Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

قياس الإلكترون غشاء البلازما عبر النقل بواسطة ميوتوبيس C2C12

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57565
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biology, Saint Louis University
* These authors contributed equally

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو رصد سبيكتروفوتوميتريكالي البلازما عبر غشاء الإلكترون النقل الاستفادة من المتقبلين للإلكترون خارج الخلية وتحليل التفاعلات الانزيمية التي قد تحدث مع هذه متقبلون الإلكترون خارج الخلية.

Abstract

البلازما عبر غشاء الإلكترون النقل (تبميت) يلعب دوراً في حماية الخلايا من الإجهاد التخفيض داخل الخلايا، فضلا عن الحماية من الأضرار بالخلية للتأكسد. هذه العملية لنقل الإلكترونات من تأشيب داخل الخلية إلى خارج الخلية للتأكسد ليست محددة تحديداً جيدا. هنا نقدم فحوصات سبيكتروفوتوميتريك من ميوتوبيس C2C12 لرصد استخدام متقبلون الإلكترون خارج الخلية تبميت: تيترازوليوم للذوبان في الماء الملح-1 (WST-1) و 2, 6-ديتشلوروفينوليندوفينول (دبيب أو دسيب). من خلال الحد من هذه متقبلون الإلكترون، نحن قادرون على مراقبة هذه العملية في تحليل في الوقت الحقيقي. مع إضافة الإنزيمات مثل اسكوربات أوكسيديز (AO) وفائق أكسيد الفاءق (الأحمق) إلى فحوصات، يمكننا تحديد أي جزء من تبميت هو سبب إنتاج التصدير أو فائق أكسيد اسكوربات، على التوالي. بينما أبدى WST-1 تحقيق نتائج مستقرة مع خلفية منخفضة، دبيب كانت قادرة على أن تكون إعادة المؤكسد بعد إضافة AO والهيئة العامة للسدود، الذي تجلى بتحليل سبيكتروفوتوميتريك. يوضح هذا الأسلوب مقايسة سبيكتروفوتوميتريك في الوقت الحقيقي، وكذلك متعددة، سريعة مع مزايا أكثر من الأساليب الأخرى المستخدمة لرصد تبميت، مثل سيانيد (فيكن) وتخفيض فيريسيتوتشرومي ج.

Introduction

قدرة تنقية البلازما الأغشية للحد من المتقبلين للإلكترون أدى إلى ت ري أن غشاء البلازما على قدرات الكامنة الأكسدة1. رأيت سابقا في الفطريات والنباتات، والحيوانات، تبميت عملية مشتركة بين الكائنات الحية متعددة2،3،،من45. على وجه التحديد، هذه العملية قد تجلى في Saccharomyces cerevisiae، الجزرة الخلايا والكريات الحمراء، لمفاوية، osteosarcoma، وسرطان الجلد، الضامة، والهيكل العظمى والعضلات والعدلات2،3، 4 , 5 , 6 , 7-يشارك في عملية نقل الإلكترونات عبر غشاء البلازما لتقليل المؤكسدات خارج الخلية، تبميت في العديد من الوظائف الخلوية بما في ذلك: الخلية النمو5،8، بقاء الخلية9، الحديد استقلاب10، الخلية إشارات11،،من1213، والحماية من الأكسجين التفاعلية الأنواع12،،من1415. بسبب المشاركة تبميت في العديد من الوظائف الخلوية، قد تم الافتراض باختلال تبميت للمساهمة في تطوير بعض الظروف الصحية الخطيرة، بما في ذلك السرطان16،17من أمراض القلب والأوعية الدموية، والتمثيل الغذائي متلازمة18.

هناك عدة طرق لمراقبة نقل الإلكترونات عبر غشاء البلازما، ولكن الأسلوب الأكثر استخداماً لتقييم الحد المتقبلين الإلكترون خارج الخلية عن طريق فحوصات اللونية. متقبلون الإلكترون خارج الخلية استخداماً هي أملاح تيترازوليوم ودبيب وفيكن وفيريسيتوتشرومي ج19،20. الملح tetrazolium الأكثر استخداماً معروف ملح من الجيل الثاني ك WST-119. هذا المركب أسهل لاستخدامها في فحوصات قياس الألوان مقارنة بالجيل الأول tetrazolium أملاح نتيجة الفريقين المشبعة بالفلور أوكتين، التي تزيد من القابلية للذوبان في الماء،21. WST-1، بالاشتراك مع ميثوسولفاتي فينازيني-1-ميثوكس يقبلون الإلكترون المتوسطة (مبمس)، يتم تقليل في اثنين واحد إلكترون نقل الأحداث. هذا الحد يتغير شكل WST-1 المؤكسدة ضعيفة الملون إلى20،فورمازان أكثر كثافة، والأصفر22. وقد WST-1 معامل انقراض مولى عالية 37 × 103 م-1سم-1، مما أدى إلى مقايسة عالية حساسية21،22. دبيب كما يستخدم يقبلون إلكترون خارج الخلية لمراقبة تبميت. فقد ثبت أنه يمكن تخفيض دبيب اكستراسيلولارلي من تبميت دون المساعدة من وسيط إلكترون متقبلون23،24. بسبب انعدام متقبلون إلكترون الوسيطة، دبيب يمكن مباشرة الإلكترونات البيك آب من غشاء البلازما، وعلى عكس WST-124. مشابهة دبيب، ثبت فيكن أن تقلص اكستراسيلولارلي إلى فيروسيانيد من تبميت دون المساعدة من وسيط إلكترون متقبلون19،24. على عكس WST-1 ودبيب، قد فيكن معامل انقراض مولى منخفضة مما يؤدي إلى حساسية فحص السفلي9. آخر يقبلون الإلكترون خارج الخلية المستخدمة عادة لرصد تبميت هو فيريسيتوتشرومي جيم على غرار WST-1، فيريسيتوتشرومي ج الحد من الزيادات باستخدام يقبلون الإلكترون المتوسطة، مبمس22. رغم ذلك، خلافا WST-1 الأسلوب ج فيريسيتوتشرومي أقل حساسية بسبب خلفية عالية ومعامل انقراض مولى منخفضا22.

هنا نقدم طريقة للتحليل في الوقت الحقيقي من تبميت عن طريق فحوصات سبيكتروفوتوميتريك. تستخدم الأسلوب متقبلون الإلكترون خارج الخلية WST-1 ودبيب، كلا منهما لديها معامل انقراض مولى عالية رغم كونها أقل تكلفة مقارنة بأخرى يشيع استخدامها متقبلون الإلكترون خارج الخلية مثل ج فيريسيتوتشرومي. يمكننا الاستفادة من فينازيني ميثوسولفاتي (PMS) بدلاً من مبمس لديهم التركيب الكيميائي مماثلة والدورة الشهرية أقل تكلفة بكثير. مبمس الهيدروكسى مستقرة وهو سمة هامة لمجموعة تجاري يحتاج إلى حياة طويلة الجرف. بيد أننا جعل الدورة الشهرية طازجة لكل فحص، حيث الاستقرار لا ينبغي أن يكون مشكلة. ونقدم أيضا وسيلة لتقييم التفاعلات الانزيمية الممكنة (انظر الشكل 1) بين يقبلون الإلكترون خارج الخلية والأنزيمات التي يمكن استخدامها لوصف عملية تبميت كذلك. على وجه التحديد، تحديد الإنزيمات AO والهيئة العامة للسدود يمكن أن تستخدم أي جزء من تبميت بسبب النقل اسكوربات أو الإفراج عن فائق أكسيد خارج الخلية، هما الأساليب الشائعة للإلكترونات بنقلها عبر غشاء البلازما.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: انظر الشكل 1 نظرة تخطيطية للخطوات الرئيسية.

1-مقايسة الحد WST-1

  1. تنمو، والتفريق بين الخلايا C2C12 ملتصقة باستخدام الخلية القياسية الثقافة الإجراءات7 في صفيحة 96-كذلك استخدام الصفوف A-f.
    1. استخدام وسيلة تمايز تتألف من المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو) وتستكمل مع مصل الحصان 2% و 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين 0.1 مغ/مل. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
    2. عند رصد مشاركة اسكوربات في تبميت، الملحق وسائط التمايز مع 100 حمض الأسكوربيك ميكرومتر. السماح للخلايا لاحتضان في التمييز بين وسائل الإعلام ل ~ 24-48 h.
  2. إعداد المخزون الحلول WST-1 والدورة الشهرية.
    1. لجعل أسهم 10 مم WST-1، حل ز 0.033 WST-1 (وزن الصيغة (مهاجم): 651.34 g/mol) في 5 مل فوسفات مخزنة المالحة (PBS). مخزن في 4 درجات مئوية.
    2. جعل مخزون 5 مم من الدورة الشهرية، حل 0.0023 ز من الدورة الشهرية (مهاجم: 306.34 g/mol) في 1.5 مل من منزوع ح2س (diH2س). تخزين في-20 درجة مئوية، وحماية من الضوء.
  3. إضافة 0.0108 ز الجلوكوز لتركيز نهائي من 5 مم إلى 11.4 مل من برنامج تلفزيوني أو حبيس مخزنة المالحة (ميزانيات؛ 20 مم حبيس الصوديوم الملح 140 ملم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 2.5 مم MgSO4، 1 مم كاكل2). إضافة ميليلتر 480 ملم 10 WST-1 لتركيز نهائي من 400 ميكرون وميليلتر 48 مم 5 الدورة الشهرية لتركيز نهائي من 20 ميكرومتر.
  4. عند رصد مشاركة اسكوربات في تبميت، تقسيم الحل إلى اثنين 6 مل مختبرين. إلى قاسمة واحد، إضافة 6 ميليلتر من diH2س وإلى قاسمة الأخرى إضافة ميليلتر 6 2 كو/مل AO لتركيز نهائي 2 يو/مليلتر.
  5. عند رصد مشاركة دِيسمُوتاز في تبميت، تقسيم الحل إلى اثنين 6 مل مختبرين. قاسمة واحد، أضف ميليلتر 55 م 0.1 مشرف4 المخزن المؤقت وإضافة إلى قاسمة الأخرى ميليلتر 55 6.5 كو/مل الأحمق لتركيز نهائي من 60 يو/مليلتر.
  6. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني. نضح وسائط الإعلام وإضافة 150 ميليلتر PBS. ثم نضح برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: يتم المقايسة مع خلايا مطلي، المرفق. وهكذا، لا يوجد الطرد المركزي أو استخدام التربسين في عملية الغسيل.
  7. إضافة 100 ميليلتر من WST-1 الحل (-) الهيئة العامة للسدود أو (-) AO لأعمدة 1-6 وإضافة 100 ميليلتر حل WST-1 (+) الهيئة العامة للسدود أو (+) أو إلى أعمدة 7-12 في لوحة 96-جيدا. استخدام الصفوف زاي وحاء كعناصر أساسية (أي، لرصد التغير في امتصاص في الكاشف وحدها في الآبار دون الخلايا).
  8. قياس امتصاص القيم باستخدام جهاز المطياف الضوئي كل 10 دقيقة ح 1 في 438 شمال البحر الأبيض المتوسط.
  9. بعد القراءة، نضح وسائط الإعلام وتغسل كل جيدا مع 150 ميليلتر من برنامج تلفزيوني. ثم نضح برنامج تلفزيوني.
  10. حساب التغير في امتصاص لكل بئر بطرح امتصاص الأولية لبئر من امتصاص في أي وقت لذلك جيدا. تصحيح هذا التغيير من أجل التغيير في امتصاص (أن وجدت) التي لوحظت في الآبار الخلفية (أي، الآبار مع الحل المقايسة ولكن أي من الخلايا).
  11. للتحليل، تطبيع البيانات امتصاص لقياس التحكم 60 دقيقة أو غسل الآبار مع برنامج تلفزيوني أو ميزانيات وثم إجراء مقايسة (اتفاق التعاون الأساسي) حمض بيسينتشونينيك على بروتين.
  12. إضافة مستوى ألبومين المصل البقري (BSA) 2 مغ/مل (تتراوح بين 0.5-2 ميليلتر للمنحنى المعياري، تبعاً لدرجة التقاء الخلايا) إلى الآبار فارغة (الصفوف زاي وحاء)، ثم إضافة الكاشف اتفاق التعاون الأساسي لجميع الآبار.
  13. التحديد الكمي للبيانات عن طريق نمول WST-1 تخفيض كل ميكروغرام من البروتين. استخدام 37 مم-1 سم-1 22 كمعامل الانقراض WST-1 انخفاض في 438 شمال البحر الأبيض المتوسط.

2-دبيب مقايسة الحد

  1. تنمو، والتفريق بين الخلايا C2C12 ملتصقة بنفس إجراء الخطوة 1، 1.
  2. إعداد المخزون 10 مم دبيب الحل كما يلي. حل ز 0.029 من دبيب (مهاجم: 290.08 g/mol) في 10 مل من diH2O. تأكيد تركيز دبيب بقياس امتصاص 600 نيوتن متر مع جهاز المطياف الضوئي. استخدم 1 مم-1 سم-1 23 كمعامل الانقراض دبيب انخفاض 600 نانومتر. مخزن في 4 درجات مئوية.
  3. إضافة 0.0108 ز الجلوكوز لمل 11.880 من برنامج تلفزيوني لتركيز نهائي من 5 ملم. إضافة ميليلتر 120 ملم 10 دبيب لتركيز نهائي من 100 ميكرومتر.
  4. عند رصد مشاركة اسكوربات في تبميت، تقسيم الحل إلى اثنين 6 مل مختبرين. إلى قاسمة واحد، إضافة 6 ميليلتر من diH2س وإلى قاسمة الأخرى إضافة ميليلتر 6 2 كو/مل AO لتركيز نهائي 2 يو/مليلتر.
  5. عند رصد مشاركة دِيسمُوتاز في تبميت، تقسيم الحل إلى اثنين 6 مل مختبرين. قاسمة واحد، أضف ميليلتر 55 م 0.1 مشرف4 المخزن المؤقت وإضافة إلى قاسمة الأخرى ميليلتر 55 6.5 كو/مل الأحمق لتركيز نهائي من 60 يو/مليلتر.
  6. نضح وسائط الإعلام وغسل الخلايا في 150 ميليلتر من برنامج تلفزيوني. نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة 100 ميليلتر من دبيب الحل (-) الهيئة العامة للسدود أو (-) AO لأعمدة 1-6 وإضافة 100 ميليلتر من دبيب الحل (+) الهيئة العامة للسدود أو (+) أو إلى أعمدة 7-12 في لوحة 96-جيدا. استخدام الصفوف ز وإرادة ح كعناصر أساسية (أي، لرصد التغير في امتصاص في الكاشف وحدها في الآبار دون الخلايا).
  7. قياس امتصاص في 600 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي كل 10 دقيقة حاء 1 قياس التغير في امتصاص نسبة إلى عنصر التحكم في 60 دقيقة مشابهة للخطوات 1، 1، 9-13.

3-تحديد عما إذا المتقبلين للإلكترون المخفضة من ركائز AO أو أبله

  1. إلى 5.436 مل من برنامج تلفزيوني أو ميزانيات، إضافة ميليلتر 240 ملم 10 WST-1 لتركيز نهائي من 400 ميكرون وميليلتر 24 مم 5 الدورة الشهرية لتركيز نهائي من 20 ميكرومتر.
    1. دبيب، إضافة 60 ميليلتر من 10 مم دبيب، لتركيز نهائي من 100 ميكرومتر، لمل 5.940 من برنامج تلفزيوني أو ميزانيات.
  2. إضافة 100 ميليلتر لإيجاد حل لكل الخير في لوحة مسطحة القاع 96-جيدا في غياب الخلايا وقياس امتصاص في جهاز المطياف الضوئي في 438 شمال البحر الأبيض المتوسط، ل WST-1، أو 600 نانومتر، دبيب.
  3. إضافة 1 ميليلتر من اسكوربات 10 ملم إلى نصف الآبار لتركيز نهائي من 100 ميكرومتر. مراقبة امتصاص حتى أن يستقر.
  4. عند التثبيت، إضافة 1 ميليلتر من 200 يو/مليلتر AO لتركيز نهائي 2 يو/مليلتر لكل بئر أو إضافة 1 ميليلتر من 6 كو/mL الأحمق لتركيز نهائي من 60 يو/مليلتر لكل خير ورصد امتصاص ح 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إحصاءات أجريت مع ANOVA مع التدابير المتكررة باستخدام البرمجيات الإحصائية RStudio25. يتم الإشارة إلى أحجام العينات في أساطير الرقم.

واستخدمت لرصد تبميت، ميوتوبيس C2C12 جنبا إلى جنب مع الإلكترون خارج الخلية المتقبلين، WST-1 ودبيب. AO واستخدمت لتحديد أي جزء من WST-1 والحد من دبيب يرجع efflux اسكوربات والهيئة العامة للسدود واستخدمت لتحديد أي جزء من الحد WST-1 كان بسبب الإفراج عن فائق أكسيد خارج الخلية. كما هو مبين في الشكل 2، ميوتوبيس C2C12 قادرون على تبميت كما يراها الحد من WST-1. مع إضافة AO، تم قمعها WST-1 الحد من قبل ~ 30% مما يشير إلى أن ~ 30% تبميت كان بسبب تصدير اسكوربات (الشكل 2A). باﻹضافة إلى الهيئة العامة للسدود، تم قمعها WST-1 الحد من قبل ~ 70%، مما يبين أن ~ 70% تبميت الواجب الإفراج عن فائق أكسيد خارج الخلية (الشكل 2). عندما استخدمت دبيب كما يقبلون إلكترون خارج الخلية بالإضافة إلى AO، الحد من دبيب تم قمعها أكثر من 100 ٪ (الشكل 3). هذا يثير أسئلة بشأن صحة استخدام دبيب مع AO لتقييم مساهمة اسكوربات.

للنظر في ما إذا كان انخفاض WST-1 ركيزة ل AO أو الهيئة العامة للسدود، تم تخفيض WST-1 مع حمض الأسكوربيك. وأضيفت AO أو الهيئة العامة للسدود، وتم رصدها امتصاص. بعد ح 1، لم يطرأ أي تغيير في امتصاص بين شكل انخفاض WST-1 دون AO أو الهيئة العامة للسدود وشكل انخفاض WST-1 مع AO أو الهيئة العامة للسدود (الشكل 4 أ، ب). ولذلك، خفض WST-1 ليست ركيزة لهذه الإنزيمات، واستخدام AO أو الهيئة العامة للسدود بالاقتران مع WST-1 مناسبة لتقييم أدوار اسكوربات أو أكسيد فائق، على التوالي.

لتحديد ما إذا كان انخفاض دبيب الركازة AO أو الهيئة العامة للسدود، تم تخفيض دبيب مع حمض الأسكوربيك. بعد 20 دقيقة، تمت إضافة AO، وتم رصدها امتصاص. وأبدى دبيب مخفضة لتكون ركيزة ل AO، كما يتضح في الشكل 5A، حيث يعود دبيب إلى شكله المؤكسد داخل 40 دقيقة. عندما أضيفت الهيئة العامة للسدود، دبيب تمت أيضا إعادة المؤكسدة (الشكل 5 (ب)). ولذلك، دبيب انخفاض ركيزة لهذه الإنزيمات ولا يقبلون إلكترون خارج الخلية مناسبة لاستخدامها مع هذه الإنزيمات.

Figure 1
رقم 1: تمثيل تخطيطي للخطوات الرئيسية لفحوصات النقل الإلكترون وتحديد التفاعلات الانزيمية مع متقبلون الإلكترون خارج الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: يمنع إضافة AO والهيئة العامة للسدود WST-1 الحد من ميوتوبيس C2C12. وقد تم تحليل تبميت (A) لمدة 60 دقيقة باستخدام 400 ميكرون WST-1 و 20 ميكرومتر الدورة الشهرية بالإضافة إلى 2 يو/مليلتر AO أو diH2س (N = 18/المجموعة). وقد تم تحليل تبميت (ب) لمدة 60 دقيقة بالإضافة إلى 60 يو/مليلتر أبله أو 0.1 M مشرف4 المخزن المؤقت (N = 36/المجموعة). ف≥ 0.05 في النقطة الزمنية المشار إليها. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للوسط، وقد تكون صغيرة جداً لتصور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
رقم 3: يمنع إضافة AO الحد دبيب ميوتوبيس C2C12. وقد تم تحليل تبميت لمدة 60 دقيقة باستخدام 100 ميكرومتر دبيب مع أو بدون إضافة 2 يو/مليلتر AO (N = 36/المجموعة). ف≥ 0.05 في النقطة الزمنية المشار إليها. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للوسط، وقد تكون صغيرة جداً لتصور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: انخفاض WST-1 ليست ركيزة للهيئة العامة للسدود أو AO- (A) WST-1 انخفض مع اسكوربات. بعد 45 دقيقة، أضيفت AO، وتم رصد امتصاص ح 1. وقد لوحظ أي تغيير في امتصاص. (ب) الإجراء هو نفسه كما ذكر أعلاه، ما عدا أبله أضيفت بعد 45 دقيقة. ولوحظ أي تغيير في امتصاص (N = 24/المجموعة). أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للوسط، وقد تكون صغيرة جداً لتصور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: دبيب انخفاض ركيزة AO والهيئة العامة للسدود- تم تخفيض دبيب (A) مع اسكوربات. بعد 20 دقيقة، تمت إضافة AO، وتم رصدها امتصاص. ضمن 40 دقيقة، عاد العينات لامتصاص الأصلي بهم، مشيراً إلى أن انخفاض دبيب ركيزة ل AO. (ب) دبيب انخفض مع اسكوربات. بعد 20 دقيقة، تم إضافة الهيئة العامة للسدود، وتم رصدها امتصاص. مع مرور الوقت، دبيب انخفاض إعادة المؤكسد، مشيراً إلى أن خفض دبيب ركيزة للهيئة العامة للسدود (N = 24/المجموعة). أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للوسط، وقد تكون صغيرة جداً لتصور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: التخطيطي يصور تبميت. في هذا النموذج من تبميت، اسكوربات (أو آخر إلكترون الناقل) تصدرها الخلية يمكن أن تقلل من الدورة الشهرية خارج الخلية. وباﻹضافة إلى ذلك، تولد oxidases نادف فائق أكسيد خارج الخلية، التي يمكن أن تقلل WST-1 مباشرة أو الحد منه غير مباشر عن طريق الحد من الدورة الشهرية. كما يمكنك تقليل الإلكترونات من الجهات المانحة الأخرى في غشاء البلازما الدورة الشهرية، التي يمكن التبرع بالإلكترونات إلى WST-1 أو س2 مع اللاحقة WST-1 الحد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد قدمنا طريقتين لاستخدام متقبلون الإلكترون خارج الخلية، WST-1 ودبيب، في فحوصات سبيكتروفوتوميتريك لرصد تبميت في ميوتوبيس C2C12. مع نمو خطوط الخلايا في الإجراءات القياسية الثقافة وقارئ لوحة جهاز المطياف الضوئي، من الممكن رصد تبميت مع هذه متقبلون إلكترون في مقايسة ميكروسكوبية بسيطة. WST-1 الحد استنساخه من بئر إلى داخل فحص، ولكن هناك تقلب يوما بعد يوم. معامل الاختلاف (CV) الاستفادة من برنامج تلفزيوني كالمخزن المؤقت اليومية هو 0.18 والسيرة الذاتية استخدام ميزانيات المخزن المؤقت هو 0.23.

من المؤلفات السابقة استخدام مبمس و WST-1، يمكننا تعديل هذا البروتوكول، على وجه التحديد، لاستخدام الدورة الشهرية. وهكذا، استكشاف الأخطاء وإصلاحها وشملت تحديد التركيزات المناسبة للدورة الشهرية ووصف WST-1 للاستخدام مع ميوتوبيس. قررنا أيضا أن درجة الحرارة (في مجموعة من 23-37 درجة مئوية) ليس عنصرا حاسما للمقايسة، بينما تهز اللوحة قبل كل قراءة امتصاص المهم. ومع ذلك، ينبغي التحقيق في هذه القضايا لخطوط الخلايا الأخرى التي تطبق المقايسة. النتائج المتعلقة بقدرة الهيئة العامة للسدود و AO لأكسدة مباشرة انخفاض WST-1 تشير إلى أن الفحص لمكونات مقايسة جديدة لهذه الخاصية أحد جوانب أساسية لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها.

البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أنه ينبغي استخدام الدورة الشهرية بالاشتراك مع WST-1 بغية استخلاص الحد الأمثل من WST-1. ووجدنا أن 100 ميكرومتر اسكوربات يقلل حجم 1 مل، نمول 322 WST-1 في الدقيقة حضور الدورة الشهرية، التي تلزم للاختزال المباشر WST-1 من اسكوربات. في وحدة تخزين 1 مل، 2 يو/مليلتر من AO يكسد اسكوربات بمعدل نمول 4,400/s، أو 800 مرات أسرع من الحد من WST-1 من اسكوربات. ومن الواضح أن النشاط الأنزيمي من AO أسرع بكثير من الاختزال المباشر للدورة الشهرية/WST-1 من اسكوربات. ونحن نتوقع أن تحذو نفس فائق أكسيد والهيئة العامة للسدود، ولو لم يكن لدينا نظام لقياس معدل WST-1 الحد المطلق بفائق أكسيد.

لتحديد ما إذا كان إدراج الدورة الشهرية يؤثر على الحد من WST-1 من أكسيد فائق، استخدمنا زانتيني أوكسيديز (4.5 mU/mL)/فائق أكسيد هيبوكسانثيني (0.1 مم) توليد النظام كما سبق وصف26،27. إدراج الدورة الشهرية تقريبا يتضاعف معدل WST-1 الحد من هذا النظام. وهكذا يبدو أن الدورة الشهرية يتوسط نقل الإلكترونات من فائق أكسيد WST-1.

لمواصلة تقييم شرط الدورة الشهرية للهاتف الخلوي WST-1 الحد، نحن جزيئي الحد في وجود أو عدم وجود الدورة الشهرية و WST-1، ووجدت أن الدورة الشهرية المطلوبة للحد من WST-1 الخلوية. عندما يتم المحتضنة الخلايا في كاشف المقايسة تتضمن الدورة الشهرية وحدها (في غياب WST-1)، وهناك زيادة في امتصاص في 438 شمال البحر الأبيض المتوسط. ويعكس هذا يرجح أن تراكم النموذج سيميكوينوني للدورة الشهرية (PMS مربعا) الذي يحتوي امتصاص ذروة في 440 نانومتر28. تراكم للدورة الشهرية-ميدان تقترح أن يجري تخفيض الدورة الشهرية أسرع من أنها يمكن أن تمر الإلكترونات إلى س2 لإنتاج أكسيد فائق. وهكذا تراكم الدورة الشهرية-ميدان يتسق مع تخفيض س2 بطيئة المبلغ عنها خلال الدورة الشهرية-ميدان مقارنة بالمعدل للدورة الشهرية تماما--تخفيض28.

وقد قدمنا أيضا بروتوكول لتحديد ما إذا كانت متقبلون إلكترون ركائز للإنزيمات التي يمكن أن تستخدم في رصد تبميت. من خلال رصد الحد المتقبلين الإلكترون خارج الخلية في جهاز المطياف الضوئي تليها إضافة الإنزيم للفائدة، فمن الممكن لتحديد إذا كان يقبلون الإلكترون ركيزة لهذه الإنزيمات. من خلال هذا الأسلوب، ونحن قد أظهرت أن دبيب انخفاض ركيزة AO والهيئة العامة للسدود التي تشير إلى أنه لا يقبلون إلكترون مناسبة مراقبة التصدير افلوكس وفائق أكسيد اسكوربات.

إجراءات لاختبار أم لا إنشاء مكونات الإنزيم مثل الهيئة العامة للسدود أو AO التحف تحسن كبير على الأساليب القائمة. على سبيل المثال، انخفاض دبيب ركيزة للهيئة العامة للسدود، مما يوحي بأنه ينبغي تفسير البيانات المنشورة التي تم الحصول عليها باستخدام دبيب والهيئة العامة للسدود وبناء على ذلك. دعم لدينا نتائج الأبحاث السابقة التي أجرتها دايان وداوسون الذي رصد في امتصاص leuco 2, 6-ديتشلورويندوفينول بعد إضافة AO: دبيب كان تتأكسد يشير إلى أنه ركيزة AO29. ومع ذلك، النتائج التي توصلنا إليها إضافة السياق البحوث التي أجرتها تان وباريدج24، فضلا عن بيلافيتي et al. 30، التي استخدمت الهيئة العامة للسدود تحول دون الحد من دبيب. وفي دراسة أجريت بتأن وباريدج مقارنة متقبلون إلكترون WST-1 ودبيب وفيكن في خلايا هيلا، رأوا أن الحد من بعض من المتقبلين إلكترون تم قمعها حضور الهيئة العامة للسدود. وكان الحد من WST-1، بالاشتراك مع مبمس، تحول دون ~ 80% حضور الهيئة العامة للسدود بينما كانت تحول دون الحد دبيب بنسبة 40%. كانت لا تحول دون الحد فيكن، بالاقتران مع يقبلون إلكترون متوسطة بديلة، حضور أبله24. عند تقييم وضع إلكترون تبادل بين أوكسيداسيس نادف ودبيب أو السيتوكروم ج، بيلافيتي et al. وجدت أن دبيب والسيتوكروم c وتخفض بمقدار أوكسيداسيس نادف وأن هذا التخفيض إلى حد كبير تحول دون30من الهيئة العامة للسدود. باريدج تان وأثبتت أيضا أن الهيئة العامة للسدود يمكن أن تمنع WST-1 تخفيض بنسبة 80% في خطوط الخلايا الماوس 32Dcl23، و WEHI3B، و J774، فضلا عن خطوط الخلايا البشرية من6،جوركات، MALME3M، و 143B31. مع الخلايا العَدلات الأساسية البشرية، كان الحد WST-1 تحول دون 95% حضور الهيئة العامة للسدود6،32.

وتوحي البيانات هنا أنه من المهم التحقق من أن الإنزيمات المستخدمة لتقييم مساهمات محددة من الجزيئات الذي تم تصديره إلى تبميت لا يمكن إعادة أكسدة شكل انخفاض يقبلون الإلكترون خارج الخلية. وجدنا أن (البيانات لا تظهر) الحديدية كلوريد وكبريتات الحديدية لم تكن قابلة للذوبان في برنامج تلفزيوني. في ميزانيات وخالية من الفينول الأحمر دميم، أنها كانت سرعة المؤكسدة، مما يدل على عدم التوافق مع ميزانيات أو دميم كوسائط المقايسة. وفي المقابل، AO والاحمق لا تستخدم فيروسيانيد البوتاسيوم الركازة، مما يوحي بأنها يقبلون إلكترون خارج الخلية مناسبة إذا معامل الانقراض منخفضة ليست قضية.

واحد أوجه القصور الرئيسية في هذا التحليل هو أن الدورة الشهرية/WST-1 ويمكن تخفيض دبيب متعددة المانحين الإلكترون، مثل NAD (ف) ح، اسكوربات، والفلافونويدات مثل قويرسيتين وميريسيتين19،،من3334. ومع ذلك، وهذا يمكن التغلب عليه بإضافة الإنزيمات (مثلاً، الهيئة العامة للسدود، AO) أو مثبطات لتحديد المساهمين محددة للحد من الدورة الشهرية/WST-1 أو دبيب. قيد آخر أن دبيب يمكن أن تعمل كركيزة ل AO والهيئة العامة للسدود. وبالتالي، ينبغي إلا تستخدم هذه الإنزيمات بالاقتران مع دبيب لرصد تبميت. حد هامة إضافية من هذه الدراسة هو قدرة الدورة الشهرية وغيرها سيكليرس الأكسدة لإنتاج أكسيد فائق26،،من3536. ويتضح هذا في الشكل 6. من ناحية أخرى، الدورة الشهرية نفسها أفيد بأن ليس له أي تأثير مباشر على تبميت32. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت تان وباريدج32 أن مثبط أوكسيديز (NOX) نادف، كلوريد ديفينيلينيودينيوم (نقطة في البوصة)، يمكن منع معظم WST-1 الحد، مما يوحي بأن تبميت حساسة لإدارة شؤون الإعلام يمكن أن يكون مقياس محدد لمساهمة أكاسيد النيتروجين إلى تبميت. قيد آخر أن نرى تغييرات صغيرة في امتصاص عند استخدام WST-1. وقد وجدنا أنه عندما يرصد WST-1 جديدة والخلايا المتلاقية، يعتبر أكبر تغير في امتصاص. وقد أظهرت الدراسات السابقة التي أجريت في خطوط الخلايا P388 أن مبلغ formazan أنتجت إيجابيا يرتبط مع خلية رقم21. ولذلك، كلما المتلاقية الخلايا ثم أكبر تخفيض في WST-1. يمكن تصحيح هذا عن طريق تطبيع إلى ميكروغرام بروتين لكل بئر.

التحذير واحد فيما يتعلق بهذا التحليل أنه يهدف في المقام الأول تقييم تبميت العالمية. على الرغم من أنه يمكن التلاعب بها لرصد أشكال متعددة من تبميت، مثل efflux اسكوربات، قد يكون من الأنسب فحوصات أكثر تحديداً عند الهدف لا تتطلب القياسات في السياق من تبميت. فوكس على سبيل المثال، إذا كان هو أكسيد فائق الاهتمام الرئيسي، وهناك عدد من السبل الأخرى لرصد أكسيد فائق، مثل استخدام المسابير بما في ذلك تحقيقات كتيمة الفلورسنت، وأكونيتاسي ونيتروبلوي تيترازوليوم37.

القائمة تحقيقات لرصد تبميت مثل دبيب، فيكن وفيريسيتوتشرومي ج، العيوب الحالية. على سبيل المثال، دبيب انخفاض ركيزة AO والهيئة العامة للسدود وفيكن لديها معامل انقراض مولى منخفضة يحد من فائدتها في فحوصات في الوقت الحقيقي، ومكلف السيتوكروم ج . بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تنتج بعض من هذه المجسات الخلفية عالية مما يؤدي إلى حساسية منخفضة عند قياس تغيير في امتصاص32. WST-1 قد ثبت أن لا تكون ركيزة للإنزيمات مثل AO والهيئة العامة للسدود. بالإضافة إلى ذلك، قد WST-1 معامل انقراض مولى عالية ورد فعل على خلفية منخفضة، خلق مقايسة تبميت أكثر حساسية. المضي قدما، ويمكن استخدام هذا التحليل مع طائفة واسعة من مثبطات أفضل فهم عملية تبميت وخريطة طريق النقل إلكترون في خط معين من خلية، ويؤدي إلى فهم أفضل لكيفية الحفاظ على البيئة الأكسدة والاختزال في الخلية.

وتشمل الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول تحديد أن الخلايا على استعداد للتجريب (روافد ~ 70%)، فضلا عن جعل الكواشف المقايسة، على وجه التحديد WST-1 والدورة الشهرية، طازجة لكل فحص. من المهم أيضا غسل الخلايا قبل إضافة الكواشف المقايسة. دميم المستخدمة في هذا البروتوكول لا يتضمن اسكوربات، على الرغم من أننا تكملة متوسطة التمايز مع اسكوربات. ويتضمن عدد من وسائل الإعلام المتاحة اسكوربات. ومع ذلك، يتم غسلها الخلايا قبل إضافة الكواشف المقايسة، وخالية اسكوربات، لإزالة أي بقايا اسكوربات من المتوسط. كما يعزى جزء من تبميت إلى افلوكس الجزيئية (مثلاً، اسكوربات التصدير)، من المهم أن تبدأ القراءات spectrophotometric فورا بعد إضافة كاشف الإنزيم لا تفوت اللحظات الأولى من افلوكس. أيضا، من المهم أن تشمل الآبار الخلفية لكل كاشف الفردية في تجربة. مكونات التحليل الوارد وصفها في هذه الورقة تسبب تغيير خلفية ضئيلة في امتصاص. ومع ذلك، يمكن أن تعزز بعض الإضافات (مثلاً، phloretin) فعل خلفية كبيرة. وبالتالي، من المهم أن يتم طرح الخلفية بها عندما يتم تحليل البيانات للقضاء على أي آثار الخلط التي قد تنتج الكواشف أنفسهم.

وباختصار، البروتوكول المعروضة هنا يوفر وسيلة لتقييم تبميت ويشير إلى عدد من المحاذير وجوانب البروتوكول التي ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند تطبيق المقايسة على خطوط خلايا مختلفة و/أو تقييم المساهمة المحددة ( اسكوربات وفائق أكسيد المستخدمة هنا) إلى تبميت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونود أن أشكر بيل توماس، لين ماتاتهيل ومارك مانينو ونج باتل لتقديم الدعم التقني لهم. وأيد هذا العمل جائزة "الخدمة الصحية العامة في الولايات المتحدة" R15DK102122 من المعهد الوطني لمرض السكري والجهاز الهضمي وأمراض الكلي (NIDDK) لجوناثان فيشر. محتوى المخطوطة هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية نيدك أو "المعاهد الوطنية للصحة".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C2C12 myoblasts American Type Culture Collection  CRL-1772
Dulbecco's modified eagle's medium - low glucose Sigma D6046
Fetal Plex animal serum complex Gemini Bio-Products  100-602
penicillin-streptomycin Sigma 516106
horse serum Gibco Technologies 16050-130
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma D8537
trypsin-EDTA Sigma T4049
15 cm culture dishes TPP 93150
96 well culture plates TPP 92096
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) Accela ChemBio  Inc SY016315
phenazine methosulfate  Sigma P9625
L-ascorbic acid Sigma A5960
ascorbate oxidase  Sigma A0157
superoxide dismutase  Sigma S5395
2,6-dichloroindophenol sodium salt  ICN Biomedicals 215011825
D-(+)-glucose Sigma G7528
HEPES sodium salt Sigma H3784
sodium chloride Sigma S7653
potassium chloride Fisher Scientific  BP366
magnesium sulfate heptahydrate Sigma M5921
calcium chloride dihydrate Sigma C7902
potassium phosphate Fisher Scientific  BP363
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Powerwave X-I spectrophotometer Biotek Insturments discontinued 
Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer Thermo Scientific 336001
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile MidSci 781602
Iron (II) chloride tetrahydrate Sigma 220299
Iron (II) sulfate heptahydrate Sigma 215422
hypoxanthine Sigma H9636
xanthine oxidase Sigma X4500
Excel Microsoft
R Studio Rstudio https://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4 Biotek Insturments discontinued 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).
  2. Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).
  3. Craig, T. A., Crane, F. L. Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells. Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).
  4. Mishra, R. K., Passow, H. Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells. J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).
  5. Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. Transplasma-membrane redox systems in growth and development. Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).
  6. Berridge, M. V., Tan, A. S. Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1. Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).
  7. Eccardt, A. M., et al. Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle. Antioxidants. 6 (4), 89 (2017).
  8. Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane. J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).
  9. Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells. J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).
  10. Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport. Biochemistry. 33, 11850-11857 (1994).
  11. Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).
  12. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. Multifunctional plasma membrane redox systems. Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).
  13. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells. FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).
  14. Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane. Biochem Biophys Res Commun. 234 (0), 79-81 (1997).
  15. Navarro, F., et al. Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes. Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).
  16. Herst, P. M., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines. Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).
  17. Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation. FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).
  18. Furukawa, S., et al. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).
  19. Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease. Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).
  20. Berridge, M. V., Tan, A. S. High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).
  21. Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).
  22. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
  23. Gurtoo, H. L., Johns, D. G. On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase. J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).
  24. Tan, A. S., Berridge, M. V. Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells. Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).
  25. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2013).
  26. Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1). Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).
  27. Higaki, Y., et al. Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).
  28. Zuagg, W. Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level. J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).
  29. Dayan, J., Dawson, C. R. Substrate specificity of ascorbate oxidase. Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).
  30. Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol. FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).
  31. Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts. Biochemica. 4, 15-20 (1996).
  32. Tan, A. S., Berridge, M. V. Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents. J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).
  33. Phillips, P. A., et al. Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway. Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).
  34. Altundag, E., et al. Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells. Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).
  35. Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase. Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).
  36. Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen. J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).
  37. Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases. Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 135، تبميت، WST-1، دبيب، اسكوربات، دِيسمُوتاز، ميوتوبيس C2C12، الإنزيم سبيكتروفوتوميتريك
قياس الإلكترون غشاء البلازما عبر النقل بواسطة ميوتوبيس C2C12
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kelly, S. C., Eccardt, A. M.,… More

Kelly, S. C., Eccardt, A. M., Fisher, J. S. Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes. J. Vis. Exp. (135), e57565, doi:10.3791/57565 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter