Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Kök Microbiome keşfetmek: toprak, rizosferde ve kök Endosphere bakteriyel topluluk verileri ayıklama

Published: May 2, 2018 doi: 10.3791/57561
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley, 2Plant Gene Expression Center, USDA ARS

Summary

Burada, toprak, rizosferde ve kök endosphere microbiomes amplicon sıra verileri elde etmek için bir protokol açıklayın. Bu bilgiler kompozisyon ve çeşitlilik bitki ilişkili mikrobiyal toplulukların araştırmak için kullanılan ve bitki türlerinin geniş bir kullanım için uygundur.

Abstract

Bitki ana bilgisayar ile ilişkili mikroorganizmalar arasında samimi etkileşim bitki fitness belirlemede önemlidir ve geliştirilmiş dayanıklılık abiyotik gerilmeler ve hastalıklar için teşvik edebilirsiniz. Bitki microbiome olabilir gibi son derece karmaşık, düşük maliyetli, yüksek üretilen iş amplicon tabanlı sıralama 16S rRNA gen gibi sık sık onun mikrobiyal kompozisyon ve çeşitlilik karakterize için tercih edilen yöntemlerdir. Ancak, bu tür deneyler zaman uygun metodoloji yelpazesi analizi ve örnekleri ve çalışmaları arasında karşılaştırmalar zorlaştırabilir önyargıları azaltmak için önemlidir. Bu iletişim kuralı, toplama ve DNA ekstraksiyon toprak, rizosferde ve kök örnekleri için standart bir metodoloji ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. Buna ek olarak, biz Bu örneklerdeki bakteri toplulukları bileşimi keşfi için izin veren bir iyi kurulmuş 16S rRNA amplicon sıralama boru hattı vurgulayın ve kolayca diğer marker gen için adapte edilebilir. Bu boru hattı bitki türleri, sorgum, Mısır, buğday, çilek ve agav, dahil olmak üzere çeşitli için doğrulandı ve bitki organelleri kirlenme ile ilgili sorunların üstesinden yardımcı olabilir.

Introduction

Microbiomes bitki ilişkili dinamik ve karmaşık mikrobiyal topluluklar bakteri, arkeler, virüsler, mantarlar ve diğer ökaryotik mikroorganizmaların oluşur. Bitki hastalık neden onların iyi okudu rol yanı sıra, bitki ilişkili mikroplar da olumlu bitki sağlığı biyotik ve abiyotik stres tolerans iyileştirilmesi, besin kullanılabilirliği teşvik ve bitki büyüme yoluyla artırılması etkileyebilir etki üretimi. Bu nedenle, özellikle bitki kök endospheres, rhizospheres ve çevresindeki toprak ile ilişkilendirmek takson karakterize bulunmaktadır. Bazı mikroplar izolasyon laboratuvar oluşturulan medya kültürlü olabilir, birçok kısmen diğer mikroplar ile simbiyotik ilişkiler üzerine güveniyor olabilir çünkü çok yavaş büyümek değil veya bir laboratuar ortamında yinelenemez koşulları gerektirir. Serisi tabanlı filogenetik çevre ve ana bilgisayar ilişkili mikrobiyal örnekleri profil oluşturma ekimi ihtiyacını kaçınmanızı sağlar ve nispeten ucuz ve yüksek üretilen iş çünkü, mikrobiyal topluluk raporlaması için tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir kompozisyon.

Yeni nesil (NGS) platformları1 sıralama çeşitli tarafından sağlanan uygun sıralama teknolojileri seçimi önemli faktörler de dahil olmak üzere kullanıcıların gereksinimlerini üzerinde bağlıdır: istediğiniz kapsamı, amplicon uzunluğu, beklenen toplum çeşitlilik, hem de hata oranı, okuma-uzunluk ve maliyet-başına-Çalıştır/megabase sıralama. Amplicon tabanlı sıralama deneylerinde dikkate alınması gereken başka bir ne gen AMPLİFİKATÖRLÜ olacaktır ve ne astar kullanılacak olan değişkendir. Tasarlarken veya astar seçimi yaparken, araştırmacılar genellikle bileşimleri amplifikasyon evrensellik ve taksonomik çözünürlük arasında ortaya çıkan amplicons üzerinden ulaşılabilir yapmak zorunda kalıyor. Bu nedenle, bu tür çalışmalar kez astar ve seçmeli olarak microbiome belirli alt kümeleri hedef işaretleyiciler açmadı. Bakteriyel topluluklar kompozisyonu değerlendirmek genellikle bir veya daha fazla bakteri 16S rRNA gen2,3hypervariable bölgelerin sıralama tarafından gerçekleştirilir. Bu çalışmada, biz dayalı bir amplicon tarif sıralama iletişim kuralı bu hedefleri 500 bp V3 V4 bölge için yeterli değişkenlik de sağlarken geniş amplifikasyon bakteriyel özellikleri sağlar bakteriyel 16S rRNA gen NGS platformu için geliştirilen farklı özellikleri arasında ayrım. Ayrıca, bu iletişim kuralı kolayca diğer astar kümelerini, mantar ITS2 işaretçisi veya Ökaryotlar 18S rRNA altbirim hedefleme ile kullanmak için adapte edilebilir.

Av tüfeği metagenomics, metatranscriptomics ve tek hücreli sıralama, çözümlenmiş mikrobiyal genleri ve topluluk işlevi daha doğrudan ölçümü de dahil olmak üzere diğer avantajlar sunuyor gibi diğer yaklaşımlar, bu tekniklerin genellikle daha fazla iken Burada açıklanan4pahalı ve filogenetik profil oluşturma daha yoğun hesaplama. Ayrıca, performans üzerinde kök örnekleri av tüfeği metagenomics ve metatranscriptomics okuma için ana bitki genom ait büyük bir yüzdesi görüntüler ve bu sınırlamayı aşmak için yöntemleri hala gelişmiş5,6davranıyorsun.

Herhangi bir deneysel platformunda olduğu gibi amplicon tabanlı profil oluşturma deneysel tasarım ve veri çözümleme sırasında dikkate alınması gereken potansiyel önyargıları bir dizi neden olabilir. Bu örnek koleksiyonu, DNA ekstraksiyon, PCR astar yelpazesi ve Kütüphane hazırlık nasıl gerçekleştirildiğini yöntemleri içerir. Farklı yöntem oluşturulan kullanılabilir veri miktarını önemli ölçüde etkileyebilir ve ayrıca çabaları çalışmalar arasında karşılaştırılması için engel olabilir. Örneğin, rizosferde bakteri7 ve farklı çıkarma teknikleri veya seçim DNA ekstraksiyon kitleri8,9 kaldırma yöntemi gösterilmiştir aşağı akım analizi, yol açan önemli ölçüde etkisi farklı sonuçlar ile ilgili mikroplar hediye ve onların göreceli zenginliği olan. Amplicon tabanlı profil oluşturma özelleştirilmiş beri çalışmalar arasında karşılaştırmalar yapmak zor olabilir. Earth Microbiome projesi bitki ilişkili microbiome gibi karmaşık sistemleri eğitim araştırmacılar standart protokoller geliştirme uygulama tarafından neden olduğu değişkenlik en aza indirme aracı olarak yararlanacak önerdi farklı yöntemleri arasında çalışmalar10,11. Burada, biz Yukarıdaki konuların pek çok tartışmak ve en iyi uygulamalar olarak nereye teklif öneriler uygun.

Protokol sorgum bicolor ve köklü bir DNA izolasyon kit11kullanarak açılan DNA toplama toprak, rizosferde ve kök örnekleri sürecini gösterir. Ayrıca, bizim iletişim kuralı bir detaylı amplicon sıralama iş akışı, bakteriyel topluluklar12,13,14yapısını belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir NGS platformu kullanarak içerir. Bu iletişim kuralı kullanmak üzere çok çeşitli bitki kökleri, rizosferde ve ilişkili-toprak sorgum bicolor, Zea mays ve Triticum soğanı15de dahil olmak üzere 18 monocot tür yayınlanan bir çalışmada konaklarda doğrulandı. Bu yöntem aynı zamanda diğer marker gen kullanılmak üzere mantar ITS2 marker gen çalışmaları agav microbiome16,17 ve çilek microbiome eğitim için başarılı uygulama tarafından gösterildiği gibi doğrulandı 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. toplama ve ayırma kök Endosphere, rizosferde ve toprak örnekleri

  1. Sterilize etmek için alan, otoklav ultrasaf su (suyu örnek başına en az 90 mL) girmeden önce. Epiphyte kaldırma arabellek (en az 25 mL örnek başına) KH2PO46.75 g, K2HPO48,75 g ve Triton X-100, 1 mL 1 litre steril su ekleyerek hazırlayın. 0.2 µm gözenek boyutu ile vakum filtre kullanarak arabellek sterilize.
    1. Adımlar 1.2-1.5, aşınma temiz eldiven etanol ile hiç sterilize kez ve eldiven kontaminasyonu önlemek için her örnek arasında değiştirin. Tüm ekipman % 70 etanol ile sterilize ve örnekler arasındaki tüm cihazları silin. Örnekleme önce denemeniz için en uygun örnekleme derinliği belirlemek ve tüm toprak ve kök koleksiyonları ile tutarlı.
  2. Toplu toprak örnekleri toplamak için bir etanol sterilize toprak çekirdek toplayıcı bir çekirdek toplayarak bitki köklerinin ücretsizdir toprak elde etmek için kullanın bitkinin tabanından yaklaşık 23-30 cm.
  3. Toprak bir plastik torba aktarmak, toprak yumuşak sallayarak homojenize ve bir aliquot bir 2 mL tüp doldurmak için toprak örneği (yaklaşık 600 mg) aktarın. Hemen 2 mL tüp kuru Buza koyun ya flaş dondurma tüp sıvı N2 kadar DNA ekstraksiyon (Adım 2) ile devam etmek için hazır.
    1. Bazı ortamlarda, çevresindeki toprak bitki malzeme içerebilir. Bu durumda, bir steril 2 mm elek plastik torbaya koyarak önce topraktan bitki enkaz ayırmak için kullanın.
  4. Kök ve rizosferde toplamak için bitki kök mümkün olduğunca daha fazla elde etmek için dikkat çekici, kazıp bir etanol sterilize küreği kullanın. Derinlik bitki bağlıdır. Buğday gibi küçük bitkiler-ebilmek var olmak çıkarmak birkaç santimetre kazma tarafından iken, sorgum gibi daha büyük bitkiler 30 cm veya daha fazlasını gerektirebilir. Yaklaşık 2 mm kök yüzeye kalarak toprak olana aşırı topraktan kökleri kapalı yavaşça salla.
    Not: küçük bitkiler, kırılgan kökleri ile veya içerik topraklarda kuru, yüksek-kil ile çalışırken dikkat et. İdeal olarak, yalnızca köklerine sallayarak sonra kalan toprak ince bir tabaka olmalıdır. Toprak büyük toplamları kalırsa, bir lastik tokmak toprak ateş tabanı hafifçe vurarak çıkarmak için kullanılabilir. Toprak bu işleminden sonra kalan miktarı aşıyor veya 2 mm kısa düşüyor, yaklaşık kalınlığı olması gerekmektedir.
  5. Büyük bitkiler için temsili bir alt bölümüne köklerin keser ve 500 mg kök dokusunun en az 50 mL konik şişe yerleştirir için steril makas ve/veya makası kullanın. Daha küçük otlar için tüm kök sistemi şişeyi yerleştirin. Kökleri kapak sonra hemen örnek kuru buza yer için yeterli epiphyte kaldırma arabellek ekleyebilir veya flaş dondurma sıvı N2örnek.
    Not: 50 mL konik şişe bantlayın değil olarak adım yıkama zor yapacak dikkat. Öyle ki epiphyte arabellek altına akışı, şişeyi boyunca kökler çevreleyen ve üst kapak yeterli boş alan olmalıdır. Bazı otlar 50 mL konik şişe sığmayacak kadar çok daha fazla kök biyokütle olduğundan, alt bölümüne köklerin toplanmalıdır. Ancak, bu unutulmamalıdır kökleri kesme rizosferde kesir yıkandıktan endophytic bakteri neden olabilir, bu yüzden kökleri kırma indirilmelidir. Örnekleri hemen laboratuara döndükten sonra işlenmez, onlar-80 ° C'de saklanabilir
  6. Rizosferde kökleri ayırmak için kök örnek buz çözme sonra kök örnekleri için 160 W 30 10 min darbeleri ile 4 ° C'de solüsyon içeren temizleyicide s, ayrılmış 30 s. havalesi ile kökleri bir soğutulmuş (4 ° C), 50 mL tüp steril forseps kullanarak temiz. Tampon ve toprak, rizosferde kesir (şekil 1) ile orijinal tüp ateþe atmayýn.
  7. Arabellek içeren tüp santrifüj kapasitesi ve rizosferde 10 dk 4 ° c, 4.000 x g. Decant süpernatant, flash için sıvı N2rizosferde kesir içeren tüp donma ve DNA ile devam etmek için hazır kadar rizosferde kesir-80 ° C'de depolayın ayıklama (Adım 2).
  8. Kökleri yıkamak için kök kesir için yaklaşık 20 mL soğuk (4 ° C) steril su ekleyin. Kök şiddetle (tarafından el ya da Mikser, 15-30 s) sallayarak yıkama ve su tahliye.
  9. Hiçbir toprak kök yüzeyde kalır kadar en az iki kez, bu adımı yineleyin. DNA ekstraksiyon (Adım 2) hemen gerçekleştirilmez, kökleri steril alüminyum folyo sarma, flaş dondurma sıvı N2ve mağaza-80 ° c kadar örnekleri DNA ekstraksiyon ile devam etmek için hazır kökleri.

2. DNA ekstraksiyon

Not: her zaman 2 ve 3 numaralı adımları etanol ile sterilize temiz eldiven giyilmelidir ve tüm iş-meli var olmak kılınmak etanol ile sterilize bir yüzey üzerinde.

  1. DNA toprak ve rizosferde örneklerinden ayıklayın.
    1. Hızlı bir şekilde toprak ve rizosferde 250 mg birkaç adım mesafede 1.3 ve 1.7 ayrı toplanması tüpler içine aktarmak için steril bir spatula bir ticari DNA izolasyon kiti verilen kullanım toprak çıkarılması için tasarlanmış, daha sonra DNA izolasyon kiti tedarikçi kullanarak ilerlemek iletişim kuralı.
    2. DNA izolasyon kit tarafından sağlanan elüsyon arabelleği DNA'da eluting sonra adım 3 ile devam etmek için hazır kadar DNA-20 ° C'de depolayın.
  2. DNA kök örneklerinden ayıklayın.
    1. Steril harç ve sıvı N2kullanarak havaneli chill. 600-700 mg kökü doku ölçmek ve doku harç yerleştirin. Dikkatle, kökleri kapsayacak yeterli sıvı N2 ekleyin.
    2. Kökleri küçük parçalar halinde eziyet. Sıvı N2 ekleme ve öğütme işlemi devam (en az iki kez, örnekleri arasında tutarlı olması), kökleri ince bir toz olana. Kök doku bu adımı sırasında çözülme değil emin olun.
      Uyarı: uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve kriyojenik eldiven) kullandığınızda çalışma ile sıvı N2.
      Not: düşük kaliteli DNA ekstraksiyon için toz haline aşırı kökleri eziyet ve toz-80 ° C'de depolamak faydalı olabilir
    3. Hızlı bir şekilde, önce kök tozu çözülme, başlar kök tozu önceden ağırlığını 1.5 mL tüpler içine buzda aktarmak için steril bir spatula kullanın. Kayıt ağırlığı tüp ve toz. Genellikle, 300-400 mg tozu transfer edilir.
    4. Kullanımı hızlı bir şekilde bir ticari DNA izolasyon Seti'nde sağlanan koleksiyon Tube kökü tozu 150 mg aktarmak için steril bir spatula çıkarma topraktan için tasarlanmış, daha sonra DNA izolasyon kiti tedarikçi firmanın iletişim kuralını kullanarak ilerlemek.
      Not: bazı kök örnekleri için olabilir DNA amplifikasyon PCR, özellikle farklı bir DNA ekstraksiyon protokol zaman sırasında engeller DNA Pelet kalan organik yüksek yoğunlukta (örn., CTAB ayıklama) kullanılır. Gerekirse, DNA çevre DNA temizlik Seti'nde sağlanan yönergeleri izleyerek temiz.
  3. Bir yüksek-duyarlı benchtop yer kullanarak tüm DNA örnekleri konsantrasyonu ölçmek.
    1. 1-20 µL her eluted DNA örneğinin dsDNA yüksek-duyarlı tahlil Seti'nde sağlanan tüpler içine ekleyin. Yer çalışma çözümü (1: 200 boya: arabellek) 200 µL kadar ekleyin.
    2. DNA çift 1 (0 ng/µL DNA) veya 10 µL Standart 2 (100 ng/µL) 10 µL içeren iki ek tüp hazırlayın ve her standart olarak yer çalışma çözüm 190 µL ekleyin.
    3. Standartları ve her örnek konsantrasyon ölçmek. Otomatik olarak yapılmazsa DNA toplama Absorbans çıkışta iki standardı tarafından bir doğrusal regresyon hesaplar.

3. Amplicon Kütüphane hazırlanması ve sunulması

  1. Malzemeler amplifikasyon reaksiyon için ayarlayın.
    1. DNA örnekleri 4 ° C'de erimek ve adım 3 boyunca buzda tut. DNA örnekleri önyargı PCR plaka (Tablo 2.) üzerindeki konumları nedeniyle en aza indirmek amacıyla rastgele
    2. 96-şey PCR plaka DNA moleküler düzeyde su her örnekten bir 20 µL. Ekle 20 µL dört köşe wells için moleküler düzeyde su hacmi 5 ng/µL için amplifikasyon (boş olanlar) (Tablo 2) için negatif denetimleri olarak sulandırmak.
    3. Öyle ki bir çok kanallı pipet (Şekil 2) ile eklenebilir barkodlu astar (10 µM) PCR şerit tüpler veya bir 96-şey tabak içinde düzenleyin.
    4. Her DNA örneği nüsha olarak yükseltmek için yeterli PCR ana karışımını hazırlayın. Hazırlamak 1,5 µL BSA (20 mg/mL), önceden yapılmış 2 ana mix (PCR arabellek, MgCl2, dNTPs ve Taq DNA polimeraz oluşan) x 37,5 µL, kloroplast PNA 0,57 µL (100 µM), mitokondrial Filistin 0,57 µL (100 µM) ve moleküler sınıf su 25.86 µL.
    5. Ana karışımı bir steril 25 mL çok kanallı pipet rezervuar içine dökün ve bir çok kanallı pipet kullanarak yeni bir 96-şey PCR plaka her kuyuya ana karışımı 66 µL dağıtın.
      Not: Ana karışımı için reaktif birimleri hesaplanırken, plaka başına 4 boş kuyu da eklemeyi unutmayın.
    6. Bir çok kanallı pipet kullanarak 5 ng/µL DNA'dan (normalleştirilmiş DNA plaka) ana mix tabak 6 µL ekleyin. Farklı bir ileri barkod ve her satır farklı ters barkod (Şekil 2) vardır öyle ki astar ters 1,5 µL 10 µM, her sütun vardır öyle ki 10 µM ileri astar ana plaka 1.5 µL ekleyin.
      Not: astar eklemeden önce randomize tabakalar ve ana karışımı farklı astar eklediyseniz Its veya ITS2 mantar genler yükseltmek için kullanılabilir. Bu durumda ise, benzer bir astar tasarım kullanılabilir.
    7. Spin aşağı plaka kısaca 3000 x g. karışımı yavaşça, sonra 25 µL tepki karışımı ile üç tabak içine bölmek için bir çok kanallı pipet kullanın.
      Not: üç çoğaltır kesinlikle gerekli olmasa da, bu teknik değişkenlik etkisini azaltır.
  2. Aşağıdaki koşullar bir thermocycler kullanarak her plaka DNA'da yükseltmek: 180 s 98 ° C'de 30 döngüleri: 98 ° C 45 için s 10 78 ° C (denaturing), s (PNA tavlama), 60 55 ° C (astar tavlama) s ve 72 ° C için 90 s (uzantısı) , sonra 600 s 4 ° C tarafından takip 72 ° C'de adım tutun. Amplifikasyon sonra üç Çoğalt tabak bir tek 96-şey plaka havuz.
  3. 96-şey plaka okuyucu içinde yüksek-duyarlı yer reaktifler kullanarak DNA ölçmek.
    1. 2 µL PCR ürünleri yer çalışma çözümü (1: 200 boya: arabellek) 98 µL birlikte bir 96-şey Mikroplaka ekleyin. Standart olarak 4 kuyu içerir: 5 µL (0 ng/µL DNA), DNA çift 1 1 µL Standart 2 (10 ng/µL), 2 µL Standart 2 (20 ng/µL) ve standart 2 (50 ng/µL) 5 µL. Daha sonra 100 µL son hacmi için yer çalışma çözüm ekleyin.
      Not: Her örnek bir plaka okuyucu yoksa 2.3 adımda anlatıldığı gibi bir benchtop yer kullanılarak ölçülebilir.
    2. DNA toplama Absorbans çıktısından dört standartları tarafından bir doğrusal regresyon hesaplar.
    3. Başarıyla yükseltilmiş barkodlu ürün (Bu bir konsantrasyon 15 ng/µL büyük olan), havuz 100 ng her örneğinin içine bir tek 1,5 mL tüp (Tablo 2).
    4. Havuza bir elektronik tablo programında =AVERAGE() işlevi kullanılarak eklenen örnekleri ortalama hacmi hesaplamak. "Boş" PCR ürünleri hacmi için havuza alınan örnekleri ekleyin.
      Not: "boş" PCR ürünleri kendi benzersiz barkod kombinasyonları beri onlar için herhangi bir laboratuvar kirletici maddeleri kontrol etmek için sıralı.
  4. Adım 2.3 ve almak 600 ng DNA bölümünde açıklandığı gibi bir benchtop yer kullanarak havuza alınan ürün konsantrasyon ölçmek ve moleküler düzeyde su 1,5 mL tüp içinde 100 µL son hacmiyle oranında seyreltin. Kalan havuza alınan ürün-20 ° C'de depolayın
  5. 600 ng DNA aliquot paramagnetic arıtma boncuk birkaç istisna dışında bir 96-şey biçiminde kurulan PCR arıtma işlemine takip ederek yıkayın.
    1. Taze bir 600 µL % 70 etanol aliquot olun. Altına yerleşmek boncuk yeniden askıya almak için manyetik boncuklar şişe sallamak.
    2. 1 x (100 µL) hacmi boncuk çözüm DNA 600 ng aliquot için ekleyin. 10 kez pipetting tarafından iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
    3. Tüp manyetik stand 2 min için (veya kadar çözüm açıktır) üzerine yerleştirin boncuk eriyik--dan ayırmak için. Tüp hala manyetik tribünde olmakla birlikte, açık süpernatant dikkatle manyetik boncuklar dokunmadan Aspire edin ve açık süpernatant atın.
      Not: Bu noktada, amplicon ürünleri için manyetik boncuklar bağlıdır. Rahatsız ya da kayıp sırasında aspirasyon vardır herhangi bir boncuk DNA kaybolmasına neden olacaktır.
    4. Tüp manyetik tribünde bırakın ve 300 µL % 70 etanol tüp ekleyin; oda sıcaklığında 30 s. aspiratı etanol ve atma için kuluçkaya. Bu adımları tekrarlayın ve sonra ikinci yıkama tüm etanol kaldırın. Manyetik standından tüpü çıkarması ve 5 min için Kuru hava.
    5. Moleküler düzeyde su 30 µL kurutulmuş boncuk ve 10 kez pipetting karıştırın. 2 dk. 1 dk. için manyetik stand tüp dönmek için oda sıcaklığında boncuk eriyik--dan ayırmak için kuluçkaya. Eluate için yeni bir tüp aktarın.
      Not: Manyetik boncuklar akış yönündeki tepkiler etkilemez.
  6. Son konsantrasyonu temizlenmiş, havuza alınan DNA benchtop yer 2.3. adımda açıklandığı gibi kullanarak ölçmek. Bir aliquot 10 seyreltik nM son hacim 30 µL veya konsantrasyonu ve sıralama aracı tarafından tercih edilen birim.
  7. 2 x 300 bp eşleştirilmiş uç sıralama bir NGS platformda DNA sıralamak için sıralama tesis hizmetlerini kullanan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Önerilen bir protokoldür yapmak neden, her örnek için eşleşen ve ya bir bakteriyel atanan dizin oluşturulmuş eşleştirilmiş uç okuma veri kümesinde operasyonel taksonomik birimleri (OTU) veya tam sırası varyant (ESV amplicon da, sıra varyant (ASV) ve sub-operational taksonomik birimi (sOTU)), aşağı akım analizine bağlı olarak. Yüksek kaliteli dizi verilerini elde etmek için örnek arasında tutarlılık sağlamak ve olası herhangi bir önyargı giriş örnek işleme veya kütüphane hazırlık sırasında en aza indirmek için her adımda özen göstermelidir. Topladıktan sonra işleme ve DNA örnekleri (Adım 1 ve 2), açılan elde edilen eluate açık ve ücretsiz amplifikasyon inhibe organik olarak görünmelidir. Her DNA örneği microvolume Spektrofotometre ile ölçerek saflık doğrulanabilir, biz toprak DNA ekstraksiyon kiti bütün kirletici maddeleri güvenilir bir şekilde kaldırır bulduk. Tahmin edilebilir DNA kalite sonucunda, özellikle DNA bağlanan floresan-esaslı boyalar itimat miktar yöntemleri de UV Absorbans19,20,21tarihinde dayalı daha daha uygundur. Kök örnekleri genellikle yaklaşık 30 ng/µL (Tablo 2) ortalama konsantrasyon varken PCR güçlendirme önce yaklaşık 10 ng/µL DNA, toprak ve rizosferde örnekleri ortalama.

(Adım 3) çevre DNA amplifikasyon, başarılı veya başarısız tespit varsa, benchtop yer reaktifler üzerinden PCR ürün konsantre bir plaka okuyucu ölçerek veya el ile (Tablo 2). Deneyim, yüksek kaliteli amplicon veri neden başarılı Arttırımlar 15 ng/µL PCR ürünleri daha büyük verim. Bir plaka üzerinde birden çok hataları varsa, bitki ve başarısız örnekleri örnek türü içinde pozisyonel düzenleme sorunu belirlemek yardımcı olabilir. Örneğin, plaka üzerinde tüm bitişik iseler, hepsi aynı satır veya sütundaki bir durumda, belirli bir astar ile sorunları hatırlatıyoruz, ancak pipet hata, gösterebilir. Eğer hepsi aynı örnek türüne ait örnek işleme veya DNA ekstraksiyon sorun önerebiliriz.

Kontrol belgili tanımlık compatibility evrensel PNAs belirli bitki sistemi bioinformatically ile güçlendirme, kloroplast ve mitokondri 16S genler engeller doğrulamak için deneysel tasarım sırasında önemlidir. Amplifikasyon adım olup PNAs başarıyla e mitokondriyal bağlı açık değil ve kloroplast şablonları; Bu sadece (şekil 3) sıralama sonra ortaya çıkar. PNAs etkili kirletici amplifikasyon, PNA sıra her kloroplast ve mitokondri 16S rRNA gen bitki için (birden çok kopya olabilir) bir hizalamasını engeller sağlamaya yardımcı olmak için soruşturma altında ana bilgisayar herhangi bir eşleşmeme durumu ortaya çıkarmak değil . Özellikle ortasında PNA kelepçe, 13 bp PNA diziye bile tek bir uyumsuzluk olduğu gibi sağlanan kloroplast PNA sıra olgusu ve kloroplast 16S rRNA gen Lactuca sativa (marul) ( in etkinliğini önemli ölçüde azaltır Şekil 3).

Güçlendirilmiş DNA eşit miktarda örnek, orada yaklaşık bile bir okuma sayısı örnek sıralama ve okuma onların barkodlu dizin (şekil 4) göre sıralama sonra alınmalıdır havuzlu beri. Bu okuma çoğu bakteriyel özellikleri için aynı olmalıdır. Herhangi bir ökaryotik, mitokondri, veya kloroplast maçlar iptal. Analiz boru hattı ve taksonomik veritabanı seçilen bağlı olarak, kloroplast ve mitokondri okuma yanlışlıkla bakteriyel soy, sık sık siyanobakteriler ve Rickesttia, sırasıyla atanabilir (şekil 3). Manuel küratörlüğü bir ölçüde kez bu ortak mis atamaları için kontrol etmek akıllıca olur. Belirli ayrıntıları analiz seçime bağlı olacaktır, ancak göreli bereket profilleri genellikle benzer olmalıdır (anlamlı bir fark) arasında biyolojik çoğaltır ve toprak, rizosferde ve kök örnekleri (şekil 5 arasında önemli ölçüde farklı ). Ancak, biyolojik çoğaltır arasında anlamlı bir fark olsa, en az üç çoğaltır ücret toplamak önemli olduğuna dikkat etmek önemlidir.

Bu deneylerde elde edilen verileri yorumlama yöntemleri hararetli mikrobiyal çevreciler arasında tartışma konusu. Yakın zamana kadar amplicon dizi analizi OTUs okuma gruplandırma üzerine bağımlı olmuştur. Ancak, bu sorunlu vardır çünkü: 1) onlar %97 benzerlik biraz keyfi bir eşiğe göre Değiştir dayanmaktadır, 2) çeşitlilik kez hafife ve 3) taksonomik çözünürlüğü düşük olabilir. Son zamanlarda gelişmiş alet öyle aynı derecede DADA2, Deblur ve UNOISE222,23,24 okuma OTUs kullanırken sunulan bazı sorunları çözer ESVs sıralama yapabilirsiniz. ESVs kullanarak için uyarılar içerir: çeşitlilik PCR ve hataları25,26sıralama rRNA kopya bir tür ve 2) artan duyarlılık içinde farklılıkları nedeniyle 1) yapay artar.

Figure 1
Şekil 1: kök ve rizosferde kesirler ayrılması. Akış çizelgesi kökleri kalan herhangi bir rhizoplane organizmalar kaldırmak için steril su ile yıkayarak takip kök örnekleri, rizosferde ayıran adımları görüntüleme. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: amplifikasyon ve tabak içinde dağıtım için hisse senedi astar düzen örneği. 96-şey tabak (her astar şeridinin farklı bir renkle gösterilir; portakal için ileri astar ters astar 1-12 için 9-16, mavi mor için ileri astar 1-8, içinde en iyi dağıtım için şerit tüplerde hazırlanabilir hisse senedi astar (Tablo 1) ve yeşil için ters astar 13-16.) Bu durumda, her bir benzersiz barkod arada vardır öyle ki 16 ileri ve 16 ters astar verimli bir şekilde bir çok kanallı pipet ile dağıtılabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: kloroplast PNA etkisiz olduğunu gösteriyor sonuçları. Temsilcisi sonuç rizosferde ("Rhizo"), kök ve toprak örnekleri marul olmayan tedavi (NT) veya (VT) biyolojik toprak değişiklik ile tedavi. Çoğu bitki kloroplast kirlenme engellemek için kullanılan PNA GGCTCAACCCTGGACAG27sırasıdır. Ancak, marul bir uyuşmazlıkla kloroplast 16S ribozomal RNA geni (GGCTCAACTCTGGACAG) içerir. Bu PNA etkisiz, bir yüksek göreli bereket, rizosferde ve kök örnekleri siyanobakteriler için eşleşen bir okuma sonuçlanan işler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: okuma dağılımı sayar bir kitaplık örnekleri arasında. Çubuk grafik sayısını gösteren farklı örnekleri (barlar, x ekseni), okuma barkod arada ile eşleşen sayıları (y ekseni) okuyabilir. Kaç örneklerdir: kütüphanede okuma örnek başına sayısı değişebilir; Bu alt 192 örnekleri kitaplığında sıralı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: kök, rizosferde ve toprak topluluklar üst 12 sınıfların göreli bereket. Yığılmış çubuk grafik 6 içeren bir temsilcisi 16S dataset içinde mevcut sınıfların göreli bereket gösteren her örnek türü için (toplu toprak, rizosferde ve kök endosphere) çoğaltır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1: V3 V4 bölge 16S rRNA gen yükseltecek için astar. Astar oluşur, sırayla: sıralama ve ya 341F ya da 785R 16S rRNA gen yükselterek evrensel bir PCR astar için çerçeve kayması için bir adaptör ortak bir NGS platformu, benzersiz bir barkod, NGS için astar, değişken uzunlukta bir spacer bölgesi için. Gerekli astar sayısı kaç örnekleri kitaplığı üzerine sıralanamadı bağlıdır; 244 örnekleri (256 astar bileşimleri ile boş kuyular için PCR (Şekil 2) sırasında kullanılan 12) için yeterli 16 ileri ve 16 ters astar bir kombinasyonudur. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tablo 2: normalleştirme randomize DNA örnekleri öncesinde ve sonrasında amplifikasyon. Örnekleri rasgele bir sırayla listeleme ve de kendisine atanmış astar kombinasyonu belirler tek bir 96-şey plaka konumlarını gösteren örnek çalışma sayfası. Alt satırdaki formülleri açıklamak hesaplamalar 100 eklemek için normalleştirilmiş plaka, artı 20 µL ulaşmak için su hacmi her örneğinin ng. Takip amplifikasyon, 100 birim ng başarılı her ürünün hesaplanır ve bir final havuzuna ekledi. Son havuzuna eklemek için "boş" PCR ürünü diğer örnekleri ortalamasını birimdir. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı şekil 1: en az kök biyokütle yaklaşım örnek toplama. sırasında Ne zaman toplama kökleri, en az 500 mg doku toplamak deneyin. Burada, kökleri toplanan bir genç sorgum bitki (sol, hem de A ve B) ve (sağda) bir genç pirinç bitki yanına (A) ve (B) 50 mL konik tüpler içinde gösterilir. Her iki örnek yaklaşık 1 g tartmak, ancak, rizosferde ve kök bu ağırlık içeren ve rizosferde ağırlık, bu durumda, yaklaşık yarım toplam ağırlığı olduğunu unutmamak gerekir. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu iletişim kuralı kök endosphere, rizosferde ve toprak mikrobiyal topluluk kompozisyonlar, örnek işleme ve aşağı akım sıralama alanı örnekleme keşfetmek için kurulan bir boru hattı gösterir. Eğitim microbiomes kök ilişkili benzersiz sorunlar, kusura bakma ama kısmen örnekleme doğal zorluklar için topraktan sunar. Toprak son derece değişken fiziksel ve kimyasal özellikleri açısından vardır ve farklı toprak koşullarına kadar az birkaç milimetre28,29tarafından ayrılabilir. Bu önemli ölçüde farklı mikrobiyal topluluk besteleri ve faaliyetleri30,31bitişik örnekleme sitelerden toplanan örnekleri yol açabilir. Böylece, toprak çekirdek toplayıcıları ve kürek tutarlı örnekleme derinlikleri ve homojenizasyon DNA ekstraksiyon önce kök microbiome çalışmalar içinde tekrarlanabilirlik için esastır sürdürmek için kullanma. Verimli bir şekilde rizosferde ve kök kesirleri ayırmak için önemlidir; daha muhafazakar bir yıkama kök yüzey7tüm mikroplar kaldırmayabilir iken kök yüzey sterilizasyon sert bir yöntemi kullanarak potansiyel olarak endophytes kökleri DNA ekstraksiyon önce içinde koşullar. Olumsuz yönde etkileyen veya sıralama sonuçları bozabilir başka bir önemli faktör birçok kaynaktan gelebilir ve bazen örneklenen çevre bakteri32,33dan ayırt etmek imkansız bakteriyel kirlenme var. Bu nedenle, dikkatli sterilizasyon örnekleme araçları, deneysel malzeme ve çalışma ortamlarını kirlenmesini önlemek için çok önemli.

Sonra yüksek kalitede DNA elde başarılı aşağı akım analizleri için yüksek bir öncelik örnektir. Deneyim, DNA ekstraksiyon CTAB tabanlı ayıklama yetiştirilen gibi kök örnekleri alternatif yöntemlerle alanından genellikle daha fazla miktarda Hümik asitler ve rizosferde ve toprak örnekleri için karşılaştırıldığında diğer bileşikleri içerir. Bu bileşikler DNA polimeraz enzimatik aktivite sırasında bile, düşük konsantrasyonlarda34,35PCR güçlendirme engelleyebilirsiniz. Topraklar üzerinde kök örnekleri, aksine bir fenol tarafından takip CTAB ayıklama için tasarlanmış kitleri temizlik kloroform, Hümik asitler örnekleri kurtulmak etkili ve kaliteli DNA36,37', sonuçlanır DNA ekstraksiyon kullanarak 38,39. Buna göre piyasada bulunan bir DNA ekstraksiyon kiti için kök örnekleri de kullanmanızı öneririz. Bu hedefi bitki kökleri mikrobiyal genomik DNA elde etmektir olması gerekmektedir. Böylece, kapsamlı ve tutarlı kök taşlama bitki doku kırmak ve mikrobiyal mikrobiyal DNA önyargı örnek taşlama basıncı ve zaman içinde değişim nedeniyle arasında tanıtımı olmadan serbest bırakmak hücrelere koşullar önemlidir.

DNA örneklerinden dikkatli emme, amplifikasyon sırasında sorunlar için iki ana kaynağı vardır: 1) bitki doku bitki endosymbionts (kloroplast ve mitokondri) ve 2) yükseltmek için 16S rRNA bölge yelpazesi ile kirlenme. Amplifikasyon kloroplast veya mitokondri 16S rRNA serileri oluşturabilir > kök serilerinde % 80'i40örnekleri ve daha fazla yaprak dokularda kirlilik miktarını olsa astar seçimi üzerinde bağımlı. Böylece, PNA kelepçeler bitki ana bilgisayar kloroplast ve mitokondri 16S kirlenme27,41bastırmak için PCR adımı sırasında gereklidir. Ancak, farklı bitki türü kloroplast ve mitokondri 16S sıra27varyasyon sahip olabilir; Bu nedenle, kloroplast dizisi ve mitokondrial 16S genler bitkinin (şekil 3) Kütüphane sıralama öncesinde başka PNA oligos gerekli olmadığını belirlemek için okudu onaylamak için esastır. Ayrıca, 16S rRNA gen tarafından dokuz muhafazakar bölgelerde çevrili dokuz hypervariable bölgeler oluşur; aynı toplumdan güçlendirilmiş42hangi hypervariable bölge üzerine bağlı olarak farklı sonuçlar elde edilebilir. Önceki yıllarda yapılan çalışmalarda taksonomi43 ve bu atama için diğer geniş microbiome anketler11kullanılmış olan biri en güvenilir olması için V4 bölge bulduk. Hedef V3 V4 bölgesine uzatma burada değişkenlik artırmak ve taksonomik çözünürlüğünü artırmak için önerilmektedir.

Bu protokol için biz mikrobiyal topluluk besteleri çevre örnekleri12eğitimi için 16S rRNA amplicon sıralama sonraki nesil sıralama (NGS) üzerinden gerçekleştirmek için bir boru hattı gösterdi. Çünkü bu nispeten ucuz, yüksek üretilen iş ve does değil istemek geniş Hesaplamalı uzmanlık veya çözümlemek için kaynakları amplicon sıralama filogenetik profil oluşturma için bir araç olarak kullanmanızı öneririz. Bizim yöntem microbiome bakteriyel kısmını analiz üzerinde duruluyor olsa da, kolayca mantarlar araştırmak için uyarlanabilir. Protokol adım 2 ile aynıdır ve 3. adımda tek fark ne astar amplifikasyon sırasında kullanılacak olmasıdır. Ancak, bu değer hiçbir şey dayalı amplicon profil oluşturma sınırlamaları değil mi. Bir tek marker gen sıralama tarafından topluluk fonksiyonel kapasite ile ilgili herhangi bir bilgi elde edilir. Ayrıca, özellikle ortamlardan uncharacterized mikroplar oranı yüksek olan sıralama, taksonomik çözünürlük oldukça düşük olabilir. Ancak, sıralama teknolojileri hızla gelişmektedir ve biz bazı bu eksiklikleri bu iletişim kuralı diğer sıralama platformları ile kullanmak için adapte tarafından uğraşmak için potansiyel tahmin. Son olarak, giriş bölümünde de belirtildiği gibi toprak ve rizosferde örnekleri üzerinde av tüfeği metagenomics ve metatranscriptomics kolayca gerçekleştirilebilir ve bitki bitki doku kirlenme ortadan kaldırmak için yöntem şu anda incelenmiştir. Hangi çifti amplicon tabanlı yaklaşımlar ve diğer metagenomic teknikleri deneysel tasarımlar nerede yüksek tür çeşitliliği ve düzensiz temsil özellikleri doğru av tüfeği verilerden engelleyebilirsiniz karmaşık toplumlarda özellikle etkili olabilir daha az karakterize baskın üyeleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D) tarafından finanse edildi. TS NSF yüksek lisans araştırma bursu programı tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1-10/20 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-3810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000027 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes Eppendorf 3120000909 Can substitute with equivalent from other suppliers.
100 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000043 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1000 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1122-1830 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1620-2700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mm soil sieve Forestry Suppliers 60141009 Can substitute with equivalent from other suppliers.
200 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-8810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
25 mL reservoirs VWR International LLC 89094-664 Can substitute with equivalent from other suppliers.
50 mL conical vials Thermo Fisher Scientific 352098 Can substitute with equivalent from other suppliers.
500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) VWR International LLC 156-4020
96-well microplates USA Scientific 655900
96-well PCR plates BioRad HSP9631
Agencourt AMPure XP beads Thermo Fisher Scientific NC9933872 Instructions for use:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180
&documentName=B37419AA.pdf
Aluminum foil Boardwalk 7124 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Analytical scale with 0.001 g resolution Ohaus Pioneer PA323 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Bioruptor Plus ultrasonicator Diagenode B01020001
Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL New England Biolabs B9000S
Centrifuge Eppendorf 5811000908 Including 50mL and 96-well plate bucket adapters
Cryogenic gloves Millipore Sigma Z183490 Can substitute with equivalent from other suppliers.
DNeasy PowerClean kit (optional) Qiagen Inc. 12877-50 Previously MoBio
DNeasy PowerSoil kit Qiagen Inc. 12888-100 Previously MoBio
Dry ice Any NA
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher Scientific 12321D Do not substitute
Ethanol VWR International LLC 89125-188 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gallon size freezer bags Ziploc NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gemini EM Microplate Reader Molecular Devices EM Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top.
K2HPO4 Sigma-Aldrich P3786
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
Lab coat Workrite J1367 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 Any NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 dewar Thermo Fisher Scientific 4150-9000 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Milli-Q ultrapure water purification system Millipore Sigma SYNS0R0WW
Mini-centrifuge Eppendorf 5404000014
Molecular grade water Thermo Fisher Scientific 4387937 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Mortars VWR International LLC 89038-150 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Nitrile gloves Thermo Fisher Scientific 19167032B Can substitute with equivalent from other suppliers.
Paper towels VWR International LLC BWK6212 Can substitute with equivalent from other suppliers.
PCR plate sealing film Thermo Fisher Scientific NC9684493
PCR strip tubes USA Scientific 1402-2700
Pestles VWR International LLC 89038-166 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Plastic spatulas LevGo, Inc. 17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) Thermo Fisher Scientific 13000014
PNAs - chloroplast and mitochondrial PNA Bio NA Make sure to verify sequence bioinformatically
Protective eyewear Millipore Sigma Z759015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Qubit 3.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33216
Qubit dsDNA HS assay kit Thermo Fisher Scientific Q32854
Rubber mallet (optional) Ace Hardware 2258622 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shears or scissors VWR International LLC 89259-936 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shovel Home Depot 2597400 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Soil core collector (small diameter: <1 inch) Ben Meadows 221700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Spray bottles Santa Cruz Biotechnology sc-395278 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) IDT NA 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry.
Thermocycler Thermo Fisher Scientific E950040015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Weigh boats Spectrum Chemicals B6001W Can substitute with equivalent from other suppliers.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
  2. Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic classification of environmental 16S rRNA gene sequences. ISME J. 6 (7), 1440-1444 (2012).
  3. Takahashi, S., Tomita, J., Nishioka, K., Hisada, T., Nishijima, M. Development of a Prokaryotic Universal Primer for Simultaneous Analysis of Bacteria and Archaea Using Next-Generation Sequencing. PLoS One. 9 (8), e105592 (2014).
  4. Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics. PLoS One. 9 (4), e93827 (2014).
  5. Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Front Plant Sci. 5, 209 (2014).
  6. Jiao, J. -Y., Wang, H. -X., Zeng, Y., Shen, Y. -M. Enrichment for microbes living in association with plant tissues. J Appl Microbiol. 100 (4), 830-837 (2006).
  7. Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Front Microbiol. 7, 773 (2016).
  8. Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R., Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 5709, 623-628 (2011).
  9. Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
  10. Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLoS Biol. 15 (3), e2001793 (2017).
  11. Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. , (2017).
  12. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  13. Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform. Appl Environ Microb. 79 (17), 5112-5120 (2013).
  14. Degnan, P. H., Ochman, H. Illumina-based analysis of microbial community diversity. ISME J. 6 (1), 183-194 (2012).
  15. Naylor, D., DeGraaf, S., Purdom, E., Coleman-Derr, D. Drought and host selection influence bacterial community dynamics in the grass root microbiome. ISME J. , (2017).
  16. Desgarennes, D., Garrido, E., Torres-Gomez, M. J., Peña-Cabriales, J. J., Partida-Martinez, L. P. Diazotrophic potential among bacterial communities associated with wild and cultivated Agave species. FEMS Microbiol Ecol. 90 (3), 844-857 (2014).
  17. Coleman-Derr, D., et al. Plant compartment and biogeography affect microbiome composition in cultivated and native Agave species. New Phytol. 209 (2), 798-811 (2016).
  18. De Tender, C., et al. Dynamics in the Strawberry Rhizosphere Microbiome in Response to Biochar and Botrytis cinerea Leaf Infection. Front Microbiol. 7, 2062 (2016).
  19. Kapp, J. R., et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol. 68 (2), 111-118 (2015).
  20. Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
  21. O'Neill, M., McPartlin, J., Arthure, K., Riedel, S., McMillan, N. Comparison of the TLDA with the Nanodrop and the reference Qubit system. J Phys Conf Ser. 307 (1), 012047 (2011).
  22. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  23. Amir, A., et al. Deblur Rapidly Resolves Single-Nucleotide Community Sequence Patterns. mSystems. 2 (2), e00191-e00116 (2017).
  24. Edgar, R. C. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. bioRxiv. , 081257 (2016).
  25. Nguyen, N. -P., Warnow, T., Pop, M., White, B. A perspective on 16S rRNA operational taxonomic unit clustering using sequence similarity. NPJ Biofilms Microbiomes. 2, 16004 (2016).
  26. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Holmes, S. P. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. , (2017).
  27. Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nat Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
  28. O'Brien, S. L., et al. Spatial scale drives patterns in soil bacterial diversity. Environ Microbiol. 18 (6), 2039-2051 (2016).
  29. Fierer, N., Lennon, J. T. The generation and maintenance of diversity in microbial communities. Am J Bot. 98 (3), 439-448 (2011).
  30. Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nat Rev Microbiol. 15 (10), 579-590 (2017).
  31. Buckley, D. H., Schmidt, T. M. Diversity and dynamics of microbial communities in soils from agro-ecosystems. Environ Microbiol. 5 (6), 441-452 (2003).
  32. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
  33. Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
  34. Sutlović, D., Definis Gojanović, M., Andelinović, S., Gugić, D., Primorac, D. Taq polymerase reverses inhibition of quantitative real time polymerase chain reaction by humic acid. Croat Med J. 46 (4), 556-562 (2005).
  35. Sutlovic, D., Gamulin, S., Definis-Gojanovic, M., Gugic, D., Andjelinovic, S. Interaction of humic acids with human DNA: proposed mechanisms and kinetics. Electrophoresis. 29 (7), 1467-1472 (2008).
  36. Aleklett, K., Leff, J. W., Fierer, N., Hart, M. Wild plant species growing closely connected in a subalpine meadow host distinct root-associated bacterial communities. PeerJ. 3, e804 (2015).
  37. Bogas, A. C., et al. Endophytic bacterial diversity in the phyllosphere of Amazon Paullinia cupana associated with asymptomatic and symptomatic anthracnose. Springerplus. 4, 258 (2015).
  38. Hiscox, J., Savoury, M., Müller, C. T., Lindahl, B. D., Rogers, H. J., Boddy, L. Priority effects during fungal community establishment in beech wood. ISME J. 9 (10), 2246-2260 (2015).
  39. Zhang, T., Yao, Y. -F. Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific. PLoS One. 10 (6), e0130051 (2015).
  40. Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. PLoS One. 8 (8), e71360 (2013).
  41. Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity. Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).
  42. Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -A. Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems. Appl Environ Microb. 80 (15), 4626-4639 (2014).
  43. Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -Y. Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC Bioinformatics. 17, 135 (2016).

Tags

Genetik sorunu 135 16S rRNA sıralama kök endosphere rizosferde toprak microbiome filogenetik profil oluşturma
Kök Microbiome keşfetmek: toprak, rizosferde ve kök Endosphere bakteriyel topluluk verileri ayıklama
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Simmons, T., Caddell, D. F., Deng,… More

Simmons, T., Caddell, D. F., Deng, S., Coleman-Derr, D. Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere. J. Vis. Exp. (135), e57561, doi:10.3791/57561 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter