Summary
Transplante de ilhotas pancreáticas é uma maneira de conseguir normoglycemia no diabetes tipo 1. Este artigo centra-se na técnica de transplante através da rota intraportal para manter os níveis normais de glicose em ratos diabéticos.
Abstract
Transplante de ilhotas pancreáticas para reduzir a hiperglicemia é altamente bem sucedido em roedores com diabetes quimicamente induzida. O local mais comum de transplante em transplante experimental de ilhotas é a cápsula renal. No entanto, quanto menos se sabe sobre a interação das ilhotas pancreáticas com componentes do sangue, também faz sentido utilizar a abordagem da veia porta em transplante experimental de ilhotas.
Este protocolo demonstra uma técnica de transplante de ilhotas intraportal em camundongos NMRI. Estreptozotocina (180 mg/kg) é injetada intraperitonealmente para induzir hiperglicemia em ratos do destinatários. Eles são considerados como diabético a um nível de glicose do sangue não-jejum maiores que 20 mmol/L. Um dia antes da transplantação, ilhotas pancreáticas do mouse são isoladas do pâncreas de doador por digestão de colagenase; um mínimo de 350 ilhéus são utilizados por beneficiário diabético. Dependendo do rendimento de isolamento ilhéu, dois ou mais ratos de doador são utilizados por beneficiário. Depois da cultura durante a noite a 37 ° C, ilhotas são administradas para o destinatário fígado através da veia portal. Após a cirurgia, os ratos são protegidos em casas de Makrolon vermelhas e observados até está acordado. Esse protocolo mantém controle glicêmico para 120 dias em camundongos syngeneic e 15 dias em ratos alogênico.
Introduction
Transplante de ilhotas é uma abordagem promissora para tratar o tipo 1 diabetes mellitus1. A primeira tentativa de transferir um fragmento do pâncreas de ovelhas em um paciente diabético foi realizada por Watson Williams em 1893. No entanto, um grande avanço em transplante clínico ilhéu foi alcançado com o protocolo de Edmonton, e daí em diante, uma série de programas nacionais foram desenvolvidos2. No passado, vários sites, tais como a medula óssea, bolsa omental, região intramuscular, superfície da mucosa gástrica, baço e cápsula renal, foram explorados em modelos pré-clínicos, mas o sistema venoso portal é considerado como um do local adequado e eficaz para programas clínicos3,4,5,6.
Administração exógena de insulina pode ser substituída por infusão ilhéu na veia portal. Isto é considerado um local preferido, porque o suprimento de oxigênio é comparável ao que no pâncreas nativo devido a localização a jusante da confluência do portal artéria e veia. Além disso, há uma grande área de superfície, para que a estrutura tridimensional dos ilhéus pode ser preservada, e vascularização poderia ser facilitado5. Em um rato diabético destinatário, 2.000 equivalentes humanos ou suínos ilhéu ou 350 rato ilhotas são suficientes para reverter o estado hiperglicêmico7,8. Euglicêmico níveis foram relatados por 15 dias no modelo destinatário de rato de ilhotas xenogénicas e no modelo do rato para alogênico e por mais de 120 dias no syngeneic-rato para transplante.
Fatores relevantes para a eficácia do transplante de ilhotas através da veia porta são anestesia adequada, método de punção e hemostasia9. Anestesia pode ser induzida por inalação (5% de isoflurano) ou injeção (cetamina, xilazina ou pentobarbital), e as substâncias são muitas vezes combinadas. Para controle da profundidade e tempo de anestesia, deve ser dada atenção ao estado do mouse, como a cor da membrana mucosa, tampa do olho, reflexo corneal, frequência respiratória e temperatura corporal. É importante assegurar que o animal não está se esforçando e que sobreviva a operação. A temperatura pode ser mantida por aquecimento de diferentes dispositivos, como almofadas de aquecimento, lâmpadas de luz vermelha, etc. A quente chapa térmica tem sido usada para manter uma temperatura de 25-30 ° C entre o rato e a mesa de operação, o que impede a ocorrência de hipotermia. As doses dos anestésicos são importantes, porque todos eles são metabolizados pelo fígado, e a função hepática pode ser transitoriamente desordenada por infusão de suspensão o ilhéu. O ponto de punção ideal para a veia porta é a posição entre a primeira e a segunda veia tributário.
O número de Ilhéus e o volume de injeção se destina também influencia o resultado do transplante, como um volume excessivo pode aumentar a tensão de cisalhamento. Um volume de 0,2 mL é considerado adequado para o transplante de ilhotas na veia portal. A ferida puncionar (agulha de calibre 26) induz sangramento da veia portal, que precisa ser interrompido de forma oportuna e eficaz. Gaze estéril ou um dedo pode ser aplicado com pressão mínima no local da punção por cerca de 6 min parar o sangramento. Tomados juntos, portal ilhéu injeção é eficaz e oferece o Regulamento sobre níveis de glicose em modelos do rato diabético quimicamente induzida.
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Protocol
Todos os procedimentos neste protocolo foram aprovados por diretrizes e legislação de bem-estar Animal alemão. Considere o uso de 10 a 12 semanas de idade NMRI nus ratos e camundongos C57Bl/6 (doador: fêmea velha; destinatário: masculino) durante os experimentos. Use Camundongos NMRI para isolamento ilhéu. Manter os ratos sob condições definidas de acordo com regulamentos locais instalações animais.
1. indução do Diabetes por estreptozotocina
- Dia -4, medir o peso corporal de 10 a 12 semanas de idade NMRI nude os ratos e camundongos C57Bl/6, usando uma máquina de pesagem.
- De acordo com o peso do corpo medido, prepare uma dose de 180 mg/kg de estreptozotocina em 0,1 mL de soro fisiológico por rato.
Nota: Estreptozotocina deve ser recentemente preparada antes do uso e coberta com papel de alumínio, como é sensível à luz. - Os ratos syngeneic e alogênico injete cada um com uma única dose de 0,1 mL de estreptozotocina (180 mg/kg) intraperitonealmente usando uma agulha de 26-G.
- Dia -3, -2 e -1 coletam 2-4 µ l de sangue por punção das veias de cauda de ratos não jejuou.
- Use 2-4 µ l de amostra de sangue por tira teste para medir a glicose no sangue em camundongos NMRI e camundongos C57Bl/6
Nota: Neste momento, 80% dos ratos devem se tornar diabético (20 mmol/L).- Use rato para transplante de ilhotas quando seus níveis de glicose atingem 20 mmol/L.
2. isolamento de ilhotas pancreáticas de ratos
- Anestesia os ratos com cetamina (100 mg/kg de peso) e xilazina (20 mg/kg de peso corporal) por injeção intraperitoneal com uma agulha de 26-G.
Nota: Os volumes de ketamina e xilazina foram determinados de acordo com o peso corporal dos animais (0,10 mL/10g). - Manter os ratos em posição supina e desinfectar com solução de iodo-povidona. Confirme a eutanásia adequada, verificando o reflexo de pedal.
Nota: Em caso de C57Bl/6 raspe a região abdominal. - Segure a pele com uma pinça fina e fazer uma incisão com uma tesoura para expor na cavidade abdominal. Coloque uma compressa de gaze estéril, o situs intestino para a esquerda e fora da cavidade abdominal.
- Ajustar o estômago em outra direção para localizar o pâncreas e outros associados tecidos.
- Atingir a aorta e fazer um pequeno corte para drenar o sangue. Use gaze esterilizada para absorção de sangue.
- Remova cuidadosamente o intestino. Separe o pâncreas do estômago e baço.
- Excisar o pâncreas e coloque-o em um prato de Petri fresco. Remova todos os materiais indesejados, tais como gordura, usando fórceps.
- Encher uma seringa de 5 mL com 4 mL de colagenase e injetar no pâncreas, com uma agulha de 26-G (solução: 30 mg de colagenase em 12 mL de solução de Hank).
- Picar o pâncreas com uma tesoura para aumentar a área de superfície para uma melhor digestão e transferir para um tubo de tampa vermelha 12 mL.
Nota: Hank está equilibrada solução salina: HBSS 10 x (100 mL), penicilina-estreptomicina (10 mL), gentamicina (1 mL), ciprofloxacina (10 mL), HEPES (35 mL), água destilada, H2O (900 mL) - Execute uma digestão por 10 min a 37 ° C em um banho de água a agitação. Vórtice a amostra três vezes em intervalos regulares por 15 s.
- Misture o pâncreas digerido vigorosamente à mão por 3 min e coloque-o no gelo por 10 s.
- Adicione 6 mL de solução de Hank fria para parar a reação de digestão e centrifugar 560 x g por 3 min à temperatura ambiente.
- Remover o sobrenadante e dissolva a pelota em 10 mL de meio de soro (P/FCS) bezerro Parker/fetal à temperatura ambiente.
Nota: Média P/FCS: TCM-199 10 x (100 mL), FCS (50 mL), penicilina-estreptomicina (10 mL), HEPES (20 mL), água destilada, H2O (900 mL) - Identifica as ilhotas com base na sua morfologia (esferoide, cor marrom-dourado) sob um microscópio de luz. Evite ilhotas com centros de escuros. Verifique se há pureza e viabilidade através da realização de ditizona coloração sob um microscópio de luz.
Nota: Ditizona vincula-se ao íon zinco e fornece a mancha de cor vermelha para os ilhéus. - Use uma pipeta de 1 mL para contar e escolher Ilhéus sob um microscópio de luz e transferi-los para um prato de Petri fresco (60 x 15 mm), contendo 4 mL do meio P/FCS.
Nota: O volume de P /meio de FCS numa caixa de Petri não deve exceder 4 mL para garantir a disponibilidade de oxigênio. - Manter as ilhotas isoladas em 4 mL de meio de P/FCS durante a noite a 37 ° C numa incubadora.
3. preparação dos animais para transplante de ilhotas
- Remover as ilhotas isoladas da incubadora a 37 ° C e colocá-los em um banco do fluxo. Centro de Ilhéus com um movimento circular oscilante da caixa de Petri.
- Encha uma seringa de 1 mL (agulha 23-G azul) com 0,1 mL do meio P/FCS. Em seguida, adicione 350 Ilhéus em 0,3 mL de solução de Hank. Manter a seringa na posição vertical para permitir que os ilhéus resolver.
- Diminuir o volume de 0,05 mL e substituir a agulha 23-G azul com uma agulha de 26-G marrom. A mesma seringa, adicione 0,15 mL de Ficoll (médio gradiente de densidade) na parte superior para alcançar um volume final de 0,2 mL na seringa. Evite bolhas de ar.
- Mantenha a seringa na posição vertical e girá-lo ligeiramente para evitar a aglutinação de ilhotas. Os ilhéus vão resolver no cone da seringa dentro de 2-3 min.
- Medir os níveis corpo peso e sangue glicose dos ratos destinatários; os níveis de glicose do sangue devem ser em torno de 20 mmol/L.
- Anestesia os ratos com cetamina (100 mg/kg de peso) e xilazina (20 mg/kg de peso corporal) por injeção intraperitoneal com agulha 26-G.
- Coloque os ratos em posição supina sobre uma placa térmica quente (37 ° C). Verifique a profundidade da anestesia por beliscar o dedo do pé.
- Limpe a região abdominal com solução de iodo-povidona (desinfectante da pele). Para evitar os olhos de secagem, mantê-los húmida com pomada.
Nota: Em caso de C57Bl/6 raspe a região abdominal.
4. ilhéu transplante através da rota Intraportal
- No dia 0, começa com uma laparotomia, mantendo a pele com pinças e fazendo um 2-3 cm-incisão longa com uma tesoura. Lugar uma gaze esterilizada molhada comprimir em torno das bordas da ferida para mantê-lo úmido.
- Coloque a compressa de gaze estéril, o situs intestino para a esquerda e fora da cavidade abdominal.
Nota: Mantenha o intestino húmidas durante todo o processo com solução de NaCl 0,9% previamente aquecida ou gaze estéril embebido em solução salina normal. - Mova o duodeno e localize o pâncreas. Localize a veia portal situada no local ventral, empurrando para cima o pâncreas. Usar um dedo e o polegar para expor a veia porta e, uma vez expostos, punção-lo perto do fígado.
- Dentro de 1 min, lentamente e com firmeza Injete os ilhéus (0,2 mL do passo 3.4) a veia porta sob a inspeção de lupa para evitar qualquer vazamento de Ilhéus.
Nota: Após a injeção, verifique sempre para Ilhéus remanescentes na seringa. Tome 1 mL de mídia P/FCS em uma seringa, embutida em um prato de Petri fresco e contagem sob um microscópio. - Coloque um medidor estéril no local da punção e aplicar pressão com o dedo indicador (profundidade de penetração: 0,5-1 cm) por 6 min parar o sangramento.
Nota: O volume injetado não deve exceder 0,2 mL. Pressão e volume excessivo podem danificar os ilhéus devido à tensão de cisalhamento. - Coloque cuidadosamente o intestino situs, peritônio, camada muscular abdominal e fáscia volta à sua posição.
- Usando fórceps, levantar a pele, fechar a incisão do músculo com sutura de seda e a camada superior da pele com clipes de 2-3.
- Limpe a superfície com desinfectante da pele, aplique um curandeiro de ferida e coloque os ratinhos em gaiolas individuais. Ferida curandeiro fornece uma camada de acrilato resistente à água e proteger de maceração e infecção secundária.
Nota: Observar os ratos até eles recuperaram a consciência suficiente, fornecer tramadol (0,2 mg / rato) juntamente com líquidos. Neste protocolo, os ratos recuperaram da anestesia rapidamente e administração de tramadol reduziu a dor. Após 7 dias, deve curar a ferida. - Alimente os ratos com água e comida normal. Excreção de urina e consumo de alimentos e água aumentará após a injeção de estreptozotocina.
- Medir os níveis de glicose de sangue todos os dias durante a primeira semana e depois uma vez por semana em ratos syngeneic. Em camundongos alogênico, medir os níveis de glicose do sangue, três vezes por semana por até 15 dias.
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Representative Results
Estudou-se a competência de ilhotas transplantadas em ratos diabéticos induzidos quimicamente. Os ilhéus foram transplantados através do sistema venoso portal no modelo de ratos diabéticos. A relação de doador-beneficiário foi 2:1. No modelo de rato syngeneic, dois ratos de doadores foram utilizados para obter 350 Ilhéus. Os ilhéus foram então transplantados em ratos diabéticos. No dia 1 observou-se uma redução no nível de glicose no sangue após transplante, sugerindo um papel de ilhotas do pâncreas transplantados em reduzir o nível de glicose no sangue. Estreptozotocina aumentou o nível de glicose do sangue até aproximadamente 22 mmol/L. Uma queda do nível de glicose do sangue para 4,6 mmol/L (dia 1) foi observada após transplante de ilhotas (figura 1A). Normoglycemia foi mantida até 121 dias, conforme mostrado na figura 1A. O nível de glicose no corpo peso e sangue aproximadamente seguia o mesmo padrão. Após a injeção de estreptozotocina e cirurgia, diminuiu o peso do corpo. 2 dia em diante, ele tendia a se elevam em direção normal, de 25,3 g (dia 4) para 29,7 g (dia 121), como mostrado na figura 1B.
Em caso de histocompatibilidade (MHC) ratos incompatíveis, 350 ilhotas de dois camundongos C57Bl/6 (H2d) foram transplantados para diabéticos camundongos BALB/c (H2b). Após injeção de estreptozotocina, a glicose no sangue aumentou até 26,6 mmol/L. Após transplante de ilhotas, o nível de glicose no sangue caiu para 4,4 mmol/L (dia 1; Figura 2A). Normoglycemia (4.44 a 7.2 mmol/L) foi observado por até 10 dias, mas não depois de 15 dias (20.1 mmol/L). O peso corporal de ratos diabéticos caiu de 26 g (dia -3) para 23 g (dia 0) e na sequência de 21,5 g (dia 1). Após o transplante, o peso do corpo gradualmente recuperou 23 g (dia 2) a 25 g (dia 10). Devido à incompatibilidade de MHC, aumentou o nível de glicose no sangue e o peso corporal diminuiu 10 dias após o transplante de ilhotas (Figura 2B).
Figura 1 : Efeito do transplante de ilhotas syngeneic. (A) o nível de glicose no sangue foi medido em pontos de tempo diferentes em ratos diabéticos induzido por estreptozotocina (n = 3). Uma única dose de estreptozotocina (180 mg/kg) foi injetada antes do transplante de ilhotas de 350 para cada destinatário (dia 0). O nível de glicose do sangue (mmol/L) foi medido por 121 dias (dia -3: 17 ± 2,3; dia 0: 22,6 ± 1; dia 1: 4,6 ± 0,3; dia 5: 7,5 ± 0,4; e dia 121: 5,3 ± 0,09). (B) aumento no peso corporal após transplante de ilhotas. Os dados acima representam a média ± desvio-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Efeito de transplante alogênico ilhéu. (A) o nível de glicose no sangue foi medido em pontos de tempo diferentes em ratos diabéticos induzido por estreptozotocina (n = 2). Uma única dose de estreptozotocina (180 mg/kg) foi injetada antes do transplante de ilhotas pancreáticas 350 (dia 0). O nível de glicose do sangue (mmol/L) foi medido por até 15 dias (dia -1: 25,5 ± 5,3; dia 0: 26,6 ± 1,4; dia 2:8 ± 0,9; dia 10: 6,2 ± 0,08; e dia 15: 20,1 ± 1,6). Normoglycemic estado foi mantido por até 10 dias e, posteriormente, as concentrações de glucose do sangue aumentaram. (B) acompanhamento do peso corporal antes e após o transplante de ilhotas. Os dados representam a média ± desvio-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Imagens de immunostaining representante das ilhotas do pâncreas transplantadas no fígado: Lave a fígado seção (5 µm) com PBS, bloco com soro de burro de 10%, seguido de incubação overnight a 4 ° C, com o anticorpo primário de insulina (1: 500) e plaquetas célula endotelial adesão molécula PECAM-1 anticorpo primário (1: 100). No dia seguinte, mancha com anticorpos secundários por 1h, lave com PBS, mancha de contador com Hoechst e capturar as imagens com Leica microscópio fluorescente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste estudo, a rota intraportal de transplante de ilhotas é explorada. Este protocolo é altamente eficaz no alívio de estresse diabética e oferece uma oportunidade em profundidade para explorar estudos de transplante de ilhotas. Este protocolo confirma que cerca de 350 murino ilhotas são capazes de reverter o estado hiperglicêmico. Além disso, nenhum dos ratos morreu durante o procedimento, e o controle glicêmico foi alcançado em todos os destinatários. Níveis de glicose no corpo peso e sangue foram gravados regularmente para refletir a competência, padrão e funcionalidade de ilhotas transplantadas em reverter a hiperglicemia. Em camundongos syngeneically transplantados, níveis de glicose no sangue foram medidos todos os dias durante a primeira semana e uma vez por semana depois disso. Após o transplante de ilhotas, condição hipóxica e outros fatores desencadear as células endoteliais secretam fatores de pro-angiogênico como VEGF após 14 dias e, assim, aumentar o enxerto vascular no fígado, como mostrado na Figura 3. Em camundongos alogênico, níveis de glicose no sangue foram medidos três vezes por semana por até 15 dias. Após 15 dias, ilhotas transplantadas foram rejeitadas no modelo alogênico devido a um ataque imune, a menos que drogas imunossupressoras são administradas
Existem vários protocolos de isolamento ilhéu publicados na literatura10,11. O mais simples é escolher ilhotas manualmente com base no seu tamanho e morfologia após digestão de colagenase. Este é um dos passos cruciais para selecionar somente Ilhéus e evitar as células exócrinas, detritos, etc. Selected Ilhéus deve ser mantidas a 37 ° C durante a noite em uma incubadora para permitir-lhes para se recuperar do estresse mecânico encontrado durante a digestão procedimento. Seleção da dose de estreptozotocina e o transplante de ilhotas intraportal também são chave para este protocolo. A temperatura corporal deve ser regulamentada e mantido usando uma placa térmica durante todo o procedimento cirúrgico. Gaze estéril deve ser aplicada com a pressão mínima para 6 min no local da punção para evitar sangramento. Os ratos devem ser mantidos sob observação até recobra a consciência suficiente.
Determinadas etapas neste protocolo podem ser modificadas. Por exemplo, a otimização do tempo de digestão e o volume de colagenase podem aumentar o rendimento de ilhotas em cepas de ratos diferentes. Em vez da indução rápida do diabetes (180 mg/kg de estreptozotocina), aumentar lentamente a hiperglicemia pode ser induzida usando uma dose mais baixa durante um período prolongado de tempo (por exemplo, 40 mg/kg/estreptozotocina dia durante 5 dias consecutivos). Isto poderia fornecer melhor enxertia de ilhotas transplantadas. Outros sites, tais como a medula óssea, bolsa omental, região intramuscular, superfície da mucosa gástrica, baço e rins podem ser explorados como alternativas para a veia intraportal.
Pobre enxertia de ilhotas transplantadas é ainda uma grande preocupação em ensaios clínicos. Outros incluem uma escassez de doadores, inconsistências na manutenção de níveis de glicose no sangue após o transplante, imunossupressão e reações mediadas por sangue12,13. Falta de métodos para avaliar a enxertia adequada é outro obstáculo. Transplante de ilhotas de rastreamento por ressonância magnética ou imagens de bioluminescência possivelmente poderia substituir os métodos clássicos tais como o teste de tolerância à glicose ou peptídeo-c. No futuro, poderá fornecer as células-tronco transplantadas juntamente com ilhotas nutricional e imunomoduladores suporte14.
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Disclosures
Todos os autores declaram que não têm nenhum conflito de interesses.
Acknowledgments
Nós gostaríamos de reconhecer Gundula Hertl o seu apoio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6 mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| BALB/c mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| NMRI nude mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| Ketamine | Bela-pharm | ||
| Xylazine | CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH | ||
| Syringe, 23G and 26G needle | BD | ||
| Petri Dish | Falcon | 303800 | |
| NaCl | Carl Roth | 351007 | |
| Sterile Gauze | Fuhrmann | 7647-14-5 | |
| Shaking Water bath | Kotterman | 1501 | |
| Scissors | Braun | 1501 | |
| Glucose Meter | One Touch | ||
| Warm Thermal Plate | Thermo Fisher | ||
| Braunol (povidone-iodide solution) | B.Braun Melsungen AG | 3864154 | |
| Liposic Edo - Sprinkled Ointment (eye ointment) | Dr. G Mann Chem.-Pharm. GmbH | ||
| Incubator | Fa. Roth | ||
| Flow Bench | Herdus | ||
| Ficoll | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| 5-0 Silk Suture Vicryl | Braun | (7.5 *1.75mm) | |
| Michel Clamps (clips) | Aesculap | BN507R | |
| P/FCS Solution | Gibco | 21180-021 | |
| TCM-199 (10x) | Gibco | 21180-021 | |
| FCS | Biowest | S1810-500 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES (1 M) | Biochrom | L 1613 | |
| Gentamycin | Ratiopharm | ||
| Ciprofloxacin | Fresenius Kabi | ||
| Hank's Solution | Gibco | 14060-040 | |
| Collagenase | Roche | 11213865001 | |
| Streptozotocin | Calbiochem | 572204 | |
| OPSITE-spray (wound healer) | Smith and nephew | 66004978 | |
| Reugular food | Altromin | ||
| Head light LED 16042 (magnifying glass) | Eschenbach | 16042 | |
| Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody | Millipore, Chemicon | CBL1337 | Dilution (1:100) |
| Donkey anti-rat secondary antibody | Dianova | 712095153 | Dilution (1:400) |
| Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody | Dako | A0564 | Dilution (1:500) |
| Donkey anti-guinea pig secondary antibody | Dianova | 706-259-148 | Dilution (1:400) |
References
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