Summary
هنا، يمكننا وصف بروتوكول للحصول على بيانات تسلسل amplicon التربة ورهيزوسفيري وميكروبيوميس اندوسفيري الجذر. هذه المعلومات يمكن استخدامها للتحقيق في تركيبة وتنوع المجتمعات الميكروبية النباتية المرتبطة، وهي مناسبة للاستخدام مع مجموعة واسعة من الأنواع النباتية.
Abstract
التفاعل الحميم بين المضيف النبات والكائنات الحية الدقيقة المرتبطة بها أمر بالغ الأهمية في تحديد النبات اللياقة البدنية، ويمكن أن تعزز التسامح محسنة للضغوط غير الحيوية والأمراض. ميكروبيومي النباتية يمكن أن تكون معقدة للغاية، ومنخفضة التكلفة، غالباً ما أساليب الفائق مثل amplicon-على أساس تسلسل الجين الرنا الريباسي 16S المفضل لوصف تشكيلة الميكروبية والتنوع. اختيار المنهجية المناسبة عند إجراء مثل هذه التجارب غير ذات أهمية حاسمة للحد من التحيزات التي يمكن إجراء التحليل والمقارنة بين العينات والدراسات صعبة. ويصف هذا البروتوكول بالتفصيل منهجية موحدة لجمع واستخراج الحمض النووي من التربة ورهيزوسفيري، وعينات الجذر. بالإضافة إلى ذلك، تسلط الضوء على خط أنابيب تسلسل amplicon الرنا الريباسي 16S راسخة التي تسمح لاستكشاف تركيبة المجتمعات البكتيرية في هذه العينات، ويمكن تكييفها بسهولة لجينات علامة أخرى. هذا الخط قد تم التحقق من صحة لمجموعة متنوعة من أنواع النباتات، بما في ذلك الذرة، والذرة والقمح، والفراولة، والاغاف، ويمكن أن تساعد في التغلب على القضايا المرتبطة بالتلوث من العضيات النباتية.
Introduction
ميكروبيوميس المرتبطة بالنباتات تتكون من المجتمعات الميكروبية دينامية ومعقدة تتألف من البكتيريا، العتيقات، والفيروسات والفطريات وغيرها من الكائنات الدقيقة حقيقية النواة. بالإضافة إلى دورها مدروسة في التسبب في أمراض النباتات، الميكروبات المرتبطة بالنبات يمكن أيضا التأثير إيجابيا الصحة النباتية بتحسين التسامح الإجهادات الحيوية واللاحيويه وتعزيز توافر المغذيات، وتعزيز نمو النبات من خلال إنتاج فيتوهورمونيس. ولهذا السبب، يوجد اهتمام خاص في وصف الأصناف التي تربط بجذر نبات اندوسفيريس، ورهيزوسفيريس، والتربة المحيطة بها. بينما يمكن أن تكون بعض الميكروبات المستزرعة في عزلة في مختبر الوسائط التي تم إنشاؤها، كثير لا يمكن، جزئيا لأنها قد تعتمد على علاقات تكافلية مع غيرها الميكروبات، تنمو ببطء شديد، أو تتطلب الظروف التي لا يمكن تكرارها في بيئة معمل. لأنها تلتف الحاجة إلى زراعة وغير مكلفة نسبيا وعالية الإنتاجية، على أساس تسلسل النشوء والتطور التنميط العينات البيئية وما يرتبط بها المضيف الميكروبية أصبحت طريقة مفضلة للمعايرة المجتمع الميكروبي تكوين.
اختيار التكنولوجيات التسلسل الملائم توفيرها من قبل مختلف الجيل التالي التسلسل (خ ع) منصات1 يتوقف على احتياجات المستخدمين، مع العوامل الهامة بما في ذلك: التغطية المطلوبة، وطول أمبليكون، يتوقع المجتمع التنوع، فضلا عن تسلسل نسبة الخطأ، وطول القراءة، وفي التكلفة--كل--التشغيل/مجباس. هو متغير آخر يحتاج إلى النظر في التجارب المستندة إلى amplicon التسلسل سوف تفصيل ما هي الجينات، وسوف تستخدم كبسولة تفجير ما. عند تصميم أو اختيار الإشعال، كثيرا ما يجبر الباحثين جعل المفاضلات بين الطابع العالمي للتضخيم وقرار التقسيم يمكن تحقيقه من أمبليكونس الناتجة عن ذلك. ولهذا السبب، اختيار هذه الأنواع من الدراسات غالباً ما الإشعال وعلامات التي تستهدف مجموعات فرعية محددة ميكروبيومي بصورة انتقائية. تقييم تكوين المجتمعات البكتيرية شيوعاً أنجزه تسلسل واحد أو أكثر من مناطق هايبرفاريابل 16S البكتيرية الرنا الريباسي الجين2،3. في هذه الدراسة، يصف لنا أمبليكون أساس تسلسل البروتوكول وضع لمنصة خ ع تلك الأهداف 500 bp V3-V4 المنطقة الجينات الرنا الريباسي 16S البكتيرية، التي تسمح للتضخيم واسعة من الأنواع البكتيرية مع تقلب كافية لتوفير التمييز بين الأنواع المختلفة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن بسهولة أن هذا البروتوكول تطويعها للاستخدام مع مجموعات التمهيدي الأخرى، مثل تلك التي تستهدف علامة ITS2 للفطريات أو وحدة فرعية الرنا الريباسي 18S حقيقيات النوى.
بينما الآخر النهج مثل metagenomics بندقية، وميتاترانسكريبتوميكس، وتسلسل خلية واحدة، توفر مزايا أخرى بما في ذلك حل الجينومات الميكروبية والقياس المباشر أكثر من وظيفة المجتمع، هذه التقنيات عادة أكثر ووصف مكلفة ومكثفة حسابياً من التنميط النشوء والتطور هنا4. بالإضافة إلى ذلك، أداء metagenomics بندقية وميتاترانسكريبتوميكس على عينات الجذر غلة نسبة مئوية كبيرة من القراء الذين ينتمون إلى جينوم النبات المضيف، وأساليب للتغلب على هذا القيد لا يزال حاليا نمواً5،6.
كما هو الحال مع أي برنامج تجريبي، على أساس amplicon التنميط يمكن إدخال عدد من التحيزات المحتملة التي ينبغي أن ينظر فيها أثناء تحليل التصميم والبيانات التجريبية. وتشمل هذه الأساليب لجمع العينات، والحمض النووي استخراج وانتقاء من [بكر] كبسولة تفجير، وكيف يتم إعداد مكتبة. يمكن أن يؤثر تأثيراً كبيرا على كمية البيانات للاستخدام التي تم إنشاؤها بأساليب مختلفة، ويمكن أن يعوق الجهود المبذولة لمقارنة النتائج بين الدراسات. على سبيل المثال، الأسلوب لإزالة البكتيريا رهيزوسفيري7 واستخدام تقنيات الاستخراج مختلفة أو الاختيار من الحمض النووي استخراج مجموعات8،9 قد ثبت أن تأثير كبير تحليل المتلقين للمعلومات، الأمر الذي يؤدي إلى استنتاجات مختلفة فيما يتعلق بأي من الميكروبات الحاضر وعلى وفرة نسبية. حيث يمكن تخصيصها على أساس amplicon التنميط، أن إجراء مقارنات عبر الدراسات يمكن أن يكون تحديا. وقد اقترح المشروع ميكروبيومي الأرض استفادة الباحثين دراسة النظم المعقدة مثل ميكروبيومي المرتبطة بالنبات من تطوير بروتوكولات موحدة كوسيلة لتقليل التقلبات الناجمة عن تطبيق أساليب مختلفة بين الدراسات10،11. هنا، نحن مناقشة العديد من المواضيع المذكورة أعلاه وتقديم اقتراحات بشأن أفضل الممارسات بحيث المناسبة.
البروتوكول يوضح عملية جمع التربة، رهيزوسفيري، وعينات الجذر من السرغوم ذو لونين واستخراج الحمض النووي باستخدام الحمض النووي عزلة طقم راسخة11. بالإضافة إلى ذلك، لدينا بروتوكول يتضمن سير عمل تسلسل amplicon مفصلة، باستخدام منصة خ ع تستخدم عادة، لتحديد هيكل المجتمعات البكتيرية12،،من1314. وقد تم التحقق من هذا البروتوكول لاستخدامها في طائفة واسعة من مضيفي النباتات في دراسة نشرت مؤخرا من الجذور، رهيزوسفيري، والتربة المرتبطة 18 monocot الأنواع بما في ذلك السرغوم ذو لونين، ميس زيا، و قمح أيستيفوم15. هذا الأسلوب كما تم التحقق من للاستخدام مع جينات علامة أخرى، كما تجلى في التطبيق الناجح لدراسة الجينات علامة ITS2 الفطرية في دراسات الأغاف ميكروبيومي16،17 والفراولة ميكروبيومي 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-جمع وفصل من الجذر اندوسفيري، رهيزوسفيري، وعينات من التربة
- قبل الدخول إلى الميدان، اﻷوتوكﻻف الماء عالي النقاوة (على الأقل 90 مل مياه كل عينة) لتعقيم. إعداد الهوائي إزالة المخزن المؤقت (على الأقل 25 مل كل عينة) عن طريق إضافة 6.75 ز خ2ص4و 8.75 ز ك2هبو41 مل من X-100 تريتون، إلى 1 لتر الماء المعقم. تعقيم المخزن المؤقت باستخدام عامل تصفية فراغ مع 0.2 حجم المسام ميكرومتر.
- للحصول على خطوات 1.2 إلى 1.5 ارتداء قفازات نظيفة معقمة مع الإيثانول في جميع الأوقات واستبدال القفازات بين كل عينة لمنع التلوث. تعقيم جميع المعدات مع الإيثانول 70% ومسح تنظيف جميع المعدات بين العينات. قبل أخذ العينات، تحديد عمق العينة المثلى للتجربة، وتكون متسقة مع جميع مجموعات التربة والجذر.
- لجمع عينات التربة السائبة، استخدم جامع أساسية الإيثانول تعقيم تربة للحصول على التربة التي خالية من جذور النباتات بتجميع نواة تقريبا من 23 إلى 30 سم من قاعدة النبات.
- نقل التربة بكيس من بلاستيك وتجانسه التربة التي تهز لطيف ونقل قاسمة عينة التربة (حوالي 600 مغ) لملء أنبوب 2 مل واحد. فورا وضع أنبوب 2 مل على الثلج الجاف أو فلاش تجميد الأنبوب في سائل ن2 حتى على استعداد للمضي قدما في استخراج الحمض النووي (الخطوة 2).
- في بعض البيئات، التربة المحيطة بها يمكن أن تحتوي على المواد النباتية. في هذه الحالة، استخدم غربال معقمة 2 مم لفصل الحطام النبات من التربة قبل وضعها في الكيس من البلاستيك.
- جمع الجذر ورهيزوسفيري، استخدم مجرفة تعقيم الإيثانول لحفر المصنع، مع الحرص على الحصول على قدر من الجذر ممكن. العمق مرهون بالمصنّع. في حين يمكن إزالة النباتات الصغيرة مثل القمح بحفر عدة سنتيمترات، قد تتطلب أكبر من النباتات مثل الذرة 30 سم أو أكثر. بلطف التخلص من التربة الزائدة من الجذور حتى يكون هناك حوالي 2 ملم تربة الانضمام إلى سطح الجذر.
ملاحظة: العناية عند العمل مع محطات صغيرة، ذات الجذور الهشة، أو في التربة الجافة، والطين عالية المحتوى. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن يكون هناك فقط طبقة رقيقة من التربة المتبقية على الجذور بعد الهز. إذا بقيت مجاميع كبيرة من التربة، يمكن استخدام مطرقة مطاطية لإزاحة التربة بلطف ضرب القاعدة لتبادل لإطلاق النار. إذا تجاوزت كمية التربة المتبقية بعد هذه العملية أو يقصر عن 2 مم، الجدير بسماكة تقريبية. - للمنشآت الكبيرة، استخدام مقص معقم و/أو مقص لقص فقرة تمثيلية من جذورها ووضع حد أدنى من 500 ملغ أنسجة الجذر في قنينة مخروطية 50 مل. للأعشاب أصغر، وضع النظام بأكمله الجذر إلى القنينة. إضافة المخزن المؤقت لإزالة الهوائي ما يكفي تغطية الجذور، ثم وضع العينة فورا على الثلج الجاف أو فلاش تجميد العينة في سائل ن2.
ملاحظة: الحرص على عدم أوفيرفيل القنينة المخروطية 50 مل، أنها سوف تجعل الغسيل خطوة صعبة. ينبغي أن تكون هناك مساحة فارغة كافية يكون المخزن المؤقت الهوائي قادرة على التدفق إلى الأسفل وتحيط الجذور في جميع أنحاء القنينة، وتغطية الأعلى. نظراً لأن بعض الأعشاب قد الكتلة الأحيائية الجذرية أكثر مما تحتويه في قنينة مخروطية 50 مل، ينبغي أن تجمع فرعي من الجذور. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن قطع الجذور يمكن أن تؤدي إلى بكتيريا اندوفيتيك التي يجري غسلها في الكسر رهيزوسفيري، وينبغي التقليل من ذلك كسر الجذور. إذا لم تتم معالجة العينات مباشرة بعد عودته إلى مختبر، يمكن تخزينها في-80 درجة مئوية. - فصل في رهيزوسفيري من الجذور، إذابة العينة الجذر على الجليد، ثم sonicate في نماذج الجذر عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة مع البقول من 160 ث ل 30 s، فصلها بنقل س. 30 الجذور في برود (4 درجة مئوية)، وتنظيف 50 مل الأنبوبة باستخدام الملقط العقيمة. عدم التصرف في الأنبوب الأصلي مع المخزن المؤقت، والتربة، وهو الكسر رهيزوسفيري (الشكل 1).
- الطرد المركزي الأنبوب الذي يحتوي على المخزن المؤقت ورهيزوسفيري لفلاش 10 دقيقة عند 4 درجة مئوية، 4,000 س زاي صب المادة طافية، تجميد الأنبوب الذي يحتوي على الكسر رهيزوسفيري في السائل ن2، وتخزين الكسر رهيزوسفيري في-80 درجة مئوية حتى على استعداد للمضي قدما مع الحمض النووي استخراج (الخطوة 2).
- لتغسل الجذور، إضافة حوالي 20 مل الماء المعقم المثلجة (4 درجة مئوية) إلى الكسر الجذري. تغسل الجذرية التي تهز بقوة (باليد أو خلاط، ل s 15-30)، ومن ثم استنزاف المياه.
- كرر هذه الخطوة مرتين على الأقل، حتى لا يزال أي التربة على سطح الجذر. إذا كان لا يتم استخراج الحمض النووي (الخطوة 2) فورا، التفاف الجذور في رقائق الألومنيوم العقيمة، فلاش تجميد الجذور في سائل ن2، وتخزين العينات في-80 درجة مئوية حتى على استعداد للمضي قدما في استخراج الحمض النووي.
2. استخراج الحمض النووي
ملاحظة: في جميع أنحاء الخطوات 2 و 3، قفازات نظيفة معقمة مع الإيثانول يجب أن تلبس في جميع الأوقات وجميع الأعمال ينبغي أن يقوم على سطح تعقيمها مع الإيثانول.
- استخراج الحمض النووي من عينات التربة ورهيزوسفيري.
- استخدام ملعقة معقمة بسرعة نقل 250 ملغ من التربة ورهيزوسفيري من الخطوات 1.3 و 1.7 إلى أنابيب مجموعة منفصلة قدمت في مجموعة عزل الحمض النووي تجاري المصممة للاستخراج من التربة، ثم المضي في عزل الحمض النووي باستخدام مجموعة المورد البروتوكول.
- بعد التينج تخزين الحمض النووي في المخزن المؤقت المقدمة من عدة عزل الحمض النووي، شطف الحمض النووي في-20 درجة مئوية حتى على استعداد للمضي قدما في الخطوة 3.
- استخراج الحمض النووي من عينات الجذر.
- البرد تعقيم قذائف الهاون والمدقة باستخدام سائل ن2. قياس بملغ 600 إلى 700 من أنسجة الجذر ووضع الأنسجة في الهاون. بعناية، إضافة كافية السائل ن2 لتغطية الجذور.
- طحن الجذور إلى قطع صغيرة. تستمر عملية إضافة السائل ن2 وطحن (مرتين على الأقل، تكون متسقة بين العينات)، حتى تكون الجذور مسحوق ناعم. ضمان أن الأنسجة الجذرية لا ذوبان الجليد أثناء هذه الخطوة.
تحذير: استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة (معطف مختبر والنظارات الواقية والقفازات المبردة) عندما تعمل مع سائل ن2.
ملاحظة: لاستخراج الحمض النووي منخفضة جودة، يمكن أن تكون مفيدة طحن الجذور الزائدة إلى مسحوق وتخزين المسحوق في-80 درجة مئوية. - بسرعة، يبدأ مسحوق قبل الجذر لذوبان الجليد، واستخدام ملعقة عقيمة لنقل مسحوق الجذر إلى أنابيب قبل وزنه 1.5 مل على الجليد. سجل وزن الأنبوبة ومسحوق. عادة، يتم نقل 300-400 ملغ مسحوق.
- استخدام ملعقة معقمة بسرعة نقل 150 ملغ مسحوق الجذر إلى أنبوب جمع المنصوص عليها في مجموعة عزل الحمض النووي تجاري المصممة للاستخراج من التربة، ثم المضي في عزل الحمض النووي باستخدام بروتوكول مجموعة المورد.
ملاحظة: بعض العينات الجذر، يمكن أن يكون تركيز عال من المواد العضوية المتبقية في بيليه الحمض النووي، مما يحول دون تضخيم الحمض النووي خلال PCR، خصوصا عندما بروتوكول استخراج الحمض النووي مختلفة (على سبيل المثال-، استخراج كتاب) يستخدم. إذا لزم الأمر، بتنظيف الحمض النووي باتباع الإرشادات المتوفرة في مجموعة أدوات تنظيف الحمض النووي البيئية.
- قياس تركيز جميع عينات من الحمض النووي من فلوروميتير benchtop حساسية عالية باستخدام.
- إضافة 1-20 ميليلتر من كل عينة الحمض النووي التيد داخل أنابيب المقدمة في أدوات تحليل حساسية عالية دسدنا. إضافة حل عملي فلوروميتير (1: 200 صبغ: المخزن المؤقت) ما يصل إلى 200 ميليلتر.
- إعداد اثنان أنابيب إضافية تحتوي على 10 ميليلتر من الحمض النووي 1 القياسية (0 نانوغرام/ميليلتر الحمض النووي) أو 10 ميليلتر من 2 القياسية (100 نانوغرام/ميليلتر)، وإضافة ميليلتر 190 fluorometer العامل الحل لكل معيار.
- قياس تركيز المعايير وكل عينة. إذا لم يتم ذلك تلقائياً، احسب تركيز الحمض النووي من إخراج امتصاص بانحدار خطي اثنين من المعايير.
3-أمبليكون المكتبة إعداد وتقديم
- قم بإعداد مواد لرد فعل التضخيم.
- ذوبان الجليد عينات من الحمض النووي في 4 درجات مئوية وإبقائهم على الجليد في الخطوة 3. بطريقة عشوائية على نظام عينات الحمض النووي للتقليل من التحيز بسبب الموقع على لوحة بكر (الجدول 2).
- في صفيحة بكر 96، حسنا، تمييع الحمض النووي من كل عينة في الماء الجزيئية الصف إلى 5 نانوغرام/ميليلتر في إجمالي حجم 20 ميليلتر. إضافة 20 ميليلتر الجزيئية الصف المياه إلى الآبار الزوايا الأربع كعناصر سلبية للتضخيم (فراغات) (الجدول 2).
- ترتيب الإشعال المراقب (10 ميكرومتر) في أنابيب قطاع بكر أو لوحة 96-جيدا أن يمكن إضافتها مع ماصة متعدد القنوات (الشكل 2).
- إعداد كاف بكر مزيج الرئيسي تضخيم كل عينة الحمض النووي في ثلاث نسخ. إعداد 1.5 ميليلتر لجيش صرب البوسنة (20 ملغ/مل)، ميليلتر 37.5 مسبقة الصنع 2 x ميكس الرئيسية (تتألف من المخزن المؤقت بكر مجكل2، دنتبس و بوليميراز الدنا بوليميراز)، 0.57 ميليلتر من بلاستيدات الخضراء السلطة الوطنية الفلسطينية (100 ميكرومتر)، 0.57 ميليلتر من السلطة الوطنية الفلسطينية المتقدرية (100 ميكرومتر)، و 25.86 ميليلتر من الماء الصف الجزيئية.
- صب المزيج الرئيسي إلى 25 مل عقيمة من خزان ماصة متعددة القنوات وتوزيع ميليلتر 66 من مزيج الرئيسي في كل بئر من صفيحة بكر 96-بئر جديدة استخدام ماصة متعددة القنوات.
ملاحظة: عند حساب حجم الكاشف لمزيج الرئيسي، تأكد من أيضا تشمل 4 آبار فارغة للوحة الواحدة. - استخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 6 ميليلتر من 5 نانوغرام/ميليلتر الحمض النووي (من لوحة الحمض النووي تم تسويتها) على اللوحة الرئيسية ميكس. ثم إضافة إلى ميليلتر اللوحة الرئيسية 1.5 من 10 ميكرون التمهيدي إلى الأمام كل عمود رمز شريطي مختلفة إلى الأمام، وميليلتر 1.5 من 10 ميكرون عكس التمهيدي كل صف له رمز شريطي عكس مختلفة (الشكل 2) له.
ملاحظة: قبل إضافة كبسولة تفجير، لوحات تجارب معشاة ومزيج الرئيسي يمكن لتضخيم الجينات الفطرية للبحث عن أو ITS2 إذا أضيفت الإشعال المختلفة. إذا كان هذا هو الحال، يمكن استخدام تصميم التمهيدي مماثلة. - تدور أسفل اللوحة بإيجاز في غ. س 3,000 استخدام ماصة متعدد القنوات المزيج بلطف، ثم تقسم إلى ثلاث لوحات مع 25 ميليلتر من خليط رد فعل.
ملاحظة: على الرغم من أن replicates الثلاثة ليست ضرورية تماما، فإنه يقلل تأثير التغير التقني.
- تضخيم الحمض النووي في كل لوح باستخدام ثيرموسيكلير للشروط التالية: 180 s عند 98 درجة مئوية، 30 دورات من: 98 درجة مئوية ل 45 s (يشوه)، 78 درجة مئوية لمدة 10 ق (السلطة الوطنية الفلسطينية الصلب)، 55 درجة مئوية مقابل 60 s (التمهيدي الصلب)، و 72 درجة مئوية ل 90 s (ملحق) ، 600 ثم اضغط s عند 72 درجة مئوية، يليه 4 درجات مئوية بخطوة. بعد التضخيم، تجمع ثلاث لوحات نسخ متماثل إلى لوحة 96-بئر واحدة واحدة.
- تحديد كمية الحمض النووي باستخدام الكواشف fluorometer حساسية عالية في قارئ لوحة 96-جيدا.
- إضافة 2 ميليلتر لكل منتج PCR ميكروسكوبية 96، حسنا، جنبا إلى جنب مع ميليلتر 98 fluorometer العامل الحل (1: 200 صبغ: المخزن المؤقت). وتشمل 4 آبار كمعايير: 5 ميليلتر من الحمض النووي 1 القياسية (من 0 نانوغرام/ميليلتر الحمض النووي)، ميليلتر 1 2 القياسية (10 نانوغرام/ميليلتر) و 2 ميليلتر من 2 قياسية (20 نانوغرام/ميليلتر) 5 ميليلتر من 2 القياسية (50 نانوغرام/ميليلتر). قم بإضافة فلوروميتير حل عملي لوحدة تخزين نهائي من 100 ميليلتر.
ملاحظة: كل عينة يمكن أن تقاس باستخدام فلوروميتير benchtop كما هو موضح في الخطوة 2، 3 إذا لم يتوفر قارئ لوحة. - احسب تركيز الحمض النووي من إخراج امتصاص بانحدار خطي للمعايير الأربعة.
- للمراقب بنجاح تضخيم تجمع المنتجات (تلك التي تحتوي تركيز أكبر من 15 نانوغرام/ميليلتر)، 100 نانوغرام لكل عينة في أنبوب واحد 1.5 مل (الجدول 2).
- حساب متوسط حجم العينات إضافة إلى التجمع باستخدام الدالة =AVERAGE() في برنامج جدول بيانات. إضافة حجم منتجات PCR "فارغة" للعينات المجمعة.
ملاحظة: نظراً لمنتجات PCR "فارغة" تركيبات الباركود الفريدة الخاصة بهم، يمكن متسلسلة للتحقق من وجود أي ملوثات المختبر.
- إضافة 2 ميليلتر لكل منتج PCR ميكروسكوبية 96، حسنا، جنبا إلى جنب مع ميليلتر 98 fluorometer العامل الحل (1: 200 صبغ: المخزن المؤقت). وتشمل 4 آبار كمعايير: 5 ميليلتر من الحمض النووي 1 القياسية (من 0 نانوغرام/ميليلتر الحمض النووي)، ميليلتر 1 2 القياسية (10 نانوغرام/ميليلتر) و 2 ميليلتر من 2 قياسية (20 نانوغرام/ميليلتر) 5 ميليلتر من 2 القياسية (50 نانوغرام/ميليلتر). قم بإضافة فلوروميتير حل عملي لوحدة تخزين نهائي من 100 ميليلتر.
- قياس تركيز المنتج المجمعة باستخدام فلوروميتير benchtop كما هو موضح في الخطوة 2، 3، وتأخذ 600 نانوغرام من الحمض النووي وتمييع في الماء الجزيئية الصف إلى وحدة تخزين نهائي من 100 ميليلتر في أنبوب 1.5 مل. تخزين المنتج المجمعة المتبقية في-20 درجة مئوية.
- يغسل الحمض النووي نغ 600 الكوة باتباع عملية تنقية PCR المقررة مع التنقية باراماجنيتيك الخرز في شكل 96-جيدا مع بعض الاستثناءات القليلة.
- جعل ميليلتر 600 جديدة الكوة من الإيثانول 70%. يهز زجاجة الخرز المغناطيسي إعادة تعليق الخرز التي تترسب في القاع.
- إضافة 1 x حجم (100 ميليلتر) الحل حبة إلى قاسمة نغ 600 من الحمض النووي. مزيج دقيق من بيبيتينج 10 مرات. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- ضع الأنبوب على موقف المغناطيسي ل 2 دقيقة (أو حتى الحل الواضح) لفصل حبات من الحل. بينما لا يزال الأنبوب الوقوف المغناطيسي ونضح المادة طافية واضحة بعناية دون لمس الخرز المغناطيسية، وتجاهل المادة طافية واضحة.
ملاحظة: عند هذه النقطة، المنتجات أمبليكون بد أن الخرز المغناطيسية. أي الخرز التي مطمح الانزعاج أو فقدت خلال سيؤدي إلى فقدان الحمض النووي. - ترك الأنبوب في موقف المغناطيسية وإضافة 300 ميليلتر من الإيثانول 70% إلى الأنبوب؛ احتضان في درجة حرارة الغرفة ل Aspirate س. 30 الإيثانول وتجاهل. كرر هذه العملية، وإزالة جميع الإيثانول بعد الغسيل الثاني. إزالة الأنبوب من موقف المغناطيسية، والهواء الجاف لمدة 5 دقائق.
- إضافة 30 ميليلتر من الماء الجزيئية الصف الخرز المجففة ومزيج من بيبيتينج 10 مرات. احتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 2 عودة الأنبوب بالحامل المغناطيسي لمدة 1 دقيقة لفصل الخرز من الحل. نقل النذرة بأنبوب جديد.
ملاحظة: المغناطيسي الخرز لن يؤثر على ردود فعل المتلقين للمعلومات.
- قياس تركيز النهائي لتنظيفها، والحمض النووي المجمعة باستخدام فلوروميتير benchtop كما هو موضح في الخطوة 2، 3. يضعف قاسمة إلى 10 نانومتر في حجم نهائي 30 ميليلتر، أو لتركيز وحجم المفضل من قبل مرفق التسلسل.
- الاستعانة بخدمات مرفق التسلسل لتسلسل الحمض النووي على منصة خ ع، 2 × 300 bp إقران نهاية التسلسل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ينبغي أن يؤدي تنفيذ البروتوكول الموصى بها في مجموعة بيانات المفهرسة يقرأ نهاية الاقتران يمكن مطابقة مرة أخرى لكل عينة وتم تعيينها إلى أما البكتيريا الوحدات التصنيفية التشغيلية (أسامة) أو متغير التسلسل الدقيق (ESV، كما يشار إلى أمبليكون تسلسل البديل (ASV) ووحدة تصنيفية سوبوبيراشونال (سوتو))، اعتماداً على تحليل المتلقين للمعلومات. من أجل الحصول على بيانات عالية الجودة التسلسل، يجب الحرص في كل خطوة الحفاظ على الاتساق بين العينات والتقليل من إدخال أي تحيز محتمل أثناء تجهيز العينة أو إعداد المكتبة. بعد جمع، معالجة، واستخراج الحمض النووي من عينات (الخطوات 1 و 2)، يجب أن تظهر النذرة الناتجة واضحة وخالية من المواد العضوية التي سوف تمنع التضخيم. في حين يمكن التحقق من النقاء بقياس كل عينة الحمض النووي عن طريق جهاز المطياف الضوئي ميكروفولومي، وقد وجدنا أن التربة طقم استخراج الحمض النووي موثوق بإزالة جميع الملوثات. نتيجة لنوعية الحمض النووي يمكن التنبؤ بها وأساليب القياس الكمي التي تعتمد على الأصباغ المستندة إلى الأسفار التي تربط الحمض النووي على وجه التحديد أكثر ملاءمة من تلك التي تستند إلى الأشعة فوق البنفسجية امتصاص19،،من2021. قبل [بكر] تضخيم، متوسط عينات التربة ورهيزوسفيري حوالي 10 نانوغرام/ميليلتر الحمض النووي، بينما عينات الجذر وعادة ما يكون تركيز يعني من حوالي 30 نانوغرام/ميليلتر (الجدول 2).
بعد تضخيم الحمض النووي البيئية (الخطوة 3)، يمكن تحديد نجاح أو فشل بقياس تركيز المنتج بكر عبر benchtop fluorometer الكواشف على قارئ لوحة، إذا كانت متوفرة، أو يدوياً (الجدول 2). في تجربتنا، تسفر عن إيضاحات مسهبة الناجحة التي تسفر عن بيانات عالية الجودة أمبليكون أكبر من 15 من منتجات PCR نانوغرام/ميليلتر. إذا كانت هناك إخفاقات متعددة في لوحة، الترتيب الموضعية داخل المصنع ونوع عينة من العينات الفاشلة قد تساعد على تحديد المشكلة. على سبيل المثال، إذا كانت كل المتاخمة على اللوحة، قد يشير إلى خطأ ماصة، بينما إذا كانوا جميعا في نفس الصف أو العمود، يمكن أن تشير القضايا مع تمهيدي محددة. لو أنهم جميعا ينتمون إلى نفس نوع العينة، قد توحي مشاكل تجهيز العينة أو استخراج الحمض النووي.
من المهم التحقق من المحميات العالمية التوافق مع بيوينفورماتيكالي نظام النباتات المحددة الخاصة بك أثناء التصميم التجريبي للتحقق من أنها ستعوق التضخيم بلاستيدات الخضراء وجينات الميتوكوندريا 16S. عقب الخطوة التضخيم، ليس من الواضح ما إذا كان المحميات ملزمة بنجاح إلى الميتوكوندريا وقوالب بلاستيدات الخضراء؛ وكشف هذا هو فقط بعد التسلسل (الشكل 3). للمساعدة في ضمان أن المحميات وسوف تعوق بشكل فعال التضخيم الملوث، محاذاة لتسلسل السلطة الوطنية الفلسطينية لكل بلاستيدات الخضراء والجينات الرنا الريباسي 16S الميتوكوندريا (قد يكون هناك نسخ متعددة) للمصنع المضيف قيد التحقيق لا ينبغي أن تكشف أي عدم التطابق . عدم تطابق واحد حتى لتسلسل السلطة الوطنية الفلسطينية bp 13، لا سيما في وسط المشبك السلطة الوطنية الفلسطينية، يمكن تخفيض جذري الفعالية، كما هو الحال في قضية تسلسل السلطة الوطنية الفلسطينية قدمت بلاستيدات الخضراء والجينات الرنا الريباسي 16S بلاستيدات الخضراء خس ساتيفا (الخس) ( 3 الشكل).
حيث يتم تجميع مبلغ مساو من تضخيم الحمض النووي كل عينة، هناك ينبغي عدد القراءات تقريبا حتى الحصول على كل عينة بعد ترتيب وفرز ما يلي: استناداً إلى مؤشر المراقب (الشكل 4). يجب أن تتطابق مع معظم هذه القراءات للأصناف البكتيرية. أي حقيقية النواة، الميتوكوندريا، أو يجب أن يتم تجاهل مباريات بلاستيدات الخضراء. اعتماداً على تحليل خطوط الأنابيب وقاعدة البيانات التصنيفية المختارة، بلاستيدات الخضراء ويقرأ المتقدرية يمكن عن طريق الخطأ أن تسند إلى السلالات البكتيرية، غالباً ما البكتيريا الزرقاء و ريكيستيا، على التوالي (الشكل 3). درجة من curation اليدوي في كثير من الأحيان حكيمة للتحقق من هذه التعيينات سوء المشتركة. تفاصيل محددة سيعتمد على اختيار التحليل، ولكن ملامح الوفرة النسبية ينبغي عموما أن تكون مماثلة (لا يوجد فرق كبير) بين replicates البيولوجية وتختلف اختلافاً كبيرا بين التربة ورهيزوسفيري، وعينات الجذر (الرقم 5 ). من المهم أن نلاحظ، مع ذلك، أنه بينما قد يكون هناك لا يوجد فرق كبير بين replicates البيولوجية، من المهم لجمع مالا يقل عن ثلاثة replicates كل.
أساليب لتفسير البيانات التي تم الحصول عليها في هذه التجارب هي مناقشات حامية بين علماء البيئة الميكروبية. وحتى وقت قريب، تم تحليل تسلسل amplicon تعتمد على تجميع ما يلي في OTUs. ومع ذلك، هذه إشكالية لأن: 1) أنها تستند إلى عتبة اعتباطيا إلى حد ما من التشابه 97%، وغالباً ما يتم التقليل من 2) التنوع، ويمكن 3) هناك قرار التصنيفية منخفضة. مؤخرا الأدوات المتقدمة مثل DADA2 و Deblur UNOISE222،،من2324 قادرون على فرز ما يلي إلى اسفس، الذي يحل بعض المشاكل عند استخدام OTUs. وتشمل المحاذير لاستخدام اسفس: زيادات 1) الاصطناعية في التنوع نظراً للاختلافات في نسخ الرنا الريباسي داخل الأنواع، و 2) زيادة الحساسية لبكر وتسلسلها أخطاء25،26.
رقم 1: الفصل بين الكسور الجذرية ورهيزوسفيري- مخطط انسيابي عرض الخطوات اللازمة لفصل في رهيزوسفيري من العينات الجذر، تليها غسل الجذور بالماء المعقم لإزالة أي الكائنات رهيزوبلاني المتبقية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: مثال على تخطيط الأسهم التمهيدي للتضخيم والتوزيع داخل لوحات. يمكن إعداد المخزون الإشعال (الجدول 1) في قطاع أنابيب التوزيع الأمثل داخل لوحات 96-جيدا (كل قطاع من الإشعال يتم تمثيله بلون مختلف؛ والأرجواني للإشعال إلى الأمام 1-8، الأمام اللون البرتقالي لكبسولة تفجير الأزرق 9-16، لعكس الإشعال 1-12 ، والأخضر لعكس كبسولة تفجير 13-16.) في هذه الحالة، الإشعال عكس الأمام و 16 16 يمكن توزيعها كفاءة مع ماصة متعدد القنوات أن كل جيدا لديه مجموعة فريدة من نوعها باركود. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: النتائج التي تشير إلى بلاستيدات الخضراء السلطة الوطنية الفلسطينية غير نافذ. الممثل نتيجة من رهيزوسفيري ("Rhizo")، والجذرية، وعينات التربة من الخس غير المعالجة (NT) أو تعامل (فاتو) مع تعديل تربة بيولوجية. تسلسل السلطة الوطنية الفلسطينية استخدمت لمنع تلوث بلاستيدات الخضراء لمعظم النباتات هي جكتكاكككتجاكاج27. ومع ذلك، الخس يحتوي على عدم تطابق في الجينات الحمض النووي الريبي الريباسي 16S بلاستيدات الخضراء (جكتكاكتيكتجاكاج). وهذا يجعل من غير فعال، مما أدى وفرة نسبية عالية من القراءات التي تطابق للبكتيريا الزرقاء في عينات رهيزوسفيري والجذر إلى السلطة الوطنية الفلسطينية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: التوزيع لقراءة التهم بين العينات في مكتبة- قراءة مخطط شريط يظهر عدد من التهم المحور (ص) من عينات مختلفة (أشرطة، المحور س)، يقابله الجمع بين الرمز الشريطي في القراءة. عدد القراءات كل عينة يمكن أن تختلف استناداً إلى كيفية العديد من العينات يتم في المكتبة؛ كان تسلسل هذه المجموعة الفرعية في مكتبة عينات 192. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: الوفرة النسبية للفئات الأعلى 12 في الجذر، رهيزوسفيري، ومجتمعات التربة- تخطيط شريطي مكدس عرض الوفرة النسبية للفئات الموجودة في dataset ممثل 16S التي تحتوي على 6 وإنشاء نسخ متماثلة لكل نوع العينة (التربة السائبة ورهيزوسفيري واندوسفيري الجذر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الجدول 1: كبسولة تفجير لتضخيم المنطقة V3-V4 الجينات الرنا الريباسي 16S- تتكون كبسولة تفجير، التتابع: محول لمنهاج مشترك خ ع، رمزاً شريطياً فريداً، التمهيدي لفئة الخدمات العامة الوطنية، ومنطقة فاصلة متغيرة الطول لإزاحة الإطار للتسلسل، وتمهيدي PCR عالمي أن يستفيض أما 341F أو 785R من الجينات الرنا الريباسي 16S. عدد الإشعال اللازمة متوقفاً على عينات كم هي متسلسلة كل مكتبة؛ مزيج من الإشعال عكس الأمام و 16 16 غير كافية لعينات 244 (256 تركيبات التمهيدي مع 12 المستخدمة للآبار فارغة خلال PCR (الشكل 2)). اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الجدول 2: تطبيع الحمض النووي العشوائية العينات قبل وبعد التضخيم. ورقة عمل المثال إدراج عينات في ترتيب عشوائي وتشير إلى موقعها على لوحة 96-بئر واحدة، الذي يحدد أيضا تركيبة التمهيدي المسندة إليها. الصيغ الموجودة في الصف السفلي تصف العمليات الحسابية لإضافة 100 نانوغرام لكل عينة للوحة طبيعية، بالإضافة إلى حجم المياه تصل إلى 20 ميليلتر. بعد التضخيم، حجم 100 نانوغرام لكل منتج ناجح هو حساب وإضافة إلى تجمع نهائي. حجم المنتج PCR "فارغة" إضافة إلى تجمع النهائي هو متوسط العينات الأخرى. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
تكميلية الشكل 1: تقدير تقريبي للكتلة الأحيائية الجذرية الحد الأدنى أثناء جمع العينات. عندما جمع الجذور، في محاولة لجمع مالا يقل عن 500 ملغ أنسجة. هنا، جمعت جذور من نبات السرغوم شباب (اليسار، في كل من A و B) ونبات أرز شباب (يمين) تظهر بجوار (A) وداخل أنابيب مخروطية الشكل (ب) 50 مل. كل العينات تزن حوالي 1 ز، ومع ذلك، من المهم أن نلاحظ أن هذا الوزن ويشمل رهيزوسفيري والجذرية، وهو وزن رهيزوسفيري، في هذه الحالة، ما يقرب من نصف إجمالي وزن. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول يوضح خط أنابيب ثابتة لاستكشاف اندوسفيري الجذر، رهيزوسفيري، وتركيبة المجتمع الميكروبي التربة، من المعاينة الميدانية لتجهيز العينات وتسلسل المتلقين للمعلومات. دراسة ميكروبيوميس المرتبطة بجذور تحديات فريدة من نوعها، يرجع جزئيا إلى الصعوبات الكامنة في أخذ العينات من التربة. التربة الغاية متغير من حيث الخصائص الفيزيائية والكيميائية، وظروف التربة المختلفة يمكن أن تكون مفصولة أقل قدر بضعة مليمترات28،29. وهذا يمكن أن يؤدي إلى العينات التي جمعت من مواقع أخذ العينات المتاخمة لها تركيبة المجتمع الميكروبية المختلفة إلى حد كبير والأنشطة30،31. وهكذا، استخدام التربة الأساسية جامعي ومعاول للحفاظ على الأعماق أخذ العينات متسقة والتجانس قبل استخراج الحمض النووي أمران أساسيان لإمكانية تكرار نتائج ضمن جذر ميكروبيومي الدراسات. من الضروري أيضا أن كفاءة فصل الكسور رهيزوسفيري والجذرية؛ استخدام طريقة قاسية لتعقيم سطح الجذر يمكن أن يحتمل أن endophytes داخل الجذور قبل استخراج الحمض النووي، بينما لا يغسل أكثر تحفظا بإزالة كل الميكروبات من سطح الجذر7. العوامل الرئيسية الأخرى التي يمكن أن تؤثر سلبا أو تعطيل تسلسل النتائج هو التلوث البكتيري، التي يمكن أن تأتي من مصادر عديدة وفي بعض الأحيان من المستحيل التمييز بين من32،عينات بيئية البكتيريا33. لهذا السبب، التعقيم حذراً من أدوات أخذ العينات والمواد التجريبية، وبيئات العمل الحيوي لتفادي التلوث.
وبعد أخذ العينات، الحصول على الحمض النووي ذات جودة عالية أولوية عالية لتحليلات المصب ناجحة. في تجربتنا، استخراج الحمض النووي من الحقل تزرع العينات الجذر من خلال طرق بديلة، مثل من خلال استخراج المستندة إلى كتاب، غالباً ما تحتوي على كميات أكبر بكثير من الأحماض الدبالية والمركبات الأخرى مقارنة بعينات rhizosphere والتربة. يمكن أن تمنع هذه المركبات النشاط الأنزيمي من بوليميريز الحمض النووي خلال التضخيم بكر، حتى في تركيزات منخفضة34،35. استخدام استخراج الحمض النووي مجموعات مصممة للتربة على عينات الجذر، بدلاً استخراج كتاب متبوعاً فينول كلوروفورم تنظيف ويمكن تخليص فعالية عينات أحماض الدبالية وسوف يسفر عن جودة عالية الحمض النووي36،37، 38،39. تبعاً لذلك، نوصي باستخدام مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي متاحة تجارياً لعينات الجذر كذلك. تجدر الإشارة إلى أن الهدف الحصول على الحمض النووي الجينوم الميكروبية من جذور النباتات. وهكذا، طحن الجذر شاملة ومتسقة مهم لكسر الأنسجة النباتية والخلايا الجرثومية للإفراج عن الحمض النووي الميكروبي دون إدخال التحيز بين العينات بسبب الاختلاف في طحن الضغط والوقت.
في أعقاب دقيق استخراج الحمض النووي من عينات، هناك مصدرين رئيسيين للمشاكل خلال التضخيم: 1) تلوث أنسجة النباتية مع اندوسيمبيونتس النباتية (بلاستيدات الخضراء والميتوكوندريا) و 2) اختيار منطقة الرنا الريباسي 16S تضخيم. التضخيم من بلاستيدات الخضراء أو الميتوكوندريا 16S توليد متواليات الرنا الريباسي > 80 ٪ متواليات في جذر عينات40وأكثر في أنسجة نبات، على الرغم من كمية التلوث يعتمد على اختيار كبسولة تفجير. وهكذا المشابك السلطة الوطنية الفلسطينية ضرورية أثناء الخطوة PCR لقمع النبات المضيف بلاستيدات الخضراء والتلوث 16S المتقدرية27،41. ومع ذلك، الأنواع النباتية المختلفة يمكن أن يكون الاختلاف في بلاستيدات الخضراء و تسلسل 16S المتقدرية27؛ ولذلك، من الضروري التأكد من تسلسل بلاستيدات الخضراء وجينات الميتوكوندريا 16S المصنع قيد الدراسة قبل ترتيب المكتبة، من أجل تحديد إذا كان هناك حاجة إلى بديل السلطة الوطنية أوليجوس (الشكل 3). بالإضافة إلى ذلك، يتكون الجين الرنا الريباسي 16S من تسع مناطق هايبرفاريابل الذي كان واقفاً إلى جانب تسع مناطق المحافظة؛ يمكن الحصول على نتائج مختلفة من المجتمع نفسه تبعاً لمنطقة هايبرفاريابل التي هي تضخيم42. وقد وجدت الدراسات السابقة منطقة V4 لتكون واحدة من الأكثر موثوقية لتعيين تصنيف43 ، وأنها قد استخدمت ل الدراسات الاستقصائية ميكروبيومي واسعة أخرى11. إطالة الهدف إلى منطقة V3-V4 المقترح هنا لزيادة تقلب وتحسين القرار التقسيمي.
في هذا البروتوكول، أثبتنا خط أنابيب إجراء تسلسل amplicon الرنا الريباسي 16S عبر تسلسل الجيل القادم (خ ع) لدراسة التراكيب المجتمع الميكروبية للعينات البيئية12. نوصي باستخدام تسلسل amplicon كأداة للتنميط النشوء والتطور، لأنها غير مكلفة نسبيا، والفائق، ولا تتطلب خبرة واسعة الحسابية أو الموارد اللازمة لتحليل. في حين لدينا أسلوب يركز على تحليل الكسر البكتيرية من ميكروبيومي، فإنه يمكن تكييفها بسهولة للتحقيق الفطريات. البروتوكول غير متطابقة من خلال الخطوة 2، والفرق الوحيد في الخطوة 3 كبسولة تفجير ما ستستخدم خلال التضخيم. بيد أنها تستحق شيئا أن أمبليكون على أساس التنميط ليس دون قيود. حسب تسلسل جين علامة واحدة، يتم الحصول على أي معلومات بشأن القدرات الوظيفية للمجتمع. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون هذا القرار التقسيمي منخفضة جداً، خاصة عند تسلسل من بيئات ذات نسبة عالية من الميكروبات أونتشاراكتيريزيد. ومع ذلك، تسلسل التكنولوجيات تتطور تطورا سريعاً، ونحن نتوقع إمكانيات للتعامل مع بعض هذه النواقص بتكييف هذا البروتوكول للاستخدام مع غيرها من منصات التسلسل. وأخيراً، كما ذكر في المقدمة، يمكن بسهولة إجراء metagenomics بندقية وميتاترانسكريبتوميكس على عينات التربة ورهيزوسفيري، ويجري حاليا استكشاف طرق للقضاء على تلوث المصنع من الأنسجة النباتية. تصاميم تجريبية فيها النهج القائم على أمبليكون زوج وغيرها من التقنيات الجينومية يمكن أن تكون فعالة بشكل خاص في المجتمعات المعقدة حيث تنوع الأنواع العالية والتمثيل غير المتكافئ للأصناف يمكن منع البيانات بندقية من دقة وصف الأقل أعضاء المهيمنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة الزراعة-جمعية الإغاثة اﻷرمنية (كريس 2030-21430-008-00D). الملخص معتمد من قبل "برنامج زمالة بحوث الدراسات العليا جبهة الخلاص الوطني".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-10/20 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-3810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5510 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000027 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes | Eppendorf | 3120000909 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 100 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000043 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1000 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1122-1830 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1620-2700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mm soil sieve | Forestry Suppliers | 60141009 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 200 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-8810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 25 mL reservoirs | VWR International LLC | 89094-664 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 50 mL conical vials | Thermo Fisher Scientific | 352098 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) | VWR International LLC | 156-4020 | |
| 96-well microplates | USA Scientific | 655900 | |
| 96-well PCR plates | BioRad | HSP9631 | |
| Agencourt AMPure XP beads | Thermo Fisher Scientific | NC9933872 | Instructions for use: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180 &documentName=B37419AA.pdf |
| Aluminum foil | Boardwalk | 7124 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Analytical scale with 0.001 g resolution | Ohaus Pioneer | PA323 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Bioruptor Plus ultrasonicator | Diagenode | B01020001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL | New England Biolabs | B9000S | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811000908 | Including 50mL and 96-well plate bucket adapters |
| Cryogenic gloves | Millipore Sigma | Z183490 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| DNeasy PowerClean kit (optional) | Qiagen Inc. | 12877-50 | Previously MoBio |
| DNeasy PowerSoil kit | Qiagen Inc. | 12888-100 | Previously MoBio |
| Dry ice | Any | NA | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Do not substitute |
| Ethanol | VWR International LLC | 89125-188 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gallon size freezer bags | Ziploc | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gemini EM Microplate Reader | Molecular Devices | EM | Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top. |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lab coat | Workrite | J1367 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 | Any | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 dewar | Thermo Fisher Scientific | 4150-9000 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Milli-Q ultrapure water purification system | Millipore Sigma | SYNS0R0WW | |
| Mini-centrifuge | Eppendorf | 5404000014 | |
| Molecular grade water | Thermo Fisher Scientific | 4387937 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Mortars | VWR International LLC | 89038-150 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Nitrile gloves | Thermo Fisher Scientific | 19167032B | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Paper towels | VWR International LLC | BWK6212 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| PCR plate sealing film | Thermo Fisher Scientific | NC9684493 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| Pestles | VWR International LLC | 89038-166 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Plastic spatulas | LevGo, Inc. | 17211 | |
| Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific | 13000014 | |
| PNAs - chloroplast and mitochondrial | PNA Bio | NA | Make sure to verify sequence bioinformatically |
| Protective eyewear | Millipore Sigma | Z759015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| Rubber mallet (optional) | Ace Hardware | 2258622 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shears or scissors | VWR International LLC | 89259-936 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shovel | Home Depot | 2597400 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Soil core collector (small diameter: <1 inch) | Ben Meadows | 221700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Spray bottles | Santa Cruz Biotechnology | sc-395278 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) | IDT | NA | 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry. |
| Thermocycler | Thermo Fisher Scientific | E950040015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Weigh boats | Spectrum Chemicals | B6001W | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
References
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
- Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic classification of environmental 16S rRNA gene sequences. ISME J. 6 (7), 1440-1444 (2012).
- Takahashi, S., Tomita, J., Nishioka, K., Hisada, T., Nishijima, M. Development of a Prokaryotic Universal Primer for Simultaneous Analysis of Bacteria and Archaea Using Next-Generation Sequencing. PLoS One. 9 (8), e105592 (2014).
- Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics. PLoS One. 9 (4), e93827 (2014).
- Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Front Plant Sci. 5, 209 (2014).
- Jiao, J. -Y., Wang, H. -X., Zeng, Y., Shen, Y. -M. Enrichment for microbes living in association with plant tissues. J Appl Microbiol. 100 (4), 830-837 (2006).
- Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Front Microbiol. 7, 773 (2016).
- Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R., Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 5709, 623-628 (2011).
- Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
- Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLoS Biol. 15 (3), e2001793 (2017).
- Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. , (2017).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform. Appl Environ Microb. 79 (17), 5112-5120 (2013).
- Degnan, P. H., Ochman, H. Illumina-based analysis of microbial community diversity. ISME J. 6 (1), 183-194 (2012).
- Naylor, D., DeGraaf, S., Purdom, E., Coleman-Derr, D. Drought and host selection influence bacterial community dynamics in the grass root microbiome. ISME J. , (2017).
- Desgarennes, D., Garrido, E., Torres-Gomez, M. J., Peña-Cabriales, J. J., Partida-Martinez, L. P. Diazotrophic potential among bacterial communities associated with wild and cultivated Agave species. FEMS Microbiol Ecol. 90 (3), 844-857 (2014).
- Coleman-Derr, D., et al. Plant compartment and biogeography affect microbiome composition in cultivated and native Agave species. New Phytol. 209 (2), 798-811 (2016).
- De Tender, C., et al. Dynamics in the Strawberry Rhizosphere Microbiome in Response to Biochar and Botrytis cinerea Leaf Infection. Front Microbiol. 7, 2062 (2016).
- Kapp, J. R., et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol. 68 (2), 111-118 (2015).
- Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
- O'Neill, M., McPartlin, J., Arthure, K., Riedel, S., McMillan, N. Comparison of the TLDA with the Nanodrop and the reference Qubit system. J Phys Conf Ser. 307 (1), 012047 (2011).
- Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Amir, A., et al. Deblur Rapidly Resolves Single-Nucleotide Community Sequence Patterns. mSystems. 2 (2), e00191-e00116 (2017).
- Edgar, R. C. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. bioRxiv. , 081257 (2016).
- Nguyen, N. -P., Warnow, T., Pop, M., White, B. A perspective on 16S rRNA operational taxonomic unit clustering using sequence similarity. NPJ Biofilms Microbiomes. 2, 16004 (2016).
- Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Holmes, S. P. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. , (2017).
- Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nat Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
- O'Brien, S. L., et al. Spatial scale drives patterns in soil bacterial diversity. Environ Microbiol. 18 (6), 2039-2051 (2016).
- Fierer, N., Lennon, J. T. The generation and maintenance of diversity in microbial communities. Am J Bot. 98 (3), 439-448 (2011).
- Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nat Rev Microbiol. 15 (10), 579-590 (2017).
- Buckley, D. H., Schmidt, T. M. Diversity and dynamics of microbial communities in soils from agro-ecosystems. Environ Microbiol. 5 (6), 441-452 (2003).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
- Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
- Sutlović, D., Definis Gojanović, M., Andelinović, S., Gugić, D., Primorac, D. Taq polymerase reverses inhibition of quantitative real time polymerase chain reaction by humic acid. Croat Med J. 46 (4), 556-562 (2005).
- Sutlovic, D., Gamulin, S., Definis-Gojanovic, M., Gugic, D., Andjelinovic, S. Interaction of humic acids with human DNA: proposed mechanisms and kinetics. Electrophoresis. 29 (7), 1467-1472 (2008).
- Aleklett, K., Leff, J. W., Fierer, N., Hart, M. Wild plant species growing closely connected in a subalpine meadow host distinct root-associated bacterial communities. PeerJ. 3, e804 (2015).
- Bogas, A. C., et al. Endophytic bacterial diversity in the phyllosphere of Amazon Paullinia cupana associated with asymptomatic and symptomatic anthracnose. Springerplus. 4, 258 (2015).
- Hiscox, J., Savoury, M., Müller, C. T., Lindahl, B. D., Rogers, H. J., Boddy, L. Priority effects during fungal community establishment in beech wood. ISME J. 9 (10), 2246-2260 (2015).
- Zhang, T., Yao, Y. -F. Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific. PLoS One. 10 (6), e0130051 (2015).
- Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. PLoS One. 8 (8), e71360 (2013).
- Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity. Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).
- Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -A. Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems. Appl Environ Microb. 80 (15), 4626-4639 (2014).
- Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -Y. Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC Bioinformatics. 17, 135 (2016).
