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Genetics

Explorando a raiz Microbiome: extração de dados da comunidade bacteriana da rizosfera, solo e raiz Endosphere

doi: 10.3791/57561 Published: May 2, 2018

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo para obter dados de sequência de amplicons da rizosfera, solo e raiz endosphere microbiomes. Esta informação pode ser usada para investigar a composição e diversidade de comunidades microbianas associadas a planta e é apropriada para o uso com uma ampla gama de espécies de plantas.

Abstract

A relação íntima entre a planta hospedeira e microorganismos associados é crucial para determinar a adequação de planta e pode promover maior tolerância a estresses abióticos e doenças. Como a planta microbiome pode ser altamente complexos e de baixo custo, métodos de alta produtividade como baseados em amplicon sequenciamento do gene 16S rRNA frequentemente são preferidos para caracterizar sua composição microbiana e diversidade. No entanto, a seleção de metodologia apropriada na condução de tais experiências é fundamental para reduzir preconceitos, o que podem dificultar a análise e comparações entre estudos e amostras. Este protocolo descreve detalhadamente uma metodologia padronizada para a coleta e a extração de DNA de rizosfera, solo e amostras de raiz. Além disso, podemos destacar um pipeline de sequenciamento de amplicons do rRNA 16S bem estabelecida que permite a exploração da composição das comunidades bacterianas nestas amostras e pode ser facilmente adaptados para outros genes marcadores. Esse pipeline foi validado para uma variedade de espécies de plantas, incluindo o sorgo, milho, trigo, morango e agave e pode ajudar a superar os problemas associados com a contaminação de organelas vegetais.

Introduction

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Microbiomes planta-associado consistem em comunidades microbianas dinâmicas e complexas, compostas de archaea, bactérias, vírus, fungos e outros microorganismos eucarióticos. Além de seu papel bem estudado em causar doença de planta, planta associada micróbios também positivamente podem influenciar fitossanidade, melhorando a tolerância a estresses bióticos e abióticos, promovendo a disponibilidade de nutrientes e realçando o crescimento das plantas através de a produção de fitohormônios. Por esta razão, particular interesse existe em caracterizar os táxons que associam a planta raiz endospheres, rhizospheres e o solo circundante. Enquanto alguns micróbios podem ser cultivados em isolamento no laboratório de mídia gerado, muitos não podem, em parte porque eles podem confiar em relações simbióticas com outros micróbios, crescem muito lentamente, ou exigem condições que não podem ser replicadas em um ambiente de laboratório. Porque evita a necessidade de cultivo e é relativamente barato e de alta produtividade, baseada em sequência filogenética caracterização das amostras microbianas ambientais e associado anfitrião tornou-se um método preferido para análise do comunidade microbiana composição.

A seleção de tecnologias de sequenciamento apropriados fornecidos por vários próxima geração (NGS) plataformas1 de sequenciamento é dependente de necessidades dos usuários, com importantes fatores incluindo: cobertura desejada, comprimento de amplicons, espera-se comunidade diversidade, bem como taxa de erro, leia-comprimento e o custo-por-gerência/megabase de sequenciamento. Outra variável que precisa ser considerado em experimentos de sequenciamento baseado em amplicon é que gene vai ser amplificado e que as primeiras demão serão usadas. Quando projetando ou escolhendo as primeiras demão, pesquisadores muitas vezes são forçados a fazer compensações entre a universalidade da amplificação e a resolução taxonômica realizáveis dos amplicons resultante. Por esta razão, estes tipos de estudos muitas vezes escolheram primers e marcadores que alvejar seletivamente subconjuntos específicos da microbiome. Avaliando a composição das comunidades bacterianas é comumente realizado por sequenciamento de uma ou mais das regiões hipervariáveis do bacteriana 16S rRNA gene2,3. Neste estudo, descrevemos um amplicon baseado sequenciamento protocolo desenvolvido para uma plataforma NGS região alvos a 500 bp V3-V4 do gene bacteriano 16S rRNA, que permite ampla amplificação de táxons bacterianas, proporcionando também variabilidade suficiente para distingui entre diferentes táxons. Além disso, este protocolo pode ser facilmente adaptado para o uso com outros conjuntos de cartilha, tais como os alvos o marcador ITS2 de fungos ou a subunidade de rRNA 18S de eucariotas.

Enquanto outras abordagens tais como espingarda metagenômica, metatranscriptomics e sequenciamento de célula única, oferecem outras vantagens, incluindo genomas microbianas resolvidas e medida mais direta da função da Comunidade, estas técnicas são normalmente mais caro e computacionais do que os perfis filogenética descrevem aqui4. Além disso, realizando metagenomics espingarda e metatranscriptomics em amostras de raiz produz uma grande percentagem de leituras pertencentes ao genoma vegetal hospedeiro, e métodos para superar esta limitação ainda estão sendo desenvolvidos5,6.

Tal como acontece com qualquer plataforma experimental, criação de perfil baseada em amplicon pode introduzir um número de possíveis enviesamentos que devem ser considerados durante a análise de dados e projeto experimental. Estes incluem os métodos de coleta de amostra, DNA extração, seleção de primers PCR e como é realizada a preparação da biblioteca. Diferentes métodos podem significativamente afetar a quantidade de dados utilizáveis gerados e podem também prejudicar os esforços para comparar os resultados entre os estudos. Por exemplo, o método de remoção de bactérias rizosfera7 e a utilização de técnicas diferentes de extração ou escolha de extração de DNA a kits8,9 foram mostrados para impacto a jusante análise, que leva a conclusões diferentes sobre os quais os micróbios são presente e suas abundâncias relativas. Desde a criação de perfil baseada em amplicon pode ser personalizada, fazer comparações entre estudos pode ser um desafio. O projeto de Microbiome terra sugeriu que pesquisadores estudando sistemas complexos tais como a planta associada microbiome beneficiaria o desenvolvimento de protocolos padronizados como um meio de minimizar a variabilidade causada pela aplicação de diferentes métodos entre estudos10,11. Aqui, discutimos muitos dos tópicos acima e oferecer sugestões sobre as melhores práticas onde apropriado.

O protocolo demonstra o processo de coleta de solo rizosfera e amostras de raiz de Sorghum bicolor e extrair DNA usando uma bem-estabelecida kit isolamento de DNA11. Além disso, o nosso protocolo inclui um fluxo de trabalho sequenciamento detalhado amplicon, usando uma plataforma NGS comumente utilizada, para determinar a estrutura das comunidades bacterianas12,13,14. Este protocolo foi validado para o uso em uma ampla gama de hospedeiros de planta em um recente estudo publicado das raízes e rizosfera associado-solos de 18 espécies de plantas, incluindo Sorghum bicolor, Zea mays e Triticum aestivum15. Este método também foi validado para uso com outros genes marcadores, como demonstrado pela sua aplicação bem sucedida para estudar o gene marcador ITS2 fúngico em estudos do agave microbiome16,17 e microbiome morango 18.

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Protocol

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1. recolha e separação de raiz Endosphere, rizosfera e amostras de solo

  1. Antes de entrar em campo, água ultrapura autoclave (pelo menos 90 mL de água por exemplo) para esterilizar. Prepare o buffer de remoção de epífitas (pelo menos 25 mL por amostra), acrescentando 6,75 g de KH2PO4, 8,75 g de K2HPO4e 1 mL de Triton X-100, para 1 L de água estéril. Esterilize o buffer usando um filtro de vácuo com tamanho de poro 0,2 µm.
    1. Para etapas de 1.2 a 1.5, desgaste luvas esterilizadas esterilizadas com etanol em todos os momentos e substituir as luvas entre cada amostra para evitar a contaminação. Esterilizar todos os equipamentos com etanol a 70% e limpe todos os equipamentos entre as amostras. Antes da amostragem, determinar a profundidade de amostragem ideal para sua experiência e ser coerente com todas as coleções de solo e raiz.
  2. Para coletar amostras de solo em massa, use um coletor de núcleo de solo etanol-esterilizados para obter solo que é livre de raízes de plantas, recolhendo um núcleo aproximadamente 23 a 30 cm da base da planta.
  3. Transferir o solo para um saco de plástico, homogeneizar o solo por agitação suave e transferir uma alíquota da amostra de solo (cerca de 600 mg) para encher um tubo de 2 mL. Imediatamente, coloque o tubo de 2 mL em gelo seco ou flash congelar o tubo no líquido N2 até estar pronto para prosseguir com a extração de DNA (etapa 2).
    1. Em alguns ambientes, do solo circundante pode conter material vegetal. Nesse caso, use uma peneira de 2mm esterilizado para separar os restos de plantas do solo antes de colocá-lo num saco de plástico.
  4. Para coletar a raiz e a rizosfera, use uma pá de etanol-esterilizados para desenterrar a planta, tendo o cuidado de obter o máximo da raiz quanto possível. Profundidade é dependente da planta. Enquanto pequenas plantas como o trigo podem ser removidas por cavar vários centímetros, plantas maiores tais como sorgo podem exigir 30 cm ou mais. Agite delicadamente fora excesso solo das raízes até há cerca de 2 mm do solo, aderindo à superfície da raiz.
    Nota: tenha cuidado ao trabalhar com pequenas plantas, com raízes frágeis, ou em solos conteúdos secos, alta-argila. Idealmente, só deve haver uma camada fina de solo, permanecendo nas raízes após agitação. Se continuam a ser grandes agregados do solo, um martelo de borracha pode ser usado para deslocar o solo batendo suavemente a base da filmagem. Se a quantidade de solo restante após este processo excede ou fica aquém de 2 mm, a espessura aproximada deve notar-se.
  5. Para plantas grandes, use tesoura esterilizada e/ou tesouras para cortar uma subseção representativa das raízes e colocar um mínimo de 500 mg de tecido de raiz dentro de um frasco de Erlenmeyer de 50 mL. Para gramíneas menores, coloque todo o sistema de raiz dentro do frasco. Adicionar suficiente reserva de remoção de epífitas para cobrir as raízes, em seguida, imediatamente, colocar a amostra em gelo seco ou flash congelar a amostra do líquido N2.
    Nota: tenha cuidado para não encher demais o recipiente cónico de 50 mL, como ele vai fazer lavagem passo difícil. Deve haver bastante espaço vazio, tal que o buffer de epífitas é capaz de fluir para o fundo, cercam as raízes ao longo do frasco e cobrir o topo. Porque algumas gramíneas tem mais biomassa de raiz que vai caber dentro de um frasco de Erlenmeyer de 50 mL, uma subseção de raízes deve ser colhida. No entanto, deve notar-se que corte as raízes poderia levar a bactérias endofíticas sendo lavadas para fora para a fração de rizosfera, raízes o namoro deve ser minimizado. Se as amostras não são processadas imediatamente após retornar para o laboratório, eles podem ser armazenados a-80 ° C.
  6. Para separar as raízes, a rizosfera, descongelar a amostra de raiz no gelo e, em seguida, proceda à sonicação das amostras de raiz a 4 ° C por 10 min com pulsos de 160 W por 30 s, separados por 30 s. transferência as raízes em um gelado (4 ° C), limpe 50 mL tubo usando Pinças esterilizadas. Não elimine o tubo original com amortecedor e solo, que é a fração de rizosfera (Figura 1).
  7. Centrifugar o tubo contendo tampão e rizosfera para 10 min a 4 ° C, 4.000 x g. decantar o sobrenadante, flash congelar o tubo contendo a fração de rizosfera em líquido N2e armazenar a fração de rizosfera a-80 ° C até que esteja pronto para prosseguir com o DNA extração (etapa 2).
  8. Para lavar as raízes, adicione cerca de 20 mL de água estéril refrigerados (4 ° C) para a fração de raiz. Lave a raiz agitando vigorosamente (à mão ou mixer, para 15 a 30 s) e em seguida, drenar a água.
  9. Repita este passo pelo menos duas vezes, até que nenhum solo permanece na superfície de raiz. Se a extração de DNA (etapa 2) não é executada imediatamente, envolva as raízes em folha de alumínio estéril, flash congelar as raízes no líquido N2e armazenar as amostras a-80 ° C até pronto para prosseguir com a extração de DNA.

2. extração de DNA

Nota: Durante as etapas 2 e 3, luvas esterilizadas esterilizadas com etanol devem ser usadas em todos os momentos e todo o trabalho deve ser realizado sobre uma superfície esterilizada com etanol.

  1. Extrai o DNA de amostras de solo e da rizosfera.
    1. Uso uma espátula estéril para transferir rapidamente 250 mg do solo e da rizosfera de passos 1.3 e 1.7 nos tubos de coleta seletiva fornecida em um kit de isolamento de DNA comercial projetado para extração do solo e, em seguida, prosseguir com isolamento de DNA utilizando o fornecedor kit protocolo.
    2. Após a eluição do DNA no buffer de eluição fornecido pelo kit de isolamento de DNA, armazene o DNA a-20 ° C até que esteja pronto para prosseguir com o passo 3.
  2. Extrai o DNA de amostras de raiz.
    1. Acalme um esterilizado pilão usando líquido N2. Meça 600 a 700 mg de tecido de raiz e coloque o tecido no almofariz. Cuidadosamente, adicione o suficiente de líquido N2 para cobrir as raízes.
    2. Moa as raízes em pedaços pequenos. Continuar o processo de adição de líquido N2 e moagem (pelo menos duas vezes, ser consistente entre amostras), até que as raízes são um pó fino. Certifique-se de que o tecido de raiz Não descongele durante esta etapa.
      Atenção: Utilize equipamento de protecção adequado (jaleco, óculos de proteção e luvas criogênicas) quando trabalhar com líquido N2.
      Nota: Para uma extração de DNA de baixa qualidade, pode ser benéfico moer raízes em excesso em pó e armazenar o pó a-80 ° C.
    3. Rapidamente, antes da raiz em pó começa a descongelar, use uma espátula estéril para transferir o pó da raiz em tubos pré-pesados 1,5 mL no gelo. Registre o peso do tubo e do pó. Normalmente, 300-400 mg de pó é transferida.
    4. Uso uma espátula estéril rapidamente transferir 150 mg de pó de raiz para o tubo de coleta fornecido em um kit de isolamento de DNA comercial projetado para extração do solo e, em seguida, prosseguir com isolamento de DNA usando o protocolo do kit fornecedor.
      Nota: Para algumas amostras de raiz, pode haver uma alta concentração de orgânicos, permanecendo na pelota do ADN, que impede a amplificação do DNA durante a PCR, especialmente quando um protocolo de extração de DNA diferente (ex., extração CTAB) é usado. Se necessário, limpe o DNA, seguindo as instruções fornecidas no kit de limpeza ambiental do DNA.
  3. Medir a concentração de todas as amostras de DNA usando um dados de bancada de alta sensibilidade.
    1. Adicione 1 a 20 µ l de cada amostra de DNA eluted em tubos fornecidos no kit de ensaio de alta sensibilidade de dsDNA. Adicione a solução de trabalho de dados (tintura: tampão de 1: 200) até 200 µ l.
    2. Prepare dois tubos adicionais contendo 10 µ l de DNA (0 em ng / µ l DNA) o padrão 1 ou 10 µ l de 2 padrão (100 ng / µ l) e adicionar 190 µ l da solução de trabalho de dados para cada norma.
    3. Medir a concentração das normas e cada amostra. Se não for feito automaticamente, calcule a concentração de DNA na saída de absorvância por uma regressão linear das duas normas.

3. Biblioteca de amplicons preparação e submissão

  1. Conjunto de materiais para a reação de amplificação.
    1. Descongelar as amostras de DNA em 4 ° C e mantê-los no gelo em toda a etapa 3. Randomize a ordem das amostras de DNA para minimizar o viés devido à localização na placa do PCR (tabela 2).
    2. Em um prato PCR de 96 poços, dilua DNA de cada amostra em água molecular-classe a 5 ng / µ l em um volume total de 20 µ l. Adicionar 20 µ l de água molecular grau aos poços quatro canto como controles negativos para amplificação (vazias) (tabela 2).
    3. Organize os primers de código de barras (10 µM) em cadeia da polimerase tira ou uma placa de 96 poços, tais que podem ser adicionados com uma pipeta multicanal (Figura 2).
    4. Prepare a mistura de mestre PCR suficiente para amplificar cada amostra de DNA em triplicado. Prepare-se 1,5 µ l de BSA (20 mg/mL), 37,5 µ l de pre-feitos 2x mestre mix (composto de tampão PCR, MgCl2, dNTPs e Taq DNA polimerase), 0.57 µ l de cloroplasto PNA (100 µM), 0.57 µ l de PNA mitocondrial (100 µM) e 25.86 µ l de água molecular da classe.
    5. Deite a mistura de mestre para um estéril 25 mL de reservatório de pipeta multicanal e distribuir 66 µ l do mix mestre em cada poço de uma nova placa PCR de 96 poços, com uma pipeta multicanal.
      Nota: Quando calcular volumes de reagente para a mistura de mestre, certifique-se de incluir também os 4 poços em branco por placa.
    6. Usando uma pipeta multicanal, adicione 6 µ l de 5 ng / µ l ADN (a partir da placa de DNA normalizada) para a placa de mistura de mestre. Em seguida, adicione ao µ l placa mestra 1.5 de primer para a frente de 10 µM, tal que cada coluna tem um código de barras para a frente diferente e 1,5 µ l de 10 µM reverter a primeira demão, tal que cada linha tem um código de barras reverso diferente (Figura 2).
      Nota: Antes da adição de cartilhas, as placas randomizadas e mestre mistura poderiam ser usados para amplificar os genes de fungos ITS ou ITS2 se diferentes iniciadores foram adicionados. Se este for o caso, um projeto da primeira demão semelhante pode ser usado.
    7. Spin-down a placa brevemente no 3.000 g. x Use uma pipeta multicanal para misturar suavemente e, em seguida, dividir em três placas com 25 µ l de mistura reacional.
      Nota: Apesar de três repetições não são estritamente necessárias, diminui o impacto da variabilidade técnica.
  2. Amplificar o DNA em cada placa usando um thermocycler definido para as seguintes condições: 180 s a 98 ° C, 30 ciclos de: 98 ° C por 45 s (desnaturação), 78 ° C, durante 10 s (PNA recozimento), a 55 ° C por 60 s (recozimento da primeira demão) e 72 ° C por 90 s (extensão) , então 600 s a 72 ° C, seguido por um 4 ° C segurar o passo. Após a amplificação, juntar as três placas de replicar em uma única placa de 96 poços.
  3. Quantificar o DNA usando reagentes de alta sensibilidade de dados em um leitor de placa de 96 poços.
    1. Adicione 2 µ l de cada produto do PCR para uma microplaca de 96 poços, juntamente com 98 µ l da solução de trabalho de dados (tintura: tampão de 1: 200). Inclui 4 poços como padrões: 5 µ l de DNA 1 padrão (0 ng / µ l DNA), 1 µ l de padrão 2 (10 ng / µ l), 2 µ l de padrão 2 (20 ng / µ l) e 5 µ l de padrão 2 (50 ng / µ l). Em seguida, adicione solução de trabalho de dados para um volume final de 100 µ l.
      Nota: Cada amostra pode ser medida usando um bancada de dados, conforme descrito na etapa 2.3 se um leitor não está disponível.
    2. Calcule a concentração de DNA na saída de absorvância por uma regressão linear dos quatro padrões.
    3. Para o código de barras com sucesso amplificado produtos (aqueles que têm uma concentração maior que 15 ng / µ l), piscina 100 ng de cada amostra em um tubo único 1,5 mL (tabela 2).
    4. Calcule o volume médio de amostras adicionado ao pool usando a função =AVERAGE() em um programa de planilha. Adicione o volume dos produtos do PCR "em branco" para as amostras em pool.
      Nota: Desde que os produtos PCR "em branco" têm suas próprias combinações de código de barras único, eles podem ser sequenciados para verificar se há quaisquer contaminantes de laboratório.
  4. Medir a concentração do produto em pool usando um bancada de dados conforme descrito no passo 2.3 e tomar 600 ng de DNA e diluir em água molecular grau até um volume final de 100 µ l em um tubo de 1,5 mL. Armazenar o produto em pool restante a-20 ° C.
  5. Lave a 600 ng DNA alíquota, seguindo o processo de purificação do PCR estabelecido com grânulos de purificação paramagnética em um formato de 96 poços, com algumas exceções.
    1. Fazer um fresco µ l 600 alíquota de etanol a 70%. Agite bem o frasco de grânulos magnéticos para re-suspender contas que resolver até o fundo.
    2. Adicione 1 volume x (100 µ l) da solução de grânulo de alíquota 600 ng de DNA. Misture bem, pipetando 10 vezes. Incube durante 5 min à temperatura ambiente.
    3. Coloque o tubo sobre o carrinho magnético por 2 min (ou até solução é clara) para separar os grânulos de solução. Enquanto o tubo é ainda no suporte magnético, aspirar o sobrenadante claro, cuidadosamente, sem tocar as esferas magnéticas e descartar o sobrenadante claro.
      Nota: neste ponto, os amplicon produtos são obrigados às esferas magnéticas. Quaisquer contas que são perturbada ou perdida durante a aspiração resultará em perda de DNA.
    4. Deixar o tubo no suporte magnético e adicionar 300 µ l de etanol 70% para o tubo; incube a temperatura ambiente por 30 s. Aspire o etanol e o descarte. Repita este processo e remover todos os etanol após a segunda lavagem. Retire o tubo do suporte magnético e o ar seco por 5 min.
    5. Adicionar 30 µ l de água molecular grau para os grânulos secos e misture pipetando 10 vezes. Incube a temperatura ambiente por 2 min. o tubo de retorno para o suporte magnético para 1 min para separar as contas da solução. Transfira o eluato para um tubo novo.
      Nota: Grânulos magnéticos não afetará as reações a jusante.
  6. Medir a concentração final de limpos, DNA agrupado usando um bancada de dados, conforme descrito na etapa 2.3. Diluir uma alíquota de 10 nM em um volume final de 30 µ l, ou para a concentração e volume preferido pela facilidade de sequenciamento.
  7. Utilize os serviços de uma instalação de sequenciamento para sequenciar o DNA em uma plataforma NGS, 2 x 300 sequenciamento de bp emparelhado-final.

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Representative Results

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Executar o protocolo recomendado deve resultar em um conjunto de dados de leituras de emparelhado-final indexados que podem ser combinados para cada amostra e atribuído a qualquer um bacteriano unidades taxonômicas operacionais (OTU) ou sequência exata variante (ESV, também conhecido como amplicon variante de sequência (ASV) e sub-operational unidade taxonômica (sOTU)), dependendo de análise a jusante. A fim de obter dados de sequência de alta qualidade, deve ter-se cuidado em cada etapa para manter a consistência entre as amostras e minimizar a introdução de qualquer viés potencial durante o processamento da amostra ou preparação de biblioteca. Após a coleta, processamento e extração de DNA de amostras (etapas 1 e 2), o eluato resultante deve aparecer, clara e livre de produtos orgânicos que iria inibir a amplificação. Enquanto a pureza pode ser verificada através da medição de cada amostra de DNA através de um Espectrofotômetro de microvolume, achamos que o kit de extração de DNA de solo confiantemente remove todos os contaminantes. Como resultado a qualidade previsível do DNA, métodos de quantificação que dependem de corantes baseada em fluorescência que se ligam especificamente a ADN são mais adequados do que aquelas baseadas em UV absorvância19,20,21. Antes da amplificação por PCR, amostras de solo e da rizosfera média de cerca de 10 ng / µ l DNA, enquanto amostras de raiz normalmente têm uma concentração média de aproximadamente 30 ng / µ l (tabela 2).

Após a amplificação do DNA ambiental (etapa 3), o sucesso ou fracasso pode ser determinado medindo-se a concentração do produto através de reagentes de dados benchtop PCR em um leitor de placas, se disponível, ou manualmente (tabela 2). Em nossa experiência, bem sucedidas amplificações que resultam em dados de alta qualidade amplicon rendem maior que 15 produtos PCR ng / µ l. Se houver várias falhas em um prato, o arranjo posicional dentro da planta e o tipo de amostra de amostras falhadas pode ajudar a determinar o problema. Por exemplo, se eles são todos adjacentes na placa, isso pode indicar erro de pipeta, Considerando que, se eles estão todos na mesma linha ou coluna, isso poderia sugerir questões com um primer específico. Se todos eles pertencem ao mesmo tipo de amostra, ele pode sugerir problemas com processamento de amostra ou extração de DNA.

É importante verificar a compatibilidade do PNAs universais com sua bioinformatically de sistema planta específica durante o desenho experimental a fim de verificar que obstruirão a amplificação do cloroplasto e genes mitocondriais 16S. Após a etapa de amplificação, não está claro se a PNAs vinculado com êxito a mitocondrial e modelos do cloroplasto; Isto só é revelado após a sequenciação (Figura 3). Para ajudar a garantir que a PNAs efetivamente irão bloquear a amplificação de contaminantes, um alinhamento da sequência para cada cloroplasto e mitocondrial 16S gene rRNA (pode haver várias cópias) para a planta PNA anfitrião sendo investigado não deve revelar quaisquer incompatibilidades . Nem uma única incompatibilidade para a sequência PNA bp 13, especialmente no meio da mordaça PNA, pode reduzir drasticamente a eficácia, como no caso da sequência PNA cloroplasto fornecido e o gene de rRNA 16S cloroplasto de Lactuca sativa (alface) ( Figura 3).

Desde que uma quantidade igual de DNA amplificado é agrupada por amostra, lá deve ser um aproximadamente o mesmo número de leituras obtido por amostra depois de sequenciação e ordenação lê baseado em seu índice de código de barras (Figura 4). A maioria destas leituras deve corresponder a um taxon bacteriana. Qualquer eucariota, mitocondrial, ou cloroplasto partidas devem ser descartadas. Dependendo do pipeline de análise e banco de dados taxonômico escolhido, leituras mitocondriais e cloroplasto podem equivocadamente ser atribuídas a linhagens bacterianas, frequentemente cianobactérias e Rickesttia, respectivamente (Figura 3). Um grau de curadoria manual muitas vezes é prudente para verificar estas atribuições mis comuns. Detalhes específicos dependerá a escolha de análise, mas perfis de abundância relativa geralmente devem ser semelhantes (não há diferença significativa) entre réplicas biológicas e significativamente diferentes entre rizosfera, solo e amostras de raiz (Figura 5 ). É importante observar, no entanto, que enquanto não pode haver nenhuma diferença significativa entre repetições biológicas, é importante coletar pelo menos três repetições por.

Métodos para interpretar os dados obtidos nesses experimentos são motivo de acalorados debates entre ecologistas microbianas. Até recentemente, análise de sequência do amplicon foi dependente de agrupamento leituras em OTUs. No entanto, estas são problemáticas porque: 1) que se baseiam em um limite um pouco arbitrário de 97% de similaridade, 2) diversidade é muitas vezes subestimada, e 3) pode ser baixa resolução taxonômica. Recentemente desenvolvidas ferramentas tais como DADA2, Deblur e UNOISE222,23,24 são capazes de classificar leituras em ESVs, que resolve alguns problemas apresentados quando usando OTUs. Ressalvas ao uso de ESVs incluem: 1) artificiais aumentos na diversidade devido às diferenças em cópias de RNA ribossomal, dentro de uma espécie e 2) aumento da sensibilidade do PCR e sequenciamento de erros25,26.

Figure 1
Figura 1: separação de fracções de raiz e rizosfera. Fluxograma mostrando os passos para separar a rizosfera de amostras de raiz, seguidas por lavar as raízes com água estéril para remover todos os restantes organismos rhizoplane. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: exemplo de layout de estoque cartilha para amplificação e distribuição dentro de placas. Iniciadores de estoque (quadro 1) podem ser preparados em tubos de strip-tease para distribuição ideal dentro de placas de 96 poços (cada tira de primers é representada por uma cor diferente; roxo para primers para a frente, 1-8, laranja para encaminhar as primeiras demão 9-16, azul para iniciadores reversos 1-12 e verde para reverter as primeiras demão 13-16.) Neste caso, 16 para a frente e 16 Cartilhas reversos podem ser distribuídas eficientemente com uma pipeta multicanal tal que cada um tem uma combinação única de código de barras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: resultados que sugerem cloroplasto PNA é ineficaz. Resultado representativo da rizosfera ("Rhizo"), raiz e amostras de solo de alface (NT) não tratados ou tratadocom (VT) com uma alteração biológica do solo. A sequência PNA usada para impedir a contaminação de cloroplasto da maioria das plantas é GGCTCAACCCTGGACAG27. No entanto, o alface contém uma incompatibilidade no gene do RNA ribossomal 16S cloroplasto (GGCTCAACTCTGGACAG). Isso torna o PNA ineficazes, resultando em uma alta abundância relativa de leituras que correspondem a cianobactérias na rizosfera e raiz de amostras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: distribuição de leitura conta entre amostras em uma biblioteca. Gráfico de barras mostrando o número de contagens (eixo y) lidos amostras diferentes (bares, eixo x), correspondidas com a combinação de código de barras na leitura. O número de leituras por exemplo pode variar de acordo com quantas amostras estão na biblioteca; Esse subconjunto foi sequenciado em uma biblioteca de 192 amostras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: abundância relativa das classes na raiz, rizosfera e solo comunidades top 12. Gráfico de barras empilhadas, mostrando a abundância relativa de classes presentes em um representante 16S dataset contendo 6 repetições para cada tipo de amostra (solo de granel, rizosfera e raiz endosphere). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Primers para amplificar a região V3-V4 do gene 16S rRNA. As primeiras demão são compostas de, sequencialmente: um adaptador para uma plataforma comum de NGS, um único código de barras, o primer para NGS, uma região de espaçador de comprimento variável para mudar o quadro de sequenciamento e um primer universal de PCR que amplifica ou 341F ou 785R do gene 16S rRNA. O número de primers necessários depende quantas amostras são sequenciadas por biblioteca; uma combinação de 16 para a frente e 16 primers reversa é suficiente para 244 amostras (256 combinações de primeira demão com 12 usado para poços em branco durante a PCR (Figura 2)). Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela 2: normalização de DNA randomizado amostras antes e após amplificação. Planilha de exemplo listando as amostras em uma ordem aleatória e indicando a sua localização em uma única placa de 96 poços, que também determina a combinação de primeira demão atribuída a ele. Fórmulas da linha inferior descrevem os cálculos para a adição de 100 ng de cada amostra a placa normalizada, além do volume de água para chegar a 20 µ l. Após amplificação, o volume de 100 ng de cada produto bem sucedido é calculado e adicionado a um pool de final. O volume de produto PCR "em branco" para adicionar ao pool final é a média dos outros exemplos. Clique aqui para baixar este arquivo.

Suplementar Figura 1: aproximação de biomassa de raiz mínima durante a coleta de amostra. Quando a coleta de raízes, tentar recolher pelo menos 500 mg de tecido. Aqui, as raízes coletadas de uma planta de sorgo jovem (esquerda, em ambos os casos A e B) e uma planta de arroz jovem (à direita) são mostrados ao lado (A) e no interior de tubos cónicos (B) 50 mL. Ambas amostras pesam cerca de 1 g, no entanto, é importante notar que este peso inclui a rizosfera e raiz, e o peso da rizosfera é, neste caso, aproximadamente metade do peso total. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

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Este protocolo demonstra um pipeline estabelecido para explorar a raiz endosphere, rizosfera e composições de comunidade microbiana do solo, de amostragem de campo de processamento de amostra e sequenciamento a jusante. Estou estudando microbiomes associada a raiz apresenta desafios únicos, devido em parte às dificuldades inerentes em amostragem do solo. Os solos são altamente variável em termos de propriedades físicas e químicas, e as condições do solo diferentes podem ser separadas por tão pouco quanto alguns milímetros28,29. Isso pode levar às amostras são coletadas de sites de amostragem adjacentes, tendo a comunidade microbiana consideravelmente diferentes composições e atividades30,31. Assim, usando coletores de núcleo de solo e pás para manter profundidades de amostragem consistente e homogeneização antes da extração do DNA são essenciais para a reprodutibilidade dentro estudos microbiome de raiz. Também é essencial para separar eficientemente as frações rizosfera e raiz; usar um método cruel de esterilização de superfície de raiz pode potencialmente lyse endófitos dentro raízes antes da extração do DNA, enquanto uma lavagem mais conservador pode não remover todos os micróbios da superfície raiz7. Outro fator chave que pode negativamente impactar ou perturbar os resultados do sequenciamento é a contaminação bacteriana, que pode vir de muitas fontes e às vezes é impossível distinguir as bactérias ambientais amostrados32,33. Por esta razão, cuidadosa esterilização de ferramentas de recolha de amostras, materiais experimentais e ambientes de trabalho são vitais para evitar a contaminação.

Após a amostragem, obtenção de DNA de alta qualidade é uma prioridade para as análises a jusante bem sucedidas. Em nossa experiência, a extração de DNA de campo cultivado amostras de raiz através de métodos alternativos, tais como através de extração baseado em CTAB, contêm frequentemente substancialmente maiores quantidades de ácidos húmicos e outros compostos em comparação com amostras de rizosfera e solo. Estes compostos podem impedir a atividade enzimática da DNA polimerase durante a amplificação por PCR, mesmo em baixas concentrações34,35. Usando a extração de DNA kits projetados para solos em amostras de raiz, em vez de uma extração CTAB, seguido de um fenol clorofórmio limpar, efetivamente podem livrar amostras de ácidos húmicos e resultarão em alta qualidade DNA36,37, 38,39. Nesse sentido, recomendamos o uso de um kit de extração de DNA disponível comercialmente para amostras de raiz também. Deve notar-se que o objetivo é obter DNA genômico microbiano de raízes de plantas. Assim, raiz completa e consistente de moagem é importante para quebrar o tecido de planta e lisar as células microbianas para liberar o DNA microbiano sem introduzir viés entre amostras devido a variação de pressão e tempo de moagem.

Após cuidadosa extração de DNA de amostras, há duas fontes principais para problemas durante a amplificação: 1) a contaminação dos tecidos vegetais com planta endossimbiontes (cloroplasto e mitocôndria) e 2) seleção de região de rRNA 16S para amplificar. A amplificação dos cloroplastos ou as mitocôndrias 16S rRNA sequências podem gerar >40amostras de 80% das sequências na raiz, e mais nos tecidos da folha, porém, a quantidade de contaminação é dependente da escolha das primeiras demão. Assim, PNA grampos são necessários durante a etapa de PCR para suprimir a planta anfitrião cloroplasto e mitocondrial 16S contaminação27,41. No entanto, diferentes espécies de plantas podem ter variação no cloroplasto e mitocondrial 16S sequência27; Portanto, é essencial para confirmar a sequência de cloroplasto e mitocondrial 16S genes da planta estudada antes da sequenciação de biblioteca, a fim de determinar se são necessárias alternativo PNA oligos (Figura 3). Além disso, o gene do rRNA 16S consiste em nove regiões hipervariáveis ladeadas por nove regiões conservadoras; resultados diferentes podem ser obtidos da Comunidade mesma, dependendo de qual região hipervariável é amplificado42. Estudos anteriores descobriram a região de V4 a ser um dos mais confiáveis para atribuir taxonomia43 e tem sido utilizada para outros microbiome extensas pesquisas11. Alongar o alvo à região V3-V4 é sugerido aqui para aumentar a variabilidade e melhorar a resolução taxonômica.

Neste protocolo, demonstrámos um pipeline para realizar o sequenciamento de amplicons 16S rRNA através do sequenciamento de próxima geração (NGS) para o estudo de composições da comunidade microbiana de amostras ambientais12. Nós recomendamos usar o amplicon sequenciamento como uma ferramenta para criação de perfil filogenética, porque é relativamente barato, alta produtividade e não requer grande conhecimento computacional ou recursos para analisar. Enquanto nosso método centra-se na análise da fração bacteriana a microbiome, pode facilmente ser adaptado para investigar os fungos. O protocolo é idêntico a etapa 2, e a única diferença na etapa 3 é que as primeiras demão seria usadas durante a amplificação. No entanto, não vale nada que amplicon com base de perfil não é sem limitações. Por um único marcador genético de sequenciamento, nenhuma informação é obtida em relação a capacidade funcional da Comunidade. Além disso, a resolução taxonômica pode ser bastante baixa, especialmente quando sequenciamento de ambientes com uma elevada percentagem de micróbios descaracterizadas. No entanto, tecnologias de sequenciamento estão evoluindo rapidamente, e nós antecipamos o potencial para lidar com algumas dessas deficiências, adaptando este protocolo para uso com outras plataformas de sequenciamento. Finalmente, como mencionado na introdução, metatranscriptomics e espingarda metagenomics facilmente podem ser realizadas em amostras de solo e da rizosfera, e métodos para eliminar a contaminação da planta de tecidos vegetais atualmente estão sendo explorados. Projetos experimentais que par amplicon-abordagens e outras técnicas de metagenomic podem ser particularmente eficazes em comunidades complexas onde alta diversidade e espécies representação desigual de táxons podem impedir que dados de espingarda de precisão caracterizando o menos Membros dominantes.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS é suportado pelo NSF Research Fellowship graduação.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1-10/20 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-3810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000027 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes Eppendorf 3120000909 Can substitute with equivalent from other suppliers.
100 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000043 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1000 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1122-1830 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1620-2700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mm soil sieve Forestry Suppliers 60141009 Can substitute with equivalent from other suppliers.
200 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-8810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
25 mL reservoirs VWR International LLC 89094-664 Can substitute with equivalent from other suppliers.
50 mL conical vials Thermo Fisher Scientific 352098 Can substitute with equivalent from other suppliers.
500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) VWR International LLC 156-4020
96-well microplates USA Scientific 655900
96-well PCR plates BioRad HSP9631
Agencourt AMPure XP beads Thermo Fisher Scientific NC9933872 Instructions for use:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180
&documentName=B37419AA.pdf
Aluminum foil Boardwalk 7124 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Analytical scale with 0.001 g resolution Ohaus Pioneer PA323 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Bioruptor Plus ultrasonicator Diagenode B01020001
Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL New England Biolabs B9000S
Centrifuge Eppendorf 5811000908 Including 50mL and 96-well plate bucket adapters
Cryogenic gloves Millipore Sigma Z183490 Can substitute with equivalent from other suppliers.
DNeasy PowerClean kit (optional) Qiagen Inc. 12877-50 Previously MoBio
DNeasy PowerSoil kit Qiagen Inc. 12888-100 Previously MoBio
Dry ice Any NA
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher Scientific 12321D Do not substitute
Ethanol VWR International LLC 89125-188 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gallon size freezer bags Ziploc NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gemini EM Microplate Reader Molecular Devices EM Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top.
K2HPO4 Sigma-Aldrich P3786
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
Lab coat Workrite J1367 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 Any NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 dewar Thermo Fisher Scientific 4150-9000 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Milli-Q ultrapure water purification system Millipore Sigma SYNS0R0WW
Mini-centrifuge Eppendorf 5404000014
Molecular grade water Thermo Fisher Scientific 4387937 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Mortars VWR International LLC 89038-150 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Nitrile gloves Thermo Fisher Scientific 19167032B Can substitute with equivalent from other suppliers.
Paper towels VWR International LLC BWK6212 Can substitute with equivalent from other suppliers.
PCR plate sealing film Thermo Fisher Scientific NC9684493
PCR strip tubes USA Scientific 1402-2700
Pestles VWR International LLC 89038-166 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Plastic spatulas LevGo, Inc. 17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) Thermo Fisher Scientific 13000014
PNAs - chloroplast and mitochondrial PNA Bio NA Make sure to verify sequence bioinformatically
Protective eyewear Millipore Sigma Z759015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Qubit 3.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33216
Qubit dsDNA HS assay kit Thermo Fisher Scientific Q32854
Rubber mallet (optional) Ace Hardware 2258622 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shears or scissors VWR International LLC 89259-936 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shovel Home Depot 2597400 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Soil core collector (small diameter: <1 inch) Ben Meadows 221700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Spray bottles Santa Cruz Biotechnology sc-395278 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) IDT NA 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry.
Thermocycler Thermo Fisher Scientific E950040015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Weigh boats Spectrum Chemicals B6001W Can substitute with equivalent from other suppliers.

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Explorando a raiz Microbiome: extração de dados da comunidade bacteriana da rizosfera, solo e raiz Endosphere
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Simmons, T., Caddell, D. F., Deng, S., Coleman-Derr, D. Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere. J. Vis. Exp. (135), e57561, doi:10.3791/57561 (2018).More

Simmons, T., Caddell, D. F., Deng, S., Coleman-Derr, D. Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere. J. Vis. Exp. (135), e57561, doi:10.3791/57561 (2018).

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