입니다. 당뇨병 Streptozotocin으로 유도

  1. -4 일에 10 ~ 12 주 된 NMRI 누드 마우스 및 무게 기계를 사용 하 여 C57Bl/6 쥐의 몸 무게를 측정 합니다.
  2. 측정 된 몸 무게에 따라 마우스 당 염 분의 0.1 ml에서 streptozotocin의 180 mg/kg의 복용량을 준비 합니다.
    참고: Streptozotocin 해야 갓 사용 하기 전에 준비 되며, 그것은 빛에 민감한 알루미늄 호 일로 덮여.
  3. Syngeneic 및 수용자 마우스 각각 streptozotocin (180 mg/kg)의 0.1 mL의 단 하나의 복용량 intraperitoneally 26 G 바늘을 사용 하 여 주사.
  4. 날-3,-2와-1 비 단식 쥐의 꼬리 정 맥을 puncturing 의해 2-4 µ L의 혈액을 수집 합니다.
  5. 테스트 스트립 당 혈액 샘플의 2-4 µ L를 사용 하 여 NMRI 누드 마우스 C57Bl/6 쥐에서 혈당을 측정
    참고:이 시점에서 쥐의 80% 해야 될 당뇨병 (20 mmol/L).
    1. 그들의 혈액 포도 당 수준을 20 mmol/l.에 도달 작은 섬이 식을 위한 마우스를 사용

2입니다. 쥐에서 췌 장 독도의 격리

  1. 26-G 바늘으로 복 주입에 의해 케 타 민 (100mg/kg 몸 무게)와 xylazine (20 mg/kg 체중) 마우스를 anesthetize.
    참고: 마 취 제 및 xylazine의 볼륨 (0.10 mL/10 g) 동물의 몸 무게에 따라 결정 됩니다.
  2. 부정사 위치에 쥐를 유지 하 고 소독 povidone-요오드 솔루션. 페달 반사를 확인 하 여 적절 한 안락사를 확인 합니다.
    참고: C57Bl/6의 경우 복 부 지구를 면도.
  3. 피부 미세 집게로 잡고 고 중간 절 개를가 위로 복 부 구멍을 폭로. 멸 균 거 즈 압축에 내장 사이트 왼쪽 및 복 부 구멍의 외부를 배치 합니다.
  4. 췌 장 및 다른 관련 된 위치를 다른 방향으로 위 조정 조직.
  5. 대동맥에 도달 하 고 혈액을 배수 하기 위하여 작은 상처를. 멸 균 거 즈를 사용 하 여 혈액 흡수에 대 한.
  6. 조심 스럽게 소장 제거. 위장과 비장 췌를 구분 합니다.
  7. 삭제할 췌 하 고 신선한 페 트리 접시에 두십시오. 지방, 집게를 사용 하 여 같은 모든 원치 않는 자료를 제거 합니다.
  8. 콜라의 4 mL와 5 mL 주사기를 췌 26 G 바늘으로 주입 (재고 솔루션: 행 크의 솔루션의 12 mL에서 콜라의 30 밀리 그램).
  9. 향상 된 소화와 12 mL 빨간 모자 튜브에 대 한 표면적 증가 위 췌를 말하다.
    참고: 행 크의 균형 소금 솔루션: HBSS 10 배 (100 mL), 페니실린-스 (10 mL), Gentamycin (1 mL), Ciprofloxacin (10 mL), HEPES (35 mL), 소 주 H2O (900 mL)
  10. 떨고 물 욕조에 37 ° C에서 10 분을 소화를 수행 합니다. 와 15에 대 한 일정 한 간격에 몇 번이 고 샘플 동 s.
  11. 3 분 동안 손으로 소화 췌를 적극적으로 혼합 하 고 10 얼음에 s.
  12. 소화 반응 및 실 온에서 3 분 560 x g에서 원심 분리기를 막으려고 찬 행 크의 솔루션의 6 mL를 추가 합니다.
  13. 상쾌한을 제거 하 고 실 온에서 파커/태아 종 아리 혈 청 (P/FCS) 중간의 10 mL에 펠 릿을 디졸브.
    참고: P/FCS 매체: TCM-199 10 배 (100 mL), FCS (50 mL), 페니실린-스 (10 mL), HEPES (20 mL), 소 주 H2O (900 mL)
  14. 가벼운 현미경 (회전 타원 체, 골든-브라운 색) 그들의 형태에 따라 독도 식별 합니다. 어두운 센터와 함께 독도를 하지 마십시오. 순도 생존에 대 한 가벼운 현미경 얼룩 dithizone 수행 하 여 확인 하십시오.
    참고: Dithizone 아연 이온을 하 고는 독도에 붉은 색 얼룩을 제공 합니다.
  15. 1 mL 피 펫을 사용 하 여 계산 하 고 가벼운 현미경 독도 따 고 P/FCS 매체의 4 mL를 포함 하는 신선한 페 트리 접시 (60 m m x 15 m m)에 그들을 전송.
    참고: 볼륨의 P /페 트리 접시에 FCS 매체 산소 가용성을 보장 하기 위해 4 mL를 초과 해서는 안됩니다.
  16. 인큐베이터에서 37 ° C에서 P/FCS 매체 하룻밤 4 mL에 격리 된 독도 유지.

3입니다. 섬 이식에 대 한 동물의 준비

  1. 37 ° C 배양 기에서 격리 된 독도 제거 하 고 흐름 벤치에서 그들을 배치. 페 트리 접시의 원형 스윙 모션 독도 센터.
  2. P/FCS 매체의 0.1 mL에 1 mL 주사기 (블루 23 G 바늘)를 채우십시오. 그런 다음, 행 크의 솔루션의 0.3 ml에서 350 독도 추가 합니다. 정착 독도 수 있도록 수직 위치에 주사기를 유지.
  3. 0.05 mL를 볼륨을 감소 하 고 갈색 26 G 바늘으로 블루 23 G 바늘을 바꿉니다. 같은 주사기를 주사기에 0.2 mL의 최종 볼륨에 도달 가기 Ficoll (밀도 그라데이션 중간)의 0.15 mL를 추가 합니다. 공기 방울을 피하십시오.
  4. 수직 위치에서 주사기를 유지 하 고 독도의 응집을 피하기 위해 약간 그것을 회전. 독도 2-3 분 이내 주사기에 정착 됩니다.
  5. 받는 사람 마우스;의 몸 무게와 혈액 포도 당 수준을 측정합니다 혈액 포도 당 수준이 약 20 mmol/l. 해야 합니다.
  6. 26-G 바늘으로 복 주입에 의해 케 타 민 (100mg/kg 몸 무게)와 xylazine (20 mg/kg 체중) 마우스를 anesthetize.
  7. 따뜻한 열 플레이트 (37 ° C)에서 부정사 위치에 마우스를 놓습니다. 발가락을 곤란 하 게 하 여 마 취의 깊이 확인 합니다.
  8. Povidone-요오드 솔루션 (피부 살 균 제)와 복 부 지역 청소. 눈이 건조 하지 않도록 유지 그들 눈 연 고와 촉촉한.
    참고: C57Bl/6의 경우 복 부 지구를 면도.

4. 섬 이식 Intraportal 경로 통해

  1. 0 일에는 개복 술과 집게와 피부를 유지 하 고 2-3 cm에 의해 시작-한가 위 절 개 긴 중간. 장소는 메 마른 젖은 거 즈 촉촉한 유지 하 상처 가장자리 압축.
  2. 멸 균 거 즈 압축에 왼쪽 및 복 부 구멍 밖에 내장 사이트를 놓습니다.
    참고: 내장 프로시저 미리 따뜻하게 0.9 %NaCl 용액 또는 일반 식 염 수에 담근 멸 균 거 즈를 통해 촉촉한 유지.
  3. 십이지 장 이동한 췌를 찾습니다. 문맥 췌를 위로 밀어 복 부 사이트에서 위치를 찾습니다. 손가락 및 엄지를 사용 하 여 포털 정 맥 노출, 노출, 일단 간 가까이 펑크.
  4. 1 분 이내 천천히 그리고 꾸준히 독도의 어떤 누설을 피하기 위해 돋보기의 검사에서 문맥에 독도 (0.2 mL 3.4 단계에서)을 주사.
    참고: 후 주입, 항상 확인 주사기에 남아 있는 독도 대 한. 받아 P/FCS 미디어의 1 mL 주사기, 신선한 페 트리 접시를 현미경 하에서 계산으로 플러시.
  5. 펑크 사이트에서 살 균 계기를 배치 하 고 검지 손가락으로 압력을 적용 (침투 깊이: 0.5-1 c m) 6 분 출혈을 멈추게.
    참고: 주입 볼륨 0.2 mL를 초과 하지 않아야 합니다. 과도 한 볼륨 및 압력 전단 응력으로 인해 독도 손상 수 있습니다.
  6. 조심 스럽게 내장 사이트, 복 막, 복 부 근육 층과 근 막에 다시.
  7. 집게를 사용 하 여, 피부, 근육 절 개 흡수 실크 봉합, 그리고 2-3 클립 위쪽 피부 레이어를 닫습니다.
  8. 피부 소독 제와 표면 청소, 상처 치유, 적용 하 고 개별 장에 쥐를 놓습니다. 상처 치유 및 단식 및 이차 감염에서 보호 방수 아크릴 레이어를 제공 합니다.
    참고: 때까지 그들은 충분 한 의식 회복가지고 쥐를 관찰, 체액 함께 tramadol (마우스 당 0.2 mg)을 제공 합니다. 이 프로토콜에서 마우스 마 취에서 빠르게 회복 하 고 tramadol 관리 고통을 감소. 7 일 후 상처를 치유 한다.
  9. 일반 음식과 물 쥐 먹이. 음식과 물 소비 및 소변 배설 streptozotocin 주입 후 증가할 것 이다.
  10. 첫 주 한 주 syngeneic 마우스에 다음 번에 대 한 매일 혈액 포도 당 수치를 측정 합니다. 수용자 마우스에서 최대 15 일 동안 일주일에 세 번 혈액 포도 당 수준을 측정 합니다.

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Representative Results

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이식된 독도의 역량은 화학적으로 유발 된 당뇨 쥐에서 연구 했다. 독도 당뇨병 쥐 모델에서 포털 정 맥 시스템을 통해 이식 했다. 기증 받는 사람 비율 2:1 이었다. Syngeneic 마우스 모델에서 두 기증자 쥐 350 독도를 활용 했다. 독도 다음 당뇨병 쥐에 이식 했다. 혈액 포도 당 수준에 있는 감소는 이식, 이식된 췌 장 독도 혈액 포도 당 수준을 감소에서 역할을 제안 후 1 일에 관찰 되었다. Streptozotocin 증가 혈액 포도 당 수준을 약 22 m m o l/l. 4.6 mmol/l (1 일) 혈액 포도 당 수준에 있는 하락 후에 작은 섬 이식 (그림 1A) 관찰 되었다. 그림 1A와 같이 Normoglycemia 최대 121 일 동안 유지 되었다. 몸 무게와 혈액 포도 당 수준 대략 동일한 패턴을 따 랐 다. Streptozotocin 주입 및 수술 후 체중 감소. 앞으로 하루 2에서 그것은 그림 1B와같이 25.3 g (주 4) 29.7 g (121 일)에서 정상을 향해 상승 경향이 있었다.

중요 한 조직 적합성 (MHC)의 경우 일치 하지 않는 쥐, 두 C57Bl/6 (h 2d) 마우스에서 350 독도 BALB/c (h 2b) 당뇨병 쥐에 이식 했다. 후에 streptozotocin 주입, 혈액 포도 당 증가 최대 26.6 m m o l/l. 섬 이식 후 혈액 포도 당 수준이 떨어졌다 4.4 mmol/L (하루 1; 그림 2A)입니다. Normoglycemia (4.44 7.2 mmol/l)는 최대 10 일 동안 하지만 15 일 (20.1 mmol/L) 후 관찰 되었다. 당뇨병 쥐의 몸 무게 23 g (매일 0)과 21.5 g (주 1) 추가 26 g (하루-3)에서 떨어졌다. 이식 후 몸 무게 점차적으로 복구 23 g (주 2)에서 25 g (10 일). MHC-일치 하지 않아, 혈액 포도 당 수준을 증가 하 고 체중 감소 작은 섬 이식 (그림 2B) 후 10 일.

Figure 1
그림 1 : Syngeneic 섬 이식의 효과. (A) 혈액 포도 당 수준 streptozotocin 유도 당뇨 마우스에서 다른 시간 지점에서 측정 되었다 (n = 3). Streptozotocin (180 mg/kg)의 단 하나의 복용량 (0 일) 각 받는 사람에 게 350 독도의 이식 하기 전에 주입 했다. 혈액 포도 당 수준 (mmol/L) 최대 121 일 동안 측정 되었다 (일-3: 17 ± 2.3; 0: 22.6 ± 1, 하루 1: 4.6 ± 0.3; 하루 5: 7.5 ± 0.4; 및 하루 121: 5.3 ± 0.09). (B) 섬 이식 후 체중 증가. 위의 데이터는 평균 ±를 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 수용자 섬 이식의 효과. (A) 혈액 포도 당 수준 streptozotocin 유도 당뇨 마우스에서 다른 시간 지점에서 측정 되었다 (n = 2). Streptozotocin (180 mg/kg)의 단 하나의 복용량 350 췌 장 독도 (0 일)의 이식 하기 전에 주입 했다. 혈액 포도 당 수준 (mmol/L)까지 15 일 동안 측정 되었다 (주-1: 25.5 ± 5.3; 0: 26.6 ± 1.4; 하루 2: 8 ± 0.9, 하루 10: 6.2 ± 0.08; 및 하루 15: 20.1 ± 1.6). Normoglycemic 상태 최대 10 일 동안 그리고 그 후, 혈액 포도 당 농도 증가 유지 했다. (B) 섬 이식 전후 몸 무게의 속 행. 데이터는 평균 ±를 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 간으로 이식된 췌 장 독도의 대표 immunostaining 그림: PBS, 10% 당나귀 혈 청 인슐린 1 차적인 항 체 (1: 500)와 혈소판 4 ° C에서 하룻밤 부 화 뒤 블록 간 섹션 (5 µ m) 세척 내 피 세포 접착 분자 PECAM-1 1 차적인 항 체 (1: 100). 다음 날, 1 시간에 대 한 2 차 항 체로 얼룩 PBS, Hoechst와 카운터 얼룩을 세척 하 고 Leica 형광 현미경 이미지를 캡처. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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본이 연구에서는 섬 이식의 intraportal 경로 탐구 된다. 이 프로토콜 당뇨 스트레스 완화에 매우 효율적 이며 섬 이식 연구를 탐구 하는 깊이 있는 기회를 제공 합니다. 이 프로토콜은 약 350 murine 독도 hyperglycemic 상태를 역전 할 수 있다 확인 한다. 또한, 쥐의 절차 동안, 죽 었 고 glycemic 제어 모든 받는 사람에 달성 했다. 몸 무게와 혈액 포도 당 수준의 능력, 표준, 및 반대로 혈당에 이식된 독도의 기능을 반영 하기 위해 정기적으로 기록 되었다. Syngeneically 이식된 생쥐에서 혈액 포도 당 수준은 첫 번째 주를 일주일에 한 번 그 후 매일 측정 했다. 독도 이식, hypoxic 조건 등 후 요인 14 일 후 신생 프로 요인 VEGF 등을 분 비 하 고 그림 3에서처럼 간에서 혈관 engraftment 증가를 내 피 세포를 트리거합니다. 수용자 쥐에서 혈액 포도 당 수준 까지의 15 일 동안 일주일에 세 번을 측정 했다. 15 일 후 이식된 독도 거절 되었다 면역 공격으로 인해 수용자 모델에서 면역 억제 약은 관리 하지 않는 한

문학10,11에 게시 하는 여러 섬 격리 프로토콜을 확인 하 고 있습니다. 가장 간단한 콜라 소화 후 수동으로 그들의 크기와 형태에 근거 하 여 독도 선택 하는 것입니다. 독도을 선택 하는 가장 중요 한 단계 중 하나 이며 외 분 비 세포, 파편, 선택한 독도 피하기 위해 밤새 소화 하는 동안 발생 하는 기계적 스트레스 로부터 복구할 수 있도록 인큐베이터에서에서 37 ° C에서 유지 되어야 한다 절차입니다. Streptozotocin 투여 및 intraportal 섬 이식의 선택이이 프로토콜에 키도 있습니다. 체온 통제 되어야 하 고 수술에 걸쳐 열 플레이트를 사용 하 여 유지. 멸 균 거 즈를 출혈을 피하기 위해 펑크의 사이트에서 6 분에 대 한 최소한의 압력으로 적용 되어야 한다. 그들은 충분 한의 식이 되 찾을 때까지 마우스 움직임만 유지 되어야 한다.

이 프로토콜의 특정 단계를 수정할 수 있습니다. 예를 들어 소화 시간의 최적화와 콜라의 볼륨 다른 쥐 긴장에 독도의 수율을 증가할 수 있습니다. 당뇨병 (streptozotocin 180 mg/kg)의 급속 한 유도, 대신 천천히 혈당을 증가 유도 될 수 있는 시간의 연장된 기간 동안 낮은 복용량을 사용 하 여 (예를 들어, 40 mg/kg/5 일 연속 하루 streptozotocin). 이 이식된 독도의 더 나은 engraftment를 제공할 수 있습니다. Intraportal 정 맥을 대신 골, omental 주머니, 근육 지역, 위 점 막 표면, 비장, 신장 등 다른 사이트를 탐험 수 있습니다.

이식된 독도의 가난한 engraftment 아직도 임상 시험에서 주요 관심사입니다. 기타 기증자, 이식, 면역 억제, 및 혈액 중재 반응12,13후 혈액 포도 당 수치를 유지 하는 불일치의 부족을 포함. 적절 한 engraftment를 평가 하는 방법의 부족은 또 다른 장애물입니다. 자기 공명 또는 생물 발광 영상 이식된 독도 추적 가능 하 게 포도 당 내성 검사 등 c-펩 티 드 클래식 메서드를 대체할 수 있다. 미래에 독도 함께 이식 하는 줄기 세포 영양 제공 그리고 면역 조정 지원14.

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Disclosures

모든 저자 들은 관심의 충돌을 선언 합니다.

Acknowledgments

우리는 그녀의 지원에 대 한 Gundula Hertl를 인정 하 고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57Bl/6 mice  Charles River (Sulzfeld, Germany) (10-12 weeks)
BALB/c mice Charles River (Sulzfeld, Germany) (10-12 weeks)
NMRI nude mice Charles River (Sulzfeld, Germany) (10-12 weeks)
Ketamine Bela-pharm
Xylazine CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH
Syringe, 23G and 26G needle BD
Petri Dish Falcon 303800
NaCl Carl Roth 351007
Sterile Gauze Fuhrmann 7647-14-5
Shaking Water bath Kotterman 1501
Scissors Braun 1501
Glucose Meter  One Touch
Warm Thermal Plate Thermo Fisher
Braunol (povidone-iodide solution) B.Braun Melsungen AG 3864154
Liposic Edo - Sprinkled Ointment (eye ointment) Dr. G Mann Chem.-Pharm.  GmbH
Incubator Fa. Roth
Flow Bench Herdus
Ficoll Sigma-Aldrich 10771
5-0 Silk Suture Vicryl Braun (7.5 *1.75mm)
Michel Clamps (clips) Aesculap  BN507R
P/FCS Solution Gibco 21180-021
TCM-199 (10x) Gibco 21180-021
FCS Biowest S1810-500
Penicillin-streptomycin Gibco 15140-122
HEPES (1 M) Biochrom L 1613
Gentamycin Ratiopharm
Ciprofloxacin Fresenius Kabi
Hank's Solution Gibco 14060-040
Collagenase Roche 11213865001
Streptozotocin Calbiochem 572204
OPSITE-spray (wound healer) Smith and nephew 66004978
Reugular food Altromin
Head light LED 16042 (magnifying glass) Eschenbach 16042
Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody Millipore, Chemicon CBL1337 Dilution (1:100)
Donkey anti-rat secondary antibody Dianova 712095153 Dilution (1:400)
Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody Dako A0564 Dilution (1:500)
Donkey anti-guinea pig secondary antibody Dianova 706-259-148 Dilution (1:400)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, (7), a007823 (2012).
  2. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343, (4), 230-238 (2000).
  3. Cantarelli, E., et al. Bone marrow as an alternative site for islet transplantation. Blood. 114, (20), 4566-4574 (2009).
  4. Echeverri, G. J., et al. Endoscopic gastric submucosal transplantation of islets (ENDO-STI): technique and initial results in diabetic pigs. American Journal of Transplantation. 9, (11), 2485-2496 (2009).
  5. Korsgren, O., et al. Optimising islet engraftment is critical for successful clinical islet transplantation. Diabetologia. 51, (2), 227-232 (2008).
  6. Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. British Journal of Surgery. 95, (12), 1449-1461 (2008).
  7. Lingwal, N., et al. Inhibition of gelatinase B (matrix metalloprotease-9) activity reduces cellular inflammation and restores function of transplanted pancreatic islets. Diabetes. 61, (8), 2045-2053 (2012).
  8. Chen, C., et al. Improved intraportal islet transplantation outcome by systemic IKK-beta inhibition: NF-kappaB activity in pancreatic islets depends on oxygen availability. American Journal of Transplantation. 11, (2), 215-224 (2011).
  9. Wang, Y., Wang, T., Zhang, L. Three aspects are critical for carrying out intraportal islet transplants successfully in a diabetes mouse model. Experimental and Clinical Transplantation. 10, (3), 302-304 (2012).
  10. Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments. (88), e50374 (2014).
  11. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  12. Rother, K. I., Harlan, D. M. Challenges facing islet transplantation for the treatment of type 1 diabetes mellitus. Journal of Clinical Investigation. 114, (7), 877-883 (2004).
  13. Su, Z., et al. Small islets are essential for successful intraportal transplantation in a diabetes mouse model. Scandinavian Journal of Immunology. 72, (6), 504-510 (2010).
  14. Rekittke, N. E., Ang, M., Rawat, D., Khatri, R., Linn, T. Regenerative Therapy of Type 1 Diabetes Mellitus: From Pancreatic Islet Transplantation to Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 22 (2016).
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Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gürol, A. O., Linn, T. Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model. J. Vis. Exp. (135), e57559, doi:10.3791/57559 (2018).More

Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gürol, A. O., Linn, T. Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model. J. Vis. Exp. (135), e57559, doi:10.3791/57559 (2018).

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