Summary
膵島移植で 1 型糖尿病な場合を達成するために道はあります。糖尿病マウスの通常のブドウ糖のレベルを維持するために門脈内のルートを通じて移植技術について説明します。
Abstract
高血糖を抑える膵島移植は化学的に誘発性糖尿病を持つ齧歯類で非常に成功しました。実験的膵島移植における最も一般的な移植サイトは腎被膜です。ただし、以下は膵島の血液成分との相互作用について知られている、また理にかなって実験的膵島移植における門脈アプローチを利用します。
このプロトコルは、当所ヌードマウスにおける門脈内の膵島移植技術を示しています。ストレプトゾトシン (180 mg/kg) を受信者のマウスにおける高血糖を誘発する腹腔内注入します。20 ミリ モル/l. より大きい非空腹時血糖で糖尿病と見なされます1 日、移植前にマウスの膵島がドナーの膵臓由来のコラゲナーゼの消化力; によって350 小島の最小値は、糖尿病の受信者ごと利用されています。膵島分離歩留まりによりますが、2 つ以上のドナー マウス受信者ごとに活用されます。37 ° C で一晩培養後の小島は門脈を介して受信者の肝臓に管理されています。マウスの赤い「マクロロン」家で保護されているとまで観察の手術後、目を覚ましています。このプロトコルは、同系マウスの 120 日間と同種のマウスで 15 日間の血糖コントロールを維持します。
Introduction
膵島移植は、タイプ 1 の糖尿病1の治療に有望なアプローチです。糖尿病患者に羊膵フラグメントを転送する最初の試みは 1893 年にワトソン ウィリアムズが行った。臨床膵島移植で画期的だったエドモントンの議定書を達成し、その後、国家プログラムのシリーズが開発された2。過去には、前臨床モデルで骨髄、大網ポーチ、筋肉内地域、胃粘膜、脾臓、腎臓のカプセルなど、いくつかのサイトを検討したが、門脈系は適切かつ効果的なサイトの 1 つとして考慮されます。臨床プログラム3,4,5,6。
インスリンの外因性投与は、アイレット門脈内注入によって置き換えることができます。これは酸素の供給がポータル動脈と静脈の合流点の下流の場所のためのネイティブの膵臓に匹敵するので最寄りのサイトと見なされます。また、小島の立体構造を保持することがありますので、大きい表面積があるし、血管新生促進5ができます。糖尿病マウスの受信者、2,000 の人間や豚の膵島同等または 350 マウス島高血糖状態7、8を逆に適切です。外因のレベルは、同系マウスに移植に 120 日以上の異種膵島と同種のマウス-マウス モデルにおけるマウスの受信者モデルで 15 日間の報告されました。
門脈を介して膵島移植の有効性に関連する要因は、適切な麻酔穿刺・止血9法です。麻酔は、吸入 (5% イソフルラン) または (ケタミン、キシラジン、またはペントバルビ タール) の注入によって誘起することし、物質は頻繁に結合されます。深さの制御と麻酔の時間は、マウス、色の粘膜、目の蓋、角膜反射、呼吸数、体温などの状態に留意する必要があります。動物の苦労はないとそれが操作を存続を確保することが重要です。赤電球に、加熱パッドなどの異なる暖房機器で温度を維持できるなどの暖かいサーマル プレートはマウスとの発生を防止する操作テーブルの間 25-30 ° C の温度を維持するために使用されています低体温症。麻酔薬の投与量が重要で、それらのすべては、肝臓で代謝され、肝機能は一過性島ペンション.の注入によって乱れることがあります。門脈の理想的な穿刺のポイントは、最初と 2 番目の支流静脈間位置です。
小島と意図した注入量の数は、過剰なボリュームは、せん断応力を高める可能性がありますとも、移植の結果に影響を与えます。0.2 mL ボリュームは門脈に膵島移植に適したと見なされます。貫通傷 (26 g 針) は、タイムリーかつ効果的な方法で停止する必要がある門脈からの出血を誘発します。約 6 分、出血を止めるための穿刺のサイトで最低限の圧力で滅菌ガーゼまたは指を適用できます。撮影一緒に、ポータルの膵島の注入は効果的な化学物質誘発糖尿病マウスの血糖値を規制を提供しています。
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Protocol
このプロトコルのすべてのプロシージャは、ドイツ動物福祉法及びガイドラインで承認されています。10-12 週齢当所ヌードマウスと c57bl/6 マウスの使用を検討 (ドナー: 古い女性; 受信者: 男性) 実験中。膵島分離に当所ヌードマウスを使用します。ローカル動物施設の規則に従って定義された条件の下でマウスを維持します。
1. 誘導によるストレプトゾトシン糖尿病の
- -4 日 12 週齢当所ヌードマウスと c57bl/6 マウスの計量機を使用して 10 の体重を測定します。
- 測定体重に従ってマウスあたり生理食塩水を 0.1 mL のストレプトゾトシンの 180 mg/kg の線量を準備します。
注: ストレプトゾトシン新鮮な使用前に、の準備、それは光に敏感なアルミ箔で覆われています。 - ストレプトゾトシン (180 mg/kg) を 0.1 mL の単回投与と腹腔内 26 G 針を使用してそれぞれの同系と同種のマウスを挿入します。
- -3 日-2 と-1 は、非絶食マウスの尾静脈を穿刺によって 2-4 μ L の血液を収集します。
- 当所ヌードマウスと c57bl/6 マウスの血糖値を測定するのに血液サンプル テスト ストリップあたりの 2-4 μ L を使用します。
注: この時点で、マウスの 80% が糖尿病に (20 mmol/L)。- 血糖値が 20 ミリ モル/l. に達したら、膵島移植のマウスを使用します。
2. マウスの膵島の分離
- 26 G 針で腹腔内投与によるケタミン (100 mg/kg 体重) とキシラジン (20 mg/kg 体重) マウスを麻酔します。
注: 動物 (0.10 mL/10 g) の体重によるとケタミン ・ キシラジンのボリュームを求めた。 - 仰臥位でマウスを維持し、ポビドン ヨード液で消毒します。ペダルの反射をチェックして適切な安楽死を確認します。
注: C57Bl/6 の場合、腹部領域を剃る。 - 微細鉗子で肌を保持し、腹腔内を公開するハサミで正中切開。滅菌ガーゼ湿布に腹部キャビティの外側と左腸の内臓を配置します。
- 膵臓および他の関連を検索する別の方向で胃を調整する組織。
- 大動脈に到達し、血液を排出する小さなカットをします。血液吸収に滅菌ガーゼを使用します。
- 腸を慎重に取り外します。胃と脾臓から膵臓を区切ります。
- 膵臓を切除、新鮮なシャーレ内に置きます。鉗子を使用して脂肪など、すべての不要な物質を削除します。
- コラゲナーゼの 4 mL と 5 mL シリンジを記入し、26 G 針と膵臓に挿入 (貯蔵液: ハンクの溶液 12 mL 中のコラゲナーゼの 30 mg)。
- 消化力の改善と 12 mL 赤キャップ チューブへの転送のための表面積を高めるためハサミで膵臓をミンチします。
注: ハンクの平衡塩溶液: HBSS 10 (100 mL)、x (10 mL) のペニシリン-ストレプトマイシン、ゲンタマイシン (1 mL)、シプロフロキサシン (10 mL)、HEPES (35 mL)、蒸留 H2O (900 mL) - 振動水バースの 37 ° C で 10 分間の消化を実行します。渦 15 の定期的な間隔で三度サンプル s。
- 3 分間の手によって積極的に消化膵臓をミックスし、10 の氷の上に置きます s。
- 消化反応と 560 x g で室温で 3 分間遠心を停止する冷たいハンクの溶液 6 mL を追加します。
- 上澄みを除去し、室温でパーカー/胎児の子牛血清 (P/FCS) 培地 10 mL にペレットを溶解します。
注: P/FCS 中: TCM 199 10 (100 mL) x FCS (50 mL)、ペニシリン ・ ストレプトマイシン (10 mL)、HEPES (20 mL)、蒸留 H2O (900 mL) - 光学顕微鏡下でその形態 (回転楕円体、金茶色色) に基づく小島を識別します。中心部が暗い島は避けてください。純度、光学顕微鏡による染色ジチゾンを実行することで生存率をチェックします。
注: ジチゾン亜鉛イオンに結合し、小島に赤い染みを提供します。 - 1 mL ピペットを使用して、カウントし光学顕微鏡の下で小島を手で摘むし、P/FCS 培地 4 mL を含んでいる新鮮なペトリ皿 (60 mm × 15 mm) にそれらを転送します。
注: のボリュームP/FCS ペトリ皿中は酸素の可用性を確保するために 4 mL を超えない。 - インキュベーターの 37 ° C で膵島の P/FCS 中一晩 4 mL を維持します。
3. 動物の膵島移植のための準備
- 37 ° C の定温器から膵島を削除し、流れベンチ下に配置。ペトリ皿の揺れ円運動と小島を中心します。
- P/FCS 中の 0.1 mL を 1 mL の注射器 (青 23 G 針) を入力します。その後、ハンクの溶液 0.3 mL で 350 島を追加します。解決する島を許可する垂直方向の位置に注射をしてください。
- 0.05 mL に音量を下げるし、茶色の 26 G 針に青 23 G 針を置き換えます。同じ注射器に注射器で 0.2 mL の最終的なボリュームに到達する上に 0.15 mL Ficoll (密度勾配媒体) を追加します。空気の泡を避けるため。
- 垂直位置に注射器を保つため、小島の凝集を避けるために少し回します。小島は 2-3 分以内で注射器のコーンで解決されます。
- 受信者のネズミのボディ重量および血ブドウ糖のレベルを測定します。血糖値が約 20 ミリ モル/l. をする必要があります。
- 26 G 針で腹腔内投与によるケタミン (100 mg/kg 体重) とキシラジン (20 mg/kg 体重) マウスを麻酔します。
- 暖かいサーマル プレート (37 ° C) に仰臥位にマウスを配置します。つま先をつまんで麻酔の深さを確認します。
- ポビドン ヨード液 (皮膚の消毒剤) と腹部をクリーンアップします。目の乾燥を防ぐためにそれらを保つ眼軟膏で湿潤。
注: C57Bl/6 の場合、腹部領域を剃る。
4. 門脈経由膵島移植
- 開腹した、0 日に始めるにはピンセットで皮膚を押しながら 2-3 cm を作る-ハサミで正中切開。場所滅菌濡れたガーゼを傷周囲にそれを湿った保つに圧縮します。
- 滅菌ガーゼ湿布に腹部キャビティの外左に腸の内臓を配置します。
注: は、腸に予め温めておいた 0.9 %nacl 水溶液や食塩に浸した滅菌ガーゼを使ってプロシージャ全体で潤いを保ちます。 - 十二指腸に移動し、膵臓を探します。膵臓を上向きに押すことで腹側のサイトに位置して門脈を探します。指と親指を使用して門脈を公開して、公開、一度穴を肝臓の近くに。
- 1 分以内ゆっくりと着実には、島の漏洩を避けるために拡大鏡の検査で門脈に小島 (3.4 の手順から 0.2 mL) を挿入します。
メモ: 注入後常にシリンジの残りの島のために確認します。新鮮なペトリ皿と顕微鏡下でカウントにフラッシュの注射器 1 mL P/FCS メディアを取る。 - 穿刺部位に滅菌ゲージを置き、人差し指で圧力を適用 (浸透深さ: 0.5-1 cm)、出血を止めるため 6 分間。
注: 注入量は 0.2 mL を超えない。過度な量と圧力は、せん断応力による島に損傷を与えます。 - 慎重に腸の内臓、腹膜、腹部筋層、筋膜を元の位置に配置します。
- 鉗子を使用して、皮膚を持ち上げて、シルク縫合糸と筋切開と 2-3 クリップ上部の皮膚層を閉じます。
- 皮膚の消毒剤で表面をきれいに傷の治療師を適用し、個々 のケージにマウスを置きます。傷の治療師は耐水性アクリル層を提供し、浸軟、二次感染を防ぐ。
注: 十分な意識を取り戻しているまでマウスを観察、流体と共にトラマドール (マウスあたり 0.2 mg) を提供します。このプロトコルではすぐに麻酔から回復したマウスとトラマドール管理が苦痛を減少します。7 日後、傷を癒す必要があります。 - 通常の餌と水でマウスを供給します。ストレプトゾトシン投与後食料と水の消費量と尿中排泄が増加します。
- 最初の 1 週間と同系マウスの週後に毎日血糖値を測定します。同種のマウスで最大 15 日間の週 3 回血糖値を測定します。
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Representative Results
化学物質誘発糖尿病マウスにおける移植膵島の能力を調べた。小島は糖尿病マウスにおける門脈経由で移植されました。ドナーと受信者の比 2:1 であった。同系マウス モデルにおける 2 つのドナー マウスが活かされて 350 島を取得します。小島それから糖尿病マウスに移植。血糖値を減らすことで膵ランゲルハンス島移植の役割を示唆して、移植後 1 日目に血糖値の低下を認めた.ストレプトゾトシンが約 22 ミリ モル/l. まで血糖値のレベルを増加しました。4.6 モル/L (1 日目) に血糖値の低下は、膵島移植 (図 1 a) 後に観察されました。な場合は、図 1 aに示すように、121 日間維持されました。ボディの重量および血ブドウ糖のレベルほぼ同じパターンに従ってください。ストレプトゾトシン投与、手術後、体重が減少。2 日目から以降、図 1 bに示すように普通 29.7 g (121 日)、25.3 g (4 日目) から上昇傾向にあった。
主要組織適合抗原 (MHC) の場合一致しないマウス、マウス二、C57Bl/6 (H2d) から 350 島は糖尿病 (H2b) BALB/c マウスに移植されました。ストレプトゾトシン投与後血糖値増加最大 26.6 ミリ モル/l.膵島移植後血糖値を落とした 4.4 mmol/l (日 1;図 2 a)。10 日間、15 日間 (20.1 ミリ モル/L) 後ではなく、な場合 (4.44 7.2 mmol/l) が観察されました。糖尿病マウスの体重は 23 g (0 日) に、21.5 g (1 日目) 26 g (日-3) から落ちた移植後は、体重は、25 g (10 日目) に徐々 にで 23 g (2 日目) から回復。MHC の不一致により血中グルコース濃度の増加し、体重減少 (図 2 b) 膵島移植後 10 日。
図 1: 同系膵島移植の効果。ストレプトゾトシン誘発糖尿病マウスで異なる時点で (A) 血糖値のレベルを測定した (n = 3)。ストレプトゾトシン 180 mg/kg の単回投与は、それぞれの受信者 (0 日) に 350 の小島の移植前に注入しました。121 日前まで測定した血糖値 (mmol/L) (日-3: 17 ± 2.3; 0 日: 22.6 ± 1; 日 1: 4.6 ± 0.3; 日 5: 7.5 ± 0.4; と日 121: 5.3 ± 0.09)。(B) 膵島移植後体重増加。上記のデータは、平均 ± 標準偏差を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 同種膵島移植の効果。ストレプトゾトシン誘発糖尿病マウスで異なる時点で (A) 血糖値のレベルを測定した (n = 2)。ストレプトゾトシン 180 mg/kg の単回投与は、350 の膵島 (0 日目) の移植前に注入しました。15 日間測定した血糖値 (mmol/L) (日-1: 25.5 ± 5.3; 0 日: 26.6 ± 1.4; 日 2:8 ± 0.9; 日 10: 6.2 ± 0.08; と一日 15: 20.1 ± 1.6)。Normoglycemic 状態は、血中グルコース濃度の増加とその後 10 日間を維持しました。(B) 体重前に、と膵島移植後のフォロー アップ。データは、平均 ± 標準偏差を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:肝臓に移植膵島の代表染色画像: 10% ロバ血清インスリンの一次抗体 (1: 500) と血小板の 4 ° C で一晩インキュベート続いてブロック、pbs 肝セクション (5 μ m) を洗う血管内皮細胞接着分子 1 PECAM 一次抗体 (1: 100)。次の日、1 時間、二次抗体で染色カウンター ヘキスト染色 PBS で洗浄し、ライカ蛍光顕微鏡でイメージをキャプチャーします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
本研究では、膵島移植の門脈内のルートが検討されます。このプロトコルは糖尿病のストレスの緩和に非常に効率的な膵島移植の研究を探索する詳細な機会を提供しています。このプロトコルは、約 350 マウス島が高血糖状態を逆転させることができることを確認します。また、プロシージャの間に死んだマウスのどれも、血糖コントロールは、すべての受信者で達成されました。本体重量および血ブドウ糖のレベルは、能力、標準、および高血糖を逆転させることで移植膵島の機能を反映するように定期的に記録されました。Syngeneically 移植マウスの血糖値は、毎日最初の週と週に一度その後を測定しました。膵島移植、低酸素条件の後の要因は 14 日後 VEGF などプロ血管新生因子を分泌して、図 3に示すように、肝臓の血管の生着を高めるに内皮細胞をトリガーします。同種のマウスの血糖値は最大 15 日間の週 3 回を測定しました。15 日後免疫抑制剤を投与しない限りは、免疫の攻撃による同種のモデルで移植膵島の拒否されました。
文献10,11で公開されていくつかの膵島隔離のプロトコルがあります。コラゲナーゼの消化力の後のサイズと形態に基づいて手動で小島をピックアップする最も簡単です。これは膵島だけを選択する最も重要な手順の 1 つと外分泌細胞、破片など選択した島を避けるためには、消化中に発生する機械的ストレスから回復することを許可するインキュベーターで一晩 37 ° C で維持されるべきプロシージャ。ストレプトゾトシン投与量および門脈内膵島移植の選択もこのプロトコルに重要であります。体温は規制されるべきし、手術中のサーマル プレートを使用して維持されます。滅菌ガーゼは、出血を避けるために穿刺のサイトで 6 分間の最小限の圧力を適用しなければなりません。彼らは十分な意識を取り戻すまで、観察の下でマウスを保管すべき。
このプロトコルの特定のステップを変更できます。たとえば、消化時間の最適化とコラゲナーゼのボリュームは、異なるマウス系統の島の収量を増加可能性があります。糖尿病 (ストレプトゾトシン 180 mg/kg) の急速な誘導、代わりにゆっくりと高血糖の増加を誘起すること時間の長期間にわたって低用量を使用して (例えば、 40 mg/kg/日 5 日間連続のストレプトゾトシン)。これは膵島移植より生着を提供可能性があります。門脈静脈に代わるものとして骨髄、大網ポーチ、筋肉内の地域、胃粘膜、脾臓、腎臓などの他のサイトを探索できます。
移植膵島の生着不全はまだ臨床試験で主要な関心事です。他には、不一致移植、免疫抑制療法、血液を介した反応12,13前後後の血糖値を維持するために、ドナーの不足が含まれます。適切な生着を評価する手法の欠如は、別の障害です。磁気共鳴または生物発光イメージングによる移植膵島を追跡可能性があるブドウ糖負荷試験や c-ペプチドなど古典的な方法を置き換えることができます。今後、島とともに移植された幹細胞は栄養あります、免疫サポート (14)。
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Disclosures
すべての著者は、利害の衝突があるないことを宣言します。
Acknowledgments
彼女のサポートのためグンドラ ・ Hertl を認識したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6 mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| BALB/c mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| NMRI nude mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| Ketamine | Bela-pharm | ||
| Xylazine | CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH | ||
| Syringe, 23G and 26G needle | BD | ||
| Petri Dish | Falcon | 303800 | |
| NaCl | Carl Roth | 351007 | |
| Sterile Gauze | Fuhrmann | 7647-14-5 | |
| Shaking Water bath | Kotterman | 1501 | |
| Scissors | Braun | 1501 | |
| Glucose Meter | One Touch | ||
| Warm Thermal Plate | Thermo Fisher | ||
| Braunol (povidone-iodide solution) | B.Braun Melsungen AG | 3864154 | |
| Liposic Edo - Sprinkled Ointment (eye ointment) | Dr. G Mann Chem.-Pharm. GmbH | ||
| Incubator | Fa. Roth | ||
| Flow Bench | Herdus | ||
| Ficoll | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| 5-0 Silk Suture Vicryl | Braun | (7.5 *1.75mm) | |
| Michel Clamps (clips) | Aesculap | BN507R | |
| P/FCS Solution | Gibco | 21180-021 | |
| TCM-199 (10x) | Gibco | 21180-021 | |
| FCS | Biowest | S1810-500 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES (1 M) | Biochrom | L 1613 | |
| Gentamycin | Ratiopharm | ||
| Ciprofloxacin | Fresenius Kabi | ||
| Hank's Solution | Gibco | 14060-040 | |
| Collagenase | Roche | 11213865001 | |
| Streptozotocin | Calbiochem | 572204 | |
| OPSITE-spray (wound healer) | Smith and nephew | 66004978 | |
| Reugular food | Altromin | ||
| Head light LED 16042 (magnifying glass) | Eschenbach | 16042 | |
| Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody | Millipore, Chemicon | CBL1337 | Dilution (1:100) |
| Donkey anti-rat secondary antibody | Dianova | 712095153 | Dilution (1:400) |
| Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody | Dako | A0564 | Dilution (1:500) |
| Donkey anti-guinea pig secondary antibody | Dianova | 706-259-148 | Dilution (1:400) |
References
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