Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Изучения корня микрофлора: извлечение данных бактериальных сообщества из почвы, ризосфере и корень Endosphere

doi: 10.3791/57561 Published: May 2, 2018

Summary

Здесь мы описываем протокол для получения данных последовательности ампликон почвы, ризосфере и корня endosphere microbiomes. Эта информация может использоваться для изучения состава и разнообразие растений связанные микробных сообществ и подходит для использования с широким спектром видов растений.

Abstract

Интимные взаимодействие между растение хост и связанные микроорганизмов имеет решающее значение в определении фитнес завод и может способствовать повышение толерантности к абиотическим стрессам и болезням. Как завод микрофлора может быть весьма сложным, лоу кост, высок объём методы, такие как на основе ампликон секвенирование гена 16S рРНК часто являются предпочтительными для характеризующие его микробный состав и разнообразия. Однако выбор соответствующей методологии при проведении таких экспериментов имеет решающее значение для снижения отклонений, которые может затруднить анализ и сравнение образцов и исследования. Этот протокол описывает подробно стандартизированной методологии для сбора и извлечения ДНК из почвы, ризосфере и корень. Кроме того мы выделите устоявшихся 16S рРНК ампликон последовательности конвейера, который позволяет для изучения состава бактериальной общин в этих образцах и может быть легко адаптирована для других маркерных генов. Этот трубопровод был одобрен для различных видов растений, в том числе сорго, кукурузы, пшеницы, клубника и агавы и может помочь преодолеть проблемы, связанные с загрязнением от завода органеллы.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Завод связанные microbiomes состоят из динамичных и сложных микробных сообществ, состоит из бактерий, археи, вирусов, грибков и других эукариотических микроорганизмов. Помимо их хорошо изучена роль в возникновении болезни растений связанных растений микробы могут также положительно повлиять здоровья растений, повышение толерантности к биотическим и абиотическим стрессовым наличия питательных веществ и поощрения повышения роста растений через производство фитогормонов. По этой причине в характеристике таксонов, которые ассоциируются с завода корень endospheres, rhizospheres и окружающий грунт существует особый интерес. Хотя некоторые микробы могут быть культивировали в изоляции на лабораторных созданный СМИ, многие нельзя отчасти потому, что они могут полагаться на симбиотические отношения с другими микробами, растут очень медленно, или требуют условий, которые не могут быть реплицированы в лабораторной среде. Потому что он обходит необходимость культивирования и относительно недорогой и высокой пропускной способности, филогенетическое профилирование на основе последовательности экологических и связанных с ними принимающей микробиологических образцов стала предпочтительным методом для assaying микробных композиция.

Выбор соответствующей последовательности технологий, предоставляемые различными следующего поколения виртуализации платформ (НГС)1 зависит от потребностей пользователей, с важными факторами, в том числе: желаемого охвата, длина ампликонами, ожидается сообщества разнообразия, а также виртуализации-погрешность, чтение Длина и стоимости за запуск/megabase. Какие Джин будет усилен и какие праймеры будет использоваться другой переменной, которая должна рассматриваться в экспериментах на базе ампликон последовательности. При создании или выборе грунты, исследователи часто вынуждены компромисс между универсальностью амплификации и таксономические резолюции достижимые из результирующей ампликонами. По этой причине эти виды исследований часто выбрал грунты и маркеры, которые выборочно целевых конкретных подмножеств микрофлора. Оценке состава бактериальных сообществ обычно осуществляется путем sequencing один или более из гипервариабельных регионов бактериальных 16S рРНК ген2,3. В этом исследовании, мы описываем ампликон на основе последовательности протокол, разработанный для платформы NGS этого региона цели 500 bp V3 V4 бактериальных 16S рРНК ген, который позволяет для широкого амплификации обеспечивая при этом достаточно изменчивости для бактериальных таксонов различие между различными таксонов. Кроме того этот протокол может быть легко адаптирована для использования с другими наборами грунт, например маркер ITS2 грибов или 18S рРНК Субблок эукариот.

В то время как другие подходы, такие, как ружье метагеномики, metatranscriptomics и одноклеточного последовательности, предлагают другие преимущества, включая решена микробных геномов и более прямого измерения функции сообщества, эти методы обычно более дорого и вычислительных ресурсов, чем филогенетических профилирования описано здесь4. Кроме того выполняя метагеномики ружье и metatranscriptomics на образцах корень дает большой процент читает, принадлежащих к принимающей генома растений, и методы, чтобы преодолеть это ограничение, по-прежнему подвергаются развитых5,6.

Как и в случае с любой экспериментальной платформы, профилирование на основе ампликон можно ввести ряд потенциальных отклонений, которые должны быть рассмотрены в ходе экспериментального проектирования и анализа данных. К ним относятся методы сбора проб, ДНК добычи, отбора праймеры PCR, и как проводится подготовка библиотеки. Различные методы может существенно снизить количество используемых данных и может также затруднить усилия чтобы сравнить результаты исследований. Например метод удаления ризосферной бактерии7 и использование методов различных извлечения или выбор ДНК извлечения комплекты8,9 было показано значительное воздействие течению анализа, что приводит к различные выводы относительно которых микробы формируют настоящее и их относительного обилия. Поскольку можно настроить профилирование на основе ампликонами, делая сравнения различных исследований может быть сложным. Проект микрофлора земли предположил, что исследователи, изучение сложных систем, таких как завод связанные микрофлора выиграют от разработки стандартизированных протоколов как средства минимизации изменчивости, вызванных применением различные методы между исследования10,11. Здесь мы обсуждаем многие из вышеуказанных тем, и предложение предложения относительно наилучшей практики, где это уместно.

Протокол демонстрирует процесс сбора почвы, ризосфере и корень образцов из Сорго зерновое и извлечения ДНК, используя налаженные ДНК изоляции комплект11. Кроме того наш протокол включает в себя подробный ампликон последовательности рабочего процесса с использованием обычно используемых NGS платформы, для определения структуры бактериальных сообществ12,,1314. Этот протокол был утвержден для использования в широком диапазоне растений хостов в недавно опубликованном исследовании корней, ризосфере и связанных почвах 18 видов растения, включая15 гаолян, Zea mays и Triticum aestivum. Этот метод также были проверены для использования с другими маркерных генов, как свидетельствует его успешное применение к изучению грибковых ITS2 маркер гена в изучении агавы микрофлора16,17 и клубники микрофлора 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. сбор и разделения корень Endosphere, ризосфере и образцы почвы

  1. Перед входом на местах, автоклав ультрачистая вода (по крайней мере 90 мл воды на сэмпл) для стерилизации. Подготовьте эпифиты удаления буфера (по крайней мере 25 мл на сэмпл) путем добавления 6.75 g KH2PO4, 8.75 г K2HPO4и 1 мл X-100 Тритон, 1 Л стерильной воды. Стерилизуйте буфер с помощью вакуум-фильтр с размером пор 0,2 мкм.
    1. Для шагов 1,2-1,5 чистые перчатки износа стерилизованное с этанолом на всех раз и замены перчаток между выборками для предотвращения загрязнения. Простерилизуйте все оборудование с 70% этанола и протрите все оборудование между выборками. До взятия пробы, определить глубину оптимальный выборки для вашего эксперимента и соответствовать все почвы и корня коллекции.
  2. Для сбора проб почвы оптом, использовать ядро сборщика этанола стерилизация почвы для получения почвы, которая свободна от корней растений, собирая ядро приблизительно 23-30 см от основания завода.
  3. Передача почвы в пластиковый мешок, гомогенизировать почвы мягкий встряхивания и передачи Алиготе образца грунта (примерно 600 мг) для заполнения одного 2-мл пробирку. Сразу же месте 2-мл пробирку на сухой лед или вспышки заморозить трубку в жидкости N2 до готовности приступить к экстракции ДНК (шаг 2).
    1. В некоторых средах окружающей почвы может содержать растительного материала. В этом случае используйте стерилизованные 2 мм сито для разделения мусора завод от почвы до помещения его в пластиковый пакет.
  4. Для сбора корень и ризосфере, используйте стерилизованное этанола лопатой выкапывают растения, заботясь, чтобы получить как много из корня как можно. Глубина зависит от завода. В то время как небольшие растения, такие как пшеница могут быть удалены путем выкапывать несколько сантиметров, крупных предприятий, таких, как сорго может потребоваться 30 см или более. Аккуратно стряхните излишки почвы от корней до тех пор, пока существует примерно 2 мм почвы, придерживаясь поверхности корня.
    Примечание: Будьте осторожны при работе с малыми заводами, хрупкие корни, или сухой, высокий глина контента почвах. В идеале должна существовать только тонким слоем почвы, оставаясь на корнях после встряхивания. Если остаются большие компоситы почвы, резинового молотка может использоваться выбить почву, осторожно нажав база стрелять. Если количество почвы, оставшиеся после этого процесса превышает или падает ниже 2 мм, следует отметить приблизительный толщина.
  5. Для крупных растений используйте стерильные ножницы и ножницы сократить представитель подраздел корней и поместить как минимум 500 мг, корня ткани в конической флакон 50 мл. Для меньших трав место всей корневой системы в пробирку. Добавьте достаточно эпифиты удаления буфера для покрытия корни, а затем сразу же поместить образец на сухой лед или вспышки заморозить образца в жидкости N2.
    Примечание: заботиться не переполняйте флакон 50 мл конические, как он будет делать Стиральная шаг трудно. Там должно быть достаточно пустого места, таким образом, что эпифиты буфера потока на дно, окружают корни всей флакона и крышка в верхней. Потому что некоторые травы имеют больше биомассы корень не будет вписываться в коническую пробирку 50 мл, подраздел корни должны быть собраны. Однако следует отметить, что резки корни может привести к эндофитные бактерий промывают в ризосфере дроби, так ломать корни должны быть сведены к минимуму. Если образцы не обрабатываются сразу же после возвращения в лаборатории, они могут храниться при температуре-80 ° C.
  6. Чтобы отделить ризосфере от корней, оттепель корень образец на льду, а затем sonicate корень образцы на 4 ° C на 10 мин с импульсами 160 Вт 30 s, разделенных 30 s. передачи корни в охлажденный (4 ° C), очистить 50 мл трубки с помощью стерильный пинцет. Не выбрасывайте оригинальный трубу с буфера и почвы, которая является ризосфере дроби (рис. 1).
  7. Центрифуга трубка, содержащая буфера и ризосфере для флэш-10 мин при 4 ° C, 4000 x g. Decant супернатанта, заморозить трубка, содержащая ризосфере дроби в жидкости N2и хранить ризосфере дробь в-80 ° C до готовности приступить к ДНК добыча (шаг 2).
  8. Для мытья корни, добавьте примерно 20 мл стерильной воды охлажденной (4 ° C) на долю корневой. Вымойте корня путем встряхивания энергично (от руки или смеситель, за 15-30 с) и затем слейте воду.
  9. Повторите этот шаг, по крайней мере дважды, до тех пор, пока не почвы остается на поверхности корня. Если экстракции ДНК (шаг 2) не производится немедленно, оберните корни в стерильных алюминиевой фольги, вспышки заморозить корни в жидкости N2и хранить образцы на-80 ° C до готовы приступить к экстракции ДНК.

2. ДНК добыча

Примечание: На протяжении шаги 2 и 3, чистые стерилизации с этанолом следует надевать перчатки во все времена, и вся работа должна быть выполнена на поверхности стерилизации с этанолом.

  1. Извлечь ДНК из образцов почвы и ризосфере.
    1. Использование стерильных шпатель для быстрой передачи 250 мг почвы и ризосфере из шагов 1.3 и 1.7 в отдельной коллекции трубок предусмотрено в коммерческих комплект изоляции ДНК предназначен для извлечения из почвы, а затем приступить к изоляции ДНК с помощью поставщика комплект Протокол.
    2. После элюирующие ДНК в Элюирующий буфер, поставляемых в комплект изоляции ДНК, храните ДНК при-20 ° C до готовности продолжить с шага 3.
  2. Извлечь из корневого образцов ДНК.
    1. Холод, стерилизованные ступку и пестик, используя жидкость N2. Отмерьте 600 до 700 мг, корня ткани и ткани в раствор. Осторожно добавьте достаточно жидкости N2 для покрытия корни.
    2. Молоть корни на мелкие кусочки. Продолжить процесс добавления жидкости N2 и шлифовальные (по крайней мере два раза, согласовываться между выборками), до тех пор, пока корни являются мелкий порошок. Убедитесь, что ткань корень не размораживать во время этого шага.
      Предупреждение: Использовать надлежащие средства личной защиты (лаборатории пальто, защитные очки и перчатки криогенных) при работе с жидкостью N2.
      Примечание: Для экстракции ДНК низкого качества, это может быть полезно измельчить в порошок избыток корни и хранить порошок-80 ° c.
    3. Быстро до корня порошок начинает таять, стерильные лопаточкой для передачи порошок корень в предварительно взвешенный 1.5 мл пробирок на льду. Запишите вес трубки и порошка. Как правило передается 300-400 мг порошка.
    4. Использование стерильных шпатель для быстрой передачи 150 мг порошка корня на коллекции трубу в коммерческих комплект изоляции ДНК предназначен для извлечения из почвы, а затем приступить к изоляции ДНК с помощью поставщика комплект протокола.
      Примечание: Для некоторых образцов корень, может быть высокой концентрацией органических веществ, оставшихся в ДНК Пелле, который предотвращает амплификации ДНК в PCR, особенно когда другой протокол извлечения ДНК (например., CTAB добычу) используется. При необходимости, очистите ДНК, следуя инструкциям, приведенным в экологической очистки комплект ДНК.
  3. Измерьте концентрацию всех образцов ДНК, используя флуориметр высок чувствительности benchtop.
    1. Добавьте 1-20 мкл каждого eluted образца ДНК в dsDNA высок чувствительности пробирного комплекта трубок. Добавьте флуориметр рабочего раствора (1: 200 краска: буфер) до 200 мкл.
    2. Подготовить две дополнительные пробирки, содержащие 10 мкл ДНК стандарт 1 (0 нг/мкл ДНК) или 10 мкл стандарт 2 (100 нг/мкл) и 190 мкл рабочего раствора флуориметр для каждого стандарта.
    3. Измерьте концентрацию стандартов и каждого образца. Если это не делается автоматически, рассчитайте концентрации ДНК от поглощения вывода методом линейной регрессии двух стандартов.

3. ампликон библиотеки подготовка и представление

  1. Настройка материалы для усиления реакции.
    1. Оттепель образцы ДНК при температуре 4 ° C и держать их на льду в шаг 3. Случайный порядок образцов ДНК, чтобы свести к минимуму предвзятость благодаря расположению на пластину ПЦР (Таблица 2).
    2. В 96-луночных ПЦР-планшете разбавляют ДНК от каждого образца в воде молекулярно класса до 5 нг/мкл в общем объеме 20 мкл. добавить 20 мкл молекулярного уровня воды скважин четыре угловых как негативный контроль для амплификации (пустые) (Таблица 2).
    3. Организовать перепутываются грунтовки (10 мкм) в PCR газа трубы или плиту 96-луночных таким образом, что они могут быть добавлены с многоканальные пипетки (рис. 2).
    4. Подготовьте достаточно мастер смесь ПЦР для того чтобы усилить каждый образец ДНК в трех экземплярах. Подготовить 1.5 мкл BSA (20 мг/мл), 37,5 мкл заранее сделал 2 x главный микс (состоит из буфера PCR, MgCl2, дНТФ и ДНК-полимеразы Taq ), 0,57 мкл хлоропласта PNA (100 мкм), митохондриальных PNA 0.57 мкл (100 мкм) и 25.86 мкл воды молекулярного уровня.
    5. Вылить смесь мастер в стерильные 25 мл многоканальные пипетки водохранилища и распространять 66 мкл мастер смесь в каждой скважине новой 96-луночных ПЦР пластины с помощью многоканальных дозаторов.
      Примечание: При расчете объемов реагент для основной смеси, убедитесь, что также включает 4 пустой скважины за тарелку.
    6. С помощью многоканальных дозаторов, мкл 6 5 нг/мкл ДНК (от нормализованные плиты ДНК) к пластине Мастер микс. Затем добавьте в мастер плита 1,5 мкл 10 мкм вперед грунтовки, таким образом, что каждый столбец имеет разные вперед штрих-код и 1,5 мкл 10 мкм вспять грунт, таким образом, чтобы каждая строка имеет различные обратный штрих-кодов (рис. 2).
      Примечание: Перед добавлением грунты, рандомизированных пластины и мастер смесь может использоваться для усиления его или ITS2 грибковых гены, если были добавлены различные грунтовки. Если это так, можно использовать подобные конструкции праймера.
    7. Спин вниз плита кратко в 3000 x g. использовать многоканальные пипетки осторожно перемешать, а затем разделить на три пластины с 25 мкл реакционной смеси.
      Примечание: Хотя три реплицирует не являются строго необходимыми, и уменьшается влияние технических изменчивости.
  2. Усилить ДНК в каждой пластины с помощью Термоциклер, набор для следующих условий: 180 s на 98 ° C, 30 циклов: 98 ° C на 45 s (денатурации), 78 ° C 10 s (PNA отжига), 55 ° C для 60 s (отжига праймера) и 72 ° C для 90 s (расширение) , затем 600 s при 72 ° C, после чего 4 ° C держать шаг. После усиления объединить три реплицировать пластины в один единый 96-луночных пластины.
  3. Количественного определения ДНК, используя высок чувствительности флуориметр реагенты в 96-луночных пластины читателя.
    1. 2 мкл каждого продукта PCR, в 96-луночных микропланшетов, наряду с 98 мкл флуориметр рабочего раствора (1: 200 краска: буфера). Включает 4 скважин как стандарты: 5 мкл ДНК стандарт 1 (0 нг/мкл ДНК), 1 мкл стандарт 2 (10 нг/мкл), 2 мкл стандарт 2 (20 нг/мкл) и 5 мкл стандарт 2 (50 нг/мкл). Затем добавьте флуориметр рабочего раствора для заключительного тома 100 µL.
      Примечание: Каждый образец может быть измерена с помощью benchtop флуориметр, как описано в шаге 2.3 Если плита читатель не доступен.
    2. Рассчитайте концентрации ДНК от поглощения вывода методом линейной регрессии четырех стандартов.
    3. Для успешно усиливается перепутываются продуктов (те, которые имеют больше чем 15 нг/мкл концентрации), бассейн 100 нг каждого образца в одном 1,5 мл трубку (Таблица 2).
    4. Рассчитайте средний объем выборок, добавляемого в пул, используя функцию =AVERAGE() в программу электронных таблиц. Добавьте объем «пустой» продуктов ПЦР проб имелось.
      Примечание: Поскольку «пустой» продукты PCR имеют свои собственные уникальные штрих комбинации, они можно упорядочивать для проверки любых загрязнений лаборатории.
  4. Измерить концентрацию совместного продукта с помощью benchtop флуориметр, как описано в шаге 2.3 и принимать 600 нг ДНК и развести в воде молекулярно класса в окончательный объем 100 мкл в 1,5 мл. Сохранить оставшиеся совместного продукта при-20 ° C.
  5. Вымойте 600 нг ДНК аликвота, следуя установленным процесс очистки ПЦР с парамагнитными очистки бисером в формате 96-луночных с некоторыми исключениями.
    1. Сделайте свежий 600 мкл аликвота 70% этанола. Встряхните бутылку магнитной бусины вновь приостановить бусы, которые оседают на дно.
    2. Добавьте 1 x объем (100 мкл) шарик раствора в 600 нг Алиготе ДНК. Тщательно перемешать, закупорить 10 раз. Инкубируйте 5 мин при комнатной температуре.
    3. Поместите трубку на магнитную подставку для 2 минут (или до тех пор, пока раствор не станет прозрачным) для разделения бусы из раствора. Пока трубки магнитного стенд, аспирационная ясно супернатант тщательно не касаясь магнитные бусы и отбросить ясно супернатант.
      Примечание: на данный момент, продукция ампликон привязаны к магнитной бусины. Бусы, которые нарушенных или утраченных во время стремление приведет к потере ДНК.
    4. Оставьте трубки в магнитного стенд и 300 мкл 70% этанола на трубу; Инкубируйте 30 s. аспирата из этанола и отменить при комнатной температуре. Повторите этот процесс и удалить все этанола после второй стирки. Снять трубку из магнитного стенд, а воздух сухой за 5 мин.
    5. 30 мкл молекулярного уровня воды сушеные бисером и смешивать, закупорить 10 раз. Инкубируйте при комнатной температуре на 2 мин возвращения трубки магнитного стенд за 1 мин, чтобы отделить бисер от решения. Передать элюата новой трубки.
      Примечание: Магнитные шарики не будет затрагивать течению реакций.
  6. Измерьте конечная концентрация очищены, обобщённые ДНК с помощью benchtop флуориметр, как описано в шаге 2.3. Разбавить Алиготе до 10 Нм в окончательный объем 30 мкл, или концентрации и объема, предпочитают объекта последовательности.
  7. Пользоваться услугами механизма виртуализации для последовательности ДНК на платформе NGS, 2 x 300 bp в паре конец последовательности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Выполнение рекомендуемых протокола должно привести к набор индексированных паре конец чтений, которые могут быть сопоставлены обратно каждый образец и назначен либо бактериальной оперативной таксономических единиц (ОТУ) или точную последовательность вариант (ESV, также упоминается как ампликон последовательности вариант (ASV) и sub-operational таксономическая единица (sOTU)), в зависимости от анализа ниже по течению. Для получения высокого качества последовательности данных, необходимо позаботиться на каждом шаге поддерживать согласованность между образцами и свести к минимуму введение любого потенциального смещения во время обработки образца или библиотека подготовки. После сбора, переработки и извлечения ДНК из образцов (шаги 1 и 2), результирующий элюата должен появиться четкие и бесплатно органических веществ, которые сдерживали бы усиления. Хотя чистоты могут быть проверены путем измерения каждого образца ДНК через спектрофотометр microvolume, мы нашли, что почвы комплект экстракции ДНК надежно удаляет все загрязнения. В результате предсказуемого качества ДНК методы количественной оценки, которые полагаются на основе флуоресценции красители, которые специально связывают ДНК являются более подходящим, чем те, которые основаны на УФ поглощения19,,2021. До амплификации PCR образцов почвы и ризосфере в среднем около 10 нг/мкл ДНК, в то время как корень образцы, как правило, имеют средняя концентрация примерно 30 нг/мкл (Таблица 2).

После усиления экологических ДНК (шаг 3), успех или неудача может определяться путем измерения концентрации ПЦР продукта через benchtop флуориметр реагентов на тарелку читатель, если таковые имеются, или вручную (Таблица 2). В нашем опыте успешных уточнениями, которые приводят к ампликон высокого качества данных дают больше, чем 15 нг/мкл продукты PCR. Если существует несколько сбоев на тарелку, позиционные договоренности в рамках завода и образец типа не образцов может помочь определить проблему. Например если они все прилегающие на табличке, это может означать ошибка пипеткой, а если они находятся в той же строке или столбце, можно предположить проблемы с конкретным грунт. Если все они принадлежат к одному типу образца, он может предложить проблемы с пример обработки или экстракции ДНК.

Важно проверить совместимость универсальной PNAs с bioinformatically системы вашего конкретного завода во время экспериментального дизайна для того, чтобы убедиться, что они будут блокировать амплификации генов митохондрий 16S и хлоропластов. После усиления шаг, не ясно ли PNAs успешно привязаны к митохондриальной и хлоропласта шаблоны; Это проявляется только после виртуализации (рис. 3). Чтобы гарантировать, что PNAs будет эффективно блокировать загрязнителем амплификации, выравнивание последовательности ПНА каждому хлоропластов и митохондриальной 16S рРНК гена (там может быть несколько копий) для завода хост расследуются не должна раскрывать любые несоответствия . Даже одно несоответствие 13 bp ПНА последовательности, особенно в середине ПНА зажим, может существенно снизить эффективность, как и в случае последовательности ПНА предоставленный хлоропластов и хлоропласта гена 16S рРНК Lactuca sativa (салат) ( Рисунок 3).

Так как равное количество амплифицированного ДНК пуле на сэмпл, там должно быть примерно даже количество считываний получено на сэмпл после виртуализации и сортировка читает, основанные на их перепутываются индекса (рис. 4). Большинство этих чтений должно соответствовать к бактериальной таксонов. Любые эукариот, митохондриальных, или хлоропласта матчи должны быть отброшены. В зависимости от анализа трубопровода и таксономические базы данных выбран, хлоропластов и митохондриальной читает может ошибочно присваиваться бактериальных родов, часто цианобактерий и Rickesttia, соответственно (рис. 3). Степень ручной курирование часто целесообразно проверить для этих общих назначений неправильно. Конкретные детали будут зависеть от выбора анализа, но относительное изобилие профили вообще должна быть аналогичной (никакого существенного различия) среди биологических реплицирует и значительно отличаются между почвой, ризосфере и образцы корня (Рисунок 5 ). Важно отметить, однако, что, хотя там может быть никакого существенного различия между биологической реплицирует, важно собрать по меньшей мере три реплицирует за.

Методы для интерпретации данных, полученных в этих экспериментах горячо обсуждается среди микробной экологов. До недавнего времени, анализ последовательности Ампликон был зависеть группировка читает в OTUs. Однако, эти проблемы потому что: 1) они основаны на несколько произвольных порог подобия 97%, 2) разнообразие часто недооценивается, и 3) не может быть низкой таксономических резолюции. Недавно разработанных инструментов таких как DADA2, Deblur и UNOISE222,,2324 возможность сортировать читает в ESVs, которые решает некоторые проблемы при использовании OTUs. Предостережения для использования ESVs включают в себя: 1) искусственное увеличение разнообразия к разницам в рРНК копий в пределах вида и 2) повышенная чувствительность ПЦР и секвенирования ошибки25,26.

Figure 1
Рисунок 1: разделение фракций корня и ризосфере. Блок отображения шаги для разделения ризосфере от корневого образцов, после мытья корни с стерильной водой, чтобы удалить все оставшиеся ризоплане организмов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: пример структуры запасов грунтовка для усиления и распространения внутри плиты. Складе грунтовки (Таблица 1) может быть подготовлен в трубки газа для оптимального распределения в течение 96-луночных пластины (каждая полоса праймеров представлен другой цвет; фиолетовый для грунтовки вперед 1-8, оранжевый для вперед грунтовки 9-16, синий для обратного грунтовки 1-12 и зеленый для обратного грунтовки 13-16.) В этом случае 16 вперед и 16 обратный грунты могут распределяться эффективно с многоканальные пипетки таким образом, что каждый хорошо имеет сочетание уникальный штрих-код. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: результаты, которые предполагают хлоропласта ПНА неэффективным. Представитель результат от ризосферной («Rhizo»), корень и образцы почвы из салата, которые были не относились (NT) или лечить (VT) с биологической почвы поправки. ПНА последовательность используется для блокировки хлоропласта загрязнения большинства растений является GGCTCAACCCTGGACAG27. Однако салат содержит несоответствия в хлоропласте гена 16S рибосомная РНК (GGCTCAACTCTGGACAG). Это сводит ПНА, что приводит к высокой относительное обилие чтений, которые соответствуют цианобактерии в ризосфере и корень образцы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: распространение чтения насчитывает среди образцов в библиотеке. Бар диаграмма, показывающая количество чтения графов (ось y) из различных образцов (бары, оси x), соответствует комбинацией штрих в чтение. Количество считываний за образец может меняться в зависимости от сколько образцы находятся в библиотеке; Это подмножество был секвенирован в библиотеке 192 проб. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: относительное обилие 12 лучших классов в корень, ризосфере и почвы общин. Линейчатая диаграмма с накоплением показаны относительное обилие классов в представитель 16S dataset, содержащий 6 реплицирует для каждого образца типа (сыпучих почв, ризосфере и endosphere корня). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1: Праймеры для усиления регионе V3 V4 гена 16S рРНК. Праймеры состоят из, последовательно: адаптер для общей платформы NGS, уникальный штрих-код, грунтовка для NGS, распорка региона переменной длины смещения кадра для секвенирования и универсальный PCR праймер, что усиливает 341F или 785R гена 16S рРНК. Количество грунтовки необходимо зависит сколько образцы виртуализируются каждой библиотеки; сочетание 16 вперед и 16 обратный грунтовки достаточна для 244 образцов (256 комбинаций грунт с 12, используется для пустых скважин во время ПЦР (рис. 2)). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Таблица 2: нормализация рандомизированных ДНК образцов до и после усиления. Пример листа список образцов в рандомизированных порядке и указанием их местоположения на одной пластине 96-луночных, который также определяет комбинацию грунтовка, возложенные на него. Формулы в нижней строке описания вычислений для добавления 100 нг каждого образца нормализованные плиты, плюс объем воды до 20 мкл. После усиления, объем 100 нг каждого успешного продукта рассчитывается и добавлен в пул окончательный. Объем «пустой» ПЦР продукта для добавления в окончательном пул является средним и другие примеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительные рисунок 1: приближение минимум корень биомассы во время проб. Когда сбор корней, попробуйте собрать по меньшей мере 500 мг ткани. Здесь, корни собираемые растения молодые сорго (слева, как A и B) и молодой риса завода (справа) показаны рядом с (A) и (B) 50 мл конические трубы. Оба образцы весят примерно 1 g, однако, важно отметить, что этот вес включает в себя ризосфере и корня, и вес ризосфере, в данном случае, примерно половину общего веса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Этот протокол показывает установленные трубопровода для изучения корня endosphere, ризосфере и почвы микробных композиции, от выборки поля Образец обработки и ниже по течению последовательности. Изучение связанных корня microbiomes представляет уникальные проблемы, из-за частично трудности, присущие выборки из почвы. Почвы очень разнообразны с точки зрения физических и химических свойств, и различных почвенных условий могут быть разделены в несколько миллиметров28,29. Это может привести к образцы, которые собираются из прилегающих выборки сайты, имеющие существенно различных микробных сообщества композиции и деятельности30,31. Таким образом использование почвы основными коллекционеров и лопаты для поддержания глубины последовательной выборки и гомогенизации до экстракции ДНК важны для воспроизводимости в пределах корневого микрофлора исследования. Важно также эффективно отделить ризосфере и корень фракций; с помощью суровых метода стерилизации поверхности корня могут потенциально лизируют эндофитов в корни до экстракции ДНК, в то время как более консервативные мыть не может удалить все микробы из поверхности корня7. Еще одним ключевым фактором, который может негативно повлиять или нарушить последовательность результатов является бактериального загрязнения, которые могут поступать из многих источников и иногда невозможно отличить от пробы окружающей среды бактерий32,33. По этой причине тщательной стерилизации инструментов выборки, экспериментальных материалов и рабочей среды являются жизненно важными для того, чтобы избежать загрязнения.

После выборки, получение высокого качества ДНК является приоритетной для успешного анализа, ниже по течению. По нашему опыту экстракции ДНК из поля выросли корень образцы посредством альтернативных методов, таких как через на основе CTAB добычу, часто содержат значительно большее количество гуминовых кислот и других соединений, по сравнению с образцы ризосфере и почвы. Эти соединения могут предотвратить Ферментативная активность ДНК-полимераза во время ПЦР-амплификации, даже при низких концентрациях34,35. С помощью экстракции ДНК комплекты, предназначенные для почв на корень образцов, в отличие от CTAB добычу, после чего фенола хлороформ очистки, можно эффективно избавиться от образцов гуминовых кислот и приведет к высоким качеством ДНК36,37, 38,39. Соответственно мы рекомендуем использование коммерчески доступных комплект экстракции ДНК для корня образцов, а также. Следует отметить, что целью является получение микробного геномной ДНК от корней растений. Таким образом измельчения тщательного и последовательного корень важно сломать тканей растений и лизируют микробной клетки выпустить микробной ДНК без введения смещения между выборками из-за различия в шлифовальный давления и времени.

После тщательного экстракции ДНК из образцов, существует два основных источника проблем во время усиления: 1) загрязнение растительных тканей с endosymbionts завод (хлоропластов и митохондрий) и 2) выбор 16S рРНК региона усилить. Амплификация хлоропласта или митохондрии 16S рРНК последовательности можно создать > 80% последовательностей в корень образцов40и более в тканях листа, хотя количество загрязнения зависит от выбора грунтовки. Таким образом ПНА зажимы необходимы во время шага ПЦР для подавления растений хлоропласта хост и митохондриальной 16S загрязнения27,41. Однако различных видов растений могут иметь различия в хлоропласте и последовательности митохондриальной 16S27; Таким образом важно, чтобы подтвердить последовательность хлоропластов и генов митохондрий 16S завода изучается до библиотеки виртуализации, с целью определения необходимости альтернативные oligos PNA (рис. 3). Кроме того гена 16S рРНК состоит из девяти гипервариабельных регионов, обрамленная девять консервативных районах; различные результаты могут быть получены из той же общины, в зависимости от которой гипервариабельных регион является усиленный42. Предыдущие исследования показали V4 региона является одним из самых надежных для назначения таксономии43 и он был использован для других обследований обширные микрофлора11. Удлинения целевой регион V3 V4 предлагается здесь повышения вариативности и таксономические резолюции.

В этом протоколе мы продемонстрировали трубопровода для выполнения 16S рРНК ампликон последовательности через следующего поколения последовательности (НОО) для изучения микробных композиции проб окружающей среды12. Мы рекомендуем использовать ампликон последовательности как инструмент для филогенетических профилирования, потому что это относительно недорогой, высокой пропускной способности и не требуют большой вычислительной опыт или ресурсы для анализа. В то время как наш метод сосредоточена на анализе часть бактериальная микрофлора, она может быть легко адаптирована для расследования грибов. Протокол идентичен через шаг 2, и только разница в шаге 3 какие праймеры будет использоваться во время усиления. Однако ничего не стоит, что профилирование на основе ампликон является не без ограничений. Секвенирование гена один маркер, получить никакой информации относительно функциональных возможностей сообщества. Кроме того таксономический резолюции может быть довольно низкой, особенно при виртуализации сред с высоким процентом uncharacterized микробов. Однако секвенирование технологии быстро развиваются, и мы ожидаем возможности для решения некоторых из этих недостатков путем адаптации этот протокол для использования с другими платформами виртуализации. Наконец как уже упоминалось во введении, дробовик метагеномики и metatranscriptomics легко могут выполняться на образцы почвы и ризосфере, и в настоящее время изучаются методы ликвидации загрязнения растений из растительных тканей. Экспериментальные образцы которых пара подходов на основе ампликон и другие методы метагеномных может быть особенно эффективным в сложных общинах, где высокое видовое разнообразие и неравномерным представление таксонов может предотвратить ружье данных точно Характеризуя менее доминирующим членов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа финансировалась USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS поддерживается программой стипендий аспирантов исследований NSF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1-10/20 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-3810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000027 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes Eppendorf 3120000909 Can substitute with equivalent from other suppliers.
100 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000043 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1000 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1122-1830 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1620-2700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mm soil sieve Forestry Suppliers 60141009 Can substitute with equivalent from other suppliers.
200 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-8810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
25 mL reservoirs VWR International LLC 89094-664 Can substitute with equivalent from other suppliers.
50 mL conical vials Thermo Fisher Scientific 352098 Can substitute with equivalent from other suppliers.
500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) VWR International LLC 156-4020
96-well microplates USA Scientific 655900
96-well PCR plates BioRad HSP9631
Agencourt AMPure XP beads Thermo Fisher Scientific NC9933872 Instructions for use:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180
&documentName=B37419AA.pdf
Aluminum foil Boardwalk 7124 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Analytical scale with 0.001 g resolution Ohaus Pioneer PA323 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Bioruptor Plus ultrasonicator Diagenode B01020001
Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL New England Biolabs B9000S
Centrifuge Eppendorf 5811000908 Including 50mL and 96-well plate bucket adapters
Cryogenic gloves Millipore Sigma Z183490 Can substitute with equivalent from other suppliers.
DNeasy PowerClean kit (optional) Qiagen Inc. 12877-50 Previously MoBio
DNeasy PowerSoil kit Qiagen Inc. 12888-100 Previously MoBio
Dry ice Any NA
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher Scientific 12321D Do not substitute
Ethanol VWR International LLC 89125-188 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gallon size freezer bags Ziploc NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gemini EM Microplate Reader Molecular Devices EM Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top.
K2HPO4 Sigma-Aldrich P3786
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
Lab coat Workrite J1367 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 Any NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 dewar Thermo Fisher Scientific 4150-9000 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Milli-Q ultrapure water purification system Millipore Sigma SYNS0R0WW
Mini-centrifuge Eppendorf 5404000014
Molecular grade water Thermo Fisher Scientific 4387937 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Mortars VWR International LLC 89038-150 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Nitrile gloves Thermo Fisher Scientific 19167032B Can substitute with equivalent from other suppliers.
Paper towels VWR International LLC BWK6212 Can substitute with equivalent from other suppliers.
PCR plate sealing film Thermo Fisher Scientific NC9684493
PCR strip tubes USA Scientific 1402-2700
Pestles VWR International LLC 89038-166 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Plastic spatulas LevGo, Inc. 17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) Thermo Fisher Scientific 13000014
PNAs - chloroplast and mitochondrial PNA Bio NA Make sure to verify sequence bioinformatically
Protective eyewear Millipore Sigma Z759015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Qubit 3.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33216
Qubit dsDNA HS assay kit Thermo Fisher Scientific Q32854
Rubber mallet (optional) Ace Hardware 2258622 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shears or scissors VWR International LLC 89259-936 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shovel Home Depot 2597400 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Soil core collector (small diameter: <1 inch) Ben Meadows 221700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Spray bottles Santa Cruz Biotechnology sc-395278 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) IDT NA 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry.
Thermocycler Thermo Fisher Scientific E950040015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Weigh boats Spectrum Chemicals B6001W Can substitute with equivalent from other suppliers.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17, (6), 333-351 (2016).
  2. Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic classification of environmental 16S rRNA gene sequences. ISME J. 6, (7), 1440-1444 (2012).
  3. Takahashi, S., Tomita, J., Nishioka, K., Hisada, T., Nishijima, M. Development of a Prokaryotic Universal Primer for Simultaneous Analysis of Bacteria and Archaea Using Next-Generation Sequencing. PLoS One. 9, (8), e105592 (2014).
  4. Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics. PLoS One. 9, (4), e93827 (2014).
  5. Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Front Plant Sci. 5, 209 (2014).
  6. Jiao, J. -Y., Wang, H. -X., Zeng, Y., Shen, Y. -M. Enrichment for microbes living in association with plant tissues. J Appl Microbiol. 100, (4), 830-837 (2006).
  7. Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Front Microbiol. 7, 773 (2016).
  8. Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R., Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 5709, 623-628 (2011).
  9. Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol Ecol. 87, (1), 217-230 (2014).
  10. Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLoS Biol. 15, (3), e2001793 (2017).
  11. Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. (2017).
  12. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6, (8), 1621-1624 (2012).
  13. Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform. Appl Environ Microb. 79, (17), 5112-5120 (2013).
  14. Degnan, P. H., Ochman, H. Illumina-based analysis of microbial community diversity. ISME J. 6, (1), 183-194 (2012).
  15. Naylor, D., DeGraaf, S., Purdom, E., Coleman-Derr, D. Drought and host selection influence bacterial community dynamics in the grass root microbiome. ISME J. (2017).
  16. Desgarennes, D., Garrido, E., Torres-Gomez, M. J., Peña-Cabriales, J. J., Partida-Martinez, L. P. Diazotrophic potential among bacterial communities associated with wild and cultivated Agave species. FEMS Microbiol Ecol. 90, (3), 844-857 (2014).
  17. Coleman-Derr, D., et al. Plant compartment and biogeography affect microbiome composition in cultivated and native Agave species. New Phytol. 209, (2), 798-811 (2016).
  18. De Tender, C., et al. Dynamics in the Strawberry Rhizosphere Microbiome in Response to Biochar and Botrytis cinerea Leaf Infection. Front Microbiol. 7, 2062 (2016).
  19. Kapp, J. R., et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol. 68, (2), 111-118 (2015).
  20. Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8, (6), e62692 (2013).
  21. O'Neill, M., McPartlin, J., Arthure, K., Riedel, S., McMillan, N. Comparison of the TLDA with the Nanodrop and the reference Qubit system. J Phys Conf Ser. 307, (1), 012047 (2011).
  22. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods. 13, (7), 581-583 (2016).
  23. Amir, A., et al. Deblur Rapidly Resolves Single-Nucleotide Community Sequence Patterns. mSystems. 2, (2), e00191-e00116 (2017).
  24. Edgar, R. C. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. bioRxiv. 081257 (2016).
  25. Nguyen, N. -P., Warnow, T., Pop, M., White, B. A perspective on 16S rRNA operational taxonomic unit clustering using sequence similarity. NPJ Biofilms Microbiomes. 2, 16004 (2016).
  26. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Holmes, S. P. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. (2017).
  27. Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nat Methods. 10, (10), 999-1002 (2013).
  28. O'Brien, S. L., et al. Spatial scale drives patterns in soil bacterial diversity. Environ Microbiol. 18, (6), 2039-2051 (2016).
  29. Fierer, N., Lennon, J. T. The generation and maintenance of diversity in microbial communities. Am J Bot. 98, (3), 439-448 (2011).
  30. Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nat Rev Microbiol. 15, (10), 579-590 (2017).
  31. Buckley, D. H., Schmidt, T. M. Diversity and dynamics of microbial communities in soils from agro-ecosystems. Environ Microbiol. 5, (6), 441-452 (2003).
  32. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
  33. Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15, (12), 564 (2014).
  34. Sutlović, D., Definis Gojanović, M., Andelinović, S., Gugić, D., Primorac, D. Taq polymerase reverses inhibition of quantitative real time polymerase chain reaction by humic acid. Croat Med J. 46, (4), 556-562 (2005).
  35. Sutlovic, D., Gamulin, S., Definis-Gojanovic, M., Gugic, D., Andjelinovic, S. Interaction of humic acids with human DNA: proposed mechanisms and kinetics. Electrophoresis. 29, (7), 1467-1472 (2008).
  36. Aleklett, K., Leff, J. W., Fierer, N., Hart, M. Wild plant species growing closely connected in a subalpine meadow host distinct root-associated bacterial communities. PeerJ. 3, e804 (2015).
  37. Bogas, A. C., et al. Endophytic bacterial diversity in the phyllosphere of Amazon Paullinia cupana associated with asymptomatic and symptomatic anthracnose. Springerplus. 4, 258 (2015).
  38. Hiscox, J., Savoury, M., Müller, C. T., Lindahl, B. D., Rogers, H. J., Boddy, L. Priority effects during fungal community establishment in beech wood. ISME J. 9, (10), 2246-2260 (2015).
  39. Zhang, T., Yao, Y. -F. Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific. PLoS One. 10, (6), e0130051 (2015).
  40. Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. PLoS One. 8, (8), e71360 (2013).
  41. Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity. Appl Environ Microb. 66, (2), 549-557 (2000).
  42. Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -A. Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems. Appl Environ Microb. 80, (15), 4626-4639 (2014).
  43. Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -Y. Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC Bioinformatics. 17, 135 (2016).
Изучения корня микрофлора: извлечение данных бактериальных сообщества из почвы, ризосфере и корень Endosphere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Simmons, T., Caddell, D. F., Deng, S., Coleman-Derr, D. Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere. J. Vis. Exp. (135), e57561, doi:10.3791/57561 (2018).More

Simmons, T., Caddell, D. F., Deng, S., Coleman-Derr, D. Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere. J. Vis. Exp. (135), e57561, doi:10.3791/57561 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter