Summary
Trasplante de islotes pancreáticos es una manera de lograr normoglycemia en diabetes tipo 1. Este artículo se centra en la técnica de trasplante vía intraportal para mantener niveles normales de glucosa en ratones diabéticos.
Abstract
Trasplante de islotes pancreáticos para reducir la hiperglucemia es exitoso en roedores con diabetes inducida químicamente. El sitio más común de trasplante en el trasplante de islote experimental es la cápsula del riñón. Sin embargo, como se sabe menos acerca de la interacción de islotes pancreáticos con los componentes de la sangre, también tiene sentido utilizar el enfoque de la vena porta en el trasplante de islote experimental.
Este protocolo muestra una técnica de trasplante intraportal islotes en ratones desnudos NMRI. Streptozotocin (180 mg/kg) se inyecta por vía intraperitoneal para inducir hiperglucemia en ratones receptores. Se consideran como diabético a un nivel de glucosa en sangre no ayuno mayores que 20 mmol/L. Un día antes del trasplante, islotes pancreáticos de ratón son aislados de páncreas de donante por digestión de colagenasa; un mínimo de 350 islotes son utilizados por beneficiario diabético. Según el rendimiento de aislamiento de islotes pancreáticos, ratones de donantes de dos o más son utilizados por destinatario. Después de la cultura durante la noche a 37 ° C, islotes son administrados en el destinatario hígado vía la vena porta. Después de la cirugía, los ratones son protegidos en casas de Makrolon rojo y observados hasta despierto. Este protocolo mantiene control de la glucemia durante 120 días en ratones syngeneic y 15 días en ratones alogénicos.
Introduction
Trasplante de islotes pancreáticos es un enfoque prometedor para tratar tipo 1 diabetes mellitus1. El primer intento de transferencia de un fragmento de páncreas de oveja en un paciente diabético fue realizado por Watson Williams en 1893. Sin embargo, se logró un importante avance en el trasplante clínico de islotes pancreáticos con el protocolo de Edmonton, y después de eso, una serie de programas nacionales fueron desarrollados2. En el pasado, varios sitios, como la médula ósea, bolsa omental, intramuscular región, superficie de la mucosa gástrica, bazo y la cápsula renal, fueron explorados en modelos preclínicos, pero el sistema venoso portal se considera como uno de los sitio conveniente y eficaz para los programas clínicos3,4,5,6.
La administración exógena de insulina puede ser sustituida por infusión de islotes en la vena porta. Esto se considera un sitio preferido porque el suministro de oxígeno es comparable a la del páncreas nativo debido a la ubicación aguas abajo de la confluencia de la arteria porta y la vena. Además, hay una gran superficie, por lo que la estructura tridimensional de los islotes puede ser preservada y vascularización puede ser facilitado5. En un ratón diabético destinatario, 2.000 equivalentes del islote humano o porcino o ratón 350 islotes son suficientes para revertir el estado hiperglucémico7,8. Hiperinsulinémico niveles registraron durante 15 días en el modelo de receptor de ratón de islotes xenogeneicos y en el modelo de ratón a ratón alogénico y para más de 120 días del trasplante syngeneic de ratón a ratón.
Factores pertinentes a la eficacia del trasplante de islotes pancreáticos a través de la vena porta son anestesia adecuada, método de puntura y hemostasia9. La anestesia puede ser inducida por inhalación (5% isoflurano) o inyección (ketamina xilacina y pentobarbital), y a menudo se combinan las sustancias. Para el control de la profundidad y tiempo de anestesia, debe prestarse atención al estado del ratón, como el color de la mucosa, párpado, reflejo corneal, la frecuencia respiratoria y temperatura corporal. Es importante asegurarse de que el animal no está luchando y que sobrevive a la operación. La temperatura se puede mantener por aparatos de calefacción diferentes, tales como cojines de calefacción, focos de luz roja, etc. A la placa termal caliente se ha utilizado para mantener una temperatura de 25-30 ° C entre el ratón y la tabla de la operación, que previene la aparición de hipotermia. Las dosis de los anestésicos son importantes, ya que todos ellos son metabolizados por el hígado, y función hepática puede ser transitoriamente desordenada por la infusión de la suspensión del islote. El punto ideal de punción de la vena porta es la posición entre la primera y la segunda vena tributaria.
El número de islotes y el volumen de inyección previsto también influir en el resultado del trasplante, como un volumen excesivo puede aumentar la tensión de esquileo. Un volumen de 0.2 mL se considera apropiado para el trasplante de islotes en la vena porta. La herida pinchar (aguja de calibre 26) induce sangrado de la vena porta, que necesita ser detenido de manera oportuna y eficaz. Gasa estéril o un dedo se puede aplicar con una mínima presión en el sitio de la punción durante unos 6 min a detener el sangrado. Tomado junto, portal islote inyección es eficaz y ofrece regulación de niveles de glucosa en sangre en modelos de ratón diabético químicamente inducida.
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Protocol
Todos los procedimientos de este protocolo han sido aprobados por normas y ley de Bienestar Animal de alemán. Considere el uso de ratones desnudos de 10 a 12 semanas de edad NMRI y ratones C57Bl/6 (donante: mujer vieja; destinatario: masculino) a lo largo de los experimentos. Utilizar ratones desnudos NMRI para aislamiento de islotes pancreáticos. Mantener los ratones bajo condiciones definidas según las regulaciones locales de Animalario.
1. inducción de la Diabetes por Streptozotocin
- Día -4, medir el peso corporal de 10 a 12 semanas de edad NMRI desnudas ratones y ratones C57Bl/6 con una máquina de pesaje.
- Según el peso del cuerpo medido, preparar una dosis de 180 mg/kg de streptozotocin en 0,1 mL de solución salina por ratón.
Nota: Streptozotocin debe ser recién preparada antes de su uso y cubierto con papel de aluminio, ya que es sensible a la luz. - Inyectar a los ratones syngeneic y alogénicos cada uno con una dosis única de 0,1 mL del streptozotocin (180 mg/kg) por vía intraperitoneal utilizando una aguja de 26 G.
- Día -3, -2 y -1 recogen 2-4 μL de sangre por punción de las venas de la cola de los ratones no ayunó.
- Usar 2-4 μL de la muestra de sangre por tira reactiva para medir la glucosa en sangre en ratones desnudos NMRI y ratones C57Bl/6
Nota: En este punto, el 80% de los ratones debe llegar a ser diabético (20 mmol/L).- Utilizar ratones para el trasplante de islote cuando sus niveles de glucosa en sangre 20 mmol/L.
2. aislamiento de islotes pancreáticos de ratones
- Anestesiar los ratones con ketamina (100 mg/kg de peso corporal) y xilacina (20 mg/kg de peso corporal) por inyección intraperitoneal con una aguja de 26 G.
Nota: Los volúmenes de ketamina y xilacina se determinaron según el peso corporal de los animales (0,10 mL/10 g). - Mantener los ratones en posición supina y desinfectar con solución de povidona-yodo. Confirmar la correcta eutanasia activando el reflejo pedal.
Nota: En caso de C57Bl/6 afeite la región abdominal. - Mantener la piel con unas pinzas finas y hacer una incisión de línea media con unas tijeras para exponer la cavidad abdominal. Coloque el situs del intestino a la izquierda y fuera de la cavidad abdominal sobre una compresa de gasa estéril.
- Ajustar el estómago en otra dirección para localizar el páncreas y otros asociados los tejidos.
- Llegar a la aorta y hacer una pequeña incisión para drenar la sangre. Usar gasa estéril para la absorción de la sangre.
- Retire con cuidado el intestino. Separar el páncreas del estómago y el bazo.
- Suprimir el páncreas y colocar en una placa Petri fresca. Retire todos los materiales no deseados, tales como grasa, con unas pinzas.
- Llene una jeringa de 5 mL con 4 mL de colagenasa e inyecte en el páncreas con una aguja de 26 G (solución de stock: 30 mg de colagenasa en 12 mL de solución de Hank).
- Pique el páncreas con tijeras para aumentar el área superficial para una mejor digestión y transfiéralo a un tubo de tapa roja de 12 mL.
Nota: Hank equilibrada solución de sal: HBSS 10 x (100 mL), penicilina-estreptomicina (10 mL), gentamicina (1 mL), ciprofloxacino (10 mL), HEPES (35 mL), agua destilada H2O (900 mL) - Realizar una digestión durante 10 min a 37 ° C en un baño. Vórtice la muestra tres veces a intervalos regulares de 15 s.
- Mezcla el páncreas digerido vigorosamente a mano durante 3 minutos y coloque en hielo por 10 s.
- Añadir 6 mL de solución de Hank fría para detener la reacción de digestión y centrifugar a 560 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
- Quite el sobrenadante y disolver el precipitado en 10 mL de medio de suero (P/FCS) becerro fetal Parker a temperatura ambiente.
Nota: Medio P/FCS: TCM-199 10 x (100 mL), FCS (50 mL), penicilina-estreptomicina (10 mL), HEPES (20 mL), agua destilada H2O (900 mL) - Identificar los islotes basados en su morfología (esferoide, color dorado) bajo un microscopio de luz. Evite los islotes con centros oscuros. Comprobar la pureza y viabilidad realizando ditizona tinción bajo un microscopio de luz.
Nota: Ditizona se une al ion zinc y proporciona color rojo colorante a los islotes. - Usar una pipeta de 1 mL para contar y dedazo islotes bajo un microscopio y transferirlas a un fresco plato de Petri (60 x 15 mm) que contiene 4 mL de medio P/FCS.
Nota: El volumen de P /medio de FCS en el plato de Petri no debe exceder 4 mL para asegurar la disponibilidad de oxígeno. - Mantener los islotes aislados en 4 mL de medio P/FCS durante la noche a 37 ° C en una incubadora.
3. preparación de animales para el trasplante de islotes pancreáticos
- Quitar los islotes aislados de la incubadora de 37 ° C y colocarlos en un banco del flujo. Centro de los islotes con un movimiento circular de la placa de Petri.
- Llene una jeringa de 1 mL (aguja de 23 G azul) con 0,1 mL de medio P/FCS. Luego, agregar 350 islotes en 0,3 mL de solución de Hank. Mantenga la jeringa en posición vertical para permitir que los islotes resolver.
- Disminuir el volumen de 0.05 mL y reemplazar la aguja 23 G azul con una aguja 26-G marrón. En la misma jeringa, agregar 0,15 mL de Ficoll (medio de gradiente de densidad) en la parte superior para llegar a un volumen final de 0.2 mL en la jeringa. Evitar las burbujas de aire.
- Mantener la jeringa en posición vertical y gire ligeramente para evitar la aglutinación de islotes. Los islotes se asentarán en el cono de la jeringa dentro de 2-3 minutos.
- Medir el cuerpo peso y sangre glucosa niveles de los ratones receptores; los niveles de glucosa en sangre deben ser alrededor de 20 mmol/L.
- Anestesiar los ratones con ketamina (100 mg/kg de peso corporal) y xilacina (20 mg/kg de peso corporal) por inyección intraperitoneal con aguja 26-G.
- Coloque el ratón en posición supina en una placa térmica caliente (37 ° C). Verificar la profundidad de la anestesia pellizcando el dedo del pie.
- Limpiar la región abdominal con solución de povidona yodada (desinfectante de la piel). Para evitar que los ojos de secado, mantenerlos húmedos con ungüento oftálmico.
Nota: En caso de C57Bl/6 afeite la región abdominal.
4. islote trasplante vía Intraportal
- En el día 0, empezar con una laparotomía por sostener la piel con pinzas y hacer un 2-3 cm-incisión de línea media larga con una tijera. Coloque una gasa húmeda estéril comprimir alrededor de los bordes de la herida para mantenerlo húmedo.
- Coloque el situs del intestino a la izquierda y fuera de la cavidad abdominal sobre la compresa de gasa estéril.
Nota: Mantenga el intestino húmedo durante todo el procedimiento con solución de NaCl al 0.9% precalentada o gasa estéril humedecido en solución salina normal. - Mueva el duodeno y localizar el páncreas. Localizar la vena portal situada en el sitio ventral empujando hacia arriba el páncreas. Utilizar un dedo y el pulgar para exponer la vena porta y, una vez expuesto, la puntura cerca del hígado.
- Dentro de 1 minuto, lenta y constantemente inyectar los islotes (0.2 mL del paso 3.4) en la vena porta bajo la inspección de la lupa para evitar cualquier fuga de islotes.
Nota: Después de la inyección, compruebe siempre para islotes restantes en la jeringa. Tomar 1 mL de media P/FCS en una jeringa, al ras en un fresco plato de Petri y conteo al microscopio. - Coloque un calibrador de estéril en el sitio de punción y aplicar presión con el dedo índice (profundidad de la penetración: 0.5-1 cm) durante 6 minutos detener el sangrado.
Nota: El volumen inyectado no debe exceder 0,2 mL. Presión y un volumen excesivo pueden dañar los islotes debido a tensión de esquileo. - Con cuidado coloque el situs del intestino, peritoneo, capa muscular abdominal y faja en su lugar.
- Con unas pinzas, levantar la piel, cerca de la incisión del músculo con sutura absorbible de seda y capa superior de la piel con pinzas de 2-3.
- Limpie la superficie con desinfectante de la piel, aplicar un curador de la herida y colocar los ratones en jaulas individuales. Sanador de la herida proporciona una capa de acrilato resistente al agua y proteger de la maceración y la infección secundaria.
Nota: Observar los ratones hasta que ha recuperado la conciencia suficiente, proporcionar tramadol (0,2 mg por ratón) junto con líquidos. En este protocolo, ratones rápidamente se recuperaron de la anestesia y la administración de tramadol redujo el dolor. Después de 7 días, la herida debe sanar. - Alimentar los ratones con agua y comida regular. Aumentará la excreción alimentos y agua de consumo y de la orina después de la inyección del streptozotocin.
- Medir los niveles de glucosa en sangre todos los días durante la primera semana y luego una vez a la semana en ratones syngeneic. En los ratones alogénicos, medir los niveles de glucosa en sangre tres veces a la semana durante un máximo de 15 días.
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Representative Results
La competencia de los islotes trasplantados fue estudiada en ratones diabéticos inducidos químicamente. Los islotes fueron trasplantados a través del sistema venoso portal en modelo de ratones diabéticos. La relación de donantes y receptores fue 2:1. En el modelo de syngeneic de ratón, dos ratones donantes fueron utilizados para obtener 350 islotes. Las islas entonces fueron transplantadas en ratones diabéticos. Se observó una reducción en el nivel de glucosa en sangre el día 1 después del trasplante, sugiriendo un papel de islotes pancreáticos transplantados en reducir el nivel de glucosa en sangre. Streptozotocin aumentó el nivel de glucosa en sangre hasta cerca de 22 mmol/L. Una caída en el nivel de glucosa en sangre a 4,6 mmol/L (día 1) se observó después del trasplante de islotes pancreáticos (figura 1A). Normoglycemia se mantuvo durante 121 días, como se muestra en la figura 1A. El nivel de glucosa de sangre y el peso de cuerpo más o menos había seguido el mismo patrón. Después de la cirugía y la inyección streptozotocin, disminución de peso corporal. Desde el día 2 hacia adelante, tendió a elevarse hacia la normal, de 25,3 g (día 4) a 29,7 g (día 121), como se muestra en la figura 1B.
En el caso de histocompatibilidad (MHC) ratones no coincidentes, 350 islotes de ratones C57Bl/6 (H2d) dos fueron transplantadas en ratones BALB/c (H2b) diabéticos. Después de la inyección del streptozotocin, la glucosa en la sangre aumenta hasta 26,6 mmol/L. Después del trasplante de islotes pancreáticos, el nivel de glucosa en sangre disminuyó a 4.4 mmol/L (día 1; Figura 2A). Normoglycemia (4,44 a 7,2 mmol/L) se observó un máximo de 10 días, pero no después de 15 días (20,1 mmol/L). El peso corporal de ratones diabéticos se redujo de 26 g (día -3) 23 g (día 0) y a 21,5 g (día 1). Después del trasplante, el peso del cuerpo poco a poco se recuperó de 23 g (día 2) a 25 g (día 10). Debido a la incompatibilidad de MHC, el nivel de glucosa en sangre aumenta y el peso corporal disminuyó 10 días después del trasplante de islotes pancreáticos (figura 2B).
Figura 1 : Efecto del trasplante de islotes pancreáticos syngeneic. (A) el nivel de glucosa en sangre se midió en diferentes puntos temporales en ratones diabéticos inducida (n = 3). Se inyectó una dosis única de streptozotocin (180 mg/kg) antes del trasplante de 350 islotes para cada destinatario (día 0). Se midió el nivel de glucosa en sangre (mmol/L) hasta 121 días (día -3: 17 ± 2.3; día 0: 22,6 ± 1, día 1: 4.6 ± 0.3; día 5: 7.5 ± 0.4; y día 121: 5.3 ± 0,09). (B) aumento de peso después del trasplante del islote. Los datos anteriores representan la media ± la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Efecto del trasplante alogénico de islotes pancreáticos. (A) el nivel de glucosa en sangre se midió en diferentes puntos temporales en ratones diabéticos inducida (n = 2). Se inyectó una dosis única de streptozotocin (180 mg/kg) antes del trasplante de islotes pancreáticos 350 (día 0). Se midió el nivel de glucosa en sangre (mmol/L) hasta 15 días (día -1: 25,5 ± 5.3; día 0: 26,6 ± 1.4; día 2:8 ± 0.9; día 10: 6.2 ± 0.08; y día 15: 20,1 ± 1.6). Normoglucémicos estado se mantuvo durante 10 días y posteriormente, aumentaron de las concentraciones de glucosa de la sangre. (B) seguimiento de peso corporal antes y después del trasplante del islote. Los datos representan la media ± la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Cuadro representante immunostaining de islotes pancreáticos transplantados en hígado: la sección de hígado (5 μm) de lavado con PBS, bloque con el suero de burro 10% seguido de incubación durante la noche a 4 ° C con anticuerpo primario de insulina (1: 500) y de la plaqueta células endoteliales adherencia molécula PECAM-1 anticuerpo primario (1: 100). Al día siguiente, tinción con anticuerpos secundarios para 1 h, lavar con PBS, mancha de contador con Hoechst y capturar las imágenes con el microscopio de fluorescencia Leica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este estudio se explora la vía intraportal de trasplante de islotes pancreáticos. Este protocolo es muy eficaz en el alivio de estrés diabético y ofrece una profunda oportunidad de explorar estudios de trasplante de islotes pancreáticos. Este protocolo confirma que cerca de 350 islotes murinos son capaces de revertir el estado hiperglucémico. Por otra parte, ninguno de los ratones murió durante el procedimiento y control de la glucemia fue alcanzado en todos los destinatarios. Niveles de glucosa en sangre y el peso corporal se registraron regularmente para reflejar la competencia, estándar y funcionalidad de los islotes trasplantados en la reversión de la hiperglucemia. En ratones trasplantados syngeneically, niveles de glucosa en sangre se midieron diariamente durante la primera semana y una vez por semana después de eso. Después de trasplante de islotes, condición hipóxica y otros factores activan las células endoteliales secretan factores pro-angiogénicos como VEGF después de 14 días y así aumentar el injerto vascular en el hígado, como se muestra en la figura 3. En los ratones alogénicos, niveles de glucosa en sangre se midieron tres veces a la semana durante un máximo de 15 días. Después de 15 días, islotes trasplantados fueron rechazados en el modelo de trasplante allogeneic debido a un ataque inmune, a menos que se administran fármacos inmunosupresores
Hay varios protocolos de aislamiento de islotes publicados en la literatura10,11. La más sencilla es escoger islotes manualmente sobre la base de su morfología y tamaño después de la digestión de la colagenasa. Este es uno de los pasos más importantes para seleccionar sólo islotes y debe mantenerse evitar que las células exocrinas, escombros, etc. seleccionadas islotes a 37 ° C durante la noche en una incubadora para que puedan recuperarse de los esfuerzos mecánicos durante la digestión procedimiento. La selección de la dosis del streptozotocin y el trasplante de islote intraportal son también clave en el presente Protocolo. La temperatura corporal debe ser regulada y mantenido usando una placa térmica durante todo el procedimiento quirúrgico. Gasa estéril se debe aplicar con presión mínima de 6 minutos en el sitio de punción para evitar sangrado. Ratones se deben mantenerse bajo observación hasta que recupere la conciencia suficiente.
Ciertos pasos en el presente Protocolo pueden ser modificados. Por ejemplo, la optimización del tiempo de digestión y el volumen de la colagenasa pueden aumentar el rendimiento de islotes en cepas de ratones diferentes. En vez de la rápida inducción de la diabetes (streptozotocin de 180 mg/kg), poco a poco aumentar la hiperglucemia puede ser inducida con una dosis más baja durante un período prolongado de tiempo (por ejemplo, 40 mg/kg/streptozotocin día por 5 días consecutivos). Esto podría proporcionar mejor engraftment de islotes trasplantados. Otros sitios, como la médula ósea, bolsa omental, intramuscular región, superficie de la mucosa gástrica, bazo y riñón pueden explorarse como alternativas a la vena intraportal.
Pobre engraftment de islotes trasplantados sigue siendo una preocupación importante en los ensayos clínicos. Otros incluyen una escasez de donantes, la incoherencias en el mantenimiento de niveles de glucosa en sangre después de trasplante, la inmunosupresión y la reacciones mediadas por la sangre12,13. Falta de métodos para evaluar el engraftment adecuado es otro obstáculo. Seguimiento de trasplantados islotes por resonancia magnética o la proyección de imagen de bioluminiscencia posiblemente podría reemplazar métodos clásicos como la prueba de tolerancia a la glucosa o el c-peptide. En el futuro, las células madre trasplantadas junto con islotes podría proporcionar nutricional e inmunomodulador apoyo14.
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Disclosures
Todos los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Nos gustaría reconocer Gundula Hertl por su apoyo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6 mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| BALB/c mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| NMRI nude mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| Ketamine | Bela-pharm | ||
| Xylazine | CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH | ||
| Syringe, 23G and 26G needle | BD | ||
| Petri Dish | Falcon | 303800 | |
| NaCl | Carl Roth | 351007 | |
| Sterile Gauze | Fuhrmann | 7647-14-5 | |
| Shaking Water bath | Kotterman | 1501 | |
| Scissors | Braun | 1501 | |
| Glucose Meter | One Touch | ||
| Warm Thermal Plate | Thermo Fisher | ||
| Braunol (povidone-iodide solution) | B.Braun Melsungen AG | 3864154 | |
| Liposic Edo - Sprinkled Ointment (eye ointment) | Dr. G Mann Chem.-Pharm. GmbH | ||
| Incubator | Fa. Roth | ||
| Flow Bench | Herdus | ||
| Ficoll | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| 5-0 Silk Suture Vicryl | Braun | (7.5 *1.75mm) | |
| Michel Clamps (clips) | Aesculap | BN507R | |
| P/FCS Solution | Gibco | 21180-021 | |
| TCM-199 (10x) | Gibco | 21180-021 | |
| FCS | Biowest | S1810-500 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES (1 M) | Biochrom | L 1613 | |
| Gentamycin | Ratiopharm | ||
| Ciprofloxacin | Fresenius Kabi | ||
| Hank's Solution | Gibco | 14060-040 | |
| Collagenase | Roche | 11213865001 | |
| Streptozotocin | Calbiochem | 572204 | |
| OPSITE-spray (wound healer) | Smith and nephew | 66004978 | |
| Reugular food | Altromin | ||
| Head light LED 16042 (magnifying glass) | Eschenbach | 16042 | |
| Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody | Millipore, Chemicon | CBL1337 | Dilution (1:100) |
| Donkey anti-rat secondary antibody | Dianova | 712095153 | Dilution (1:400) |
| Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody | Dako | A0564 | Dilution (1:500) |
| Donkey anti-guinea pig secondary antibody | Dianova | 706-259-148 | Dilution (1:400) |
References
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