Summary
在这里, 我们描述了获取土壤、根际和根 endosphere 微生物的扩增子序列数据的协议。该信息可用于研究植物相关微生物群落的组成和多样性, 适合广泛的植物种类使用。
Abstract
植物宿主和相关微生物之间的密切互动对确定植物的适应性至关重要, 并能促进对非生物胁迫和疾病的耐受性提高。由于植物菌群可以是高度复杂的, 低成本, 高通量的方法, 如基于扩增子的 16S rRNA 基因测序, 往往更倾向于表征其微生物组成和多样性。然而, 在进行此类实验时, 选择适当的方法对于减少可能使样本和研究之间的分析和比较变得困难的偏见至关重要。本议定书详细描述了从土壤、根际和根样本收集和提取 DNA 的标准化方法。此外, 我们还强调了一个建立完善的 16S rRNA 扩增子测序管道, 允许探索这些样本中细菌群落的组成, 并可以很容易地适应其他标记基因。这条管道已经验证了各种植物种类, 包括高粱, 玉米, 小麦, 草莓和龙舌兰, 并可以帮助克服与植物细胞器污染相关的问题。
Introduction
植物相关的微生物由细菌、古菌、病毒、真菌和其他真核微生物组成的动态和复杂的微生物群落组成。除了它们在引起植物病害方面的良好研究作用外, 植物相关的微生物还可以通过提高对生物和非生命胁迫的耐受性, 促进养分供应, 并通过激素的生产。因此, 特殊的兴趣存在于与植物根系 endospheres、豆科和周围土壤相关联的分类。虽然有些微生物可以在实验室产生的培养基上隔离培养, 但许多人不能, 部分原因是它们可能依赖与其他微生物的共生关系, 生长非常缓慢, 或者需要在实验室环境中不能复制的条件。由于它绕过了耕种的需要, 而且相对便宜和高通量, 基于序列的环境和宿主相关微生物样本的系统发育分析已成为测定微生物群落的首选方法。组成。
不同的下一代测序平台1提供的适当排序技术的选择取决于用户的需求, 其中包括: 所需的覆盖率、扩增子长度、预期的社区多样性, 以及排序错误率, 读长, 和每运行成本/megabase。另一个需要在基于扩增子的测序实验中考虑的变量是什么基因将被放大, 以及将使用什么引物。在设计或选择底漆时, 研究人员常常被迫在放大的普遍性和由此产生的 amplicons 所能实现的分类分辨率之间做出权衡。因此, 这些类型的研究往往选择了引物和标记, 有选择地针对微生物群的特定子集。对细菌群落组成的评估通常是通过对细菌 16S rRNA 基因2、3的一个或多个高变区域进行排序而完成的。在本研究中, 我们描述了一个基于扩增子的测序协议, 它是针对 16S rRNA 基因的 500 bp V3-V4 区域而开发的, 它允许对细菌类群进行广泛的扩增, 同时也为区分不同的分类群。此外, 该协议可以很容易地适应使用其他底漆集, 如那些针对真菌的 ITS2 标志或 18S rRNA 亚单位的真核生物。
虽然其他方法, 如猎枪 metagenomics, metatranscriptomics 和单细胞测序, 提供其他优势, 包括解决微生物基因组和更直接测量社区功能, 这些技术通常更比此处描述的系统系统分析更昂贵和计算密集型4。此外, 在根样本上执行猎枪 metagenomics 和 metatranscriptomics 产生的读数占宿主植物基因组的百分比很大, 克服此限制的方法仍在开发中5,6。
与任何实验平台一样, 基于扩增子的分析可以引入一些潜在的偏差, 在实验设计和数据分析过程中应该考虑到这一点。这些方法包括样本采集、DNA 提取、PCR 引物的选择以及如何进行库准备。不同的方法可以显著地影响生成的可用数据量, 也会阻碍研究结果的比较。例如, 去除根际细菌的方法7和使用不同的提取技术或选择 DNA 提取套件8,9已被证明大大影响下游分析, 这导致不同的结论关于哪些微生物存在和他们的相对丰度。由于可以自定义基于扩增子的分析, 所以在研究中进行比较可能具有挑战性。地球微生物学项目建议, 研究复杂系统的研究人员, 如植物相关的微生物群将受益于标准化协议的发展, 作为一种手段, 以尽量减少因应用而引起的变异性研究10、11之间的不同方法。在这里, 我们讨论了以上的许多主题, 并提出了适当的最佳做法的建议。
该协议展示了从高粱双色收集土壤、根际和根样本的过程, 并使用建立良好的 dna 隔离套件11提取 dna。此外, 我们的协议还包括一个详细的扩增子排序工作流, 使用一个常用的 "通用" 平台来确定细菌群落的结构12, 13, 14.在最近发表的关于18种单子叶植物物种的根、根际和相关土壤的研究中, 本议定书已得到验证, 用于广泛的植物寄主, 其中包括高粱双色、玉米、和小麦的15。该方法也得到了验证, 以用于其他标记基因, 这表明其成功地应用于研究的真菌 ITS2 标记基因在龙舌兰微生物组学16,17和草莓微生物群18。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 根 Endosphere、根际和土壤样品的收集和分离
- 进入现场之前, 高压釜超纯水 (每样至少90毫升水) 进行杀菌。通过将6.75 克的25毫升的2PO4、8.75 克的 K2HPO4和 X-100 的1毫升, 为无菌水的1升, 准备真菌去除缓冲 (每样样品至少可达到每个采样率的约为 mL)。使用0.2 µm 孔径的真空过滤器消毒缓冲器。
- 对于步骤1.2 至 1.5, 请穿戴干净的手套, 在任何时候都用乙醇消毒, 并更换每个样品之间的手套以防止污染。用70% 乙醇消毒所有设备, 在样品间擦拭所有设备。取样前, 确定试验的最佳取样深度, 并与所有土壤和根系集合一致。
- 收集散装土壤样品, 使用乙醇灭菌土壤核心收集器获得土壤没有植物根通过收集一个核心约23至30厘米从基地的植物。
- 将土壤转移到塑料袋中, 用柔和的震动融汇土壤, 并转移土壤样品的整除 (约600毫克) 以填充2毫升管。立即将2毫升管放在干冰或闪光冷冻在液体 N2的管, 直到准备进行 DNA 提取 (步骤 2)。
- 在某些环境中, 周围土壤可以含有植物材料。在这种情况下, 使用灭菌的2毫米筛将植物碎片从土壤中分离出来, 然后放入塑料袋中。
- 收集根和根际, 使用乙醇灭菌铲挖掘植物, 照顾尽可能获得尽可能多的根。深度取决于植物。虽然像小麦这样的小植物可以通过挖几厘米来除去, 但像高粱这样的大型植物可能需要30厘米或更多。从根部轻轻地摇动多余的土壤, 直到有大约2毫米的土壤附着在根部表面。
注意: 在与小植物, 有脆弱的根, 或在干燥, 高粘土含量的土壤工作时要小心。理想情况下, 在震动后, 根上应该只有一层薄薄的土壤。如果土壤中有大量的聚集物, 橡胶槌可以用来通过轻轻地击中射击的底部来去除土壤。如果在这个过程中剩余的土壤量超过或低于2毫米, 应注意近似厚度。 - 对于大型植物, 使用无菌剪刀和/或剪刀切割一个有代表性的根分部, 并将至少500毫克的根组织放入50毫升圆锥瓶。对于较小的草, 把整个根系统放进瓶子里。添加足够的真菌去除缓冲, 以覆盖根部, 然后立即将样品放在干冰或闪光冻结的样品在液体 N2。
注意: 小心不要溢出50毫升锥形瓶, 因为它会使洗涤步骤困难。应该有足够的空空间, 使真菌缓冲能够流到底部, 围绕在整个瓶子的根, 并覆盖顶部。因为有些草的根系生物量比将其放入50毫升圆锥小瓶中要多, 所以应该收集根的一个小节。然而, 应该指出的是, 切割根可能导致内生细菌被冲出到根际的分数, 所以打破根应尽量减少。如果在返回实验室后不立即处理样品, 则可以将其存储在摄氏-80 摄氏度。 - 将根根从根部分离, 在冰上解冻根部样品, 然后将根样品在4摄氏度上油脂实验10分钟, 三十年代的脉冲为 160 W, 三十年代分离. 将根转移到冷冻 (4 °c), 清洁50毫升管使用无菌钳。不要用缓冲区和土壤来处理原始管, 这是根际分数 (图 1)。
- 离心管包含缓冲和根际10分钟在4°c, 4000 x g. 醒酒上清, 闪光冻结含有根际分数的管在液体 N2, 并存储根际分数在-80 °c, 直到准备进行 DNA提取 (步骤 2)。
- 要洗涤根, 增加大约20毫升冷 (4 °c) 不育水到根分数。用力摇动 (用手或搅拌机, 15-三十年代) 冲洗根, 然后排出水。
- 重复此步骤至少两次, 直到根表面没有土壤残留。如果不立即执行 DNA 提取 (步骤 2), 则将根包在无菌铝箔上, 在液 N2中将根部冷冻, 并将样品储存在-80 摄氏度, 直到准备好进行 DNA 提取。
2. DNA 提取
注: 在整个步骤2和3中, 应随时佩戴带有乙醇消毒的干净手套, 所有工作都应在用乙醇消毒的表面上进行。
- 从土壤和根际样品中提取 DNA。
- 使用无菌铲快速将250毫克的土壤和根际从步骤1.3 和1.7 转移到分离的收集管中提供的商业 DNA 隔离套件, 为从土壤中提取, 然后进行 DNA 隔离使用套件供应商的协议。
- 在 dna 隔离套件提供的洗脱缓冲器中, 将 dna 洗脱后, 将 dna 储存在-20 摄氏度, 直到准备好进行步骤3。
- 从根样本中提取 DNA。
- 使用液体 N2冷却灭菌砂浆和杵。测量出600至700毫克的根组织, 并将组织放入砂浆中。小心, 添加足够的液体 N2以覆盖根。
- 把树根磨成小块。继续添加液体 N2和研磨 (至少两次, 在样品之间保持一致), 直到根是细粉。确保此步骤中的根组织不会解冻。
注意: 使用适当的个人防护设备 (实验室大衣、防护眼镜和低温手套) 时, 用液体 N2。
注: 对于低质量的 DNA 提取, 可以将多余的根研磨成粉末, 并将粉末贮存在-80 摄氏度。 - 很快, 在根粉开始解冻之前, 用不育的刮刀将根粉转移到冰上预先称量的1.5 毫升管上。记录管和粉末的重量。通常, 300-400 毫克的粉末转移。
- 使用无菌刮刀快速将150毫克的根粉转移到用于从土壤中提取的商业 dna 隔离套件中提供的收集管, 然后使用套件供应商的协议进行 DNA 隔离。
注: 对于一些根样本, 可能存在高浓度的有机物残留在 dna 颗粒中, 这防止了 dna 在 PCR 过程中的扩增, 特别是当使用不同的 dna 提取协议 (e. g, CTAB 提取)。如有必要, 按照环境 dna 清理试剂盒中提供的指示清洁 dna。
- 使用高灵敏度台式荧光计测量所有 DNA 样品的浓度。
- 将每个洗脱 DNA 样本的 1-20 µL 添加到 dsDNA 高灵敏度检测试剂盒中的管中。添加荧光计工作解决方案 (1:200 染料: 缓冲器) 高达200µL。
- 准备两个额外的管, 包含10µL dna 标准 1 (0 ng/µL dna) 或10µL 的标准 2 (100 ng/µL), 并增加190µL 的荧光计工作解决方案, 每个标准。
- 测量标准和每个样品的浓度。如果不自动完成, 则通过两个标准的线性回归计算从吸光度输出中的 DNA 浓度。
3. 扩增子图书馆的准备和提交
- 为放大反应设置材料。
- 将 DNA 样品解冻4摄氏度, 在步骤3中将其保持在冰上。随机的 DNA 样本的顺序, 以尽量减少偏倚, 由于在 PCR 板上的位置 (表 2)。
- 在96井 PCR 盘中, 从分子级水中的每样样品中稀释 DNA 到5µL, 总容积为20µL. 将20µL 的分子级水添加到四角井, 作为放大 (空白) 的负控制 (表 2)。
- 将条形码底漆 (10 µM) 排列在 PCR 条管或96井板中, 这样可以添加多通道吸管 (图 2)。
- 准备足够的 PCR 大师组合, 以三种方法放大每个 DNA 样本。准备1.5 µL 的 BSA (20 毫克/毫升), 37.5 µL 预先制作的2x 主混合 (由 PCR 缓冲器、氯化镁2、dNTPs 和Taq DNA 聚合酶)、0.57 µL 叶绿体肽 (100 µM)、0.57 µL 线粒体肽 (100 µM) 和25.86 µL 分子级水组成。
- 将主混合倒入一个无菌的25毫升多通道的吸管库中, 将66µL 的主混合分布到一个新的96井 PCR 板中, 使用多通道吸管。
注: 在计算主混合试剂卷时, 请确保还包括每板4个空白井。 - 使用多通道吸管, 添加6µL 5 ng/µL dna (从规范化的 dna 板块) 到主混合板。然后添加到主板1.5 µL 10 µM 向前底漆, 使每列有一个不同的前向条码, 1.5 µL 10 µM 反向底漆, 使每行有一个不同的反向条码 (图 2)。
注: 在添加底漆之前, 如果添加了不同的引物, 可使用随机板和主混合体放大其或 ITS2 真菌基因。如果是这种情况, 可以使用类似的底漆设计。 - 简单地在 3000 x g 下旋转盘子. 使用多通道吸管轻轻混合, 然后分成三个板块, 25 µL 反应混合物。
注意: 虽然三的复制不是严格必要的, 但它减少了技术变异性的影响。
- 用 thermocycler 设置到以下条件的每个板块中的 DNA 放大: 180s 在98°c, 30 个周期:98 °c 为四十五年代 (变性), 78 °c 为十年代 (肽退火), 55 °c 为六十年代 (底漆退火) 和72°c 为九十年代 (引伸), 然后600s 在72摄氏度之后, 4 摄氏度保持一步。放大后, 将三个复制板放入一个单一的96井板中。
- 用高灵敏度的荧光计试剂在96井板阅读器中量化 DNA。
- 将每种 PCR 产品的2µL 添加到96井微板块, 连同98µL 荧光计工作溶液 (1:200 染料: 缓冲器)。包括4井作为标准: 5 µL 脱氧核糖核酸标准 1 (0 ng/µL 脱氧核糖核酸), 1 µL 标准 2 (10 ng/µL), 2 µL 标准 2 (20 ng/µL), 5 µL 标准 2 (50 ng/µL)。然后添加荧光计工作解决方案, 最终体积为100µL。
注意: 如果无法使用台式荧光计, 可以用步骤2.3 中的描述来测量每个样本。 - 用四标准的线性回归计算从吸光度输出中的 DNA 浓度。
- 对于成功放大的条形码产品 (那些浓度大于 15 ng/µL), 每个样品的池 100 ng 成一个1.5 毫升管 (表 2)。
- 使用电子表格程序中的 = 平均值 () 函数计算添加到池中的样本的平均体积。将 "空白" PCR 产品的体积添加到汇集的样品中。
注: 由于 "空白" PCR 产品有自己独特的条码组合, 他们可以测序检查任何实验室污染物。
- 将每种 PCR 产品的2µL 添加到96井微板块, 连同98µL 荧光计工作溶液 (1:200 染料: 缓冲器)。包括4井作为标准: 5 µL 脱氧核糖核酸标准 1 (0 ng/µL 脱氧核糖核酸), 1 µL 标准 2 (10 ng/µL), 2 µL 标准 2 (20 ng/µL), 5 µL 标准 2 (50 ng/µL)。然后添加荧光计工作解决方案, 最终体积为100µL。
- 使用步骤2.3 中描述的台式荧光计测量聚集产品的浓度, 并将600的 DNA 和稀释在分子级水中, 在1.5 毫升管中的最终体积为100µL。将剩余的共用产品存储在摄氏-20 摄氏度。
- 以96井格式的顺磁性纯化珠为整除, 通过以下几种例外的方法, 清洗 600 ng DNA。
- 做一个新鲜的600µL 整除70% 乙醇。摇一瓶磁性珠子, 重新悬挂沉淀到底部的珠子。
- 添加1x 体积 (100 µL) 的珠溶液到600整除的 DNA。彻底混合吹打10次。室温下孵育5分钟。
- 将管子放在磁支架上2分钟 (或直到溶液清晰), 将珠子与溶液分开。当管仍在磁性支架上时, 小心地吸清上清, 而不接触磁性珠子, 并丢弃清上清液。
注: 在这一点上, 扩增子产品绑定到磁性珠子。任何在吸入过程中受到干扰或丢失的珠子都会导致 DNA 丢失。 - 将管放在磁支架中, 将300µL 70% 乙醇添加到管中;在室温下孵化三十年代. 取出乙醇并丢弃。重复这一过程, 并删除所有的乙醇后, 第二次清洗。从磁支架上取下管子, 空气干燥5分钟。
- 将30µL 的分子级水添加到干珠中, 然后吹打10次混合。在室温下孵育2分钟. 将管子回磁支架1分钟, 将珠子从溶液中分离出来。把洗脱液转移到新的管子上。
注: 磁性珠子不会影响下游反应。
- 使用步骤2.3 中描述的台式荧光计测量清洁的、汇集的 DNA 的最终浓度。将整除稀释至 10 nM, 最终体积为30µL, 或按测序装置优选的浓度和容积。
- 利用测序装置的服务, 将 DNA 序列化到一个 2 x 300 bp 配对端序列上。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
执行建议的协议应导致一个索引配对端读取的数据集, 可以匹配回每个样本, 并分配给细菌操作分类学单位 (OTU) 或精确序列变体 (ESV, 也称为扩增子序列变体 (ASV) 和次操作分类单元 (sOTU)), 取决于下游分析。为了获得高质量的序列数据, 必须在每个步骤中都注意保持样本之间的一致性, 并尽量减少在样品处理或库准备过程中引入任何潜在偏差。在收集、处理和提取样本 (步骤1和 2) 中的 DNA 后, 由此产生的洗脱液应该清晰而无有机物, 从而抑制放大。虽然纯度可以通过 microvolume 分光光度计测量每个 DNA 样本来验证, 但我们发现土壤 dna 提取试剂盒能够可靠地去除所有污染物。由于 dna 质量的可预测性, 依靠荧光染料专门绑定 dna 的量化方法比基于紫外吸光度19、20、21的定量方式更合适。在 PCR 扩增之前, 土壤和根际样品平均约10µL DNA, 而根样通常有平均浓度约 30 ng/µL (表 2)。
随着环境 DNA 的放大 (步骤 3), 成功或失败可以通过台式荧光计试剂 (如果可用) 或手动 (表2) 测量 PCR 产品的浓度来确定。在我们的经验中, 成功的放大, 导致高质量的扩增子数据产生超过 15 ng/µL PCR 产品。如果板上有多个故障, 则工厂内的位置安排和失败样本的样本类型可能有助于确定问题。例如, 如果它们都在板上相邻, 它可能表明吸管的错误, 而如果它们都在同一行或列, 它可以建议问题与特定的底漆。如果它们都属于相同的样本类型, 它可能建议的问题, 样品处理或 DNA 提取。
重要的是要检查与您的特定植物系统 bioinformatically 在实验设计中的相容性, 以验证它们将阻断叶绿体和线粒体16S 基因的放大。在放大步骤之后, 不清楚是否成功地绑定到线粒体和叶绿体模板;这仅在排序后显示 (图 3)。为了帮助确保 rRNA 有效地阻止污染物的放大, 对被调查的植物宿主的肽序列对每个叶绿体和线粒体16S 基因 (可能有多个拷贝) 的排列不应显示任何不匹配.即使是 13 bp 肽序列的一个不匹配, 特别是在肽钳的中间, 可以大大降低效率, 如提供的叶绿体肽序列和叶绿体 16S rRNA 基因莴苣(生菜) (图 3)。
由于相同数量的扩增 DNA 是按样本汇集的, 因此在排序和排序读取依据其条形码索引 (图 4) 后, 每个样本所获得的读取量应近似为偶数。这些读数的大部分应与细菌分类。任何真核, 线粒体, 或叶绿体匹配应该被丢弃。根据所选择的分析管道和分类数据库, 叶绿体和线粒体读数可以错误地分配给细菌血统, 通常是蓝藻和Rickesttia(图 3)。一定程度的手动精选通常是谨慎的, 以检查这些常见的错误分配。具体细节将取决于分析的选择, 但相对丰度剖面通常应该是相似的 (没有重大区别) 在生物复制和明显地不同之间土壤、根际和根样品 (图5).然而, 必须指出的是, 虽然生物复制之间可能没有显著的差异, 但至少收集三个复制是很重要的。
这些实验中获得的数据的解释方法在微生物生态学家中引起了激烈的争论。直到最近, 扩增子序列分析一直依赖于分组读入 OTUs。然而, 这些都是有问题的, 因为: 1) 他们是基于一个有点任意的阈值97% 相似性, 2) 多样性往往被低估, 和 3) 可以有低分类分辨率。最近开发的工具, 如 DADA2、去模糊和 UNOISE2 22、23、24能够将读取内容排序为 ESVs, 从而解决了使用 OTUs 时出现的一些问题.使用 ESVs 的注意事项包括: 1) 由于物种中 rRNA 拷贝的差异, 人工增加多样性, 2) 提高了对 PCR 和排序错误的敏感性25,26。
图 1: 根目录和根际分数的分离.流程图中显示了从根样本中分离根部的步骤, 然后用无菌水洗涤根部, 以除去残留的 rhizoplane 有机体。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 用于在板材内放大和分布的库存底漆布局示例.库存底漆 (表 1) 可在带管中制备, 以便在96井板内进行最佳分配 (每条引物均用不同颜色表示; 紫色为向前底漆 1-8, 橙色为向前底漆 9-16, 蓝色为反向底漆 1-12, 绿色为反向底漆 13-16。在这种情况下, 16 向前和16反向引物可以有效地分配一个多通道的吸管, 使每个井有一个独特的条形码组合。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 提示叶绿体肽的结果无效.有代表性的结果来自根际 ("根际"), 根, 和土壤样本的生菜, 未经处理 (NT) 或处理 (如) 与生物土壤修正。用于阻止大多数植物叶绿体污染的肽序列是 GGCTCAACCCTGGACAG27。然而, 莴苣含有一个不匹配的叶绿体16S 核糖体 RNA 基因 (GGCTCAACTCTGGACAG)。这使肽不起作用, 导致高相对丰度的读数与蓝藻在根际和根样品。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 库中示例之间的读取计数的分布.条形图显示来自不同样本 (条形、x 轴) 的读取计数 (y 轴) 数, 与读取中的条形码组合匹配。每个样本的读取次数可以根据库中的样本数而变化;此子集在192个样本库中进行了排序。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 根、根际和土壤群落中前12类的相对丰度.堆积条形图, 显示代表16S 数据集中的类的相对丰度, 其中包含每个样本类型 (散装土壤、根际和根 endosphere) 的6个复制。请单击此处查看此图的较大版本.
表 1: 用于放大 16S rRNA 基因的 V3-V4 区域的底漆.引物由, 依次: 一个通用的 rRNA 平台适配器, 一个独特的条码, 为我们的底漆, 一个可变长度的间隔区域, 以改变序列的框架, 以及一个通用的 PCR 底漆, 放大341F 或785R 的16S 基因。所需的引物数量取决于每个库对多少个样本进行排序;16向前和16反向底漆的组合足够244样品 (256 底漆组合与12用于空白井在 PCR 期间 (图 2))。请单击此处下载此文件.
表 2: 在放大之前和之后随机 DNA 样本的规范化.示例工作表按随机顺序列出样本, 并指示它们在单个96井板上的位置, 这也决定了分配给它的底漆组合。底部的公式描述了将每个样品中的 100 ng 加到规范化的板上的计算, 再加上水的体积达到20µL。放大后, 每一个成功的产品100的体积计算, 并添加到最终池。添加到最终池的 "空白" PCR 产品的体积是其他样品的平均值。请单击此处下载此文件.
补充图 1: 在取样收集过程中最小根生物量的近似值. 收集根时, 尽量收集至少500毫克的组织。这里, 从一个年轻的高粱植物 (左, 在 a 和 B) 和一个年轻的水稻植株 (右), 显示在 (a) 和内 (B) 50 毫升圆锥管的根。两个样本的重量约为1克, 但是, 重要的是要注意, 这一重量包括根际和根, 而根际重量是, 在这种情况下, 大约一半的总重量。请单击此处下载此文件.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
该协议展示了一个建立的管道, 用于探索根 endosphere、根际和土壤微生物群落组成, 从野外取样到样品处理和下游测序。研究根相关的微生物提出了独特的挑战, 部分原因是从土壤取样的固有困难。土壤在物理和化学性质上是高度可变的, 不同的土壤条件可以用少量毫米28、29来分隔。这可能导致从相邻取样点收集的样本, 它们的微生物群落组成和活动有相当大的不同30,31。因此, 在 DNA 提取之前, 使用土芯收集器和铲子保持一致的取样深度和均匀性, 对于根微生物研究的重现性至关重要。有效地分离根际和根系也至关重要;使用苛刻的根表面杀菌方法可能会在 DNA 提取前溶解菌, 而更保守的清洗可能不会从根表面清除所有微生物7。另一个可能对测序结果产生负面影响或干扰的关键因素是细菌污染, 这可能来自许多来源, 有时无法区分取样的环境细菌32,33。因此, 为了避免污染, 对取样工具、实验材料和工作环境进行仔细的灭菌是至关重要的。
取样后, 获得高质量的 DNA 是成功的下游分析的一个高度优先事项。根据我们的经验, 通过替代方法, 如通过 CTAB 提取, 从田间生长的根样品中提取 DNA, 通常含有大量的腐植酸和其他化合物, 与根际和土壤样本相比。这些化合物可以防止 PCR 扩增期间 DNA 聚合酶的酶活性, 即使在低浓度34,35。使用为根样本土壤设计的 DNA 提取套件, 而不是 CTAB 萃取, 其次是苯酚氯仿清理, 可以有效地去除腐植酸样品, 并将导致高质量的 DNA36,37, 38,39。因此, 我们建议使用一个商业上可用的 DNA 提取试剂盒的根样本以及。应该指出, 目标是从植物根部获取微生物基因组 DNA。因此, 彻底和一致的根磨对分解植物组织和溶解微生物细胞释放微生物 DNA, 而不引入样品之间的偏差, 由于磨削压力和时间的变化是很重要的。
经过仔细抽取样本中的 DNA, 有两个主要来源的问题在放大: 1) 植物组织污染的植物 endosymbionts (叶绿体和线粒体) 和 2) 选择 16S rRNA 区域放大。从叶绿体或线粒体 16S rRNA 序列的放大可以产生 > 80% 的根样本的序列在40, 以及更多的叶组织, 虽然污染的数量取决于引物的选择。因此, 肽夹是必要的, 在 PCR 步骤, 以抑制植物宿主叶绿体和线粒体16S 污染27,41。然而, 不同的植物种类可能有变异在叶绿体和线粒体16S 序列27;因此, 必须确认在图书馆测序之前研究的植物叶绿体和线粒体16S 基因的序列, 以确定是否需要替代的肽寡核苷酸 (图3)。此外, 16S rRNA 基因由九个保守区域两侧的九高变区域组成;不同的结果可以从相同的社区获得, 具体取决于哪个高变区域被放大 42.以前的研究发现, V4 区域是分配分类法43最可靠的方法之一, 它已用于其他广泛的微生物调查11。这里建议将目标延长到 V3-V4 区域, 以增加变异性, 提高分类分辨率。
在本协议中, 我们展示了通过下一代测序 (rRNA) 进行16S 扩增子测序的管道, 用于研究环境样品的微生物群落组成12。我们建议使用扩增子测序作为系统系统分析的工具, 因为它相对便宜, 吞吐量高, 不需要大量的计算专门知识或资源进行分析。虽然我们的方法集中在分析微生物的细菌含量, 它可以很容易地适应调查真菌。在步骤2中, 协议是相同的, 在步骤3中唯一的区别是在放大过程中使用什么引物。然而, 扩增子基础的分析并非没有限制, 这是值得的。通过测序一个单一标记基因, 没有获得关于社区功能能力的信息。此外, 分类分辨率可能相当低, 特别是当测序从高比例的 uncharacterized 微生物的环境。然而, 测序技术正在迅速发展, 我们预计有可能解决其中的一些缺点, 方法是将此协议调整为与其他排序平台一起使用。最后, 如导言所述, 在土壤和根际样品上可以很容易地进行猎枪 metagenomics 和 metatranscriptomics, 目前正在探索消除植物组织中植物污染的方法。以扩增子为基础的方法和其他宏基因组技术的实验设计在复杂群落中特别有效, 在这些社区中, 物种多样性高, 分类不均匀, 可以准确地防止猎枪数据描绘的是不太占优势的成员。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由美国农业部 (2030-21430-008-00D) 资助。TS 由 NSF 研究生研究奖学金计划支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-10/20 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-3810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5510 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000027 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes | Eppendorf | 3120000909 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 100 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000043 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1000 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1122-1830 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1620-2700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mm soil sieve | Forestry Suppliers | 60141009 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 200 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-8810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 25 mL reservoirs | VWR International LLC | 89094-664 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 50 mL conical vials | Thermo Fisher Scientific | 352098 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) | VWR International LLC | 156-4020 | |
| 96-well microplates | USA Scientific | 655900 | |
| 96-well PCR plates | BioRad | HSP9631 | |
| Agencourt AMPure XP beads | Thermo Fisher Scientific | NC9933872 | Instructions for use: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180 &documentName=B37419AA.pdf |
| Aluminum foil | Boardwalk | 7124 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Analytical scale with 0.001 g resolution | Ohaus Pioneer | PA323 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Bioruptor Plus ultrasonicator | Diagenode | B01020001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL | New England Biolabs | B9000S | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811000908 | Including 50mL and 96-well plate bucket adapters |
| Cryogenic gloves | Millipore Sigma | Z183490 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| DNeasy PowerClean kit (optional) | Qiagen Inc. | 12877-50 | Previously MoBio |
| DNeasy PowerSoil kit | Qiagen Inc. | 12888-100 | Previously MoBio |
| Dry ice | Any | NA | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Do not substitute |
| Ethanol | VWR International LLC | 89125-188 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gallon size freezer bags | Ziploc | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gemini EM Microplate Reader | Molecular Devices | EM | Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top. |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lab coat | Workrite | J1367 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 | Any | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 dewar | Thermo Fisher Scientific | 4150-9000 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Milli-Q ultrapure water purification system | Millipore Sigma | SYNS0R0WW | |
| Mini-centrifuge | Eppendorf | 5404000014 | |
| Molecular grade water | Thermo Fisher Scientific | 4387937 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Mortars | VWR International LLC | 89038-150 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Nitrile gloves | Thermo Fisher Scientific | 19167032B | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Paper towels | VWR International LLC | BWK6212 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| PCR plate sealing film | Thermo Fisher Scientific | NC9684493 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| Pestles | VWR International LLC | 89038-166 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Plastic spatulas | LevGo, Inc. | 17211 | |
| Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific | 13000014 | |
| PNAs - chloroplast and mitochondrial | PNA Bio | NA | Make sure to verify sequence bioinformatically |
| Protective eyewear | Millipore Sigma | Z759015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| Rubber mallet (optional) | Ace Hardware | 2258622 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shears or scissors | VWR International LLC | 89259-936 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shovel | Home Depot | 2597400 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Soil core collector (small diameter: <1 inch) | Ben Meadows | 221700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Spray bottles | Santa Cruz Biotechnology | sc-395278 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) | IDT | NA | 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry. |
| Thermocycler | Thermo Fisher Scientific | E950040015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Weigh boats | Spectrum Chemicals | B6001W | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
References
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
- Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic classification of environmental 16S rRNA gene sequences. ISME J. 6 (7), 1440-1444 (2012).
- Takahashi, S., Tomita, J., Nishioka, K., Hisada, T., Nishijima, M. Development of a Prokaryotic Universal Primer for Simultaneous Analysis of Bacteria and Archaea Using Next-Generation Sequencing. PLoS One. 9 (8), e105592 (2014).
- Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics. PLoS One. 9 (4), e93827 (2014).
- Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Front Plant Sci. 5, 209 (2014).
- Jiao, J. -Y., Wang, H. -X., Zeng, Y., Shen, Y. -M. Enrichment for microbes living in association with plant tissues. J Appl Microbiol. 100 (4), 830-837 (2006).
- Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Front Microbiol. 7, 773 (2016).
- Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R., Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 5709, 623-628 (2011).
- Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
- Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLoS Biol. 15 (3), e2001793 (2017).
- Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. , (2017).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform. Appl Environ Microb. 79 (17), 5112-5120 (2013).
- Degnan, P. H., Ochman, H. Illumina-based analysis of microbial community diversity. ISME J. 6 (1), 183-194 (2012).
- Naylor, D., DeGraaf, S., Purdom, E., Coleman-Derr, D. Drought and host selection influence bacterial community dynamics in the grass root microbiome. ISME J. , (2017).
- Desgarennes, D., Garrido, E., Torres-Gomez, M. J., Peña-Cabriales, J. J., Partida-Martinez, L. P. Diazotrophic potential among bacterial communities associated with wild and cultivated Agave species. FEMS Microbiol Ecol. 90 (3), 844-857 (2014).
- Coleman-Derr, D., et al. Plant compartment and biogeography affect microbiome composition in cultivated and native Agave species. New Phytol. 209 (2), 798-811 (2016).
- De Tender, C., et al. Dynamics in the Strawberry Rhizosphere Microbiome in Response to Biochar and Botrytis cinerea Leaf Infection. Front Microbiol. 7, 2062 (2016).
- Kapp, J. R., et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol. 68 (2), 111-118 (2015).
- Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
- O'Neill, M., McPartlin, J., Arthure, K., Riedel, S., McMillan, N. Comparison of the TLDA with the Nanodrop and the reference Qubit system. J Phys Conf Ser. 307 (1), 012047 (2011).
- Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Amir, A., et al. Deblur Rapidly Resolves Single-Nucleotide Community Sequence Patterns. mSystems. 2 (2), e00191-e00116 (2017).
- Edgar, R. C. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. bioRxiv. , 081257 (2016).
- Nguyen, N. -P., Warnow, T., Pop, M., White, B. A perspective on 16S rRNA operational taxonomic unit clustering using sequence similarity. NPJ Biofilms Microbiomes. 2, 16004 (2016).
- Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Holmes, S. P. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. , (2017).
- Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nat Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
- O'Brien, S. L., et al. Spatial scale drives patterns in soil bacterial diversity. Environ Microbiol. 18 (6), 2039-2051 (2016).
- Fierer, N., Lennon, J. T. The generation and maintenance of diversity in microbial communities. Am J Bot. 98 (3), 439-448 (2011).
- Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nat Rev Microbiol. 15 (10), 579-590 (2017).
- Buckley, D. H., Schmidt, T. M. Diversity and dynamics of microbial communities in soils from agro-ecosystems. Environ Microbiol. 5 (6), 441-452 (2003).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
- Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
- Sutlović, D., Definis Gojanović, M., Andelinović, S., Gugić, D., Primorac, D. Taq polymerase reverses inhibition of quantitative real time polymerase chain reaction by humic acid. Croat Med J. 46 (4), 556-562 (2005).
- Sutlovic, D., Gamulin, S., Definis-Gojanovic, M., Gugic, D., Andjelinovic, S. Interaction of humic acids with human DNA: proposed mechanisms and kinetics. Electrophoresis. 29 (7), 1467-1472 (2008).
- Aleklett, K., Leff, J. W., Fierer, N., Hart, M. Wild plant species growing closely connected in a subalpine meadow host distinct root-associated bacterial communities. PeerJ. 3, e804 (2015).
- Bogas, A. C., et al. Endophytic bacterial diversity in the phyllosphere of Amazon Paullinia cupana associated with asymptomatic and symptomatic anthracnose. Springerplus. 4, 258 (2015).
- Hiscox, J., Savoury, M., Müller, C. T., Lindahl, B. D., Rogers, H. J., Boddy, L. Priority effects during fungal community establishment in beech wood. ISME J. 9 (10), 2246-2260 (2015).
- Zhang, T., Yao, Y. -F. Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific. PLoS One. 10 (6), e0130051 (2015).
- Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. PLoS One. 8 (8), e71360 (2013).
- Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity. Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).
- Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -A. Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems. Appl Environ Microb. 80 (15), 4626-4639 (2014).
- Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -Y. Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC Bioinformatics. 17, 135 (2016).
