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Genetics

Explorant le Microbiome racine : extraire les données de la communauté bactérienne du sol, rhizosphère et racine endosphère

doi: 10.3791/57561 Published: May 2, 2018

Summary

Nous décrivons ici un protocole pour obtenir des données de séquence amplicon du sol, la rhizosphère et racine endosphère microbiomes. Cette information peut être utilisée pour étudier la composition et la diversité des communautés microbiennes associées aux plantes et est adaptée pour l’utilisation avec un large éventail d’espèces végétales.

Abstract

L’interaction intime entre la plante hôte et les microorganismes associés est cruciale dans la détermination de remise en forme de plante et peut favoriser l’amélioration de la tolérance aux stress abiotiques et aux maladies. Le microbiome usine peut être très complexes et à faible coût, haut débit méthodes telles que l’amplicon basée sur le séquençage du gène de l’ARNr 16 s sont souvent préférées pour caractériser sa composition microbienne et sa diversité. Toutefois, le choix d’une méthodologie appropriée lorsqu’il procède à de telles expériences est essentiel pour réduire les préjugés qui peuvent compliquer l’analyse et des comparaisons entre les études et les échantillons. Ce protocole décrit en détail une méthode normalisée pour la collecte et l’extraction de l’ADN d’échantillons de sol, rhizosphère et racine. En outre, nous mettre en évidence un pipeline bien établi 16 s rRNA amplicon séquençage qui permet l’exploration de la composition des communautés bactériennes dans ces échantillons et peut facilement être adaptées pour d’autres gènes marqueurs. Ce gazoduc a été validé pour une variété d’espèces de plantes, y compris le sorgho, le maïs, blé, fraise et agave et peut aider à surmonter les problèmes associés à la contamination des organelles de la plante.

Introduction

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Associées aux plantes microbiomes se composent des communautés microbiennes dynamiques et complexes, composées de bactéries, archées, virus, champignons et autres micro-organismes eucaryotes. Outre leur rôle bien étudié en provoquant des maladies des plantes, associées aux plantes microbes peuvent également influencera phytosanitaire en améliorer la tolérance aux stress biotiques et abiotiques, promouvoir la disponibilité des nutriments et l’amélioration de la croissance des plantes par le biais la production des phytohormones. Pour cette raison, un intérêt particulier existe pour caractériser les taxons qui associent à la plante racine endosphères, rhizosphères et le sol environnant. Alors que certains microbes peuvent être cultivés dans un isolement sur milieux généré de laboratoire, beaucoup ne peuvent pas, en partie parce qu’ils peuvent compter sur des relations symbiotiques avec d’autres microbes, poussent très lentement, ou nécessitent des conditions qui ne peuvent pas être répliquées dans un environnement de laboratoire. Parce qu’il contourne la nécessité pour la culture et est relativement peu coûteux et haut-débit, profilage phylogénétique basé sur séquence d’échantillons microbiens environnementaux et liés à l’hôte est devenue une méthode de choix pour doser la communauté microbienne composition.

La sélection des technologies de séquençage approprié fourni par divers prochaine génération séquençage (NGS) plates-formes1 repose sur les besoins des utilisateurs, avec des facteurs importants dont : couverture désirée, longueur de l’amplicon, attendu communautaire diversité, ainsi que le séquençage de taux d’erreur, lire-la longueur et le coût-par-run/megabase. Une autre variable qui doit être examinée dans les expériences de séquençage axée sur l’amplicon est quels gènes seront amplifiés et quelles amorces seront utilisés. Lors de la conception ou choix d’amorces, chercheurs sont souvent contraints d’opérer compromis entre l’universalité de l’amplification et la résolution taxonomique réalisable depuis les amplicons qui en résulte. Pour cette raison, ces types d’études choisi souvent des amorces et des marqueurs qui ciblent sélectivement des sous-ensembles spécifiques du microbiome. Évaluation de la composition des communautés bactériennes est couramment exécutée par séquençage un ou plusieurs des régions hypervariables des bactérienne 16 s rRNA gene2,3. Dans cette étude, les auteurs décrivent un amplicon basé le séquençage protocole développé pour une plate-forme NGS région du gène de l’ARNr 16 s bactérienne, qui permet une amplification large de taxons bactériens tout en offrant une variabilité suffisante pour cibles les 500 bp V3-V4 distinguer les différents taxons. En outre, le présent protocole peut être facilement adapté pour l’utilisation avec d’autres paires d’amorces, telles que celles qui visent le marqueur ITS2 de champignons ou de la sous-unité d’ARNr 18 s des eucaryotes.

Tandis que d’autres approches comme fusil métagénomique, metatranscriptomics et séquençage des unicellulaires, offrent des autres avantages notamment résolu de génomes microbiens et une mesure plus directe de la fonction communautaire, ces techniques sont généralement plus cher et par le calcul intensif que le profilage phylogénétique décrites ici4. En outre, exécutant fusil métagénomique et metatranscriptomics sur des échantillons de racines donne un pourcentage élevé de lectures appartenant au génome de la plante hôte, et des méthodes pour contourner cette limitation sont toujours développés5,6.

Comme avec n’importe quelle plateforme expérimentale, axée sur l’amplicon profilage peut introduire un certain nombre de biais potentiels qui doivent être considérés lors de l’analyse de données et la conception expérimentale. Il s’agit de méthodes de prélèvement d’échantillons ADN extraction, choix des amorces de PCR et comment la préparation de la bibliothèque est effectuée. Différentes méthodes peuvent avoir un impact significativement la quantité de données utilisables générées et peuvent aussi entraver les efforts visant à comparer les résultats entre les études. Par exemple, la méthode d’élimination de bactéries rhizosphère7 et l’utilisation de techniques d’extraction différente ou choix de DNA extraction kits8,9 montrent significativement en aval l’étude d’impact, ce qui conduit à conclusions différentes concernant les microbes sont présents et leur abondance relative. Étant donné que le profilage basé sur amplicon peut être personnalisé, faire des comparaisons entre les études peut être difficile. La terre Microbiome Project a suggéré que les chercheurs qui étudient les systèmes complexes comme le microbiome associées aux plantes bénéficieraient de l’élaboration de protocoles normalisés comme un moyen d’atténuer la variabilité causée par l’application de différentes méthodes entre études10,11. Ici, nous discutons beaucoup des thèmes ci-dessus et approprié de présenter des propositions quant à où les meilleures pratiques.

Le protocole montre le processus de collecte de sol rhizosphère et échantillons de racines de Sorghum bicolor et extraction ADN à l’aide d’un kit isolement d’ADN bien établi11. En outre, notre protocole inclut un flux de travail de séquençage détaillé amplicon, utilisant une plate-forme NGS couramment utilisée, pour déterminer la structure des communautés bactériennes12,13,14. Ce protocole a été validé pour l’usage dans une large gamme de plantes-hôtes dans une récente étude publiée des racines, rhizosphère et associés-les sols de 18 espèces de monocotylédones dont Sorghum bicolor, Zea mays et Triticum aestivum15. Cette méthode a également été validée pour être utilisé avec d’autres gènes marqueurs, comme en témoigne son application réussie à l’étude du gène de marqueur ITS2 fongique dans les études de l’agave microbiome16,17 et fraise microbiome 18.

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Protocol

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1. collecte et séparation des racines endosphère, la rhizosphère et des échantillons de sol

  1. Avant d’entrer dans le champ, l’eau ultrapure (au moins 90 mL d’eau par exemple) autoclave pour stériliser. Préparer, tampon de retrait épiphyte (au moins 25 mL par exemple) en ajoutant 6,75 g de KH2PO4, 8,75 g K2HPO4et 1 mL de Triton X-100, à 1 L d’eau stérile. Stériliser le tampon à l’aide d’un filtre à vide avec 0.2 µm taille de pores.
    1. Pour les étapes 1,2 à 1,5, porter des gants propres stérilisés avec de l’éthanol à toutes les fois et remplacer les gants entre chaque échantillon pour prévenir la contamination. Stériliser tous les appareils avec l’éthanol à 70 % et nettoyez tous les équipements entre les échantillons. Avant l’échantillonnage, déterminer la profondeur d’échantillonnage optimal pour votre expérience et être compatible avec toutes les collections de sol et des racines.
  2. Pour collecter des échantillons de sol en vrac, utilisez un collectionneur de noyau de sols stérilisés à l’éthanol pour obtenir du sol qui est exempt des racines des plantes en recueillant un noyau environ 23 à 30 cm de la base de la plante.
  3. Transférer le sol dans un sac en plastique, homogénéiser le sol en agitant doucement et transférer une partie aliquote de l’échantillon de sol (environ 600 mg) pour remplir un tube de 2 mL. Placer immédiatement le tube 2 mL sur la glace sèche ou flash freeze le tube dans le liquide N2 jusqu’au moment de procéder à l’extraction de l’ADN (étape 2).
    1. Dans certains environnements, le sol environnant peut contenir des matières végétales. Dans ce cas, utilisez un tamis stérilisée de 2 mm pour séparer les débris végétaux du sol avant de placer dans le sac en plastique.
  4. Pour collecter la racine et la rhizosphère, utilisez une pelle stérilisées en éthanol pour creuser vers le haut de la plante, en prenant soin d’obtenir autant de la racine que possible. Profondeur dépend directement de l’usine. Tandis que les petites plantes comme le blé peuvent être retirés en creusant de plusieurs centimètres, les grandes usines comme le sorgho peuvent exiger 30 cm ou plus. Secouer doucement excessif de sol des racines jusqu'à ce qu’il y a environ 2 mm du sol adhérant à la surface des racines.
    Remarque : prendre soin lorsque vous travaillez avec des petites plantes, avec des racines fragiles, ou dans les sols secs, haute-argile contenus. Idéalement, il faut seulement une mince couche de sol restant sur les racines après agitation. Si les grands agrégats du sol restent, un maillet en caoutchouc peut être utilisé pour déloger le sol en appuyant doucement sur la base de la tige. Si le montant du sol qui reste après ce processus supérieur ou inférieur à 2 mm, on notera l’épaisseur approximative.
  5. Pour les grandes usines, utiliser ciseaux stériles et/ou des cisailles pour couper un paragraphe représentatif des racines et placer un minimum de 500 mg de tissus racinaires dans une fiole conique de 50 mL. Pour les plus petites graminées, placer l’ensemble du système racinaire dans le flacon. Ajouter suffisamment épiphyte de tampon d’enlèvement pour couvrir les racines, puis placer immédiatement l’échantillon sur la glace sèche ou flash freeze l’échantillon liquide N2.
    Remarque : s’assurer pour ne pas trop remplir la fiole conique de 50 mL, car il sera difficile de laver l’étape. Il faut suffisamment d’espace vide, telle que la mémoire tampon épiphyte est capable de s’écouler vers le bas, entourent les racines tout au long de la fiole et couvrez le dessus. Parce que certaines graminées ont plus de biomasse racinaire ne tiendront dans une fiole conique de 50 mL, une sous-section des racines doit être recueillie. Toutefois, il est à noter que couper les racines pourrait conduire à des bactéries endophytes étant emportées dans la fraction de la rhizosphère, donc casser racines doit être minimisée. Si les échantillons ne sont pas traités immédiatement après son retour au laboratoire, ils peuvent être conservés à-80 ° C.
  6. Pour séparer les racines de la rhizosphère, décongeler l’échantillon de racine sur la glace, puis laisser agir les échantillons de racines à 4 ° C pendant 10 min avec des impulsions de 160 W pour 30 s, séparés par transfert s. 30 les racines dans un frais (4 ° C), nettoyer le tube à 50 mL à l’aide d’une pince stérile. Ne pas jeter le tube original avec tampon et le sol, qui est la fraction de la rhizosphère (Figure 1).
  7. Centrifuger le tube contenant un tampon et rhizosphère de Flash 10 min à 4 ° C, 4 000 x g. décanter le liquide surnageant, geler le tube contenant la fraction de la rhizosphère en liquide N2et stocker la fraction de la rhizosphère à-80 ° C jusqu’au moment de procéder à l’ADN extraction (étape 2).
  8. Pour laver les racines, ajoutez environ 20 mL d’eau stérile de frais (4 ° C) pour la fraction de la racine. Lavez la racine en agitant vigoureusement (à la main ou table de mixage, pour 15-30 s) et puis videz l’eau.
  9. Répétez cette opération au moins deux fois, jusqu'à ce qu’aucune saleté de la surface des racines. Si l’extraction de l’ADN (étape 2) n’est pas effectuée immédiatement, envelopper les racines en feuille d’aluminium stérile, flash geler les racines liquide N2et magasin les échantillons à-80 ° C jusqu'à prêt à procéder à l’extraction d’ADN.

2. Extraction d’ADN

Remarque : Tout au long des étapes 2 et 3, des gants propres stérilisés avec de l’éthanol doivent être portées en tout temps et tous les travaux doivent être effectués sur une surface stérilisée avec de l’éthanol.

  1. Extraire l’ADN des échantillons de sol et la rhizosphère.
    1. Utiliser une spatule stérile pour transférer rapidement les 250 mg de sol et la rhizosphère d’étapes 1.3 et 1.7 dans des tubes de collecte sélective fournie dans un kit d’isolation ADN commercial conçu pour l’extraction du sol, puis procéder à l’isolement d’ADN à l’aide du fournisseur de la trousse Protocole.
    2. Après élution de l’ADN dans le tampon d’élution, fourni par le kit d’isolation de l’ADN, stocker l’ADN à-20 ° C jusqu’au moment de passer à l’étape 3.
  2. Extraire l’ADN d’échantillons de la racine.
    1. Faites refroidir un stérilisé mortier et un pilon à l’aide de liquide N2. Mesurer 600 à 700 mg de tissus racinaires et placez le tissu dans le mortier. Ajouter avec précaution, assez liquide N2 pour couvrir les racines.
    2. Broyer les racines en petits morceaux. Poursuivre le processus d’ajout de liquide N2 et meulage (au moins deux fois, être cohérent entre les échantillons), jusqu'à ce que les racines sont une poudre fine. Veiller à ce que les tissus racinaires ne pas décongeler pendant cette étape.
      ATTENTION : Utiliser les équipement de protection individuelle approprié (blouse, lunettes de protection et des gants cryogéniques) quand travailler avec liquide N2.
      Remarque : Pour une extraction d’ADN de faible qualité, il peut être bénéfique broyer les racines excédentaires en poudre et de stocker la poudre à-80 ° C.
    3. Rapidement, avant la racine poudre commence à dégeler, utiliser une spatule stérile pour transférer la poudre de racine dans tubes pré-pesés 1,5 mL sur la glace. Noter le poids du tube et de poudre. En règle générale, 300-400 mg de poudre est transférée.
    4. Utiliser une spatule stérile pour transférer rapidement 150 mg de poudre de la racine vers le tube de prélèvement fourni dans un kit d’isolation ADN commercial conçu pour l’extraction du sol, puis procéder à l’isolement d’ADN utilisant le protocole du fournisseur de la trousse.
      Remarque : Pour certains échantillons de racines, il peut y avoir une forte concentration de matières organiques restantes dans le granule d’ADN, qui empêche l’amplification de l’ADN pendant l’ACP, en particulier lorsqu’un protocole d’extraction d’ADN différent (p. ex.., extraction de CTAB) est utilisé. Si nécessaire, nettoyer l’ADN en suivant les instructions fournies dans le kit de nettoyage ADN environnemental.
  3. Mesurer la concentration de tous les échantillons d’ADN à l’aide d’un fluorimètre de benchtop de haute sensibilité.
    1. Ajoutez 1-20 µL de chaque échantillon d’ADN éluée dans des tubes fournis dans le kit de test de haute sensibilité ADN double brin. Ajouter la solution de travail fluorimètre (colorant : tampon de 1 : 200) jusqu'à 200 µL.
    2. Préparer deux tubes supplémentaires contenant 10 µL d’ADN standard 1 (0 ng/µL ADN) ou 10 µL de standard 2 (100 ng/µL) et ajouter 190 µL de solution de travail fluorimètre à chaque norme.
    3. Mesurer la concentration des normes et de chaque échantillon. S’il n’est pas fait automatiquement, calculer la concentration d’ADN de la sortie de l’absorbance par une régression linéaire des deux normes.

3. présentation et préparation de la bibliothèque de l’Amplicon

  1. Mettre en place des matériaux pour la réaction d’amplification.
    1. Décongeler les échantillons d’ADN à 4 ° C et les garder sur la glace tout au long de l’étape 3. Randomiser l’ordre des échantillons d’ADN pour minimiser le biais dû à l’emplacement sur la plaque PCR (tableau 2).
    2. Dans un plat de PCR 96 puits, diluer ADN chaque échantillon dans l’eau moléculaire de qualité à 5 ng/µL dans un volume total de 20 µL. Ajouter 20 µL d’eau moléculaire de qualité sur les puits de quatre coin comme contrôles négatifs pour l’amplification (vides) (tableau 2).
    3. Organiser les amorces avec code à barres (10 µM) en tubes de bande PCR ou une plaque à 96 puits, tels qu’ils peuvent être ajoutés à l’aide d’une pipette multicanaux (Figure 2).
    4. Préparer suffisamment mélange maître PCR pour amplifier chaque échantillon d’ADN en triple exemplaire. Préparer 1,5 µL de BSA (20 mg/mL), 37,5 µL de pré-faites 2 x mélange principal (composé de tampon PCR, MgCl2, dNTPs et Taq DNA polymérase), 0,57 µL du chloroplaste PNA (100 µM), 0,57 µL de PNA mitochondriale (100 µM) et 25.86 µL d’eau moléculaire de catégorie.
    5. Versez le mélange maître dans un stérile 25 mL de réservoir pipette multicanaux et distribuer 66 µL du mélange maître dans chaque cupule d’une nouvelle plaque PCR 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux.
      Remarque : Lors du calcul des volumes de réactifs pour master mix, assurez-vous d’inclure également les 4 puits vides par plaque.
    6. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 6 µL de 5 ng/µL ADN (à partir de la plaque d’ADN normalisée) sur la plaque de mélange principal. Puis ajoutez à la µL de plat principal 1,5 d’apprêt avant de 10 µM, telle que chaque colonne possède un code-barres différent avant et 1,5 µL de 10 µM inverser apprêt tels que chaque ligne possède un code-barres différent inverse (Figure 2).
      Remarque : Avant d’ajouter les amorces, les plaques randomisés et les mélange maître pourraient servir pour amplifier les gènes fongiques STI ou ITS2 si différentes amorces ont été ajoutés. Si c’est le cas, une conception similaire d’amorce peut être utilisée.
    7. Centrifuger la plaque brièvement à 3 000 x g. Utilisez une pipette multi-canaux pour mélanger doucement, puis diviser en trois plaques et 25 µL du mélange réactionnel.
      Remarque : Bien que trois répétitions ne sont pas strictement nécessaires, il diminue l’incidence de la variabilité technique.
  2. Amplifier l’ADN dans chaque assiette en utilisant un thermocycleur défini aux conditions suivantes : 180 s à 98 ° C, 30 cycles de : 98 ° C pour 45 s (dénaturation), 78 ° C pendant 10 s (PNA recuit), 55 ° C pendant 60 s (apprêt recuit) et 72 ° C pendant 90 s (extension) , puis 600 s à 72 ° C, suivie d’un 4C ° tenir étape. Après l’amplification, centraliser les trois plaques répétées dans une seule plaque 96 puits.
  3. Quantifier l’ADN à l’aide de réactifs de haute sensibilité fluorimètre dans un lecteur de plaque à 96 puits.
    1. Ajouter 2 µL de chaque produit PCR d’une microplaque 96 puits, ainsi que 98 µL de solution de travail fluorimètre (colorant : tampon de 1 : 200). Comprend 4 puits en tant que normes : 5 µL d’ADN 1 standard (0 ng/µL ADN), 1 µL de norme 2 (10 ng/µL), 2 µL de norme 2 (20 ng/µL) et 5 µL de 2 standard (50 ng/µL). Ajoutez ensuite la solution de travail fluorimètre pour un volume final de 100 µL.
      Remarque : Chaque échantillon peut être mesurée au moyen d’un fluorimètre benchtop comme indiqué au point 2.3, si un lecteur n’est pas disponible.
    2. Calculer la concentration d’ADN de la sortie de l’absorbance par une régression linéaire des quatre normes.
    3. Pour le code-barres avec succès amplifié produits (ceux qui ont une concentration supérieure à 15 ng/µL), piscine de 100 ng de chaque échantillon dans un tube unique de 1,5 mL (tableau 2).
    4. Calculer le volume moyen des échantillons ajoutés au pool en utilisant la fonction =AVERAGE() dans un tableur. Ajouter le volume des produits PCR « en blanc » pour les pools d’échantillons.
      Remarque : Étant donné que les produits PCR « en blanc » ont leurs propres combinaisons de code à barres unique, ils peuvent être séquencés pour vérifier tout contaminant de laboratoire.
  4. Mesurer la concentration du produit mis en commun à l’aide d’un fluorimètre benchtop tel que décrit à l’étape 2.3 et prendre 600 ng d’ADN et diluer dans l’eau moléculaire de qualité pour un volume final de 100 µL dans un tube de 1,5 mL. Stocker le produit restant groupé à-20 ° C.
  5. Laver l’ADN ng 600 aliquote en suivant le processus de purification PCR établi avec des perles de purification paramagnétique dans un format 96 puits à quelques exceptions près.
    1. Faire une douce 600 µL aliquote d’éthanol à 70 %. Agiter vigoureusement la bouteille de billes magnétiques pour remettre en suspension les perles qui se déposent au fond.
    2. Ajouter 1 volume x (100 µL) de solution de perle à l’aliquote de 600 ng d’ADN. Bien mélanger en pipettant également 10 fois. Incuber 5 min à température ambiante.
    3. Placer le tube sur le support magnétique, 2 min (ou jusqu'à ce que la solution est claire) pour séparer les perles de la solution. Alors que le tube est toujours dans le support magnétique, aspirer le surnageant clair soigneusement sans toucher les billes magnétiques et éliminer le surnageant clair.
      Remarque : À ce stade, les produits amplicon respectent les billes magnétiques. Les perles qui sont perturbée ou perdue pendant aspiration seront traduira par une perte de l’ADN.
    4. Maintenir le tube dans le support magnétique et ajouter 300 µL d’éthanol à 70 % dans le tube ; Incuber à température ambiante pendant 30 s. aspirer à l’éthanol et le jeter. Répétez ce processus et enlever tout l’éthanol après le deuxième lavage. Enlever le tube du support magnétique et laisser sécher pendant 5 min.
    5. Ajouter 30 µL d’eau moléculaire de qualité aux talons secs et mélanger en pipettant également 10 fois. Incuber à température ambiante pendant 2 min. retour du tube sur le support magnétique pendant 1 min pour séparer les billes de solution. Transférer l’éluat dans un nouveau tube.
      Remarque : Les billes magnétiques n’affectera pas les réactions en aval.
  6. Mesurer la concentration finale de nettoyé, mis en commun ADN à l’aide d’un fluorimètre benchtop comme indiqué au point 2.3. Diluer une aliquote de 10 nM dans un volume final de 30 µL, ou à la concentration et volume préféré par l’installation de séquençage.
  7. Utiliser les services d’une installation de séquençage à séquencer l’ADN sur une plate-forme NGS, 2 x 300 séquençage jumelé-fin de bp.

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Representative Results

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Exécutant le protocole recommandé devrait se traduire par un ensemble de données indexées lectures jumelé-fin qui peut être assorti à chaque échantillon et assignés à une ou l’autre bactérienne des unités taxonomiques opérationnelles (UTO) ou une séquence exacte variante (ESV, également dénommé amplicon variante de séquence (ASV) et sub-operational unité taxonomique (sOTU)), selon l’analyse en aval. Afin d’obtenir des données sur les séquences de haute qualité, il faut à chaque étape pour maintenir la cohérence entre les échantillons et de minimiser l’introduction de tout biais potentiel durant le traitement des échantillons ou de la préparation de la bibliothèque. Après la collecte, traitement et extraire l’ADN à partir d’échantillons (étapes 1 et 2), l’éluat qui en résulte doit apparaître clair et exempt de matières organiques qui inhiberaient l’amplification. Tandis que la pureté peut être vérifiée en mesurant chaque échantillon d’ADN par un spectrophotomètre microvolume, nous avons constaté que le sol kit d’extraction d’ADN supprime efficacement tous les contaminants. En raison de la qualité de l’ADN prévisible, les méthodes de quantification qui s’appuient sur des colorants à base de fluorescence qui lient spécifiquement l’ADN sont plus appropriées que celles fondées sur l’UV absorbance19,20,21. Avant l’amplification par PCR, échantillons de sol et la rhizosphère en moyenne environ 10 ng/µL ADN, tandis que des échantillons de racines ont typiquement une concentration moyenne d’environ 30 ng/µL (tableau 2).

Suite à l’amplification de l’ADN environnemental (étape 3), le succès ou l’échec peut être déterminé en mesurant la concentration du produit PCR via réactifs fluorimètre benchtop sur un lecteur de plaque, si disponible, ou manuellement (tableau 2). Dans notre expérience, amplifications réussies qui donnent lieu à des données de haute qualité amplicon produisent plus de 15 produits PCR ng/µL. S’il y a plusieurs échecs sur une plaque, l’arrangement positionnel au sein de l’usine et le type d’échantillon des échantillons ayant échouées peut-être aider à déterminer le problème. Par exemple, s’ils sont tous adjacents sur la plaque, cela peut indiquer erreur pipette, alors que si ils sont tous dans la même ligne ou colonne, il pourrait suggérer des questions avec un apprêt spécifique. Si elles appartiennent toutes au même type d’échantillon, il pourrait suggérer des problèmes de traitement des échantillons ou extraction de l’ADN.

Il est important de vérifier la compatibilité des PNAs universels avec votre bioinformatically système de végétaux spécifiques lors de la conception expérimentale afin de vérifier qu’ils bloqueront l’amplification des chloroplastes et des gènes mitochondriaux 16. Après l’étape d’amplification, il n’est pas clair si les PNAs liée avec succès à mitochondrial et chloroplastique modèles ; Ceci est révélé seulement après séquençage (Figure 3). Pour faire en sorte que les PNAs seront bloque efficacement l’amplification contaminant, un alignement de la séquence de l’ANP à chaque chloroplastiques et un gène d’ARNr 16 s mitochondrial (il peut y avoir plusieurs copies) pour l’usine hôte étant l’objet d’une enquête ne devrait pas révéler toute inadéquation . Même une seule incompatibilité à la séquence PNA bp 13, surtout dans le milieu de la pince de la PNA, peut réduire considérablement l’efficacité, comme dans le cas de la séquence PNA chloroplastique fourni et le gène d’ARNr 16 s des chloroplastes de Lactuca sativa (laitue) ( Figure 3).

Étant donné que la même quantité d’ADN amplifié est mis en commun par exemple, il devrait être environ même obtenir un numéro de lectures par exemple après le séquençage et le tri des lectures en fonction de leur index avec code à barres (Figure 4). La majorité de ces lectures doit correspondre à des taxons bactériens. Tout eucaryotes, mitochondriale, ou chloroplaste matches devraient être jetées. Selon le pipeline d’analyse et de la base de données taxonomique choisi, chloroplastiques et mitochondries lectures peuvent par erreur être assignés aux lignées bactériennes, souvent des cyanobactéries et Rickesttia, respectivement (Figure 3). Un degré de curation manuelle est souvent prudent de vérifier ces affectations erronées courantes. Détails précis dépendra le choix de l’analyse, mais les profils d’abondance relative doivent généralement être similaires (différence non significative) chez les réplicats biologiques et significativement différente entre les sols, la rhizosphère et des échantillons de racines (Figure 5 ). Il est important de noter, toutefois, que, bien qu’il ne peut y avoir aucune différence significative entre les réplicats biologiques, il est important de recueillir au moins trois répétitions par.

Méthodes d’interprétation des données obtenues lors de ces expériences sont vivement débattues parmi les écologistes microbiennes. Jusqu'à tout récemment, le séquençage amplicon a été dépendant de grouper les lectures dans OTUs. Cependant, ceux-ci sont problématiques parce que : 1) elles sont basées sur un seuil quelque peu arbitraire de 97 % de similarité, diversité 2) est souvent sous-estimée, et 3) il peut y avoir des basse résolution taxonomique. Récemment les outils développés tels que DADA2 non-flou et UNOISE222,23,24 sont capables de trier les lectures dans des ESV, ce qui résout certains problèmes posés lors de l’utilisation de OTUs. Mises en garde à l’utilisation d’ESV comprennent : 1) artificielle augmente la diversité en raison des différences en ARNr exemplaires au sein d’une espèce et 2) augmentation de la sensibilité de la PCR et séquençage des erreurs25,26.

Figure 1
Figure 1 : séparation des fractions de racine et de la rhizosphère. Diagramme montrant les étapes pour la séparation de la rhizosphère des échantillons de racine, suivi par lavage des racines avec de l’eau stérile pour enlever tout organisme rhizoplan restants. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : exemple de mise en stock primer pour l’amplification et la répartition au sein des plaques. Amorces stocks (tableau 1) peuvent être préparés dans des tubes de la bande pour une distribution optimale au sein des plaques à 96 puits (chaque bande d’amorces est représentée par une couleur différente ; violet pour les amorces avant 1-8, orange pour transmettre des amorces 9-16, bleu pour les amorces inverses 1-12 et vert pour inverser les amorces 13-16.) Dans ce cas, 16 amorces inverses vers l’avant et 16 peuvent être distribués en efficacement avec une pipette multicanaux tels que chacun a bien une combinaison de code à barres unique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : résultats qui suggèrent des chloroplastes PNA sont inefficace. Résultat représentatif de la rhizosphère (« Rhizo »), racine et les échantillons de sol de laitue qui étaient non traitées (NT) ou traitées (VT) avec un amendement de sol biologique. La séquence PNA utilisée pour bloquer la contamination des chloroplastes des plantes la plupart est GGCTCAACCCTGGACAG27. Toutefois, la laitue contient une incohérence dans le gène de l’ARN ribosomique 16 s de chloroplaste (GGCTCAACTCTGGACAG). Cela rend l’ANP inefficace, ce qui entraîne une forte abondance relative des lectures qui correspondent aux cyanobactéries dans les échantillons de la rhizosphère et racine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Distribution de lecture compte parmi les échantillons dans une bibliothèque. Diagramme à barres indiquant le nombre de lire des comtes (axe y) de différents échantillons (bars, axe x), correspondant à la combinaison de codes à barres dans la lecture. Le nombre de lectures par exemple peut varier selon combien d’échantillons est dans la bibliothèque ; ce sous-ensemble a été séquencé dans une bibliothèque de 192 échantillons. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : abondance Relative des classes dans la racine, la rhizosphère et les communautés du sol haut 12. Histogramme montrant l’abondance relative des classes présentes dans un dataset représentant 16 s contenant 6 réplique pour chaque type d’échantillon (sol en vrac, la rhizosphère et racine endosphère). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : amorces pour amplifier la région V3-V4 du gène de l’ARNr 16 s. Amorces sont composées de, dans l’ordre : un adaptateur pour un espaceur de longueur variable, l’amorce pour la NGS, un code-barres unique, une plate-forme commune de NGS pour décaler le cadre pour le séquençage et une amorce PCR universelle qui amplifie 341F ou 785R du gène de l’ARNr 16 s. Le nombre d’amorces nécessaire dépend de combien d’échantillons est séquencés par bibliothèque ; une combinaison de 16 amorces inverses vers l’avant et 16 suffit pour 244 échantillons (256 combinaisons d’amorces avec 12 utilisé pour puits vides pendant l’ACP (Figure 2)). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Tableau 2 : normalisation de l’ADN randomisée des échantillons avant et après amplification. Exemple feuille de calcul répertoriant les échantillons dans un ordre aléatoire et indiquant leur localisation sur une seule plaque 96 puits, qui détermine également la combinaison d’amorces lui sont confiée. Décrivent les formules dans la rangée du bas calculs pour l’ajout de 100 ng de chaque échantillon à la plaque normalisée, plus le volume d’eau pour atteindre 20 µL. Suite à l’amplification, le volume de 100 ng de chaque produit à succès est calculé et ajouté à une poule finale. Le volume du produit PCR « en blanc » à ajouter à la poule finale est la moyenne des autres échantillons. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Supplémentaire Figure 1 : rapprochement de biomasse racinaire minimal au cours du prélèvement de l’échantillon. Quelle perception des racines, essayer de collecter au moins 500 mg de tissu. Ici, racines provenant d’une plante jeune sorgho (gauche, à la fois A et B) et un plant de riz jeune (à droite) sont indiqués à côté de (A) et à l’intérieur de tubes coniques (B) 50 mL. Les deux échantillons peser environ 1 g, cependant, il est important de noter que ce poids inclut la rhizosphère et racine, et le poids de la rhizosphère est, dans ce cas, environ la moitié du poids total. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

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Ce protocole montre un pipeline établi pour explorer la racine endosphère, la rhizosphère et compositions de communauté microbienne du sol, de l’échantillonnage sur le terrain pour le traitement des échantillons et le séquençage en aval. Experimentation microbiomes associés à racine présente des difficultés particulières, dû en partie aux difficultés inhérentes à l’échantillonnage du sol. Les sols sont très variables en fonction des propriétés physiques et chimiques, et les différentes conditions du sol peuvent être séparées en aussi peu que quelques millimètres28,29. Cela peut conduire à des échantillons qui sont recueillies auprès des sites d’échantillonnage adjacentes ayant des compositions considérablement différentes communautés microbiennes et activités30,31. Ainsi, en utilisant sol core collectionneurs et pelles pour maintenir les profondeurs d’échantillonnage uniforme et homogénéisation avant l’extraction de l’ADN sont essentiels à la reproductibilité dans les études de microbiome racine. Il est également essentiel de séparer efficacement les fractions de la rhizosphère et racine ; en utilisant une méthode dure de stérilisation en surface racinaire peut potentiellement lyse endophytes dans les racines avant l’extraction de l’ADN, alors qu’un lavage plus conservatrice ne peut pas supprimer tous les microbes de la surface racinaire7. Un autre facteur important qui peut influer négativement ou de perturber le résultats du séquençage est la contamination bactérienne, qui peut provenir de nombreuses sources et est parfois impossible de distinguer les bactéries environnementales échantillonnées32,33. Pour cette raison, prudente stérilisation des outils d’échantillonnage, supports expérimentaux et des environnements de travail sont indispensables pour éviter toute contamination.

Après le prélèvement, obtention d’ADN de haute qualité est une priorité pour les analyses en aval avec succès. Dans notre expérience, extraction de l’ADN du champ cultivé des échantillons de racines par le biais de méthodes alternatives, telles que par l’intermédiaire de CTAB d’extraction, contiennent souvent sensiblement plus grandes quantités d’acides humiques et autres composés par rapport aux échantillons rhizosphère et le sol. Ces composés peuvent empêcher l’activité enzymatique de l’ADN polymérase au cours de l’amplification par PCR, même à faibles concentrations34,35. À l’aide de l’extraction d’ADN kits conçus pour les sols sur des échantillons de racines, par opposition à une extraction de CTAB suivie d’un phénol chloroforme nettoyage, peuvent débarrasser efficacement des échantillons des acides humiques et seront traduira par la haute qualité ADN36,37, 38,,39. En conséquence, nous recommandons d’utiliser un kit d’extraction d’ADN disponible dans le commerce pour des échantillons de racines aussi bien. Il est à noter que l’objectif est d’obtenir l’ADN génomique microbienne de racines des plantes. Ainsi, racine complète et cohérente de meulage est important de briser les tissus végétaux et lyser les cellules microbiennes afin de libérer l’ADN microbien sans introduire un biais entre les échantillons en raison de la variation de pression et temps de meulage.

Suite à une extraction de l’ADN provenant d’échantillons, il y a deux principales sources de problèmes au cours de l’amplification : 1) la contamination des tissus végétaux avec plante endosymbiotes (mitochondries et chloroplastes) et 2) sélection de région ARNr 16 s pour amplifier. L’amplification de chloroplastes ou mitochondries 16 s peuvent générer des séquences d’ARNr > 80 % des séquences dans racine échantillons40, et plus dans les tissus foliaires, bien que le degré de saleté repose sur le choix des amorces. Ainsi, les pinces PNA sont nécessaires pendant l’étape PCR pour supprimer la plante hôte chloroplastiques et mitochondriaux 16 s contamination27,41. Toutefois, les différentes espèces de plantes peuvent avoir des variation dans le chloroplaste et 16 s mitochondrial séquence27; par conséquent, il est essentiel de confirmer la séquence du chloroplaste et gènes 16 s mitochondrial de la plante étudiée avant le séquençage de la bibliothèque, afin de déterminer s’il est nécessaire de rechange PNA oligos (Figure 3). En outre, le gène de l’ARNr 16 s se compose de neuf régions hypervariables flanquées de neuf régions conservatrices ; différents résultats peuvent être obtenus de la même communauté selon quelle région hypervariable est amplifié42. Des études antérieures ont trouvé la région V4 pour être parmi les plus fiables pour attribution taxonomie43 et il a été utilisé pour les autres microbiome vastes enquêtes11. Allongement de la cible dans la région de V3-V4 est suggéré ici pour améliorer la variabilité et leur résolution taxonomique.

Dans ce protocole, nous avons démontré un pipeline pour effectuer le séquençage d’amplicon ARNr 16 s par l’intermédiaire de séquençage de la génération suivant (NGS) pour étudier les compositions de la communauté microbienne des échantillons environnementaux12. Nous recommandons l’utilisation de séquençage de l’amplicon comme un outil de profilage phylogénétique, parce qu’il est relativement peu coûteux et à haut débit et ne nécessite pas une grande expertise informatique ou les ressources pour analyser. Alors que notre méthode se concentre sur l’analyse de la fraction bactérienne de la microbiome, il peut s’adapter facilement pour enquêter sur les champignons. Le protocole est identique à l’étape 2, et la seule différence à l’étape 3 est Quelles amorces serviraient dans l’amplification. Toutefois, il ne vaut rien que l’amplicon basé profilage n’est pas sans limites. En séquençant un gène marqueur unique, aucune information n’est obtenue au sujet de la capacité fonctionnelle de la communauté. En outre, la résolution taxonomique peut être assez faible, surtout lors du séquencement des environnements avec un pourcentage élevé des microbes non caractérisés. Cependant, technologies de séquençage évoluent rapidement, et nous prévoyons que le potentiel de traiter certaines de ces lacunes en adaptant ce protocole pour une utilisation avec d’autres plateformes de séquençage. Enfin, comme mentionné dans l’introduction, la metatranscriptomics et le fusil de chasse métagénomique facilement peut être effectuée que sur des échantillons de sol et la rhizosphère et méthodes pour éliminer la contamination de la plante de tissus végétaux sont actuellement à l’étude. Les conceptions expérimentales quelles approches axées sur l’amplicon de paire et d’autres techniques de métagénomique peuvent être particulièrement efficaces dans les communautés complexes où la diversité des espèces de haute et la représentation inégale des taxons peuvent empêcher les données de fusil de chasse d’avec précision caractériser les moins membres dominants.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par l’USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS est pris en charge par le programme de bourses en recherche universitaire NSF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1-10/20 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-3810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000027 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes Eppendorf 3120000909 Can substitute with equivalent from other suppliers.
100 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000043 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1000 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1122-1830 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1620-2700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mm soil sieve Forestry Suppliers 60141009 Can substitute with equivalent from other suppliers.
200 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-8810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
25 mL reservoirs VWR International LLC 89094-664 Can substitute with equivalent from other suppliers.
50 mL conical vials Thermo Fisher Scientific 352098 Can substitute with equivalent from other suppliers.
500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) VWR International LLC 156-4020
96-well microplates USA Scientific 655900
96-well PCR plates BioRad HSP9631
Agencourt AMPure XP beads Thermo Fisher Scientific NC9933872 Instructions for use:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180
&documentName=B37419AA.pdf
Aluminum foil Boardwalk 7124 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Analytical scale with 0.001 g resolution Ohaus Pioneer PA323 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Bioruptor Plus ultrasonicator Diagenode B01020001
Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL New England Biolabs B9000S
Centrifuge Eppendorf 5811000908 Including 50mL and 96-well plate bucket adapters
Cryogenic gloves Millipore Sigma Z183490 Can substitute with equivalent from other suppliers.
DNeasy PowerClean kit (optional) Qiagen Inc. 12877-50 Previously MoBio
DNeasy PowerSoil kit Qiagen Inc. 12888-100 Previously MoBio
Dry ice Any NA
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher Scientific 12321D Do not substitute
Ethanol VWR International LLC 89125-188 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gallon size freezer bags Ziploc NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gemini EM Microplate Reader Molecular Devices EM Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top.
K2HPO4 Sigma-Aldrich P3786
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
Lab coat Workrite J1367 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 Any NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 dewar Thermo Fisher Scientific 4150-9000 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Milli-Q ultrapure water purification system Millipore Sigma SYNS0R0WW
Mini-centrifuge Eppendorf 5404000014
Molecular grade water Thermo Fisher Scientific 4387937 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Mortars VWR International LLC 89038-150 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Nitrile gloves Thermo Fisher Scientific 19167032B Can substitute with equivalent from other suppliers.
Paper towels VWR International LLC BWK6212 Can substitute with equivalent from other suppliers.
PCR plate sealing film Thermo Fisher Scientific NC9684493
PCR strip tubes USA Scientific 1402-2700
Pestles VWR International LLC 89038-166 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Plastic spatulas LevGo, Inc. 17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) Thermo Fisher Scientific 13000014
PNAs - chloroplast and mitochondrial PNA Bio NA Make sure to verify sequence bioinformatically
Protective eyewear Millipore Sigma Z759015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Qubit 3.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33216
Qubit dsDNA HS assay kit Thermo Fisher Scientific Q32854
Rubber mallet (optional) Ace Hardware 2258622 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shears or scissors VWR International LLC 89259-936 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shovel Home Depot 2597400 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Soil core collector (small diameter: <1 inch) Ben Meadows 221700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Spray bottles Santa Cruz Biotechnology sc-395278 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) IDT NA 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry.
Thermocycler Thermo Fisher Scientific E950040015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Weigh boats Spectrum Chemicals B6001W Can substitute with equivalent from other suppliers.

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Explorant le Microbiome racine : extraire les données de la communauté bactérienne du sol, rhizosphère et racine endosphère
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Simmons, T., Caddell, D. F., Deng, S., Coleman-Derr, D. Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere. J. Vis. Exp. (135), e57561, doi:10.3791/57561 (2018).More

Simmons, T., Caddell, D. F., Deng, S., Coleman-Derr, D. Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere. J. Vis. Exp. (135), e57561, doi:10.3791/57561 (2018).

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