Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

At udforske Root Microbiome: udtrække bakteriel Fællesskabets Data fra jord, rhizosfære og rod Endosphere

Published: May 2, 2018 doi: 10.3791/57561
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley, 2Plant Gene Expression Center, USDA ARS

Summary

Her, beskriver vi en protokol for at opnå amplikon sekvens data af jord, rhizosfære og roden endosphere microbiomes. Denne information kan bruges til at undersøge sammensætningen og mangfoldighed af plante-forbundet mikrobielle samfund, og er velegnet til brug med en bred vifte af plantearter.

Abstract

Det intime samspil mellem plante vært og tilknyttede mikroorganismer er afgørende betydning for anlægget fitness, og kan fremme forbedrede tolerance over for abiotisk understreger og sygdomme. Som plante microbiome kan være meget komplekse, lave omkostninger, er høj overførselshastighed metoder såsom amplikon-baserede sekventering af 16S rRNA-genet ofte at foretrække for kendetegner dets mikrobielle sammensætning og mangfoldighed. Udvælgelse af passende metode når gennemføre sådanne eksperimenter er imidlertid afgørende for at mindske skævheder, der kan vanskeliggøre analyse og sammenligninger mellem prøver og undersøgelser. Denne protokol beskriver i detaljer en standardiseret metode til indsamling og udvinding af DNA fra jord, rhizosfære og rod prøver. Derudover vi fremhæve en veletableret 16S rRNA-amplikon sekventering rørledning, der giver mulighed for udforskning af sammensætningen af bakterielle samfund i disse prøver, og kan nemt tilpasses til andre markørgener. Denne rørledning er blevet valideret for en række plantearter, herunder sorghum, majs, hvede, jordbær og agave, og kan hjælpe med at overvinde problemer forbundet med forurening fra anlægget organeller.

Introduction

Plante-forbundet microbiomes består af dynamiske og komplekse mikrobielle samfund består af bakterier, archaea, vira, svampe og andre mikroorganismer i eukaryote. Ud over deres velundersøgte rolle i forårsager plantesygdomme, kan plante-forbundet mikrober også positivt påvirke plantesundhed ved at forbedre tolerance over for biotisk og abiotisk understreger, at fremme næringsstoftilgængelighed og forbedring af planternes vækst gennem produktion af Phytohormoner. Af denne grund findes særlig interesse i kendetegner de taxa, som forbinder med anlægget rod endospheres, rhizospheres og den omgivende jord. Mens nogle mikrober kan være kulturperler i isolation på laboratoriet genererede medier, mange ikke, dels fordi de kan stole på symbiotiske relationer med andre mikrober, vokser meget langsomt, eller kræver betingelser, der ikke kan genskabes i et laboratoriemiljø. Fordi det omgår behovet for dyrkning og er relativt billig og høj overførselshastighed, er sekvens-baserede fylogenetiske profilering af miljømæssige og vært-associerede mikrobielle prøver blevet en foretrukne metode til paavisning mikrobielle samfund sammensætning.

Udvælgelse af passende sekventering teknologier fra forskellige næste generation sequencing (NGS) platforme1 er afhængig af brugernes behov, med vigtige faktorer herunder: ønskede dækning, amplikon længde, forventes EF mangfoldighed, samt sekventering fejlprocenten, læse-længde og cost-per-run/megabase. En anden variabel, der skal overvejes i amplikon-baserede sekventering eksperimenter er hvad gen vil blive forstærket og hvad primere vil blive brugt. Når designe eller vælge primere, er forskere ofte tvunget til at indgå kompromiser mellem universelle forstærkning af og den taksonomiske opløsning opnåelige fra den resulterende amplikoner. Derfor valgte disse typer af undersøgelser ofte primere og markører, der selektivt målrette specifikke delmængder af microbiome. Evaluering af sammensætningen af bakterielle samfund er almindeligt opnås ved sekventering en eller flere af hypervariable regionerne af bakteriel 16S rRNA gen2,3. I denne undersøgelse, vi beskriver en amplikon baseret sekventering protokol udviklet til en NGS platform mål 500 bp V3-V4 regionen af bakteriel 16S rRNA gen, som giver mulighed for bred forstærkning af bakteriel taxa samtidig også give tilstrækkelig variation til skelne mellem forskellige taxa. Derudover kan denne protokol nemt tilpasses til brug med andre primer sæt, såsom rettet mod ITS2 markøren af svampe eller 18S rRNA underenhed af eukaryoter.

Mens andre tilgange såsom shotgun metagenomics, metatranscriptomics og encellede sekventering, tilbyder andre fordele, herunder løst mikrobielle genomer og mere direkte måling af Fællesskabets funktion, er disse teknikker typisk mere dyrt og beregningskrævende end den fylogenetiske profilering beskrevet her4. Derudover udfører shotgun metagenomics og metatranscriptomics på rod prøver giver en stor procentdel af læser tilhører værten plante genom, og metoder til at overvinde denne begrænsning er stadig at blive udviklet5,6.

Som med enhver eksperimentelle platform, kan amplikon-baserede profilering indføre en række potentielle afvigelser, som bør overvejes under den eksperimentelle design og data analyse. Disse omfatter metoder til prøvetagning, DNA udvinding, udvalg af PCR-primere, og hvordan bibliotek forberedelse udføres. Forskellige metoder kan markant indflydelse på mængden af brugbare data genereret, og kan også hæmme bestræbelserne på at sammenligne resultater mellem undersøgelser. For eksempel, metoden til at fjerne rhizosfære bakterier7 og brugen af forskellige udvinding teknikker eller valg af DNA udvinding kits8,9 har vist sig at betydeligt påvirke downstream analyse, hvilket fører til forskellige konklusioner vedrørende som mikrober er nutid og deres relative mængder. Da amplikon-baserede profilanalyse kan være tilpasset, kan foretage sammenligninger på tværs af undersøgelser være udfordrende. Jorden Microbiome projekt har foreslået, at forskere studerer komplekse systemer som plante-forbundet microbiome ville drage fordel af udviklingen af standardiserede protokoller som et middel til minimering af variation forårsaget af anvendelsen af forskellige metoder mellem undersøgelser10,11. Her vi diskutere mange af de ovennævnte emner, og tilbud forslag til bedste praksis, hvor det er relevant.

Protokollen viser processen med at indsamle jord, rhizosfære og rod prøver fra Sorghum bicolor og uddrager DNA ved hjælp af en veletableret DNA isolering kit11. Vores protokol indeholder desuden en detaljeret amplikon sekventering arbejdsproces, ved hjælp af et almindeligt udnyttede NGS platform, for at bestemme strukturen af den bakterielle samfund12,13,14. Denne protokol er blevet valideret til brug i en bred vifte af plante værter i en nylig offentliggjort undersøgelse af rødder, rhizosfære og tilknyttede jord af 18 monocot arter herunder Sorghum bicolor, Zea mays, og Triticum aestivum15. Denne metode er også blevet valideret til brug sammen med andre markørgener, som det fremgår af dens vellykkede program til at studere de svampe ITS2 markørgen i undersøgelser af agave microbiome16,17 og jordbær microbiome 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. samling og adskillelse af rod Endosphere, rhizosfære og jordprøver

  1. Forudgående at ind i feltet, autoklave ultrarent vand (mindst 90 mL vand pr. prøve) at sterilisere. Forberede epifyt fjernelse buffer (mindst 25 mL pr. sample) ved at tilføje 6,75 g KH2PO4, 8,75 g K2HPO4og 1 mL Triton X-100, 1 L af sterilt vand. Sterilisere bufferen ved hjælp af et vakuum filter med 0,2 µm porestørrelse.
    1. Til trin 1,2 til 1,5, slid rene handsker steriliseret med ethanol på alle tidspunkter og erstatte handsker mellem hver prøve at forhindre forurening. Sterilisere alle udstyr med 70% ethanol og tørres rene alt udstyr mellem prøver. Før prøvetagning, bestemme den optimale prøveudtagning dybde til dit eksperiment, og være i overensstemmelse med alle jord og rod samlinger.
  2. For at indsamle bulk jordprøver, bruge en ethanol-steriliseret jord core samler for at få jord, der er fri for planternes rødder ved at indsamle en kerne ca 23 til 30 cm fra bunden af anlægget.
  3. Overføre jorden til en plasticpose, homogeniseres jorden af blid ryster, og en alikvot del af jordprøve (ca 600 mg) til at fylde en 2 mL tube. 2 mL glasset anbringes straks på tøris eller flash fryse røret i flydende N2 indtil klar til at gå videre med DNA-ekstraktion (trin 2).
    1. I nogle miljøer, kan den omgivende jord indeholde plantemateriale. I dette tilfælde bruge en steriliseret 2 mm sigte for at adskille planterester fra jorden før placere den i en plasticpose.
  4. Til opsamling af rod og rhizosfære, skal du bruge en ethanol-steriliseret skovl for at grave planten, at tage sig til at få så meget rod som muligt. Dybde er afhængig af planten. Mens små planter såsom hvede kan fjernes ved at grave flere centimeter, kræver større planter såsom sorghum 30 cm eller mere. Forsigtigt ryst overskydende jord fra rødderne, indtil der er ca 2 mm af jorden roden overfladen at overholde.
    Bemærk: passe på når man arbejder med små planter, med skrøbelige rødder eller i tør, høj-ler indhold jord. Ideelt set bør der kun være et tyndt lag jord tilbage på rødderne efter omrystning. Hvis der stadig er store aggregater af jord, kan en gummihammer bruges til at løsne jorden ved forsigtigt at ramme bunden af skuddet. Hvis mængden af jord tilbage efter denne proces overstiger eller falder under 2 mm, skal den omtrentlige tykkelse bemærkes.
  5. For store anlæg, skal du bruge steril saks og/eller Sakse til at skære en repræsentativ underafdeling af rødder og placere et minimum af 500 mg root væv i en 50 mL konisk hætteglas. For mindre græs, skal du placere hele rodsystemet ind i hætteglasset. Tilføje nok epifyt fjernelse buffer for at dække rødderne, så prøven straks anbringes på tøris eller flash fryse prøven i flydende Nielsen2.
    Bemærk: Sørg for ikke at for meget 50 mL konisk hætteglasset, da det vil gøre vask trin vanskeligt. Der bør være nok tom plads, således at epifyt buffer er i stand til at flyde til bunden, omgiver rødder i hele hætteglasset og dække toppen. Fordi nogle græsser har flere rod biomasse end vil passe ind i en 50 mL konisk hætteglas, skal en underafdeling af rødderne indsamles. Dog skal det bemærkes, at skære rødderne kunne føre til endophytic bakterier bliver vasket i den rhizosfære fraktion, så bryde rødder bør minimeres. Hvis prøverne ikke behandles umiddelbart efter hjemkomsten til lab, kan de opbevares ved-80 ° C.
  6. For at adskille rhizosfære fra rødderne, tø eksemplet root på is, så Læg instrumenterne i ultralydsbad rod prøver ved 4 ° C i 10 min med pulser af 160 W til 30 s, adskilt af 30 s. overførsel rødder i en kølet (4 ° C), clean 50 mL tube ved hjælp af steril pincet. Bortskaf ikke det oprindelige rør med buffer og jord, som er den rhizosfære fraktion (figur 1).
  7. Centrifugeres rør indeholdende buffer og rhizosfære for 10 min. ved 4 ° C, 4000 x g. Decant supernatanten, flash fryse rør indeholdende den rhizosfære fraktion i flydende Nielsen2, og gemme den rhizosfære fraktion ved-80 ° C indtil klar til at gå videre med DNA udvinding (trin 2).
  8. For at vaske rødderne, ca 20 mL kølet (4 ° C) sterilt vand tilsættes til roden brøkdel. Vaske roden af ryster kraftigt (i hånden eller mixer til 15-30 s), og derefter afløb vandet.
  9. Gentag dette trin mindst to gange, indtil ingen jord forbliver på roden overfladen. Hvis DNA-ekstraktion (trin 2) ikke udføres umiddelbart, wrap rødderne i steril aluminiumfolie, flash fryse rødder i flydende Nielsen2, og store prøver på-80 ° C indtil klar til at gå videre med DNA-ekstraktion.

2. DNA-ekstraktion

Bemærk: I hele trin 2 og 3, rene handsker steriliseret med ethanol bør blive båret på alle tidspunkter og alle arbejde bør udføres på en overflade, der er steriliseret med ethanol.

  1. Uddrag DNA fra de jord og rhizosfære prøver.
    1. Brug en steril spatel til hurtigt at overføre 250 mg af jord og rhizosfære fra trin 1.3 og 1,7 til særskilt indsamling rør findes i en kommerciel DNA isolering kit designet til udvinding fra jord, så gå videre med DNA isoleret ved hjælp af kit leverandør protokol.
    2. Efter eluerer DNA i eluering buffer leveret af DNA isolering kit, skal du gemme DNA ved-20 ° C indtil klar til at gå videre med trin 3.
  2. Uddrag DNA fra root-stikprøver.
    1. Chill en steriliseret morter og støder med flydende N2. Afmåle 600 til 700 mg af root væv og placere væv i mørtel. Omhyggeligt, tilføje nok væske Nielsen2 for at dække rødderne.
    2. Male rødderne i små stykker. Fortsætte processen med at tilføje flydende N2 og slibning (mindst to gange, være overensstemmelse mellem prøver), indtil rødderne er et fint pulver. Sikre, at root væv ikke tø under dette trin.
      Forsigtig: Brug egnede personlige værnemidler (laboratoriekittel, beskyttelsesbriller og kryogene handsker) Hvornår arbejder med flydende N2.
      Bemærk: For en lav kvalitet DNA-ekstraktion, det kan være gavnligt at male overskydende rødder til pulver og gemme pulver ved-80 ° C.
    3. Hurtigt, før rod begynder pulver at tø, bruge en steril spatel til at overføre rod pulver til pre vejede 1,5 mL rør på is. Optage vægten af rør og pulver. Typisk er 300-400 mg pulver overført.
    4. Brug en steril spatel til hurtigt at overføre 150 mg af rod pulver til collection tube findes i en kommerciel DNA isolering kit designet til udvinding fra jorden, så gå videre med DNA isoleret ved hjælp af kit leverandørens protokol.
      Bemærk: For nogle rod prøver, kan der være en høj koncentration af organiske tilbage i DNA pellet, som forhindrer forstærkning af DNA under PCR, især når en anden DNA udvinding protokol (fx., CTAB udvinding) bruges. Om nødvendigt, ren DNA ved at følge vejledningen i den miljømæssige DNA oprensning kit.
  3. Mål koncentrationen af alle DNA-prøver ved hjælp af en højfølsom benchtop fluorometer.
    1. Tilføje 1-20 µL af hver eluted DNA-prøve i rør i dsDNA Højfølsom assay kit. Tilføj fluorometer brugsopløsning (1:200 farvestof: buffer) op til 200 µL.
    2. Forbered to ekstra rør indeholdende 10 µL af DNA standard 1 (0 ng/µL DNA) eller 10 µL af standard 2 (100 ng/µL), og tilføje 190 µL af fluorometer brugsopløsning til hver standard.
    3. Måle koncentrationen af standarderne og hver prøve. Hvis det ikke sker automatisk, skal du beregne DNA koncentration fra absorbans output af en lineær regression af de to standarder.

3. amplikon bibliotek udarbejdelse og indsendelse

  1. Opsætning af materialer til forstærkning reaktion.
    1. Tø DNA prøver ved 4 ° C og holde dem på is i hele trin 3. Tilfældig rækkefølge af DNA-prøver at minimere bias på grund af placeringen på PCR-plade (tabel 2).
    2. I en 96-brønd PCR plade, der fortyndes DNA fra hver prøve i vand af Molekylær renhed til 5 ng/µL i en samlet maengde paa 20 µL. tilføje 20 µL vand af Molekylær renhed til de fire hjørne brønde som negative kontroller for forstærkning (tomme) (tabel 2).
    3. Arrangere barcoded primere (10 µM) i enten PCR strip rør eller en 96-brønd plade, således at de kan tilføjes med en multikanal-pipette (figur 2).
    4. Forberede tilstrækkelige PCR master mix at forstærke hver DNA-prøve i tre eksemplarer. Forberede 1,5 µL af BSA (20 mg/mL), 37,5 µL af præ-made 2 x master mix (sammensat af PCR buffer, MgCl2, dNTP'er og Taq DNA polymerase), 0.57 µL af grønkorn PNA (100 µM), 0.57 µL af mitokondrie PNA (100 µM), og 25.86 µL vand af Molekylær renhed.
    5. Hæld den master mix i en steril 25 mL af multikanalpipette reservoir og distribuere 66 µL af master mix i hver brønd med en ny 96-brønd PCR plade ved hjælp af en multikanalpipette.
      Bemærk: Ved beregningen af reagens diskenheder for master mix, Sørg for at også omfatter 4 tomme brøndene pr. plade.
    6. Brug af en multikanal-pipette, tilføje 6 µL af 5 ng/µL DNA (fra den normaliserede DNA plade) til master mix plade. Derefter føje til master plade 1,5 µL af 10 µM fremad primer, således at hver kolonne har en anderledes frem stregkode og 1,5 µL af 10 µM reverse primer, således at hver række har en forskellige omvendt stregkode (figur 2).
      Bemærk: Før tilføje primere, randomiseret plader og master mix kan bruges til at forstærke de ITS eller ITS2 svampe gener, hvis forskellige primere blev tilføjet. Hvis dette er tilfældet, kan en lignende primer design bruges.
    7. Spin ned plade kort på 3.000 x g. bruge en multikanal-pipette til blandes forsigtigt, så opdele i tre plader med 25 µL af reaktionsblandingen.
      Bemærk: Selv om tre gentagelser ikke er strengt nødvendigt, det nedsætter virkningen af tekniske variabilitet.
  2. Forstærke DNA i hver plade ved hjælp af en thermocycler sat på følgende betingelser: 180 s på 98 ° C, 30 cykler af: 98 ° C til 45 s (denatureringen), 78 ° C til 10 s (PNA udglødning), 55 ° C i 60 s (primer udglødning), og mindst 72 ° C til 90 s (udvidelse) , derefter 600 s ved 72 ° C efterfulgt af en 4 ° C hold trin. Efter forstærkning, pool tre Repliker pladerne i en enkelt 96-brønd plade.
  3. Kvantificere DNA ved hjælp af høj følsomhed fluorometer reagenser i en 96-brønd pladelæseren.
    1. Tilføje 2 µL af hver PCR produkt til en 96-brønd mikrotiterplade, sammen med 98 µL af fluorometer brugsopløsning (1:200 farvestof: buffer). Omfatter 4 brønde som standarder: 5 µL DNA standard 1 (0 ng/µL DNA), 1 µL af standard 2 (10 ng/µL), 2 µL af standard 2 (20 ng/µL) og 5 µL af standard 2 (50 ng/µL). Tilføj derefter fluorometer brugsopløsning for en endelige mængden af 100 µL.
      Bemærk: Hver prøve kan måles ved hjælp af en benchtop fluorometer som beskrevet i trin 2.3 Hvis en Pladelæser ikke er tilgængelig.
    2. Beregne DNA koncentration fra absorbans output af en lineær regression af de fire standarder.
    3. For den med held forstærket barcoded produkter (dem, der har en koncentration, der er større end 15 ng/µL), pool 100 ng af hver prøve i en enkelt 1,5 mL tube (tabel 2).
    4. Beregning af det gennemsnitlige volumen af prøver, der er føjet til puljen ved hjælp af funktionen =AVERAGE() i et regnearksprogram. Tilføje volumen af de "tomme" PCR produkter til de poolede prøver.
      Bemærk: Da de "tomme" PCR produkter har deres egen unikke stregkode kombinationer, kan de blive sekventeret for at tjekke for kontaminanter laboratorium.
  4. Måler koncentrationen af poolede produktet ved hjælp af en benchtop fluorometer som beskrevet i trin 2.3 og tage 600 ng af DNA og fortyndes i vand af Molekylær renhed til en endelige mængden af 100 µL i 1,5 mL rør. Gemme den resterende poolede produkt ved-20 ° C.
  5. Vask 600 ng DNA alikvot ved at følge de etablerede PCR rensningsprocessen med Paramagnetiske rensning perler i en 96-brønds format med et par undtagelser.
    1. Gøre en frisk 600 µL alikvot af 70% ethanol. Ryst flasken af magnetiske perler til genopslæmmes perler, det bilægge til bunden.
    2. Tilføje 1 x volumen (100 µL) af perle løsning til de 600 ng alikvot af DNA. Blandes grundigt ved pipettering 10 gange. Inkuber i 5 min ved stuetemperatur.
    3. Placer røret på den magnetiske stå i 2 min. (eller indtil løsning er klar) til at adskille perler fra løsning. Mens røret er stadig i den magnetiske stå, Aspirér klart supernatanten omhyggeligt uden at røre de magnetiske perler, og supernatanten klar.
      Bemærk: på dette tidspunkt amplikon produkter er bundet til de magnetiske perler. Alle perler, der er forstyrret eller tabt under aspiration vil resultere i et tab af DNA.
    4. Forlader røret i den magnetiske stå og tilføje 300 µL af 70% ethanol til røret; Inkuber ved stuetemperatur i 30 s. aspirat ud ethanol og kassér. Gentag denne proces, og fjerne alle ethanol efter den anden vask. Fjerne røret fra magnetiske standen, og lufttørre i 5 min.
    5. Tilføje 30 µL vand af Molekylær renhed til de tørrede perler og mix af pipettering 10 gange. Inkuber ved stuetemperatur i 2 min. retur røret til den magnetiske stå i 1 minut for at skille perlerne fra løsning. Overføre eluatet til en ny tube.
      Bemærk: Magnetiske perler vil ikke påvirke downstream reaktioner.
  6. Måle den endelige koncentration af renset, samles DNA ved hjælp af en benchtop fluorometer som beskrevet i trin 2.3. Fortynde en alikvot til 10 nM i en endelige rumfang af 30 µL eller fusionsparterne og volumen foretrækkes af sekventering facilitet.
  7. Benytte tjenestegrene af en sekventering facilitet til sekvens DNA på en NGS platform, 2 x 300 bp parret ende sekvensering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Udfører de anbefalede protokollen bør resultere i et datasæt af indekserede parret ende læser, der kan matches tilbage til hver prøve og tildelt enten en bakteriel operationelle taksonomiske enheder (OTU) eller nøjagtige rækkefølge variant (ESV, også benævnt amplikon sekvens variant (ASV) og sub-operational taksonomisk enhed (sOTU)), afhængigt af downstream analyse. For at opnå høj kvalitet sekvens data, skal der udvises forsigtighed på hvert trin at bevare sammenhængen mellem prøver og minimere indførelsen af enhver potentiel bias under prøven forarbejdning eller bibliotek forberedelse. Efter indsamling, bør behandling, og uddrager DNA fra prøver (trin 1 og 2), det resulterende eluatet vises klart og fri for organiske stoffer, der vil hæmme forstærkning. Mens renhed kan verificeres ved måling af hver DNA-prøve via Spektrofotometer microvolume, har vi fundet, at jord DNA udvinding kit pålideligt fjerner alle forureninger. Som følge af den forudsigelige DNA kvalitet er kvantificering metoder, der er afhængige af fluorescens-baserede farvestoffer, der specifikt binder DNA mere passende end dem baseret på UV absorbans19,20,21. Før PCR-amplifikation gennemsnit jord og rhizosfære prøver omkring 10 ng/µL DNA, mens rod prøver har typisk en gennemsnitlig koncentration på ca 30 ng/µL (tabel 2).

Efter forstærkning af den miljømæssige DNA (trin 3), succes eller fiasko kan bestemmes ved at måle koncentrationen af PCR-produktet via benchtop fluorometer reagenser i en Pladelæser, hvis den er tilgængelig, eller manuelt (tabel 2). Vores erfaring, vellykket klarlægger, der resulterer i høj kvalitet amplikon data udbytte større end 15 ng/µL PCR produkter. Hvis der er flere fejl på en plade, kan den positionelle arrangement inden for anlægget og prøvetypen mislykket prøver hjælpe afgøre problemet. For eksempel, hvis de er alle tilstødende på pladen, kan det tyde pipette fejl, der henviser til, at hvis de er alle i samme række eller kolonne, det kunne antyde problemer med en bestemt primer. Hvis de alle tilhører den samme prøvetype, kunne det tyde på problemer med prøve behandling eller DNA-ekstraktion.

Det er vigtigt at kontrollere foreneligheden af de universelle PNAs med dine specifikke anlæg system bioinformatically under eksperimentelle design for at kontrollere, at de vil blokere forstærkning af grønkorn og mitokondriel 16S gener. Efter forstærkning skridt, det er ikke klart om PNAs korrekt bundet til mitokondrier og grønkorn skabeloner; Dette er kun afsløret efter sekventering (figur 3). For at sikre, at PNAs effektivt vil blokere forurenende forstærkning, en tilpasning af PNA sekvens til hver grønkorn og mitokondriel 16S rRNA gen (der kan være flere kopier) til anlægget bør vært undersøges ikke afsløre eventuelle uoverensstemmelser . Selv en enkelt uoverensstemmelse til den 13 bp PNA sekvens, især i midten af PNA clamp, kan drastisk reducere effektiviteten, som i tilfældet med den medfølgende grønkorn PNA sekvens og grønkorn 16S rRNA gen Lactuca sativa (salat) ( Figur 3).

Da en lige mængde amplificerede DNA er samlet pr. sample, der bør en ca selv antal læsninger opnås pr. prøve efter sekvensering og sortering læser baseret på deres barcoded indeks (figur 4). Fleste af disse læser skal svare til bakteriel taxa. Alle eukaryote, mitokondrie, eller grønkorn kampe skal kasseres. Afhængigt af den analyse pipeline og taksonomisk database valgt, grønkorn og mitokondriel læser kan fejlagtigt tildeles bakteriel lineages, ofte cyanobakterier og Rickesttia, henholdsvis (figur 3). En grad af manuel datasikring er ofte klogt at tjekke for disse fælles mis tildelinger. Specifikke detaljer vil afhænge af valget af analyse, men relativ overflod profiler bør generelt være lignende (ingen signifikant forskel) blandt biologiske replikater og signifikant forskellig mellem jord, rhizosfære og rod prøver (figur 5 ). Det er vigtigt at bemærke, at mens der kan være nogen væsentlig forskel mellem biologiske replikater, det er vigtigt at indsamle mindst tre gentagelser pr..

Metoder for at fortolke resultaterne i disse eksperimenter er varmt debatteret blandt mikrobielle økologer. Indtil for nylig, har amplikon Sekvensanalyse været afhængig af gruppering læsninger i OTUs. Disse er imidlertid problematisk fordi: 1) de er baseret på en noget vilkårlig grænse på 97% lighed, 2) mangfoldighed er ofte undervurderet og 3) der kan være lavt taksonomisk opløsning. For nylig er udviklede værktøjer som DADA2, Deblur og UNOISE222,23,24 stand til at sortere læser ind i ESVs, som løser nogle problemer når du bruger OTUs. Forbehold til ved hjælp af ESVs omfatter: 1) kunstige stigninger i mangfoldighed på grund af forskelle i rRNA kopier inden for en art, og 2) øget følsomhed til PCR og sekventering fejl25,26.

Figure 1
Figur 1: adskillelse af rod og rhizosfære fraktioner. Flowchart viser skridt til at adskille rhizosfære fra roden prøver, efterfulgt af vask rødder med sterilt vand for at fjerne enhver resterende rhizoplane organismer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: eksempel på lager primer layout til forstærkning og distribution inden for plader. Stock primere (tabel 1) kan tilberedes i strip rør for optimal fordeling i 96-brønd plader (hver strimmel af primere er repræsenteret af en anden farve, lilla for fremad primere 1-8, orange for videresende primere 9-16, blå for omvendt primere 1-12 og grøn for reverse primere 13-16.) I dette tilfælde kan 16 frem og 16 omvendt primere fordeles effektivt med en multikanal-pipette sådan at hver godt har en unik stregkode kombination. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: resultater, der tyder på grønkorn PNA er ineffektiv. Repræsentativt resultat fra rhizosfære ("Rhizo"), rod og jordprøver fra salat, der var ubehandlede (NT) eller behandlet (VT) med en biologisk jord ændringsforslag. PNA sekvensen bruges til at blokere grønkorn forurening i de fleste planter er GGCTCAACCCTGGACAG27. Salat indeholder imidlertid en uoverensstemmelse i grønkornets 16S ribosomale RNA-genet (GGCTCAACTCTGGACAG). Dette gør PNA ineffektive, hvilket resulterer i en høj relativ overflod af læser, der svarer til cyanobakterier i rhizosfære og rod prøver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: fordeling af Læs tæller blandt prøver i et bibliotek. Søjlediagrammet viser antallet af læse tæller (y-akse) fra forskellige prøver (barer, x-aksen), modsvares af stregkode kombination i Læs. Antallet af læser per prøve kan variere afhængigt af hvor mange prøver er i biblioteket; Dette delkrav blev sekventeret i et bibliotek af 192 prøver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: relativ overflod af top 12 klasser i roden, rhizosfære og jorden samfund. Stablet liggende søjlediagram viser relativ overflod af klasser i en repræsentant 16S datasæt indeholdende 6 replikater for hver prøvetype (bulk jord, rhizosfære og rod endosphere). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1: primere for forstærke regionen V3-V4 af 16S rRNA gen. Primere er sammensat af, sekventielt: en adapter til en fælles NGS platform, en unik stregkode og primer til NGS en spacer region af variabel længde til at flytte rammen til sekvensering, og en universel PCR primer, der forstærker enten 341F eller 785R af 16S rRNA-genet. Antallet af primere behov er afhængig af hvor mange prøver er sekventeret pr. bibliotek; en kombination af 16 frem og 16 omvendt primere er tilstrækkelig for 244 prøver (256 primer kombinationer med 12 bruges til Tom brønde under PCR (figur 2)). Venligst klik her for at downloade denne fil.

Tabel 2: normalisering af randomiserede DNA prøver forud for og efter forstærkning. Eksempel regnearket oversigt over prøver i en randomiseret rækkefølge og med angivelse af deres placering på en enkelt 96-brønd plade, som også bestemmer primer kombinationen tildelt. Formler i den nederste række beskriver beregninger for at tilføje 100 ng af hver prøve til den normaliserede plade, plus mængden vand at nå 20 µL. Efter forstærkning, mængden af 100 ng af hver vellykket produkt beregnes og tilføjes en endelige pool. Mængden af "blank" PCR produkt til at tilføje til den sidste pool er gennemsnittet af de øvrige prøver. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 1: indbyrdes tilnærmelse af minimum root biomasse under prøvetagning. Når indsamling rødder, forsøger at indsamle mindst 500 mg af væv. Her, rødder indsamlet fra en ung sorghum plante (venstre, i både A og B) og unge ris plante (til højre) er vist ud for (A) og inde b 50 mL konisk rør. Begge prøver vejer ca. 1 g, men det er vigtigt at bemærke, at denne vægt omfatter rhizosfære og rod, og den rhizosfære vægt er i dette tilfælde cirka halvdelen den samlede vægt. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol viser en etableret rørledningen for at udforske rod endosphere, rhizosfære og jord mikrobielle samfund kompositioner, fra feltet prøveudtagning til prøve behandling og downstream sekventering. Studere root-associerede microbiomes præsenterer unikke udfordringer, skyldes dels de iboende vanskeligheder i prøvetagning fra jord. Jord er meget variabel i form af fysiske og kemiske egenskaber og forskellige jordbundsforhold kan være adskilt af så lidt som et par millimeter28,29. Dette kan føre til de prøver, som er indsamlet fra tilstødende prøveudtagning sites der betydeligt forskellige mikrobielle samfund kompositioner og aktiviteter30,31. Således bruge jord core samlere og skovle til at opretholde konsekvent prøveudtagning dybder og homogenisering forud for DNA-ekstraktion er afgørende for reproducerbarhed inden for roden microbiome undersøgelser. Det er også vigtigt at effektivt adskille de rhizosfære og rod fraktioner; ved hjælp af en barsk metode rod overflade sterilisation kan potentielt lyse endofytter inden for rødder inden DNA-ekstraktion, mens en mere konservativ vask ikke kan fjerne alle mikrober fra roden overfladen7. En anden vigtig faktor, der negativt kan påvirke eller forstyrre sekventering resultater er bakteriel forurening, som kan komme fra mange kilder og er undertiden umulig at skelne fra stikprøven miljømæssige bakterier32,33. Af denne grund, omhyggelig Sterilisation af prøveudtagning værktøjer, eksperimentelle materialer og arbejdsmiljøer er afgørende for at undgå kontaminering.

Efter prøvetagning er at opnå høj kvalitet DNA en høj prioritet for vellykket downstream analyser. Vores erfaring indeholder DNA-ekstraktion fra feltet vokset rod prøver gennem alternative metoder, såsom gennem CTAB-baseret udvinding, ofte betydeligt større mængder af humusfraktionerne syrer og andre forbindelser i forhold til rhizosfære og jorden prøver. Disse forbindelser kan forhindre den enzymatiske aktivitet af den DNA-polymerasen under PCR-amplifikation, selv ved lave koncentrationer34,35. Ved hjælp af DNA-ekstraktion kits designet til jord på roden prøver, i modsætning til en CTAB ekstraktion efterfulgt af en phenol chloroform oprydning, effektivt kan slippe prøver af humusfraktionerne syrer og vil resultere i høj kvalitet DNA36,37, 38,39. Derfor, vi anbefaler at bruge en kommercielt tilgængelig DNA udvinding kit for rod prøver så godt. Det skal bemærkes, at målet er at opnå mikrobielle genomisk DNA fra planternes rødder. Derfor, grundig og konsekvent root slibning er vigtigt at nedbryde plantevæv og lyse de mikrobielle celler for at frigive mikrobielle DNA uden at indføre skævhed mellem prøver på grund af variationen i slibning tryk og tid.

Efter omhyggelig udvinding af DNA fra prøver, der er to hovedkilder til problemer under forstærkning: 1) forurening af plantevæv med plante endosymbionts (grønkorn og mitokondrier) og 2) valg af 16S rRNA region til at forstærke. Forstærkningen fra grønkorn eller mitokondrier 16S rRNA sekvenser kan generere > 80% af sekvenser i rod prøver40, og mere i blad væv, selvom mængden af forurening er afhængig af valget af primere. Således er PNA klemmer nødvendige under trinnet PCR til at undertrykke plante vært grønkorn og mitokondriel 16S forurening27,41. Forskellige plantearter kan dog have variation i grønkorn og mitokondriel 16S sekvens27; Derfor er det vigtigt at bekræfte sekvensen af chlorplasttransitpeptidsekvensen og mitokondriel 16S gener af anlægget undersøgt før bibliotek sekventering, for at afgøre, om alternative PNA oligos er nødvendige (figur 3). Derudover består 16S rRNA gen af ni hypervariable regioner flankeret af ni konservative regioner; forskellige resultater kan opnås fra det samme fællesskab, afhængigt af hvilken hypervariable region er forstærket42. Tidligere undersøgelser har fundet V4-regionen til at være en af de mest pålidelige for tildeling af taksonomi43 og det har været brugt i andre omfattende microbiome undersøgelser11. Forlængelse af målet til regionen V3-V4 foreslås her at øge variabilitet og forbedre taksonomiske opløsning.

I denne protokol vist vi en pipeline for at udføre 16S rRNA-amplikon sekventering via næste generation sequencing (NGS) til at studere mikrobielle samfund kompositioner af miljøprøver12. Vi anbefaler at bruge amplikon sekventering som et redskab om fylogenetiske profilering, fordi det er relativt billige, høj overførselshastighed, og ikke kræver omfattende beregningsmæssige ekspertise eller ressourcer til at analysere. Mens vores metode fokuserer på at analysere den bakterielle brøkdel af microbiome, kan den nemt tilpasses for at undersøge svampe. Protokollen er identiske gennem trin 2, og den eneste forskel i trin 3 er hvad primere ville blive brugt under forstærkning. Men det er intet værd at amplikon baseret profilering er ikke uden begrænsninger. Ved sekventering en enkelt markørgen, er ingen oplysninger indhentet med hensyn til den funktionelle kapacitet af Fællesskabet. Derudover kan den taksonomiske beslutning være ganske lav, især når sekventering fra miljøer med en høj procentdel af uncharacterized mikrober. Dog sekventering teknologier udvikler sig hurtigt, og vi forventer potentiale til at behandle nogle af disse mangler ved at tilpasse denne protokol til brug med andre sekventering platforme. Endelig, som nævnt i indledningen, shotgun metagenomics og metatranscriptomics nemt kan udføres på jord og rhizosfære prøver, og metoder til at fjerne planten forurening fra plantevæv er i øjeblikket ved at blive undersøgt. Eksperimentelle design som par amplikon-baserede tilgange og andre metagenomic teknikker kan være særdeles effektiv i komplekse samfund hvor høj arternes mangfoldighed og ujævn repræsentation af taxa kan forhindre shotgun data fra præcist kendetegner mindre dominerende medlemmer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS understøttes af NSF Graduate Research Fellowship Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1-10/20 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-3810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000027 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes Eppendorf 3120000909 Can substitute with equivalent from other suppliers.
100 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000043 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1000 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1122-1830 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1620-2700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mm soil sieve Forestry Suppliers 60141009 Can substitute with equivalent from other suppliers.
200 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-8810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
25 mL reservoirs VWR International LLC 89094-664 Can substitute with equivalent from other suppliers.
50 mL conical vials Thermo Fisher Scientific 352098 Can substitute with equivalent from other suppliers.
500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) VWR International LLC 156-4020
96-well microplates USA Scientific 655900
96-well PCR plates BioRad HSP9631
Agencourt AMPure XP beads Thermo Fisher Scientific NC9933872 Instructions for use:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180
&documentName=B37419AA.pdf
Aluminum foil Boardwalk 7124 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Analytical scale with 0.001 g resolution Ohaus Pioneer PA323 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Bioruptor Plus ultrasonicator Diagenode B01020001
Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL New England Biolabs B9000S
Centrifuge Eppendorf 5811000908 Including 50mL and 96-well plate bucket adapters
Cryogenic gloves Millipore Sigma Z183490 Can substitute with equivalent from other suppliers.
DNeasy PowerClean kit (optional) Qiagen Inc. 12877-50 Previously MoBio
DNeasy PowerSoil kit Qiagen Inc. 12888-100 Previously MoBio
Dry ice Any NA
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher Scientific 12321D Do not substitute
Ethanol VWR International LLC 89125-188 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gallon size freezer bags Ziploc NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gemini EM Microplate Reader Molecular Devices EM Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top.
K2HPO4 Sigma-Aldrich P3786
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
Lab coat Workrite J1367 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 Any NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 dewar Thermo Fisher Scientific 4150-9000 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Milli-Q ultrapure water purification system Millipore Sigma SYNS0R0WW
Mini-centrifuge Eppendorf 5404000014
Molecular grade water Thermo Fisher Scientific 4387937 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Mortars VWR International LLC 89038-150 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Nitrile gloves Thermo Fisher Scientific 19167032B Can substitute with equivalent from other suppliers.
Paper towels VWR International LLC BWK6212 Can substitute with equivalent from other suppliers.
PCR plate sealing film Thermo Fisher Scientific NC9684493
PCR strip tubes USA Scientific 1402-2700
Pestles VWR International LLC 89038-166 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Plastic spatulas LevGo, Inc. 17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) Thermo Fisher Scientific 13000014
PNAs - chloroplast and mitochondrial PNA Bio NA Make sure to verify sequence bioinformatically
Protective eyewear Millipore Sigma Z759015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Qubit 3.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33216
Qubit dsDNA HS assay kit Thermo Fisher Scientific Q32854
Rubber mallet (optional) Ace Hardware 2258622 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shears or scissors VWR International LLC 89259-936 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shovel Home Depot 2597400 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Soil core collector (small diameter: <1 inch) Ben Meadows 221700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Spray bottles Santa Cruz Biotechnology sc-395278 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) IDT NA 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry.
Thermocycler Thermo Fisher Scientific E950040015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Weigh boats Spectrum Chemicals B6001W Can substitute with equivalent from other suppliers.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
  2. Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic classification of environmental 16S rRNA gene sequences. ISME J. 6 (7), 1440-1444 (2012).
  3. Takahashi, S., Tomita, J., Nishioka, K., Hisada, T., Nishijima, M. Development of a Prokaryotic Universal Primer for Simultaneous Analysis of Bacteria and Archaea Using Next-Generation Sequencing. PLoS One. 9 (8), e105592 (2014).
  4. Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics. PLoS One. 9 (4), e93827 (2014).
  5. Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Front Plant Sci. 5, 209 (2014).
  6. Jiao, J. -Y., Wang, H. -X., Zeng, Y., Shen, Y. -M. Enrichment for microbes living in association with plant tissues. J Appl Microbiol. 100 (4), 830-837 (2006).
  7. Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Front Microbiol. 7, 773 (2016).
  8. Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R., Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 5709, 623-628 (2011).
  9. Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
  10. Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLoS Biol. 15 (3), e2001793 (2017).
  11. Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. , (2017).
  12. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  13. Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform. Appl Environ Microb. 79 (17), 5112-5120 (2013).
  14. Degnan, P. H., Ochman, H. Illumina-based analysis of microbial community diversity. ISME J. 6 (1), 183-194 (2012).
  15. Naylor, D., DeGraaf, S., Purdom, E., Coleman-Derr, D. Drought and host selection influence bacterial community dynamics in the grass root microbiome. ISME J. , (2017).
  16. Desgarennes, D., Garrido, E., Torres-Gomez, M. J., Peña-Cabriales, J. J., Partida-Martinez, L. P. Diazotrophic potential among bacterial communities associated with wild and cultivated Agave species. FEMS Microbiol Ecol. 90 (3), 844-857 (2014).
  17. Coleman-Derr, D., et al. Plant compartment and biogeography affect microbiome composition in cultivated and native Agave species. New Phytol. 209 (2), 798-811 (2016).
  18. De Tender, C., et al. Dynamics in the Strawberry Rhizosphere Microbiome in Response to Biochar and Botrytis cinerea Leaf Infection. Front Microbiol. 7, 2062 (2016).
  19. Kapp, J. R., et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol. 68 (2), 111-118 (2015).
  20. Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
  21. O'Neill, M., McPartlin, J., Arthure, K., Riedel, S., McMillan, N. Comparison of the TLDA with the Nanodrop and the reference Qubit system. J Phys Conf Ser. 307 (1), 012047 (2011).
  22. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  23. Amir, A., et al. Deblur Rapidly Resolves Single-Nucleotide Community Sequence Patterns. mSystems. 2 (2), e00191-e00116 (2017).
  24. Edgar, R. C. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. bioRxiv. , 081257 (2016).
  25. Nguyen, N. -P., Warnow, T., Pop, M., White, B. A perspective on 16S rRNA operational taxonomic unit clustering using sequence similarity. NPJ Biofilms Microbiomes. 2, 16004 (2016).
  26. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Holmes, S. P. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. , (2017).
  27. Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nat Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
  28. O'Brien, S. L., et al. Spatial scale drives patterns in soil bacterial diversity. Environ Microbiol. 18 (6), 2039-2051 (2016).
  29. Fierer, N., Lennon, J. T. The generation and maintenance of diversity in microbial communities. Am J Bot. 98 (3), 439-448 (2011).
  30. Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nat Rev Microbiol. 15 (10), 579-590 (2017).
  31. Buckley, D. H., Schmidt, T. M. Diversity and dynamics of microbial communities in soils from agro-ecosystems. Environ Microbiol. 5 (6), 441-452 (2003).
  32. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
  33. Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
  34. Sutlović, D., Definis Gojanović, M., Andelinović, S., Gugić, D., Primorac, D. Taq polymerase reverses inhibition of quantitative real time polymerase chain reaction by humic acid. Croat Med J. 46 (4), 556-562 (2005).
  35. Sutlovic, D., Gamulin, S., Definis-Gojanovic, M., Gugic, D., Andjelinovic, S. Interaction of humic acids with human DNA: proposed mechanisms and kinetics. Electrophoresis. 29 (7), 1467-1472 (2008).
  36. Aleklett, K., Leff, J. W., Fierer, N., Hart, M. Wild plant species growing closely connected in a subalpine meadow host distinct root-associated bacterial communities. PeerJ. 3, e804 (2015).
  37. Bogas, A. C., et al. Endophytic bacterial diversity in the phyllosphere of Amazon Paullinia cupana associated with asymptomatic and symptomatic anthracnose. Springerplus. 4, 258 (2015).
  38. Hiscox, J., Savoury, M., Müller, C. T., Lindahl, B. D., Rogers, H. J., Boddy, L. Priority effects during fungal community establishment in beech wood. ISME J. 9 (10), 2246-2260 (2015).
  39. Zhang, T., Yao, Y. -F. Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific. PLoS One. 10 (6), e0130051 (2015).
  40. Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. PLoS One. 8 (8), e71360 (2013).
  41. Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity. Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).
  42. Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -A. Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems. Appl Environ Microb. 80 (15), 4626-4639 (2014).
  43. Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -Y. Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC Bioinformatics. 17, 135 (2016).

Tags

Genetik spørgsmålet 135 16S rRNA sekventering rod endosphere rhizosfære jord microbiome fylogenetiske profilering
At udforske Root Microbiome: udtrække bakteriel Fællesskabets Data fra jord, rhizosfære og rod Endosphere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Simmons, T., Caddell, D. F., Deng,… More

Simmons, T., Caddell, D. F., Deng, S., Coleman-Derr, D. Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere. J. Vis. Exp. (135), e57561, doi:10.3791/57561 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter