Summary
अग्नाशय टाप ट्रांसप्लांटेशन प्रकार में normoglycemia प्राप्त करने के लिए एक तरीका है 1 मधुमेह. यह लेख मधुमेह चूहों में सामान्य ग्लूकोज का स्तर बनाए रखने के लिए intraportal मार्ग के माध्यम से प्रत्यारोपण तकनीक पर केंद्रित है ।
Abstract
अग्नाशय टाप ट्रांसप्लांटेशन hyperglycemia को कम करने के लिए रासायनिक प्रेरित मधुमेह के साथ कुतर में अत्यधिक सफल है । प्रायोगिक टाप प्रत्यारोपण में सबसे आम प्रत्यारोपण स्थल किडनी कैप्सूल है । हालांकि, के रूप में कम रक्त के घटक के साथ अग्नाशय के टाप की बातचीत के बारे में जाना जाता है, यह भी प्रयोगात्मक टाप ट्रांसप्लांटेशन में पोर्टल नस दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए समझ में आता है ।
यह प्रोटोकॉल NMRI न्यूड चूहों में एक intraportal टाप ट्रांसप्लांटेशन तकनीक को दर्शाता है । Streptozotocin (१८० मिलीग्राम/kg) intraperitoneally इंजेक्शन है प्राप्तकर्ता चूहों में hyperglycemia प्रेरित करने के लिए । वे एक गैर उपवास पर मधुमेह के रूप में माना जाता है रक्त शर्करा के स्तर से अधिक 20 mmol/ एक दिन पहले प्रत्यारोपण करने के लिए, माउस अग्नाशय के टाप collagenase पाचन द्वारा दाता अग्ंयाशय से अलग कर रहे हैं; ३५० के एक ंयूनतम टाप मधुमेह प्राप्तकर्ता प्रति उपयोग किया जाता है । टाप अलगाव उपज पर निर्भर करता है, दो या अधिक दाता चूहों प्राप्तकर्ता प्रति उपयोग किया जाता है । ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात संस्कृति के बाद, टाप पोर्टल नस के माध्यम से प्राप्तकर्ता जिगर में प्रशासित रहे हैं । सर्जरी के बाद, चूहों लाल Makrolon घरों में संरक्षित कर रहे हैं और जाग रहे हैं जब तक मनाया. यह प्रोटोकॉल syngeneic चूहों में १२० दिनों के लिए glycemic नियंत्रण और allogeneic चूहों में 15 दिनों के लिए बनाए रखता है ।
Introduction
टाप ट्रांसप्लांटेशन प्रकार का इलाज करने के लिए एक होनहार दृष्टिकोण है 1 मधुमेह1। एक मधुमेह रोगी में एक भेड़ अग्नाशय टुकड़ा हस्तांतरण करने के लिए पहला प्रयास १८९३ में वाटसन विलियंस द्वारा किया गया था । हालांकि, नैदानिक टाप प्रत्यारोपण में एक बड़ी सफलता एडमोंटन प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त किया गया था, और उसके बाद, राष्ट्रीय कार्यक्रमों की एक श्रृंखला में विकसित किया गया था2। अतीत में, इस तरह के अस्थि मज्जा, omental थैली, इंट्रामस्क्युलर क्षेत्र, गैस्ट्रिक श्लैष्मिक सतह, तिल्ली, और गुर्दे कैप्सूल के रूप में कई साइटों, पूर्व नैदानिक मॉडल में पता लगाया गया, लेकिन पोर्टल शिरापरक प्रणाली उपयुक्त और प्रभावी साइट में से एक के रूप में माना जाता है नैदानिक कार्यक्रमों के लिए3,4,5,6.
इंसुलिन के Exogenous प्रशासन के पोर्टल नस में टाप अर्क द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है । यह एक पसंदीदा स्थल माना जाता है क्योंकि ऑक्सीजन की आपूर्ति है कि मूल निवासी अग्न्याशय में पोर्टल धमनी और नस के संगम के स्थान बहाव के कारण के बराबर है । इसके अलावा, वहाँ एक बड़ा सतह क्षेत्र है, ताकि टाप के तीन आयामी संरचना संरक्षित किया जा सकता है, और vascularization की सुविधा हो सकती है5. एक प्राप्तकर्ता मधुमेह माउस में, २,००० मानव या सुअर का टाप समकक्ष या ३५० माउस टाप hyperglycemic राज्य 7, 8 रिवर्स करने के लिए पर्याप्त हैं । Euglycemic स्तर xenogeneic टाप के माउस प्राप्तकर्ता मॉडल में 15 दिनों के लिए और allogeneic माउस-से-माउस मॉडल में रिपोर्ट किए गए थे, और syngeneic माउस-से-माउस ट्रांसप्लांटेशन में १२० से अधिक दिनों के लिए ।
पोर्टल नस के माध्यम से टाप ट्रांसप्लांटेशन की प्रभावकारिता के लिए प्रासंगिक कारकों उचित संज्ञाहरण, पंचर की विधि, और रक्तस्तम्भन9रहे हैं । संज्ञाहरण साँस लेना द्वारा प्रेरित किया जा सकता (5% isoflurane) या इंजेक्शन (ketamine, xylazine, या pentobarbital), और पदार्थ अक्सर संयुक्त कर रहे हैं. गहराई और संज्ञाहरण के समय के नियंत्रण के लिए, ध्यान इस तरह के श्लेष्मा झिल्ली, आँख ढक्कन, corneal पलटा, श्वसन दर, और शरीर के तापमान के रंग के रूप में, माउस की स्थिति के लिए भुगतान किया जाना चाहिए । यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि पशु संघर्ष नहीं है और यह ऑपरेशन बचता है । तापमान इस तरह हीटिंग पैड, लाल बत्ती बल्ब, आदि के रूप में अलग हीटिंग उपकरणों, द्वारा बनाए रखा जा सकता है । एक गर्म थर्मल प्लेट माउस और आपरेशन टेबल, जो की घटना से बचाता है के बीच 25-30 डिग्री सेल्सियस के तापमान को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया गया है हाइपोथर्मिया. निश्चेतक की खुराक महत्वपूर्ण हैं, उन सभी के रूप में जिगर से metabolized हैं, और यकृत समारोह क्षणिक टाप सस्पेंशन के अर्क द्वारा परिक्रमा किया जा सकता है. पोर्टल नस के लिए आदर्श पंचर बिंदु पहली और दूसरी उपनदी नस के बीच की स्थिति है ।
एक अत्यधिक मात्रा कतरनी तनाव में वृद्धि हो सकती है के रूप में, टाप की संख्या और इरादा इंजेक्शन की मात्रा भी प्रत्यारोपण के परिणाम को प्रभावित करते हैं । एक ०.२ मिलीलीटर की मात्रा पोर्टल नस में टाप प्रत्यारोपण के लिए उपयुक्त माना जाता है । puncturing घाव (26 गेज सुई) पोर्टल नस, जो एक समय पर और प्रभावी तरीके से बंद कर दिया जाना चाहिए से खून बह रहा लाती है । बाँझ धुंध या एक उंगली रक्तस्राव को रोकने के लिए के बारे में 6 मिनट के लिए पंचर की साइट पर न्यूनतम दबाव के साथ लागू किया जा सकता है । एक साथ लिया, पोर्टल टाप इंजेक्शन प्रभावी है और रासायनिक प्रेरित मधुमेह माउस मॉडल में रक्त शर्करा के स्तर पर विनियमन प्रदान करता है ।
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Protocol
इस प्रोटोकॉल में सभी प्रक्रियाओं जर्मन पशु कल्याण कानून और दिशा निर्देशों के द्वारा अनुमोदित किया गया है । प्रयोग करने पर विचार करें 10-to 12-सप्ताहीय NMRI नग्न चूहों और C57Bl/6 चूहों (दाता: पुरानी महिला; प्राप्तकर्ता: पुरुष) प्रयोगों के दौरान । टाप अलगाव के लिए NMRI न्यूड चूहों का प्रयोग करें । स्थानीय पशु सुविधा नियमों के अनुसार चूहों को निर्धारित शर्तों के तहत रखें ।
1. Streptozotocin द्वारा मधुमेह की प्रेरण
- दिन-4 पर, 10 से 12 सप्ताह पुराने NMRI नग्न चूहों और C57Bl/6 चूहों एक वजनी मशीन का उपयोग कर के शरीर के वजन को मापने ।
- मापा शरीर के वजन के अनुसार, माउस प्रति खारा की ०.१ मिलीलीटर में एक १८० मिलीग्राम/किलो खुराक streptozotocin तैयार ।
नोट: Streptozotocin हौसले से इस्तेमाल से पहले तैयार किया जाना चाहिए और एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर, के रूप में यह प्रकाश के प्रति संवेदनशील है । - syngeneic और allogeneic चूहों प्रत्येक streptozotocin की ०.१ मिलीलीटर की एक खुराक के साथ सुई (१८० मिलीग्राम/एक 26-जी सुई का उपयोग कर intraperitoneally.
- दिन-3,-2 और-1 पर इकट्ठा 2-4 गैर-तेज चूहों की पूँछ नसों को puncturing करके रक्त की µ एल.
- NMRI न्यूड चूहों और C57Bl में रक्त ग्लूकोज को मापने के लिए परीक्षण पट्टी प्रति रक्त नमूना के 2-4 µ एल का उपयोग करें/
नोट: इस बिंदु पर, चूहों के ८०% मधुमेह (20 mmol/एल) बन जाना चाहिए ।- टाप प्रत्यारोपण के लिए चूहों का प्रयोग जब उनके रक्त शर्करा के स्तर तक पहुँचने 20 mmol/
2. चूहों से अग्नाशय के टाप का अलगाव
- Anesthetize के साथ चूहों को ketamine (१०० मिलीग्राम/किग्रा शरीर का वजन) और xylazine (20 मिलीग्राम/kg शरीर का वजन) के साथ intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा 26-G सुई ।
नोट: ketamine और xylazine की मात्रा जानवरों के शरीर के वजन के अनुसार निर्धारित की गई थी (०.१० मिलीलीटर/ - चूहों को लापरवाह स्थिति में रखें और povidone-आयोडीन समाधान के साथ संक्रमित करें. पैडल पलटा की जाँच करके उचित इच्छामृत्यु की पुष्टि करें ।
नोट: C57Bl/6 के मामले में उदर क्षेत्र दाढ़ी । - ठीक संदंश के साथ त्वचा पकड़ो और एक midline चीरा करने के लिए पेट की गुहा को बेनकाब कैंची के साथ । एक बाँझ धुंध सेक पर बाईं और उदर गुहा के बाहर करने के लिए आंत सीटू प्लेस ।
- अग्न्याशय और अन्य जुड़े ऊतकों का पता लगाने के लिए एक और दिशा में पेट समायोजित करें ।
- महाधमनी तक पहुंचें और खून की निकासी के लिए एक छोटा सा कट बना लें । रक्त अवशोषण के लिए बाँझ धुंध का प्रयोग करें ।
- आंत को सावधानीपूर्वक निकालें । अग्ंयाशय को पेट और तिल्ली से अलग करें ।
- अग्ंयाशय और एक ताजा पेट्री डिश में जगह है । सभी अवांछित सामग्री, जैसे वसा, संदंश का उपयोग कर निकालें ।
- collagenase के 4 मिलीलीटर के साथ एक 5 मिलीलीटर सिरिंज भरें और एक 26-जी सुई (शेयर समाधान के साथ अग्ंयाशय में सुई: collagenase के 30 है हांक समाधान के 12 मिलीलीटर में मिलीग्राम) ।
- एक बेहतर पाचन के लिए सतह क्षेत्र को बढ़ाने और एक 12 मिलीलीटर लाल कैप ट्यूब को हस्तांतरण करने के लिए कैंची के साथ अग्ंयाशय कीमा ।
नोट: है हांक संतुलित नमक समाधान: HBSS 10x (१०० मिलीलीटर), पेनिसिलिन-Streptomycin (10 मिलीलीटर), गेन्तमयसीं (1 मिलीलीटर), Ciprofloxacin (10 मिलीलीटर), HEPES (३५ मिलीलीटर), आसुत एच2ओ (९०० एमएल) - एक मिलाते हुए पानी स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एक पाचन प्रदर्शन । भंवर 15 एस के लिए एक नियमित अंतराल पर तीन बार नमूना ।
- 3 मिनट के लिए हाथ से पचा अग्ंयाशय सख्ती से मिश्रण है और यह 10 एस के लिए बर्फ पर जगह है ।
- ठंड है हांक समाधान के 6 मिलीलीटर जोड़ें पाचन प्रतिक्रिया को रोकने और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए ५६० x g पर केंद्रापसारक ।
- supernatant निकालें और 10 पार्कर/भ्रूण बछड़ा सीरम (पी/FCS) मध्यम कमरे के तापमान पर मिलीलीटर में गोली भंग ।
नोट: P/FCS माध्यम: TCM-१९९ 10x (१०० मिलीलीटर), FCS (५० मिलीलीटर), पेनिसिलिन-Streptomycin (10 मिलीलीटर), HEPES (20 मिलीलीटर), आसुत H2O (९०० मिलीलीटर) - एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत उनकी आकृति विज्ञान (अंडाकार आकृति, स्वर्ण-भूरे रंग) के आधार पर टाप की पहचान करें । अंधेरे केंद्रों के साथ टाप से बचें । शुद्धता और व्यवहार्यता के लिए जांच एक प्रकाश खुर्दबीन के नीचे धुंधला dithizone प्रदर्शन द्वारा ।
नोट: Dithizone जस्ता आयन को बांधता है और लाल रंग के दाग को टाप प्रदान करता है । - एक हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे गिनती और handpick टाप करने के लिए एक 1-एमएल पिपेट का प्रयोग करें और उन्हें एक ताजा पेट्री डिश (६० mm x 15 mm) के लिए स्थानांतरण P/FCS मध्यम के 4 मिलीलीटर से युक्त ।
नोट: ऑक्सीजन की उपलब्धता सुनिश्चित करने के लिए पेट्री डिश में P/FCS मीडियम की मात्रा 4 एमएल से अधिक नहीं होनी चाहिए । - एक मशीन में ३७ ° c पर रात भर पी/FCS माध्यम के 4 मिलीलीटर में पृथक टाप रखें ।
3. टाप प्रत्यारोपण के लिए पशुओं की तैयारी
- ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन से अलग टाप निकालें और एक फ्लो बेंच के तहत उन्हें जगह है । केंद्र पेट्री डिश के एक परिपत्र झूल गति के साथ टाप ।
- P/FCS मध्यम के ०.१ मिलीलीटर के साथ एक 1 एमएल सिरिंज (ब्लू 23-जी सुई) भरें । फिर, है हांक समाधान के ०.३ मिलीलीटर में ३५० टाप जोड़ें । एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में सिरिंज को व्यवस्थित करने के लिए टाप रखने के लिए अनुमति देते हैं ।
- ०.०५ मिलीलीटर के लिए मात्रा में कमी और एक ब्राउन 26-जी सुई के साथ नीले 23 जी सुई की जगह । एक ही सिरिंज के लिए, शीर्ष करने के लिए Ficoll के ०.१५ मिलीलीटर (घनत्व ढाल मध्यम) जोड़ने के लिए सिरिंज में ०.२ मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा तक पहुँचने. हवा के बुलबुले से बचें ।
- सिरिंज को लंबवत स्थिति में रखें और उसे टाप के झुरमुट से बचने के लिए थोड़ा घुमाएं । इस टाप 2-3 मिनट के भीतर सिरिंज के शंकु पर बसा होगा ।
- शरीर के वजन और प्राप्तकर्ता चूहों के रक्त शर्करा के स्तर को मापने; रक्त शर्करा का स्तर 20 mmol के आसपास होना चाहिए L/
- Anesthetize के साथ चूहों को ketamine (१०० मिलीग्राम/किग्रा शरीर का वजन) और xylazine (20 मिलीग्राम/kg शरीर का वजन) 26-जी सुई के साथ intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा ।
- एक गर्म थर्मल प्लेट (३७ डिग्री सेल्सियस) पर लापरवाह स्थिति में चूहों प्लेस । पैर की अंगुली चुटकी द्वारा संज्ञाहरण की गहराई की जाँच करें ।
- povidone-आयोडीन समाधान (त्वचा विसंक्रमित) के साथ उदर क्षेत्र को साफ । आंखों को सूखने से रोकने के लिए उन्हें आई ऑइंटमेंट से नम रखें ।
नोट: C57Bl/6 के मामले में उदर क्षेत्र दाढ़ी ।
4. Intraportal मार्ग के माध्यम से टाप ट्रांसप्लांटेशन
- 0 दिन पर, संदंश के साथ त्वचा पकड़ और एक कैंची के साथ एक 2-3 सेमी लंबी midline चीरा बनाने के द्वारा एक laparotomy के साथ शुरू करते हैं । प्लेस एक बाँझ गीला धुंध घाव किनारों के आसपास सेक करने के लिए इसे नम रखने के लिए ।
- आंत को छोड़ दिया और बाहर बाँझ धुंध सेक पर उदर गुहा के लिए सीटू प्लेस ।
नोट: पूर्व गर्म ०.९% NaCl समाधान या बाँझ धुंध सामांय खारा में डूबा के साथ प्रक्रिया में आंत नम रखें । - ग्रहणी हटो और अग्ंयाशय का पता लगाने । ऊपर अग्ंयाशय धक्का द्वारा ventral साइट पर स्थित पोर्टल नस का पता लगाएं । एक उंगली और पोर्टल नस बेनकाब करने के लिए अंगूठे का प्रयोग करें और, एक बार उजागर, यह जिगर के पास पंचर ।
- 1 मिनट के भीतर, धीरे और तेजी से (३.४ कदम से ०.२ एमएल) के टाप ग्लास के निरीक्षण के तहत पोर्टल नस में टाप के किसी भी रिसाव से बचने के लिए इंजेक्शन ।
नोट: इंजेक्शन के बाद, हमेशा सिरिंज में शेष टाप के लिए जाँच करें. एक सिरिंज में पी/FCS मीडिया के 1 मिलीलीटर ले लो, एक ताजा पेट्री पकवान में फ्लश और एक खुर्दबीन के नीचे गिनती । - पंचर साइट पर एक बाँझ गेज प्लेस और रक्तस्राव को रोकने के लिए 6 मिनट के लिए सूचकांक उंगली (प्रवेश गहराई: 0.5-1 सेमी) के साथ दबाव लागू होते हैं ।
नोट: मात्रा इंजेक्शन ०.२ मिलीलीटर से अधिक नहीं होना चाहिए । अत्यधिक मात्रा और दबाव कतरनी तनाव के कारण टाप को नुकसान पहुंचा सकता है । - ध्यान से आंत सीटू, आँख, पेट की मांसपेशी परत, और प्रावरणी स्थिति में वापस जगह है ।
- संदंश का उपयोग करना, त्वचा लिफ्ट, अवशोषित रेशम टांका के साथ मांसपेशी चीरा बंद, और 2-3 क्लिप्स के साथ ऊपरी त्वचा परत ।
- त्वचा विसंक्रमित के साथ सतह को साफ, एक घाव मरहम लगाने वाले लागू होते हैं, और व्यक्तिगत पिंजरों में चूहों जगह है । घाव मरहम लगाने वाले एक पानी प्रतिरोधी acrylate परत प्रदान करता है और थकावट और द्वितीयक संक्रमण से बचाने के लिए ।
नोट: चूहों का निरीक्षण जब तक वे पर्याप्त चेतना फिर से प्राप्त किया है, tramadol प्रदान (०.२ माउस प्रति मिलीग्राम) तरल पदार्थ के साथ साथ । इस प्रोटोकॉल में, चूहों जल्दी से संज्ञाहरण से बरामद और tramadol प्रशासन दर्द कम कर दिया । 7 दिनों के बाद घाव को ठीक करना चाहिए । - चूहों को नियमित भोजन और पानी से खिलाएं । streptozotocin इंजेक्शन के बाद भोजन और पानी की खपत और मूत्र उत्सर्जन में वृद्धि होगी ।
- पहले सप्ताह के लिए हर दिन रक्त शर्करा के स्तर को मापने और फिर syngeneic चूहों में एक सप्ताह में एक बार. allogeneic चूहों में, रक्त शर्करा के स्तर को मापने के लिए एक सप्ताह में तीन बार अप करने के लिए 15 दिन.
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Representative Results
प्रत्यारोपण टाप की क्षमता रासायनिक प्रेरित मधुमेह चूहों में अध्ययन किया गया था. इस टाप मधुमेह चूहों मॉडल में पोर्टल शिरापरक प्रणाली के माध्यम से प्रत्यारोपण किया गया । दाता-प्राप्तकर्ता का अनुपात 2:1 था । syngeneic माउस मॉडल में, दो दाता चूहों ३५० टाप प्राप्त करने के लिए उपयोग किया गया । इसके बाद इस टाप को डायबिटिक चूहों में प्रत्यारोपित किया गया । रक्त शर्करा के स्तर में कमी 1 दिन पर प्रत्यारोपण के बाद मनाया गया था, रक्त शर्करा के स्तर को कम करने में प्रत्यारोपित अग्नाशय के टाप की एक भूमिका का सुझाव । Streptozotocin रक्त शर्करा के स्तर में वृद्धि के बारे में 22 mmol/ टाप ट्रांसप्लांटेशन (figure 1a) के बाद रक्त शर्करा के स्तर में एक बूंद ४.६ mmol/L (1 दिन) के लिए मनाया गया । Normoglycemia को १२१ दिनों तक रखा गया था, जैसा कि चित्र 1aमें दिखाया गया है । शरीर के वजन और रक्त शर्करा के स्तर मोटे तौर पर एक ही पैटर्न का पालन किया । streptozotocin इंजेक्शन और सर्जरी के बाद शरीर का वजन कम हुआ । 2 दिन से आगे, यह सामांय की ओर बढ़ जाता है, २५.३ जी (4 दिन) से २९.७ जी (दिन १२१), के रूप में चित्र 1bमें दिखाया गया है ।
प्रमुख histocompatibility (MHC) बेमेल चूहों के मामले में, दो C57Bl/6 से ३५० टाप (H2d) चूहों में मधुमेह बालब/सी (H2बी) चूहों में प्रत्यारोपण किया गया । streptozotocin इंजेक्शन के बाद रक्त ग्लूकोज बढ़कर २६.६ mmol/ टाप प्रत्यारोपण के बाद, रक्त शर्करा का स्तर ४.४ mmol/L (दिन 1; चित्र 2a) । Normoglycemia (४.४४ to ७.२ mmol/l) 10 दिनों के लिए मनाया गया था, लेकिन 15 दिनों के बाद नहीं (२०.१ mmol/ मधुमेह के चूहों के शरीर का वजन 26 ग्राम (day-3) से 23 ग्राम (day 0) और आगे २१.५ g (day 1) तक गिरा । रोपाई के बाद शरीर का वजन धीरे-2 से 23 ग्राम (दिन २) से २५ ग्राम (दिन १०) तक वसूलता है. MHC-बेमेल होने के कारण, रक्त शर्करा का स्तर बढ़ जाता है और शरीर के वजन में टाप ट्रांसप्लांटेशन (चित्रा बी8) के बाद 10 दिनों की कमी आई.
चित्र 1 : syngeneic टाप ट्रांसप्लांटेशन का प्रभाव । (क) रक्त शर्करा के स्तर को streptozotocin-प्रेरित मधुमेह चूहों (एन = ३) में भिन्न समय बिंदुओं पर मापा गया था. streptozotocin की एक खुराक (१८० मिलीग्राम/किग्रा) प्रत्येक प्राप्तकर्ता (0 दिन) के लिए ३५० टाप के प्रत्यारोपण से पहले इंजेक्ट किया गया था । रक्त शर्करा का स्तर (mmol/L) को १२१ दिनों तक मापा गया (दिन-3:17 ± २.३; दिन 0:२२.६ ± 1; दिन 1:४.६ ± ०.३; दिन 5:७.५ ± ०.४; और दिन १२१:५.३ ± ०.०९) । (ख) टाप प्रत्यारोपण के बाद शरीर के वजन में वृद्धि । ऊपर दिए गए डेटा का अर्थ ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 : allogeneic टाप ट्रांसप्लांटेशन का प्रभाव । (क) streptozotocin-प्रेरित मधुमेह चूहों (n = 2) में रक्त शर्करा के स्तर को अलग समय बिंदुओं पर मापा गया था. streptozotocin (१८० मिलीग्राम/किग्रा) की एक खुराक ३५० अग्नाशय के टाप (दिन 0) के प्रत्यारोपण से पहले इंजेक्ट किया गया था । रक्त शर्करा स्तर (mmol/एल) के लिए 15 दिनों के लिए मापा गया था (दिन-1:२५.५ ± ५.३; दिन 0:२६.६ ± १.४; दिन 2:8 ± ०.९; दिन 10:६.२ ± ०.०८; और दिन 15:२०.१ ± १.६) । Normoglycemic राज्य 10 दिनों तक के लिए बनाए रखा गया था, और बाद में, रक्त ग्लूकोज सांद्रता बढ़ गई । (B) टाप ट्रांसप्लांटेशन से पहले और बाद में शरीर के वजन का पालन करें । डेटा मानक विचलन मतलब ± प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 : जिगर में प्रत्यारोपित अग्नाशय के टाप के प्रतिनिधि immunostaining तस्वीर: पंजाबियों के साथ जिगर खंड (5 µm) धो, 10% गधा सीरम के साथ ब्लॉक 4 डिग्री सेल्सियस पर इंसुलिन प्राथमिक एंटीबॉडी (1:500) और प्लेटलेट के साथ रातोंरात मशीन के बाद endothelial कोशिका आसंजन अणु PECAM-१ प्राथमिक एंटीबॉडी (1:100). अगले दिन, 1 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ दाग, पंजाबियों के साथ धो, काउंटर Hoechst के साथ दाग और Leica फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ छवियों पर कब्जा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
इस अध्ययन में टाप ट्रांसप्लांटेशन के intraportal मार्ग की पड़ताल की जाती है । इस प्रोटोकॉल मधुमेह तनाव से राहत में अत्यधिक कुशल है और एक में गहराई से टाप ट्रांसप्लांटेशन अध्ययन का पता लगाने के अवसर प्रदान करता है । इस प्रोटोकॉल की पुष्टि करता है कि लगभग ३५० murine टाप hyperglycemic राज्य के पीछे करने में सक्षम हैं । इसके अलावा, चूहों में से कोई भी प्रक्रिया के दौरान मृत्यु हो गई, और glycemic नियंत्रण सभी प्राप्तकर्ताओं में प्राप्त किया गया था । शरीर के वजन और रक्त शर्करा के स्तर को नियमित रूप से दक्षता, मानक, और reversing hyperglycemia में प्रत्यारोपित टाप की कार्यक्षमता को प्रतिबिंबित दर्ज किए गए । syngeneically प्रत्यारोपण चूहों में, रक्त शर्करा का स्तर पहले सप्ताह के लिए हर दिन मापा गया और उसके बाद एक सप्ताह में एक बार. के बाद टाप प्रत्यारोपण, hypoxic हालत और दूसरों कारकों endothelial कोशिकाओं को ट्रिगर करने के लिए समर्थक angiogenic कारकों जैसे वीईजीएफ़ के बाद 14 दिनों के बाद और इस तरह जिगर में संवहनी engraftment में वृद्धि के रूप में चित्रा 3में दिखाया गया है । allogeneic चूहों में, रक्त शर्करा के स्तर को 15 दिनों के लिए एक सप्ताह में तीन बार मापा गया. 15 दिनों के बाद, प्रत्यारोपण टाप एक प्रतिरक्षा हमले के कारण allogeneic मॉडल में अस्वीकार कर दिया गया था, जब तक immunosuppressive दवाओं प्रशासित रहे हैं
साहित्य10,11में प्रकाशित कई टाप आइसोलेशन प्रोटोकॉल हैं । सबसे सरल collagenase पाचन के बाद उनके आकार और आकृति विज्ञान के आधार पर मैन्युअल रूप से टाप लेने के लिए है. यह सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक है केवल टाप का चयन करने के लिए और exocrine कोशिकाओं से बचने के लिए, मलबे, आदि चयनित टाप एक मशीन में रातोंरात ३७ डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाना चाहिए उन्हें यांत्रिक तनाव से उबरने के लिए अनुमति देने के लिए पाचन के दौरान सामना करना पड़ा प्रक्रिया. streptozotocin खुराक और intraportal टाप ट्रांसप्लांटेशन के चयन भी इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण हैं । शरीर का तापमान विनियमित किया जाना चाहिए और शल्य प्रक्रिया के दौरान एक थर्मल प्लेट का उपयोग कर बनाए रखा । बाँझ धुंध खून बह रहा से बचने के लिए पंचर की साइट पर 6 मिनट के लिए न्यूनतम दबाव के साथ लागू किया जाना चाहिए । चूहों निरीक्षण के तहत रखा जाना चाहिए जब तक वे पर्याप्त चेतना हासिल ।
इस प्रोटोकॉल में कुछ चरणों को संशोधित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, पाचन समय और collagenase की मात्रा के अनुकूलन अलग चूहों उपभेदों में टाप की उपज में वृद्धि हो सकती है । मधुमेह की तेजी से प्रेरण के बजाय (१८० मिलीग्राम/kg streptozotocin), धीरे hyperglycemia बढ़ती समय की एक विस्तारित अवधि में एक कम खुराक का उपयोग कर प्रेरित किया जा सकता है (जैसे, ४० mg/किलो/दिन streptozotocin के लिए लगातार 5 दिन). इससे रोपाई टाप की बेहतर engraftment प्रदान की जा सके । अस्थि मज्जा, omental थैली, इंट्रामस्क्युलर क्षेत्र, गैस्ट्रिक श्लैष्मिक सतह, तिल्ली, और गुर्दे के रूप में अन्य साइटों, intraportal नस के लिए विकल्प के रूप में पता लगाया जा सकता है.
प्रत्यारोपण टाप के गरीब engraftment अभी भी नैदानिक परीक्षणों में एक प्रमुख चिंता का विषय है । दूसरों के दाताओं की कमी, प्रत्यारोपण के बाद रक्त शर्करा के स्तर को बनाए रखने में विसंगतियों, प्रतिरक्षादमन, और रक्त की मध्यस्थता प्रतिक्रियाओं12,13शामिल हैं । उचित engraftment का मूल्यांकन करने के लिए विधियों का अभाव एक और बाधा है । चुंबकीय अनुनाद या bioluminescence इमेजिंग द्वारा प्रत्यारोपित टाप संभवतः ऐसे ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण या सी पेप्टाइड के रूप में शास्त्रीय तरीकों की जगह सकता है । भविष्य में, स्टेम कोशिकाओं को एक साथ टाप के साथ प्रत्यारोपण पोषण और immunomodulating समर्थन14प्रदान हो सकता है ।
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Disclosures
सभी लेखक घोषणा करते हैं कि उनके हितों का कोई टकराव नहीं है.
Acknowledgments
हम उसे समर्थन के लिए Gundula Hertl को स्वीकार करना चाहते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6 mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| BALB/c mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| NMRI nude mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| Ketamine | Bela-pharm | ||
| Xylazine | CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH | ||
| Syringe, 23G and 26G needle | BD | ||
| Petri Dish | Falcon | 303800 | |
| NaCl | Carl Roth | 351007 | |
| Sterile Gauze | Fuhrmann | 7647-14-5 | |
| Shaking Water bath | Kotterman | 1501 | |
| Scissors | Braun | 1501 | |
| Glucose Meter | One Touch | ||
| Warm Thermal Plate | Thermo Fisher | ||
| Braunol (povidone-iodide solution) | B.Braun Melsungen AG | 3864154 | |
| Liposic Edo - Sprinkled Ointment (eye ointment) | Dr. G Mann Chem.-Pharm. GmbH | ||
| Incubator | Fa. Roth | ||
| Flow Bench | Herdus | ||
| Ficoll | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| 5-0 Silk Suture Vicryl | Braun | (7.5 *1.75mm) | |
| Michel Clamps (clips) | Aesculap | BN507R | |
| P/FCS Solution | Gibco | 21180-021 | |
| TCM-199 (10x) | Gibco | 21180-021 | |
| FCS | Biowest | S1810-500 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES (1 M) | Biochrom | L 1613 | |
| Gentamycin | Ratiopharm | ||
| Ciprofloxacin | Fresenius Kabi | ||
| Hank's Solution | Gibco | 14060-040 | |
| Collagenase | Roche | 11213865001 | |
| Streptozotocin | Calbiochem | 572204 | |
| OPSITE-spray (wound healer) | Smith and nephew | 66004978 | |
| Reugular food | Altromin | ||
| Head light LED 16042 (magnifying glass) | Eschenbach | 16042 | |
| Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody | Millipore, Chemicon | CBL1337 | Dilution (1:100) |
| Donkey anti-rat secondary antibody | Dianova | 712095153 | Dilution (1:400) |
| Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody | Dako | A0564 | Dilution (1:500) |
| Donkey anti-guinea pig secondary antibody | Dianova | 706-259-148 | Dilution (1:400) |
References
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