Summary
Her beskriver vi en protokoll for å få amplicon sekvens databehandling jord, rhizosphere og rot endosphere microbiomes. Denne informasjonen kan brukes til å undersøke komposisjon og mangfoldet av plante-assosiert mikrobielle samfunn, og er egnet for bruk med en rekke forskjellige plantearter.
Abstract
Intime samspillet mellom anlegget vert og tilknyttede mikroorganismer er avgjørende anlegget fitness, og kan fremme forbedret toleranse til abiotiske stress og sykdommer. Som anlegg microbiome kan være svært komplekse, lave kostnader, er høy gjennomstrømming metoder som amplicon-baserte sekvensering av 16S rRNA genet ofte foretrukket for karakteriserer sin mikrobiell sammensetning og mangfold. Valg av riktig metode når du utfører slike eksperimenter er imidlertid avgjørende for å redusere fordommer som kan gjøre analyse og sammenligninger mellom prøver og studier vanskelig. Denne protokollen beskriver i detalj en standardisert metode for innsamling og utvinning av DNA fra jord, rhizosphere og roten prøver. I tillegg vi markere en veletablert 16S rRNA amplicon sekvensering rørledning som gjør utforskning av sammensetningen av bakteriell samfunn i prøvene, og kan lett tilpasses for andre markør gener. Denne rørledningen er validert for forskjellige plantearter, inkludert sorghum, mais, hvete, jordbær og agave, og kan bidra til overvinne problemer forbundet med forurensning fra anlegget organeller.
Introduction
Plante-assosiert microbiomes består av dynamisk og komplekse mikrobielle samfunn som består av bakterier, archaea, virus, sopp og andre eukaryotic mikroorganismer. I tillegg til sine godt studert rolle i forårsaker plante sykdom, kan plante-assosiert mikrober positivt påvirke plante helse forbedre toleranse biotiske og abiotiske påkjenninger, fremmer nærings tilgjengelighet og styrke plantevekst gjennom produksjon av phyto-hormoner. Derfor finnes særlig interesse i karakteriserer taxa som knytter plante rot endospheres, rhizospheres og det omkringliggende jorden. Mens noen mikrober kan kultivert isolert på laboratoriet generert media, kan mange delvis fordi de kan stole på symbiotiske forholdet med andre mikrober, vokser svært sakte, eller krever betingelser som ikke kan bli kopiert i et laboratoriemiljø. Fordi det omgår behovet for dyrking og er relativt billig og høy gjennomstrømming, blitt sekvens-baserte Fylogenetiske profilering av environmental og verts-assosiert mikrobiell prøver foretrukket metode for assaying mikrobielle samfunn komposisjon.
Valg av aktuell sekvensering teknologi fra ulike neste generasjons sekvensering (NGS) plattformer1 er avhengig av brukernes behov, med viktige faktorer inkludert: ønsket dekning, amplicon lengde, forventet samfunnet mangfold, samt sekvensering feil, lese-lengde og kostnad-per-run/megabase. En annen variabel som må vurderes i amplicon-baserte sekvensering eksperimenter er hva gene vil bli forsterket og hva primere skal brukes. Når du utformer eller velge primere, er forskere ofte tvunget foreta avveininger mellom universalitet forsterkning og taksonomisk oppløsningen oppnåelige fra den resulterende amplicons. Derfor valgte slike studier ofte primere og markører som selektivt målrette bestemte delsett av microbiome. Evaluere sammensetningen av bakteriell samfunn oppnås vanligvis ved sekvensering ett eller flere av regionene hypervariable bakteriell 16S rRNA gen2,3. I denne studien, beskriver vi en amplicon basert sekvensering protokoll utviklet for en NGS plattform mål 500 bp V3 V4 regionen av bakteriell 16S rRNA genet, som gir bred forsterkning av bakteriell taxa gir nok variasjon til skille mellom forskjellige taxa. I tillegg kan denne protokollen lett tilpasses for bruk med andre primer sett, som de målretting ITS2 markør for sopp eller 18S rRNA delenhet i eukaryoter.
Mens andre tilnærminger som hagle metagenomics, metatranscriptomics og encellede sekvensering, tilbyr andre fordeler inkludert løst mikrobiell genomes og mer direkte måling av samfunnet funksjonen, er disse teknikkene vanligvis mer dyrt og beregningsmessig intensiv enn Fylogenetiske profilering beskrevet her4. I tillegg utfører hagle metagenomics og metatranscriptomics på roten prøver gir en stor del av leser tilhører verten anlegget genomet, og metoder for å overkomme denne begrensningen er stadig utviklet5,6.
Som med alle eksperimentelle plattformer, kan amplicon-baserte profilering introdusere en rekke potensielle skjevheter som bør vurderes under eksperimentell design og data analysen. Disse omfatter metoder for prøvetaking, DNA ekstrahering, utvalg av PCR primere, og hvordan biblioteket forberedelse utføres. Metoder kan betydelig påvirke mengden brukbare data generert, og kan også hindre innsatsen sammenligne resultater mellom studier. For eksempel metoden å fjerne rhizosphere bakterier7 og bruk av ulike utvinning teknikker eller valg av DNA utvinning kits8,9 har vist betydelig innvirkning nedstrøms analyse, som fører til ulike konklusjoner om som mikrober er tilstede og deres relative antall. Siden amplicon-baserte profilering kan tilpasses, kan foreta sammenligninger over studier være utfordrende. Den jorden Project Microbiome har foreslått at forskere studere komplekse systemer som plante-assosiert microbiome ville ha nytte av utviklingen av standardiserte protokoller som en måte å minimere variasjon forårsaket av anvendelsen av ulike metoder mellom studier10,11. Her diskuterer vi mange av emnene over og tilby forslag til best praksis hvor hensiktsmessig.
Protokoll viser prosessen med å samle jord, rhizosphere og roten prøver fra endringer og utdrager DNA ved hjelp av en veletablert DNA isolering kit11. I tillegg inneholder våre protokollen en detaljert amplicon sekvensering arbeidsflyt, bruker en vanligvis benyttet NGS plattform, til å bestemme strukturen av bakteriell samfunn12,13,14. Denne protokollen er validert for bruk i en rekke anlegget verter i en nylig publisert studie av røtter, rhizosphere og tilknyttet jord av 18 monocot arter inkludert endringer, Zea mays, og Triticum aestivum15. Denne metoden har også blitt godkjent for bruk med andre markør gener, som demonstrert av vellykkede programmet å studere fungal ITS2 markør genet i studier av agave microbiome16,17 og jordbær microbiome 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. innsamling og separasjon av roten Endosphere, Rhizosphere og jordprøver
- Før inn feltet autoklav ultrapure vann (minst 90 mL vann per eksempel) å sterilisere. Forberede epiphyte fjerning buffer (minst 25 mL per prøve) ved å legge 6.75 g KH2PO4, 8.75 g K2HPO4og 1 mL av Triton X-100, 1 L sterilt vann. Sterilisere bufferen med et vakuum filter med 0,2 µm porestørrelse.
- Hva 1.2 til 1,5, bruk ren hansker sterilisert med etanol hele tiden og erstatte hansker mellom hver prøve å hindre forurensning. Sterilisere alt utstyr med 70% etanol og tørke ren alt utstyr mellom eksempler. Før prøvetaking, fastsette optimal prøvetaking for eksperimentet, og med alle jord og rot samlinger.
- For å samle bulk jordprøver, bruke en etanol-steriliseres jord kjernen solfangeren for å få jord som er fri for planterøttene ved å samle en kjerne ca 23-30 cm fra bunnen av anlegget.
- Overføre jord til en plastpose, homogenize jord av mild risting og overføre en aliquot av jordprøve (ca 600 mg) å fylle en 2 mL tube. Plassere umiddelbart 2 mL røret på tørris eller flash fryse røret i flytende N2 helt klar til å fortsette med DNA utvinning (trinn 2).
- I noen miljøer inneholde de omkringliggende jord plantemateriale. I dette tilfellet, bruk en sterilisert 2 mm sil for å skille anlegget rusk fra jord før å plassere den i plastposen.
- For å samle roten og rhizosphere, bruk en etanol-steriliseres spade til å grave opp anlegget, ta vare for å få så mye av rot som mulig. Dybden er avhengig av anlegget. Mens planter som hvete kan fjernes ved å grave flere centimeter, krever større planter som sorghum 30 cm eller mer. Forsiktig rist av overflødig jord fra røttene til det er ca. 2 mm av jord følge rot overflaten.
Merk: Vær forsiktig når du arbeider med små planter, med skjøre røtter eller tørr, høye leire innhold jord. Ideelt sett bør det bare være et tynt lag jord igjen på røttene etter risting. Hvis store mengder jord forblir, benyttes en gummihammer for å løsne jorden ved forsiktig å treffe bunnen av skyte. Hvis mengden jord igjen etter denne prosessen overskrider eller faller under 2 mm, bemerkes omtrentlig tykkelsen. - For store planter, kan du bruke sterilt saks og/eller saks å kutte et representativt ledd av røtter og plassere minst 500 mg av rot vev i 50 mL konisk ampuller. For mindre gress, plassere hele rotsystem i ampullen. Legg nok epiphyte fjerning buffer for å dekke røttene, og umiddelbart plasser prøven på tørris eller flash fryse eksemplet i flytende N2.
Merk: ta vare ikke for å overfylle 50 mL konisk ampullen, som det vil gjøre vask trinn vanskelig. Det bør være nok ledig plass slik at bufferen som epiphyte kan strømme til bunnen omgir røttene gjennom ampullen og dekker toppen. Fordi noen gress har mer rot biomasse enn det er plass til 50 mL konisk ampuller, skal et ledd av røttene samles. Det bør imidlertid bemerkes at kutte røttene kan føre til endophytic bakterier blir vasket ut i rhizosphere delen, så bryte røtter bør minimaliseres. Hvis prøver ikke behandles umiddelbart etter retur til lab kan de lagres på-80 ° C. - For å skille rhizosphere fra røttene, tine rot prøven på is og sonicate rot prøvene ved 4 ° C i 10 min med pulser på 160 M for 30 s, atskilt med 30 s. overføring røttene i en kjølt (4 ° C), ren 50 mL tube med sterilt tang. Kast ikke opprinnelige røret med buffer og jord, som er en rhizosphere brøkdel (figur 1).
- Sentrifuge røret som inneholder bufferen og rhizosphere for 10 min ved 4 ° C, 4000 x g. Decant nedbryting, flash fryse røret som inneholder den rhizosphere fraksjon i flytende N2, og lagre rhizosphere brøken ved-80 ° C helt klar til å fortsette med DNA ekstraksjon (trinn 2).
- For å vaske røttene, Legg ca 20 mL kjølt (4 ° C) sterilt vann til roten brøk. Vask roten av risting kraftig (for hånd eller mikser, 15-30 r), og deretter tappe vannet.
- Gjenta dette trinnet minst to ganger, til ingen jord forblir på roten overflaten. Hvis DNA utvinning (trinn 2) ikke utføres umiddelbart, Pakk røttene i sterilt aluminiumsfolie, flash fryse røttene i flytende N2, og store eksemplene på-80 ° C til klar til å fortsette med DNA utvinning.
2. DNA utvinning
Merk: I trinn 2 og 3,-ren hansker sterilisert med etanol, bør brukes til alle tider og alt arbeidet skal utføres på en overflate sterilisert med etanol.
- Ekstra DNA fra jord og rhizosphere prøvene.
- Bruk en steril slikkepott til å raskt overføre 250 mg av jord og rhizosphere fra trinn 1.3 og 1,7 inn i avfallsdeponering rør angitt i en kommersiell DNA isolering kit utviklet for utvinning fra jord, så fortsette med DNA isolasjon bruke kit leverandørens protokollen.
- Etter eluting DNA i elueringsrørets bufferen som ble angitt av DNA isolering kit, lagre DNA på 20 ° C til du er klar til å fortsette med trinn 3.
- Ekstra DNA fra roten prøvene.
- Chill en sterilisert morter bruker flytende N2. Måle ut 600 til 700 mg av rot vev og plasser vevet i mørtelen. Nøye, Legg nok væske N2 å dekke røttene.
- Grind røttene i små biter. Fortsette prosessen med å legge til flytende N2 og sliping (minst to ganger, være samsvar mellom eksempler), til røttene er et fint pulver. Kontroller at roten vev ikke tine i dette trinnet.
Advarsel: Bruk riktig personlig verneutstyr (laboratoriefrakk, vernebriller og kryogene hansker) når arbeider med flytende N2.
Merk: For en lav kvalitet DNA utvinning, kan det være gunstig å male overflødig røtter til pulver og lagre pulver på-80 ° C. - Raskt, før rot begynner pulver å tine, bruk en steril slikkepott til å overføre rot pulver i pre vektet 1,5 mL rør på is. Registrere vekten av rør og pulver. Vanligvis overføres 300-400 mg pulver.
- Bruk en steril slikkepott til å raskt overføre 150 mg av rot pulver til samling rør i en kommersiell DNA isolering kit utviklet for utvinning fra jord, og deretter fortsette med DNA isolasjon med kit leverandørens protokollen.
Merk: For noen roten prøver, kan det være en høy konsentrasjon av organiske igjen i DNA pellets, som hindrer forsterkning av DNA under PCR, spesielt når en annen DNA utvinning protokoll (f.eks., CTAB utvinning) brukes. Hvis nødvendig, rengjør DNA ved å følge instruksjonene i miljømessige DNA oppryddingen kit.
- Måle konsentrasjonen av alle DNA-prøver ved å bruke en høy følsomhet Borstemmaskin fluorometer.
- Legge til 1-20 µL av hver eluted DNA-prøve i rør i dsDNA høy følsomhet analysen kit. Legg fluorometer fungerende løsning (1:200 farge: buffer) opp til 200 µL.
- Forberede to ekstra rør som inneholder 10 µL av DNA standard 1 (0 ng/µL DNA) eller 10 µL av standard 2 (100 ng/µL), og legge til 190 µL av fluorometer fungerende løsning i hver standard.
- Måle konsentrasjonen av standarder og hvert utvalg. Hvis det ikke blir gjort automatisk, kan du beregne DNA konsentrasjonen fra absorbansen produksjon ved en lineær regresjon av de to standardene.
3. Amplicon biblioteket forberedelse og innlevering
- Sette opp materiale for forsterkning reaksjonen.
- Tine DNA-prøver på 4 ° C og holde dem på isen i trinn 3. Tilfeldig rekkefølge av DNA-prøver å minimere bias beliggenhet på PCR plate (tabell 2).
- I en 96-brønns PCR plate, fortynne DNA fra hver prøve i molekylær-grade vann til 5 ng/µL i et totalvolum på 20 µL. legge til 20 µL molekylær-grade vann til fire hjørne brønnene som negative kontroller for forsterkning (tomme) (tabell 2).
- Ordne barcoded primerne (10 µM) enten PCR stripe rør eller en 96-brønns plate slik at de kan legges til med en flerkanals pipette (figur 2).
- Forbered tilstrekkelig PCR master mix å forsterke hver DNA-prøve i tre eksemplarer. Forberede 1,5 µL av BSA (20 mg/mL), 37,5 µL av pre-laget 2 x master mix (består av PCR buffer, MgCl2, dNTPs og Taq DNA polymerase), 0.57 µL av chloroplast PNA (100 µM), 0.57 µL av mitokondrie PNA (100 µM), og 25.86 µL molekylær klasse vann.
- Hell master mix i et sterilt 25 mL av flerkanals pipette reservoaret og distribuere 66 µL av master mix i hver brønn av en ny 96-brønns PCR plate med en flerkanals pipette.
Merk: Ved beregning av reagens volumer for master mix, kontroller at også de 4 tomme brønnene per plate. - Bruke en flerkanals pipette, legge til 6 µL av 5 ng/µL DNA (fra normalisert DNA plate) til master mix plate. Deretter legge til master plate 1.5 µL av 10 µM frem primer slik at hver kolonne har en annen fremover strekkode og 1,5 µL av 10 µM reversere primer slik at hver rad har en annen omvendt strekkode (figur 2).
Merk: Før du legger primere, randomisert platene og master blanding kan brukes til å forsterke sin eller ITS2 sopp gener hvis forskjellige primere ble lagt. Hvis dette er tilfelle, kan en lignende primer design brukes. - Nedspinning tallerkenen kort i 3000 x g. Bruk en flerkanals pipette bland forsiktig, deretter dele inn i tre plater med 25 µL av reaksjonsblandingen.
Merk: Selv om tre gjentak ikke strengt nødvendig, det reduserer virkningen av tekniske variasjon.
- Forsterke DNA i hver tallerken med en thermocycler satt til følgende: 180 s på 98 ° C, 30 sykluser: 98 ° C i 45 s (denaturing), 78 ° C for 10 s (PNA annealing), 55 ° C for 60 s (primer annealing) og 72 ° C for 90 s (forlengelsen) , deretter 600 s ved 72 ° C etterfulgt av en 4 ° C holder trinn. Etter forsterkning, basseng tre Repliker platene i én enkelt 96-brønns plate.
- Kvantifisere DNA med høy følsomhet fluorometer reagenser i en 96-brønns plate leser.
- Legg 2 µL av hvert PCR-produkt til en 96-brønnen microplate, sammen med 98 µL av fluorometer fungerende løsning (1:200 farge: buffer). Inkluderer 4 brønner som standarder: 5 µL av DNA standard 1 (0 ng/µL DNA), 1 µL av standard 2 (10 ng/µL), 2 µL av standard 2 (20 ng/µL) og 5 µL av standard 2 (50 ng/µL). Deretter Legg fluorometer fungerende løsning for et siste volum av 100 µL.
Merk: Hver prøve kan måles med en Borstemmaskin fluorometer som beskrevet i trinn 2.3 Hvis en plate leser ikke er tilgjengelig. - Beregn konsentrasjonen DNA fra absorbansen produksjon av en lineær regresjon av fire.
- For vellykket forsterket barcoded produkter (de som har en konsentrasjon som er større enn 15 ng/µL), basseng 100 ng av hvert utvalg i en enkelt 1,5 mL tube (tabell 2).
- Beregne gjennomsnittlig antall prøver legges til i utvalget ved hjelp av funksjonen =AVERAGE() i et regnearkprogram. Legg volumet av "blank" PCR produktene til grupperte prøvene.
Merk: Siden "blank" PCR produktene har sin egen unike strekkode kombinasjoner, kan de være rekkefølge for å se etter eventuelle laboratorium forurensninger.
- Legg 2 µL av hvert PCR-produkt til en 96-brønnen microplate, sammen med 98 µL av fluorometer fungerende løsning (1:200 farge: buffer). Inkluderer 4 brønner som standarder: 5 µL av DNA standard 1 (0 ng/µL DNA), 1 µL av standard 2 (10 ng/µL), 2 µL av standard 2 (20 ng/µL) og 5 µL av standard 2 (50 ng/µL). Deretter Legg fluorometer fungerende løsning for et siste volum av 100 µL.
- Måle konsentrasjonen av grupperte produktet bruker en Borstemmaskin fluorometer som beskrevet i trinn 2.3 og ta 600 ng DNA og fortynne i molekylær-grade vann til et siste volum av 100 µL i en 1,5 mL tube. Lagre de resterende grupperte produktet på 20 ° C.
- Vask 600 ng DNA aliquot ved å følge den etablerte PCR renselsesprosess med spinn rensing perler i 96-brønnen format med noen få unntak.
- Gjør en frisk 600 µL aliquot av 70% etanol. Riste flasken av magnetiske perler å suspendere perler som bosette til bunnen.
- Legge til 1 x volum (100 µL) perle løsning på 600 ng aliquot DNA. Bland godt av pipettering 10 ganger. Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
- Sett røret på magnetiske stå i 2 minutter (eller til løsningen er klar) til å skille perler fra løsning. Mens røret er fortsatt i magnetiske standen, Sug opp klare nedbryting forsiktig uten å berøre de magnetiske perlene, og forkaste klart nedbryting.
Merk: på dette punktet amplicon produktene er bundet til de magnetiske perlene. Noen perler som er forstyrret eller tapt under aspirasjon vil resultere i tap av DNA. - La røret i magnetiske stå og legger 300 µL av 70% etanol til røret; Inkuber ved romtemperatur for 30 s. leveringstanken etanol og kast. Gjenta denne prosessen, og Fjern alle etanol etter andre vask. Fjern røret fra magnetiske stativet, og lufttørke i 5 min.
- Legge til 30 µL molekylær-grade vann tørket perler og bland av pipettering 10 ganger. Inkuber ved romtemperatur for 2 min. tilbake røret til den magnetiske står for 1 min for å skille perler fra løsning. Overføring av eluate til en ny tube.
Merk: Magnetiske perler påvirker ikke nedstrøms reaksjoner.
- Måle siste konsentrasjonen av renset, gruppert DNA ved å bruke en Borstemmaskin fluorometer som beskrevet i trinn 2.3. Fortynne en aliquot 10 nM i et siste volum 30 µL, eller konsentrasjonen og volum foretrukket av sekvensering anlegget.
- Benytte tjenestene til en sekvensering anlegg til sekvens DNA på en NGS plattform, 2 x 300 bp sammen-end sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utføre det anbefalte protokollen skal resultere i et dataset indekserte sammen-end lyder som kan matchet tilbake til hvert utvalg og tilordnet enten en bakteriell taksonomisk driftsenheter (OTU) eller eksakte sekvensen variant (ESV, også referert til som amplicon sekvensen variant (ASV) og sub-operational taksonomisk enhet (sOTU)), avhengig av nedstrøms. For å få høy kvalitet sekvens databehandling, må utvises på hvert trinn å opprettholde konsekvensen mellom prøvene og minimere innføring av skjevheter potensielle under eksempel behandling eller biblioteket forberedelse. Etter innsamling, skal behandling og utdrager DNA fra prøver (trinn 1 og 2), den resulterende eluate vises tydelig og gratis organiske det ville hemme forsterkning. Mens renhet kan verifiseres ved å måle hver DNA-prøve via et microvolume spektrofotometer, har vi funnet at jorda DNA utvinning kit fjerner alle forurensninger. Som følge av forutsigbare DNA kvaliteten er kvantifisering metoder som bruker fluorescens-baserte fargestoffer som spesifikt binder DNA mer hensiktsmessig enn basert på UV absorbansen19,20,21. Før PCR forsterkning gjennomsnitt jord og rhizosphere rundt 10 ng/µL DNA, mens roten prøver vanligvis har en gjennomsnittlig konsentrasjon på ca 30 ng/µL (tabell 2).
Etter forsterkning av miljømessige DNA (trinn 3), suksess eller fiasko kan bestemmes ved å måle konsentrasjonen av PCR produktet via Borstemmaskin fluorometer reagenser på en plate-leser, hvis tilgjengelig, eller manuelt (tabell 2). I vår erfaring, vellykket amplifications som resulterer i høy kvalitet amplicon data kapasitet større enn 15 ng/µL PCR produkter. Hvis det er flere feil på en plate, kan posisjonelle ordningen i anlegget og prøve typen mislykket prøver å fastsette problemet. For eksempel, hvis de er alle sammenhengende på tallerkenen, kan det tyde pipette feil, mens hvis de er i samme rad eller kolonne, det kan foreslå problemer med en bestemt primer. Hvis de alle tilhører samme eksempel type, kan det tyde på problemer med prøve behandling eller DNA utvinning.
Det er viktig å sjekke kompatibiliteten til de universelle PNAs med dine spesifikke anlegget systemet bioinformatically under eksperimentell design for å verifisere at de vil blokkere forsterkning av chloroplast og mitokondrie 16S gener. Etter det forsterkning trinnet, det er ikke klart om PNAs ble bundet til mitokondrie og chloroplast maler; Dette er bare avslørt etter sekvensering (Figur 3). For å sikre at PNAs effektivt blokkerer miljøgifter forsterkning, en justering av PNA sekvensen for hver chloroplast og mitokondrie 16S rRNA gen (det kan være flere eksemplarer) for anlegget skal vert etterforsket ikke avsløre noen uoverensstemmelser . Selv en enkelt konflikt til 13 bp PNA sekvensen, spesielt i PNA klemmen, kan drastisk redusere effektiviteten, som i tilfelle av den medfølgende chloroplast PNA sekvensen og chloroplast 16S rRNA genet av Lactuca sativa (salat) ( Figur 3).
Siden en lik mengde forsterket DNA er samlet per prøve, det skal være et lag med antall leser hentet per prøve etter sekvensering og sortering leser basert på deres barcoded indeks (Figur 4). Fleste av disse samsvare til bakteriell taxa. Alle eukaryote, mitokondrie, eller chloroplast kamper skal kastes. Avhengig av analyse rørledningen og taksonomisk databasen valgt, chloroplast og mitokondrie leser kan feilaktig tilordnes bakteriell linjene, ofte Cyanobakterie og Rickesttia, henholdsvis (Figur 3). En grad av manuell konservering er ofte klokt å se etter disse vanlige mis tildelinger. Spesifikke detaljer vil avhenge av valg av analyse, men relative overflod profiler skal vanligvis lignende (ingen signifikant forskjell) blant biologiske gjentak og signifikant forskjellig mellom jord, rhizosphere og roten prøver (figur 5 ). Det er viktig å merke seg imidlertid at mens det kan være ingen signifikant forskjell mellom biologiske gjentak, er det viktig å samle minst tre gjentak per.
Metoder for å tolke dataene innhentet i disse eksperimentene er heftig debattert blant mikrobiell økologer. Inntil nylig er amplicon sekvens analyse avhengig av gruppering leser inn OTUs. Men dette er problematisk fordi: 1) de er basert på en noe vilkårlig terskel for 97% likheten 2) mangfold er ofte undervurdert og 3) det kan være lav taksonomisk oppløsning. Nylig kan utviklet verktøy som DADA2, Deblur og UNOISE222,23,24 sortere leser i ESVs, som løser noen problemer presentert ved OTUs. Advarsler for å bruke ESVs inkluderer: 1) kunstig økning i mangfold på grunn av forskjeller i rRNA eksemplarer i arter, og 2) økt følsomhet PCR og sekvensering feil25,26.
Figur 1: separasjon av rot og rhizosphere brøker. Flytskjema som viser trinn for å skille rhizosphere fra roten prøvene, etterfulgt av vaske røttene med sterilt vann for å fjerne eventuelle gjenværende rhizoplane organismer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: eksempel på lager primer oppsett for forsterkning og distribusjon i plater. Lager primere (tabell 1) kan være forberedt i stripen rør for optimal distribusjon i 96-brønnen plater (hver stripe av primere representeres av en annen farge, lilla for fremover primere 1-8, oransje for videresende primere 9-16, blå for omvendt primere 1-12 og grønn for reversere primere 13-16.) I dette tilfellet kan 16 frem og 16 omvendt primere distribueres effektivt med en flerkanals pipette slik at hver har også en unik strekkode kombinasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: resultater som foreslår chloroplast PNA er ineffektivt. Representant resultatet fra rhizosphere ("Rhizo") og roten jordprøver fra salat som ble ikke behandlet (NT) eller behandlet (VT) med en biologisk jord endring. PNA sekvensen brukes til å blokkere chloroplast forurensning av de fleste anlegg er GGCTCAACCCTGGACAG27. Salat inneholder imidlertid ikke samsvar i chloroplast 16S ribosomal RNA genet (GGCTCAACTCTGGACAG). Dette gjengir PNA ineffektive, noe som resulterer i en høy relative overflod av lyder som passer til Cyanobakterie i rhizosphere og roten prøver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: fordeling av Les teller blant eksemplene i et bibliotek. Stolpediagram som viser antall lese teller (y-aksen) fra forskjellige prøver (barer, x-aksen) med strekkode kombinasjonen i Les. Antall leser per eksempel kan variere basert på hvor mange eksempler er i biblioteket; dette delsettet ble sekvensert i et bibliotek av 192 prøver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Relative overflod av topp 12 klasser i rot, rhizosphere og jord samfunn. Stablet liggende stolpediagram viser relative overflod av klasser i representant 16S dataset som inneholder 6 replikerer for hver eksempel (bulk jord, rhizosphere og rot endosphere). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: primere for forsterke V3 V4 regionen 16S rRNA genet. Primere består av, sekvensielt: et kort for en felles NGS plattform, en unik strekkode, primer for NGS, et spacer område av variabel lengde å flytte rammen for sekvensering og en universell PCR primer som forsterker enten 341F eller 785R av 16S rRNA genet. Primere nødvendig er avhengig av hvor mange eksempler er sekvensert per bibliotek; en kombinasjon av 16 frem og 16 omvendt primere er tilstrekkelig for 244 prøver (256 primer kombinasjoner med 12 brukt tom brønner under PCR (figur 2)). Klikk her for å laste ned denne filen.
Tabell 2: normalisering av randomiserte DNA prøver før og etter forsterkning. Eksempelregneark viser eksempler i en randomisert rekkefølge og angir plassering på en enkelt plate 96-brønnen, som bestemmer også primer kombinasjonen tilordnet. Formler i nederste rad beskriver beregninger for å legge til 100 ng av hvert utvalg normalisert platen, pluss volumet av vann å nå 20 µL. Etter forsterkning, volumet av 100 ng for hver vellykket produkt er beregnet og lagt til et siste basseng. Volumet av "blank" PCR-produkt for å legge til de er gjennomsnittet av andre prøvene. Klikk her for å laste ned denne filen.
Ekstra figur 1: tilnærming til minimum rot biomasse under prøvetakingen. Når samle røtter, prøver å samle minst 500 mg av vev. Her, røtter samlet fra en ung sorghum plante (venstre, både A og B) og en ung ris anlegg (høyre) vises til (A) og i (B) 50 mL konisk rør. Både prøver veier ca 1 g, det er imidlertid viktig å merke seg at denne vekten inkluderer rhizosphere og rot, og rhizosphere vekten er, i dette tilfellet omtrent en halv totalvekt. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen demonstrerer en etablert rørledning for å utforske roten endosphere, rhizosphere og jord mikrobiell samfunnet komposisjoner, fra feltet prøvetaking prøve behandling og nedstrøms sekvensering. Studere rot-assosiert microbiomes gir unike utfordringer, skyldes delvis til iboende vanskeligheter i prøvetaking fra jord. Jordsmonnet er svært variabel i form av fysiske og kjemiske egenskaper, og ulike jordbunnsforhold kan skilles med så lite som noen få millimeter28,29. Dette kan føre til prøvene som er samlet inn fra tilstøtende målestasjoner har betydelig forskjellige mikrobielle samfunn komposisjoner og aktiviteter30,31. Dermed bruker jord kjernen samlere og spader for å opprettholde konsekvent prøve dybder og homogenisering før DNA ekstraksjon er avgjørende for reproduserbarhet i roten microbiome studier. Det er også viktig å effektivt skille rhizosphere og rot fraksjoner; bruke en harde rot overflaten sterilisering kan potensielt lyse endophytes i røtter før DNA ekstraksjon, mens en mer konservativ vask ikke kan fjerne alle mikrober fra roten overflaten7. En annen viktig faktor som kan negativt påvirke eller forstyrre sekvensering resultater er bakteriell forurensning, som kan komme fra mange kilder og er noen ganger umulig å skille fra samplet miljømessige bakterier32,33. Av denne grunn forsiktig sterilisering av utvalg verktøy, experimental materialer og miljøer er avgjørende for å unngå forurensning.
Etter prøvetaking er å få høy kvalitet DNA en høy prioritet for vellykket nedstrøms analyser. I vår erfaring, DNA utvinning fra feltet vokst roten prøver gjennom alternative metoder, som gjennom CTAB-baserte utvinning, inneholder ofte vesentlig større mengder humic syrer og andre forbindelser i forhold til rhizosphere og jord. Forbindelsene kan hindre den enzymatiske aktiviteten av DNA polymerase under PCR forsterkning, selv ved lave konsentrasjoner34,35. Bruke DNA utvinning kits designet for jord på roten prøver, i motsetning til en CTAB utvinning etterfulgt av en fenol kloroform opprydding, kan effektivt kvitt prøver av humic syrer og vil resultere i høy kvalitet DNA36,37, 38,39. Følgelig, vi anbefaler å bruke en kommersielt tilgjengelig DNA utvinning kit for roten prøver også. Det bør bemerkes at målet er å få mikrobiell genomisk DNA fra planterøttene. Dermed er grundig og konsekvent rot sliping viktig å bryte ned anlegget vevet og lyse mikrobiell cellene å løslate mikrobiell DNA uten introdusere bias mellom eksempler på grunn av variasjoner i sliping press og tid.
Etter forsiktig Uthenting av DNA fra prøver, er det to viktigste kildene for problemer under forsterkning: 1) forurensning av anlegget vev anlegget endosymbionts (chloroplast og mitokondrier) og 2) utvalg av 16S rRNA regionen å forsterke. Forsterkning fra chloroplast eller mitokondrier 16S rRNA sekvenser kan generere > 80% av sekvenser i roten prøver40, og mer i blad vev, men mengden av forurensning er avhengig av valg av primere. Dermed er PNA klemmer nødvendig under PCR-steg å undertrykke anlegget vert chloroplast og mitokondrie 16S forurensning27,41. Forskjellige plantearter kan imidlertid ha variasjon i chloroplast og mitokondrie 16S sekvens27; Derfor er det viktig å kontrollere rekkefølgen på chloroplast og mitokondrie 16S gener av anlegget blir studert før biblioteket sekvensering, for å avgjøre om alternative PNA oligos kreves (Figur 3). I tillegg består 16S rRNA genet av ni hypervariable regioner flankert av ni konservative regioner. forskjellige resultater kan fås fra samme gruppe avhengig av hvilken hypervariable region er forsterket42. Tidligere studier har funnet V4 regionen å være en av de mest pålitelige for tilordne taksonomi43 og det har vært brukt i andre omfattende microbiome undersøkelser11. Forlenge målet til regionen V3 V4 er foreslått her å øke variasjon og bedre taksonomisk oppløsning.
I denne protokollen viste vi en pipeline for å utføre 16S rRNA amplicon sekvensering via neste generasjons sekvensering (NGS) for å studere mikrobielle samfunn komposisjoner av miljøprøver12. Vi anbefaler at du bruker amplicon sekvenser som et verktøy for Fylogenetiske profilering, fordi det er relativt billige, høy gjennomstrømming, og ikke krever omfattende beregningsorientert kompetanse eller ressurser til å analysere. Mens vår metoden fokuserer på å analysere bakteriell brøkdel av microbiome, kan det lett tilpasses for å undersøke sopp. Protokollen er identisk gjennom trinn 2, og den eneste forskjellen i trinn 3 er hva primere brukes under forsterkning. Det er imidlertid verdt noe at amplicon basert profilering ikke er uten begrensninger. Av sekvensering et enkelt merke gen, hentes ingen informasjon om den funksjonelle kapasiteten til samfunnet. I tillegg kan taksonomisk oppløsningen være ganske lav, spesielt når sekvensering fra miljøer med en høy andel av uncharacterized mikrober. Imidlertid sekvensering teknologi utvikler seg raskt, og forventer vi potensial til å håndtere noen av disse svakhetene ved å tilpasse denne protokollen for bruk med andre sekvensering plattformer. Endelig, som nevnt i innledningen, hagle metagenomics og metatranscriptomics kan enkelt utføres på jord-og rhizosphere, og metoder for å eliminere anlegget forurensning fra anlegget vev for tiden undersøkt. Eksperimentell design som par amplicon-baserte tilnærminger og andre metagenomic teknikker kan være spesielt effektiv i komplekse samfunn hvor stor og ujevn representasjon av taxa kan forhindre hagle data fra nøyaktig karakterisere mindre dominerende medlemmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS støttes av NSF Graduate Fellowship forskningsprogrammet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-10/20 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-3810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5510 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000027 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes | Eppendorf | 3120000909 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 100 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000043 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1000 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1122-1830 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1620-2700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mm soil sieve | Forestry Suppliers | 60141009 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 200 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-8810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 25 mL reservoirs | VWR International LLC | 89094-664 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 50 mL conical vials | Thermo Fisher Scientific | 352098 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) | VWR International LLC | 156-4020 | |
| 96-well microplates | USA Scientific | 655900 | |
| 96-well PCR plates | BioRad | HSP9631 | |
| Agencourt AMPure XP beads | Thermo Fisher Scientific | NC9933872 | Instructions for use: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180 &documentName=B37419AA.pdf |
| Aluminum foil | Boardwalk | 7124 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Analytical scale with 0.001 g resolution | Ohaus Pioneer | PA323 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Bioruptor Plus ultrasonicator | Diagenode | B01020001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL | New England Biolabs | B9000S | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811000908 | Including 50mL and 96-well plate bucket adapters |
| Cryogenic gloves | Millipore Sigma | Z183490 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| DNeasy PowerClean kit (optional) | Qiagen Inc. | 12877-50 | Previously MoBio |
| DNeasy PowerSoil kit | Qiagen Inc. | 12888-100 | Previously MoBio |
| Dry ice | Any | NA | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Do not substitute |
| Ethanol | VWR International LLC | 89125-188 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gallon size freezer bags | Ziploc | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gemini EM Microplate Reader | Molecular Devices | EM | Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top. |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lab coat | Workrite | J1367 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 | Any | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 dewar | Thermo Fisher Scientific | 4150-9000 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Milli-Q ultrapure water purification system | Millipore Sigma | SYNS0R0WW | |
| Mini-centrifuge | Eppendorf | 5404000014 | |
| Molecular grade water | Thermo Fisher Scientific | 4387937 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Mortars | VWR International LLC | 89038-150 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Nitrile gloves | Thermo Fisher Scientific | 19167032B | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Paper towels | VWR International LLC | BWK6212 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| PCR plate sealing film | Thermo Fisher Scientific | NC9684493 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| Pestles | VWR International LLC | 89038-166 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Plastic spatulas | LevGo, Inc. | 17211 | |
| Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific | 13000014 | |
| PNAs - chloroplast and mitochondrial | PNA Bio | NA | Make sure to verify sequence bioinformatically |
| Protective eyewear | Millipore Sigma | Z759015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| Rubber mallet (optional) | Ace Hardware | 2258622 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shears or scissors | VWR International LLC | 89259-936 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shovel | Home Depot | 2597400 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Soil core collector (small diameter: <1 inch) | Ben Meadows | 221700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Spray bottles | Santa Cruz Biotechnology | sc-395278 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) | IDT | NA | 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry. |
| Thermocycler | Thermo Fisher Scientific | E950040015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Weigh boats | Spectrum Chemicals | B6001W | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
References
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
- Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic classification of environmental 16S rRNA gene sequences. ISME J. 6 (7), 1440-1444 (2012).
- Takahashi, S., Tomita, J., Nishioka, K., Hisada, T., Nishijima, M. Development of a Prokaryotic Universal Primer for Simultaneous Analysis of Bacteria and Archaea Using Next-Generation Sequencing. PLoS One. 9 (8), e105592 (2014).
- Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics. PLoS One. 9 (4), e93827 (2014).
- Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Front Plant Sci. 5, 209 (2014).
- Jiao, J. -Y., Wang, H. -X., Zeng, Y., Shen, Y. -M. Enrichment for microbes living in association with plant tissues. J Appl Microbiol. 100 (4), 830-837 (2006).
- Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Front Microbiol. 7, 773 (2016).
- Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R., Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 5709, 623-628 (2011).
- Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
- Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLoS Biol. 15 (3), e2001793 (2017).
- Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. , (2017).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform. Appl Environ Microb. 79 (17), 5112-5120 (2013).
- Degnan, P. H., Ochman, H. Illumina-based analysis of microbial community diversity. ISME J. 6 (1), 183-194 (2012).
- Naylor, D., DeGraaf, S., Purdom, E., Coleman-Derr, D. Drought and host selection influence bacterial community dynamics in the grass root microbiome. ISME J. , (2017).
- Desgarennes, D., Garrido, E., Torres-Gomez, M. J., Peña-Cabriales, J. J., Partida-Martinez, L. P. Diazotrophic potential among bacterial communities associated with wild and cultivated Agave species. FEMS Microbiol Ecol. 90 (3), 844-857 (2014).
- Coleman-Derr, D., et al. Plant compartment and biogeography affect microbiome composition in cultivated and native Agave species. New Phytol. 209 (2), 798-811 (2016).
- De Tender, C., et al. Dynamics in the Strawberry Rhizosphere Microbiome in Response to Biochar and Botrytis cinerea Leaf Infection. Front Microbiol. 7, 2062 (2016).
- Kapp, J. R., et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol. 68 (2), 111-118 (2015).
- Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
- O'Neill, M., McPartlin, J., Arthure, K., Riedel, S., McMillan, N. Comparison of the TLDA with the Nanodrop and the reference Qubit system. J Phys Conf Ser. 307 (1), 012047 (2011).
- Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Amir, A., et al. Deblur Rapidly Resolves Single-Nucleotide Community Sequence Patterns. mSystems. 2 (2), e00191-e00116 (2017).
- Edgar, R. C. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. bioRxiv. , 081257 (2016).
- Nguyen, N. -P., Warnow, T., Pop, M., White, B. A perspective on 16S rRNA operational taxonomic unit clustering using sequence similarity. NPJ Biofilms Microbiomes. 2, 16004 (2016).
- Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Holmes, S. P. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. , (2017).
- Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nat Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
- O'Brien, S. L., et al. Spatial scale drives patterns in soil bacterial diversity. Environ Microbiol. 18 (6), 2039-2051 (2016).
- Fierer, N., Lennon, J. T. The generation and maintenance of diversity in microbial communities. Am J Bot. 98 (3), 439-448 (2011).
- Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nat Rev Microbiol. 15 (10), 579-590 (2017).
- Buckley, D. H., Schmidt, T. M. Diversity and dynamics of microbial communities in soils from agro-ecosystems. Environ Microbiol. 5 (6), 441-452 (2003).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
- Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
- Sutlović, D., Definis Gojanović, M., Andelinović, S., Gugić, D., Primorac, D. Taq polymerase reverses inhibition of quantitative real time polymerase chain reaction by humic acid. Croat Med J. 46 (4), 556-562 (2005).
- Sutlovic, D., Gamulin, S., Definis-Gojanovic, M., Gugic, D., Andjelinovic, S. Interaction of humic acids with human DNA: proposed mechanisms and kinetics. Electrophoresis. 29 (7), 1467-1472 (2008).
- Aleklett, K., Leff, J. W., Fierer, N., Hart, M. Wild plant species growing closely connected in a subalpine meadow host distinct root-associated bacterial communities. PeerJ. 3, e804 (2015).
- Bogas, A. C., et al. Endophytic bacterial diversity in the phyllosphere of Amazon Paullinia cupana associated with asymptomatic and symptomatic anthracnose. Springerplus. 4, 258 (2015).
- Hiscox, J., Savoury, M., Müller, C. T., Lindahl, B. D., Rogers, H. J., Boddy, L. Priority effects during fungal community establishment in beech wood. ISME J. 9 (10), 2246-2260 (2015).
- Zhang, T., Yao, Y. -F. Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific. PLoS One. 10 (6), e0130051 (2015).
- Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. PLoS One. 8 (8), e71360 (2013).
- Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity. Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).
- Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -A. Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems. Appl Environ Microb. 80 (15), 4626-4639 (2014).
- Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -Y. Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC Bioinformatics. 17, 135 (2016).
