Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

C2C12 Myotubes द्वारा ट्रांस प्लाज्मा झिल्ली इलेक्ट्रॉन परिवहन को मापने

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57565
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biology, Saint Louis University
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य spectrophotometrically की निगरानी ट्रांस प्लाज्मा झिल्ली इलेक्ट्रॉन extracellular इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने वालों का उपयोग परिवहन और एंजाइमी बातचीत है कि इन extracellular इलेक्ट्रॉन स्वीकार के साथ हो सकता है विश्लेषण है ।

Abstract

ट्रांस प्लाज्मा झिल्ली इलेक्ट्रॉन परिवहन (tPMET) intracellular reडक्टिंग तनाव से कोशिकाओं के संरक्षण में एक भूमिका निभाता है और साथ ही extracellular oxidants द्वारा क्षति से संरक्षण । intracellular reductants से extracellular oxidants के लिए इलेक्ट्रॉनों के परिवहन की यह प्रक्रिया अच्छी तरह से परिभाषित नहीं है । यहां हम C2C12 myotubes द्वारा स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक परख वर्तमान tPMET extracellular इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने का उपयोग पर नजर रखने के लिए: पानी में घुलनशील tetrazolium नमक-1 (WST-1) और 2, 6-dichlorophenolindophenol (DPIP या DCIP) । इन इलेक्ट्रॉन स्वीकार की कमी के माध्यम से, हम एक वास्तविक समय विश्लेषण में इस प्रक्रिया की निगरानी करने में सक्षम हैं । जैसे एंजाइमों के साथ ascorbate oxidase (ए ओ) और सुपरऑक्साइड dismutase (वतन) की परख के लिए, हम निर्धारित कर सकते है जो tPMET के हिस्से ascorbate निर्यात या सुपरऑक्साइड उत्पादन, क्रमशः के कारण है । जबकि WST-1 कम पृष्ठभूमि के साथ स्थिर परिणाम का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया था, DPIP ए ओ और वतन है, जो स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विश्लेषण के साथ प्रदर्शन किया गया था के अलावा के बाद फिर से ऑक्सीकरण करने में सक्षम था । इस विधि को दर्शाता है एक वास्तविक समय, बहु अच्छी तरह से, अंय तरीकों पर लाभ के साथ जल्दी स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक परख tPMET की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया, ऐसे ferricyanide (FeCN) और ferricytochrome सी कमी के रूप में ।

Introduction

शुद्ध प्लाज्मा झिल्ली की क्षमता इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने को कम करने के लिए देखने के लिए नेतृत्व किया गया है कि प्लाज्मा झिल्ली एक अंतर्निहित redox क्षमता1है । पहले कवक, पौधों और जानवरों में देखा, tPMET एक प्रक्रिया है एकाधिक जीवों के लिए आम2,3,4,5। विशेष रूप से, इस प्रक्रिया में प्रदर्शन किया गया है Saccharomyces cerevisiae, गाजर कोशिकाओं, एरिथ्रोसाइट्स, लिम्फोसाइटों, ऑस्टियो, मेलेनोमा, मैक्रोफेज, कंकाल की मांसपेशी, और न्यूट्रोफिल2,3, 4 , 5 , ६ , 7. एक प्रक्रिया में है कि प्लाज्मा झिल्ली भर में इलेक्ट्रॉनों परिवहन extracellular oxidants को कम करने के लिए, tPMET सहित कई सेलुलर कार्यों में शामिल है: सेल विकास5,8, सेल व्यवहार्यता9, आयरन चयापचय10, सेल संकेतन11,12,13, और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों12,14,15से सुरक्षा । कई सेलुलर कार्यों में tPMET की भागीदारी के कारण, tPMET का असंतुलन कैंसर16, हृदय रोग17, और चयापचय सहित कुछ गंभीर स्वास्थ्य स्थितियों के विकास में योगदान करने के लिए परिकल्पना की गई है सिंड्रोम18.

प्लाज्मा झिल्ली के पार इलेक्ट्रॉनों के हस्तांतरण पर नजर रखने के लिए कई तरीके हैं, लेकिन सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक वर्णमिति परख के माध्यम से extracellular इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने वालों की कमी का आकलन करने के लिए है । सामान्यतः प्रयुक्त extracellular इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने वालों में tetrazolium लवण, DPIP, FeCN, और ferricytochrome सी१९,२०हैं. सबसे अधिक इस्तेमाल किया tetrazolium नमक एक दूसरी पीढ़ी WST-119के रूप में जाना जाता नमक है । इस परिसर में दो sulfonate समूहों के कारण पहली पीढ़ी tetrazolium लवण की तुलना में वर्णमिति परख में उपयोग करने के लिए आसान है, जो अपने पानी के घुलनशीलता में वृद्धि21. WST-1, मध्यवर्ती इलेक्ट्रॉन स्वीकार्य 1-methoxy-phenazine methosulfate (mPMS) के साथ संयोजन के रूप में, दो एकल इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण की घटनाओं में कमी आई है । यह कमी एक और अधिक तीव्र, पीला formazan20,22के लिए WST-1 के कमजोर रंग का ऑक्सीकरण फार्म बदल जाता है । WST-1 ३७ x 103 एम-1सेमी-1, एक उच्च परख संवेदनशीलता21,22के लिए अग्रणी के एक उच्च दाढ़ विलुप्त होने गुणांक है । DPIP भी tPMET की निगरानी के लिए एक extracellular इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ता के रूप में उपयोग किया जाता है । इसमें दिखाया गया है कि DPIP को इंटरमीडिएट इलेक्ट्रॉनक स्वीकार्यता23,24की सहायता के बिना tPMET द्वारा extracellularly कम किया जा सकता है । मध्यवर्ती इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने वालों की कमी के कारण, DPIP सीधे WST-124के विपरीत, प्लाज्मा झिल्ली से इलेक्ट्रॉनों उठा सकते हैं । DPIP के समान, FeCN को मध्यवर्ती इलेक्ट्रॉन स्वीकार्यता19,24की सहायता के बिना tPMET द्वारा ferrocyanide करने के लिए extracellularly कम होना दिखाया गया है । WST-1 और DPIP के विपरीत, FeCN एक कम दाढ़ विलुप्त होने एक कम परख संवेदनशीलता के लिए अग्रणी गुणांक है9। tPMET मॉनिटर करने के लिए एक और आमतौर पर इस्तेमाल किया extracellular इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ता ferricytochrome सी है. इसी तरह WST-१ के समान, मध्यवर्ती इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ता, ferricytochrome के उपयोग के साथ mPMS सी कमी बढ़ जाती है२२. WST-1 के विपरीत हालांकि, ferricytochrome c विधि एक उच्च पृष्ठभूमि और कम दाढ़ विलुप्त होने के गुणांक के कारण कम संवेदनशील है22।

यहां हम स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक परख के माध्यम से tPMET के वास्तविक समय विश्लेषण के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । विधि extracellular इलेक्ट्रॉन WST-1 और DPIP का उपयोग किया, के रूप में वे दोनों एक उच्च दाढ़ विलुप्त होने गुणांक है जबकि कम खर्चीला जा रहा है जैसे extracellular सी के रूप में अंय सामांयतः इस्तेमाल ferricytochrome इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने की तुलना में । हम phenazine methosulfate (पीएमएस) के बजाय mPMS वे एक समान रासायनिक श्रृंगार है और पीएमएस का उपयोग अब तक कम खर्चीला है । mPMS photochemically स्थिर है जो एक वाणिज्यिक किट है कि एक लंबी शैल्फ जीवन की जरूरत के लिए एक महत्वपूर्ण विशेषता है । हालांकि, हम प्रत्येक परख के लिए पीएमएस ताजा करना है, तो स्थिरता एक मुद्दा नहीं होना चाहिए । हम यह भी संभव एंजाइमी बातचीत का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं ( चित्रा 1देखें) extracellular इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ता और एंजाइमों कि आगे tPMET की प्रक्रिया को चिह्नित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है के बीच. विशेष रूप से, एंजाइमों ए ओ और वतन निर्धारित किया जा सकता है tPMET के जो भाग ascorbate परिवहन या extracellular सुपरऑक्साइड जारी करने के लिए कारण है, इलेक्ट्रॉनों के लिए दो आम तरीकों प्लाज्मा झिल्ली के पार ले जाया जाएगा ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: महत्वपूर्ण चरणों का एक योजनाबद्ध ओवरव्यू के लिए चित्र 1 देखें ।

1. WST-1 कमी परख

  1. विकसित और C2C12 अनुयाई कोशिकाओं मानक सेल संस्कृति प्रक्रियाओं का उपयोग करते हुए अंतर7 में एक ९६-well प्लेट पंक्तियों का उपयोग a-F.
    1. Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम से मिलकर एक भेदभाव मध्यम का प्रयोग करें (DMEM) 2% हार्स सीरम, १०० यू/एमएल पेनिसिलिन, और ०.१ मिलीग्राम/एमएल streptomycin के साथ पूरक । 5% CO2के साथ ३७ ° c पर कोशिकाओं की मशीन ।
    2. जब tPMET में ascorbate भागीदारी की निगरानी, १०० µ एम ascorbic एसिड के साथ भेदभाव मीडिया पूरक । कोशिकाओं को भेदभाव मीडिया में ~ 24-48 ज के लिए मशीन की अनुमति दें ।
  2. स्टॉक WST-1 और पीएमएस समाधान तैयार करें ।
    1. WST-1 के 10 मिमी स्टॉक बनाने के लिए, WST के ०.०३३ g को भंग करने के लिए-1 (सूत्र वजन (अग्रेषित करें): ६५१.३४ g/) फॉस्फेट के 5 मिलीलीटर में खारा (पंजाब) । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    2. पीएमएस के 5 मिमी स्टॉक बनाने के लिए, पीएमएस के ०.००२३ जी भंग (परिवार कल्याण: ३०६.३४ g/) के १.५ मिलीलीटर में2o (दिः2ओ) । -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर और प्रकाश से रक्षा करना ।
  3. 5 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए ग्लूकोज की ०.०१०८ जी जोड़ें पंजाबियों या HEPES बफर खारा के ११.४ मिलीलीटर (एचबीएस; 20 मिमी HEPES सोडियम नमक, १४० मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, २.५ मिमी MgSO4, 1 मिमी CaCl2). 20 µ एम के अंतिम एकाग्रता के लिए 5 मिमी पीएमएस के ४०० µ एम और ४८ µ एल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 10 मिमी WST-1 के ४८० µ एल जोड़ें
  4. जब tPMET में ascorbate भागीदारी की निगरानी, दो 6 मिलीलीटर aliquots में समाधान विभाजित । करने के लिए एक aliquot, जोड़ें 6 µ l के दिः2O और अंय aliquot जोड़ें 6 µ l के 2 कू/एमएल ओ के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 2/
  5. जब tPMET में सुपरऑक्साइड भागीदारी की निगरानी, दो 6 मिलीलीटर aliquots में समाधान विभाजित । एक aliquot करने के लिए, जोड़ें ५५ µ एल के ०.१ एम केपीओ4 बफर और अंय aliquot जोड़ें ५५ µ एल के ६.५ कू/एमएल वतन के एक अंतिम एकाग्रता के लिए ६० U/एमएल ।
  6. पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें । मीडिया महाप्राण और १५० µ l पंजाबियों जोड़ें । इसके बाद पंजाबियों को महाप्राण ।
    नोट: परख चढ़ाया, संलग्न कोशिकाओं के साथ किया जाता है । इस प्रकार, वहां कोई केंद्रापसारक या धोने की प्रक्रिया में trypsin का उपयोग नहीं है ।
  7. जोड़ें १०० µ l के WST-1 समाधान (-) वतन या (-) ए ओ के कॉलम 1-6 और जोड़ने के १०० µ l के WST-1 समाधान (+) वतन या (+) ए ए ओ कॉलम 7-12 में ९६-वेल प्लेट । पंक्तियों जी और एच पृष्ठभूमि नियंत्रण (यानी, कोशिकाओं के बिना कुओं में अकेले एजेंट में अवशोषण में परिवर्तन की निगरानी करने के लिए) के रूप में उपयोग करें ।
  8. ४३८ एनएम पर 1 एच के लिए spectrophotometer हर 10 मिनट का उपयोग कर अवशोषक मूल्यों को मापने ।
  9. पढ़ने के बाद, मीडिया महाप्राण और पंजाबियों के १५० µ एल के साथ एक अच्छी तरह से धो लें । इसके बाद पंजाबियों को महाप्राण ।
  10. एक अच्छी तरह से है कि अच्छी तरह के लिए किसी भी समय बिंदु पर अवशोषित से एक के लिए प्रारंभिक अवशोषण घटाकर द्वारा प्रत्येक के लिए अवशोषित में परिवर्तन की गणना । अवशोषित में परिवर्तन के लिए इस परिवर्तन को सही (यदि कोई हो) पृष्ठभूमि कुओं में मनाया (यानी, परख समाधान लेकिन कोई कोशिकाओं के साथ कुओं) ।
  11. विश्लेषण के लिए, ६० मिनट नियंत्रण माप के लिए अवशोषक डेटा को सामान्य या पंजाब या एचबीएस के साथ कुओं धोने और फिर एक bicinchoninic एसिड (बीसीए) प्रोटीन परख प्रदर्शन करते हैं ।
  12. 2 मिलीग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) मानक (सीमा 0.5-2 µ एल से मानक वक्र के लिए, कोशिकाओं के संगम की डिग्री पर निर्भर करता है) खाली कुओं (पंक्तियों जी और एच) के लिए, तो सभी कुओं के लिए बीसीए एजेंट जोड़ें ।
  13. प्रोटीन की µ जी प्रति WST-1 कमी के nmol के माध्यम से डेटा बढ़ाता है । ४३८ एनएम पर कम WST-1 के लिए विलुप्त होने गुणांक के रूप में ३७ मिमी-1 सेमी-1 22 का उपयोग करें ।

2. DPIP कमी परख

  1. बढ़ाएँ और C2C12 अनुयाई कक्षों चरण १.१ के रूप में एक ही प्रक्रिया के साथ अंतर ।
  2. तैयार स्टॉक 10 मिमी DPIP समाधान के रूप में निंनानुसार है । DPIP के ०.०२९ जी भंग (परिवार कल्याण: २९०.०८ g/दिः के 10 मिलीलीटर में2O. DPIP के एक spectrophotometer के साथ ६०० एनएम पर अवशोषण को मापने के द्वारा एकाग्रता की पुष्टि करें । ६०० एनएम पर कम DPIP के लिए विलुप्त होने गुणांक के रूप में 1 मिमी-1 सेमी-1 23 का उपयोग करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  3. 5 मिमी की अंतिम एकाग्रता के लिए पंजाब के ११.८८० मिलीलीटर के लिए ग्लूकोज की ०.०१०८ ग्राम जोड़ें । १०० µ एम के अंतिम एकाग्रता के लिए 10 मिमी DPIP के १२० µ एल जोड़ें ।
  4. जब tPMET में ascorbate भागीदारी की निगरानी, दो 6 मिलीलीटर aliquots में समाधान विभाजित । करने के लिए एक aliquot, जोड़ें 6 µ l के दिः2O और अंय aliquot जोड़ें 6 µ l के 2 कू/एमएल ओ के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 2/
  5. जब tPMET में सुपरऑक्साइड भागीदारी की निगरानी, दो 6 मिलीलीटर aliquots में समाधान विभाजित । एक aliquot करने के लिए, जोड़ें ५५ µ एल के ०.१ एम केपीओ4 बफर और अंय aliquot जोड़ें ५५ µ एल के ६.५ कू/एमएल वतन के एक अंतिम एकाग्रता के लिए ६० U/एमएल ।
  6. महाप्राण मीडिया और पंजाब के १५० µ एल में कोशिकाओं को धो लें । महाप्राण और DPIP समाधान के १०० µ l को जोड़ें (-) वतन या (-) ए ओ के कॉलम 1-6 और जोड़ १०० µ l के DPIP समाधान (+) वतन या (+) ए ओ के कॉलम 7-12 में ९६-वेल प्लेट । पंक्तियों का उपयोग करें G और H पृष्ठभूमि नियंत्रण के रूप में (यानी, कोशिकाओं के बिना कुओं में अकेले एजेंट में अवशोषण में परिवर्तन की निगरानी करने के लिए).
  7. उपाय ६०० एनएम spectrophotometer हर 10 मिनट के लिए 1 ज. में परिवर्तन को मापने के लिए का उपयोग करते हुए अवशोषित पर नियंत्रण के सापेक्ष ६० मिनट के समान कदम 1.9-1.13 ।

3. क्या कम इलेक्ट्रॉन स्वीकार के निर्धारण के लिए ए. ए. या वतन के लिए सब्सट्रेट हैं

  1. पंजाब या एचबीएस के ५.४३६ मिलीलीटर के लिए, 10 मिमी WST-1 के २४० µ एल जोड़ने के लिए एक अंतिम एकाग्रता के लिए ४०० µ एम और 24 µ एल के 5 मिमी पीएमएस के 20 µ एम की एक अंतिम एकाग्रता के लिए.
    1. DPIP के लिए, 10 मिमी DPIP के ६० µ एल जोड़ें, १०० µ मीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए, पंजाबियों या एचबीएस के ५.९४० मिलीलीटर के लिए ।
  2. एक फ्लैट में एक अच्छी तरह से नीचे ९६-अच्छी प्लेट में कोशिकाओं के अभाव में समाधान के १०० µ एल जोड़ें और DPIP के लिए WST-1, या ६०० एनएम के लिए, ४३८ एनएम में एक spectrophotometer में अवशोषित मापने ।
  3. १०० माइक्रोन की एक अंतिम एकाग्रता के लिए कुओं के आधे से 10 मिमी ascorbate के 1 µ एल जोड़ें । जब तक यह स्थिर अवशोषण की निगरानी ।
  4. स्थिरीकरण पर, 1 µ l जोड़ें २०० u/एमएल ए ओ के अंतिम एकाग्रता के लिए 2 यू/एमएल एक अच्छी तरह से या जोड़ने के 1 µ एल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 6 कू/एमएल वतन एक अच्छी तरह से करने के लिए और 1 एच के लिए अवशोषक की निगरानी ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

सांख्यिकी दोहराया RStudio सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर25का उपयोग कर उपायों के साथ ANOVA के साथ प्रदर्शन किया गया । नमूना आकार चित्र लेजेंड में इंगित किए गए हैं ।

tPMET की निगरानी करने के लिए, C2C12 myotubes extracellular इलेक्ट्रॉन स्वीकार, WST-1 और DPIP के साथ उपयोग किया गया था । ओ. ए. WST-1 और DPIP कमी के जो भाग निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ascorbate समाप्ति के कारण था और वतन WST के जो भाग-1 कमी निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था extracellular सुपरऑक्साइड रिलीज के कारण था । के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है, C2C12 myotubes tPMET के रूप में WST-1 की कमी से देखा में सक्षम हैं । ए ओ के अलावा, WST-1 कमी ~ 30% का संकेत है कि ~ tPMET के 30% ascorbate (चित्रा 2a) के निर्यात के कारण था द्वारा दबा दिया गया था. वतन के अलावा, WST-1 कमी ~ ७०% द्वारा दबा दिया गया था, यह दर्शाता है कि ~ ७०% tPMET के कारण extracellular सुपरऑक्साइड रिलीज (चित्रा 2 बी) था । जब DPIP ए ओ के अलावा के साथ एक extracellular इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ता के रूप में उपयोग किया गया था, DPIP कमी १००% से अधिक दबा दिया गया था (चित्रा 3) । यह ascorbate के योगदान का आकलन करने के लिए ए ओ के साथ DPIP का उपयोग करने की वैधता के बारे में सवाल उठाया ।

में देखो कि कम WST-1 ए ओ या वतन के लिए एक सब्सट्रेट है, WST-1 ascorbic एसिड के साथ कम किया गया था । ए ओ या वतन जोड़ा गया, और िारी नजर आई । 1 ज के बाद, ए ओ या वतन और WST के कम फार्म-1 ए ओ या वतन के साथ (चित्रा 4a, बी) के बिना WST के कम फार्म के बीच अवशोषक में कोई बदलाव नहीं था । इसलिए, कम WST-1 इन एंजाइमों के लिए एक सब्सट्रेट नहीं है, और WST-1 के साथ संयोजन के रूप में ए ओ या वतन का उपयोग ascorbate या सुपरऑक्साइड, क्रमशः की भूमिकाओं के आकलन के लिए उपयुक्त है ।

निर्धारित करने के लिए यदि कम DPIP ए ओ या वतन के लिए एक सब्सट्रेट है, DPIP ascorbic एसिड के साथ कम किया गया था । 20 मिनट के बाद, ए ओ जोड़ा गया था, और अवशोषित पर नजर रखी थी । कम DPIP को ए ओ के लिए एक सब्सट्रेट, के रूप में दिखाया गया था चित्रा 5, जहां DPIP ४० मिनट के भीतर अपने ऑक्सीकरण फार्म के लिए रिटर्न में देखा । जब वतन जोड़ा गया था, DPIP भी फिर से ऑक्सीकरण (चित्रा 5B) था । इसलिए, कम DPIP इन एंजाइमों और नहीं एक उपयुक्त extracellular इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने के लिए इन एंजाइमों के साथ उपयोग किया जा करने के लिए एक सब्सट्रेट है ।

Figure 1
चित्रा 1: इलेक्ट्रॉन परिवहन परख और extracellular इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने के साथ एंजाइमी बातचीत के निर्धारण के प्रमुख कदम का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: ए ओ और वतन के अलावा C2C12 myotubes द्वारा WST-1 कमी को दबा । (क) tPMET ६० के लिए विश्लेषण किया गया था ४०० µ एम WST-1 और 20 µ एम पीएमएस के अलावा के साथ का उपयोग कर 2 U/एमएल ए ओ या दिः2ओ (N = 18/ (ख) tPMET ६० यू/एमएल वतन या ०.१ मीटर केपीओ4 बफर (एन = 36/समूह) के अलावा के साथ ६० मिनट के लिए विश्लेषण किया गया था । * संकेत समय बिंदु परपी≥ ०.०५ । त्रुटि पट्टियां माध्य की मानक त्रुटि दर्शाती है और कल्पना करने के लिए बहुत छोटी हो सकती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: ए ओ के अलावा C2C12 myotubes द्वारा DPIP कमी को दबा देता है । tPMET ६० के लिए विश्लेषण किया गया था १०० µ m DPIP के साथ या बिना 2 U/एमएल ए ओ ए के अलावा (N = 36/ * संकेत समय बिंदु परपी≥ ०.०५ । त्रुटि पट्टियां माध्य की मानक त्रुटि दर्शाती है और कल्पना करने के लिए बहुत छोटी हो सकती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: कम WST-1 ए ओ या वतन के लिए एक सब्सट्रेट नहीं है. (क) WST-१ को ascorbate के साथ घटा दिया गया. ४५ मिनट के बाद, ए ओ जोड़ा गया था, और अवशोषित 1 एच के लिए निगरानी की गई । िारी में कोई बदलाव नहीं देखा गया । (ख) प्रक्रिया के ऊपर के रूप में एक ही है, सिवाय वतन ४५ मिनट के बाद जोड़ा गया था । अवशोषक में कोई परिवर्तन नहीं देखा गया था (N = 24/ त्रुटि पट्टियां माध्य की मानक त्रुटि दर्शाती है और कल्पना करने के लिए बहुत छोटी हो सकती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: कम DPIP ए ओ और वतन के लिए एक सब्सट्रेट है । (क) DPIP के साथ ascorbate कम हो गई थी. 20 मिनट के बाद, ए ओ जोड़ा गया था, और अवशोषित पर नजर रखी थी । ४० मिनट के भीतर, नमूने उनके मूल अवशोषित करने के लिए लौटे, संकेत है कि कम DPIP ए. ए. के लिए एक सब्सट्रेट है । (B) DPIP को ascorbate के साथ घटाया गया था । 20 मिनट के बाद वतन जुड़ गया, और िारी नजर आई । समय के साथ, कम DPIP फिर से ऑक्सीकरण हो गया था, संकेत है कि कम DPIP वतन के लिए एक सब्सट्रेट है (N = 24/ त्रुटि पट्टियां माध्य की मानक त्रुटि दर्शाती है और कल्पना करने के लिए बहुत छोटी हो सकती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6: योजनाबद्ध चित्रण tPMET. tPMET के इस मॉडल में, ascorbate (या एक और इलेक्ट्रॉन वाहक) सेल द्वारा निर्यात extracellular पीएमएस कम कर सकते हैं । इसके अलावा, NADPH oxidases उत्पंन extracellular सुपरऑक्साइड, जो WST-1 को कम करने या सीधे पीएमएस की कमी के माध्यम से इसे कम कर सकते हैं । अंय प्लाज्मा झिल्ली दाताओं से इलेक्ट्रॉनों पीएमएस भी कम कर सकते हैं, जो या तो WST-1 या के लिए इलेक्ट्रॉनों दान कर सकते है बाद में WST-1 कमी के साथ2 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हम extracellular इलेक्ट्रॉन स्वीकार करता है, WST-1 और DPIP, स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक परख में tPMET C2C12 में myotubes पर नजर रखने के उपयोग के लिए दो तरीके प्रस्तुत किया है । मानक संस्कृति प्रक्रियाओं और एक spectrophotometer प्लेट रीडर में सेल लाइनों के विकास के साथ, यह एक सरल microplate परख में इन इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने वालों के साथ tPMET पर नजर रखने के लिए संभव है । WST-1 कमी अच्छी तरह से एक परख के भीतर अच्छी तरह से reproducible है, लेकिन वहां दिन के लिए दिन परिवर्तनशीलता है । दिन के लिए भिंनता के दिन गुणांक (cv) के रूप में बफर का उपयोग ०.१८ और एचबीएस बफ़र के रूप में उपयोग कर रहा है ०.२३ है cv ।

पिछले mPMS और WST-1 का उपयोग साहित्य से, हम इस प्रोटोकॉल, विशेष रूप से, पीएमएस के उपयोग के लिए संशोधित किया है । इस प्रकार, समस्या निवारण शामिल पीएमएस और WST के उपयुक्त सांद्रता का निर्धारण-1 myotubes वर्णित के साथ प्रयोग के लिए । हम यह भी निर्धारित किया है कि तापमान (23-37 डिग्री सेल्सियस की एक श्रेणी में) परख के लिए एक महत्वपूर्ण घटक नहीं है, जबकि प्लेट प्रत्येक अवशोषक पढ़ने से पहले मिलाते हुए महत्वपूर्ण है । हालांकि, इन समस्याओं के लिए जो करने के लिए परख लागू है अंय कक्ष पंक्तियों के लिए जांच की जानी चाहिए । वतन की क्षमता और ए ओ के बारे में निष्कर्ष सीधे ऑक्सीकरण WST कम-1 सुझाव है कि इस संपत्ति के लिए नए परख घटकों की स्क्रीनिंग समस्या निवारण का एक महत्वपूर्ण पहलू है ।

हमारे डेटा का पता चलता है कि पीएमएस WST-1 के साथ संयोजन के रूप में उपयोग किया जाना चाहिए ताकि इष्टतम WST-1 में कमी लाना । हमने पाया है कि एक 1 मिलीलीटर मात्रा में, १०० µ एम ascorbate पीएमएस की उपस्थिति में WST-1 प्रति मिनट की ३२२ nmol कम कर देता है, जो WST-1 द्वारा ascorbate की सीधी कटौती के लिए आवश्यक है । में एक 1 मिलीलीटर की मात्रा, 2 यू/ए ए ओ ऑक्सीकरण ascorbate की दर से ४,४०० nmol/एस, या ८०० गुना तेजी से WST-1 की कमी से ascorbate । जाहिर है, ओ के एंजाइमी गतिविधि पीएमएस के प्रत्यक्ष कमी की तुलना में बहुत तेजी से है/WST-1 द्वारा ascorbate । हम उंमीद करते है कि एक ही सुपरऑक्साइड और वतन के लिए पालन करेंगे, हालांकि हम सुपरऑक्साइड द्वारा WST-1 कमी की निरपेक्ष दर को मापने के लिए एक प्रणाली नहीं है ।

यह निर्धारित करने के लिए कि पीएमएस के शामिल किए जाने से WST की कमी को प्रभावित करता है-सुपरऑक्साइड द्वारा 1, हम एक xanthine oxidase (४.५ म्यू/एमएल)/hypoxanthine (०.१ मिमी) सुपरऑक्साइड उत्पादन प्रणाली के रूप में पहले वर्णित26,27का इस्तेमाल किया । पीएमएस का समावेश लगभग इस प्रणाली द्वारा WST-1 कमी की दर डबल्स । इस प्रकार, ऐसा लगता है कि पीएमएस मध्यस्थता सुपरऑक्साइड से इलेक्ट्रॉनों के हस्तांतरण WST-1 के लिए ।

आगे सेलुलर WST-1 कमी के लिए पीएमएस की आवश्यकता का मूल्यांकन करने के लिए, हम उपस्थिति या पीएमएस और WST की अनुपस्थिति में कमी परख-1, और पाया कि पीएमएस सेलुलर WST-1 कमी के लिए आवश्यक है । जब कोशिकाओं परख अकेले पीएमएस युक्त (WST-1 के अभाव में), वहां ४३८ एनएम में अवशोषक में वृद्धि हुई है में मशीन हैं । यह संभावना पीएमएस के semiquinone फार्म का एक संचय (पीएमएस-वर्ग) है कि ४४० एनएम28पर एक चोटी अवशोषक है दर्शाता है । पीएमएस के संचय-वर्ग पता चलता है कि पीएमएस तेजी से कम किया जा रहा है की तुलना में यह इलेक्ट्रॉनों को पारित कर सकते है हे2 के लिए सुपरऑक्साइड का उत्पादन । इस प्रकार, पीएमएस के संचय-वर्ग पीएमएस द्वारा2 की रिपोर्ट धीमी कमी के अनुरूप है-वर्ग पूरी तरह से कम पीएमएस28के लिए दर की तुलना में ।

हम यह भी एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है अगर इलेक्ट्रॉन स्वीकार एंजाइमों कि tPMET की निगरानी के लिए उपयोग किया जा सकता है के लिए सब्सट्रेट रहे हैं । एक spectrophotometer में extracellular इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने वालों की कमी की निगरानी द्वारा ब्याज की एंजाइम के अलावा के बाद, यह निर्धारित करने के लिए यदि इलेक्ट्रॉन स्वीकार्यता इन एंजाइमों के लिए एक सब्सट्रेट है संभव है । इस विधि के माध्यम से, हमने दिखाया है कि कम DPIP ए ओ और वतन के लिए एक सब्सट्रेट संकेत है कि यह ascorbate समाप्ति और सुपरऑक्साइड निर्यात की निगरानी के लिए एक उपयुक्त इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ता नहीं है ।

परीक्षण के लिए प्रक्रिया या नहीं, जैसे वतन या ए ओ कलाकृतियों बनाने के रूप में परख घटक मौजूदा तरीकों पर एक महत्वपूर्ण सुधार है । उदाहरण के लिए, कम DPIP वतन के लिए एक सब्सट्रेट है, सुझाव है कि प्रकाशित DPIP और वतन के उपयोग के साथ प्राप्त डेटा तदनुसार व्याख्या की जानी चाहिए । हमारे निष्कर्षों का समर्थन पिछले दयान और डावसन, जिसमें leuco 2, 6-dichloroindophenol के अवशोषण के बाद के रूप में निगरानी की गई द्वारा किए गए अनुसंधान ए ओ के अलावा: DPIP यह दर्शाता है कि यह ए. ए.29के लिए एक सब्सट्रेट है ऑक्सीकरण हो गया था । हालांकि, हमारे निष्कर्षों टैन और Berridge द्वारा किए गए अनुसंधान के लिए संदर्भ जोड़ें24, साथ ही साथ Bellavite एट अल । 30, कि DPIP कमी को बाधित करने के लिए वतन का उपयोग किया । ताम्र और Berridge द्वारा किए गए एक अध्ययन में WST-१, DPIP, और FeCN की हेला कोशिकाओं में इलेक्ट्रॉनक स्वीकार्यताओं की तुलना करते हुए उन्होंने देखा कि कुछ इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने वालों की कमी वतन की उपस्थिति में दबी हुई थी. WST की कमी-1, mPMS के साथ संयोजन के रूप में, DPIP की कमी ४०% द्वारा बाधित किया गया था, जबकि वतन की उपस्थिति में ~ ८०% बाधित किया गया था । FeCN की कमी, एक वैकल्पिक मध्यवर्ती इलेक्ट्रॉन स्वीकार्यता के साथ संयोजन के रूप में,24वतन की उपस्थिति में हिचक नहीं था । जब NADPH oxidases और DPIP या cytochrome सी, Bellavite एट अल के बीच इलेक्ट्रॉन विनिमय की विधा का मूल्यांकन. पाया कि DPIP और cytochrome सी NADPH oxidases द्वारा कम कर रहे है और यह कमी काफी वतन से हिचकते है30। Berridge और टैन भी दिखा दिया है कि वतन 32Dcl23, WEHI3B, और J774 के साथ ही मानव कोशिका लाइनों में ८०% द्वारा WST-1 कमी को बाधित कर सकते है Jurkat, MALME3M, और 143B6,31। मानव प्राथमिक न्युट्रोफिल कोशिकाओं के साथ, WST-1 कमी वतन6,३२की उपस्थिति में ९५% बाधित किया गया ।

यहां डेटा का सुझाव है कि यह सत्यापित करने के लिए कि एंजाइमों tPMET को निर्यात अणुओं के विशिष्ट योगदान का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया फिर से extracellular इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ता के कम फार्म ऑक्सीकरण नहीं कर सकते महत्वपूर्ण है । हमने पाया है कि (डेटा नहीं दिखाया गया है) लौह क्लोराइड और लौह सल्फेट पंजाब में घुलनशील नहीं थे । एचबीएस और phenol लाल मुक्त DMEM में, वे तेजी से ऑक्सीकरण, एचबीएस या परख मीडिया के रूप में DMEM के साथ असंगति का प्रदर्शन किया गया । इसके विपरीत, ए ओ और वतन एक सब्सट्रेट के रूप में पोटेशियम ferrocyanide का उपयोग नहीं करते हैं, सुझाव है कि यह एक उपयुक्त extracellular इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ता अगर अपने कम विलुप्त होने गुणांक एक मुद्दा नहीं है ।

इस परख की मुख्य सीमाओं में से एक है कि पीएमएस/WST-1 और DPIP जैसे णड (पी) एच, ascorbate, और flavonoids जैसे quercetin और myricetin के रूप में कई इलेक्ट्रॉन दाताओं, द्वारा कम किया जा सकता है19,३३,३४। हालांकि, यह एंजाइमों के अलावा से दूर किया जा सकता है (जैसे, वतन, ए ओ) या अवरोधकों पीएमएस के लिए विशिष्ट योगदानकर्ताओं का निर्धारण करने के लिए/WST-1 या DPIP कमी. एक और सीमा है कि DPIP ए ओ और वतन के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में कार्य कर सकते हैं । इस प्रकार, इन एंजाइमों DPIP के साथ संयोजन के रूप में उपयोग नहीं किया जाना चाहिए tPMET की निगरानी के लिए । इस अध्ययन की एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण सीमा पीएमएस और अंय redox साइकिल चालकों की क्षमता है सुपरऑक्साइड26,३५,३६उत्पादन । यह चित्रा 6में सचित्र है । दूसरी ओर, पीएमएस ही कथित तौर पर tPMET३२पर कोई सीधा प्रभाव है । साथ ही, टैन और Berridge३२ दिखाया गया है कि NADPH oxidase (NOX) अवरोधक, diphenyleneiodinium क्लोराइड (dpi), WST-1 कमी के बहुमत को दबा कर सकते हैं, सुझाव है कि DPI-संवेदी tPMET NOX योगदान का एक विशिष्ट माप हो सकता है ते tPMET. एक और सीमा है कि हम जब WST-1 का उपयोग अवशोषक में छोटे परिवर्तन देखते हैं । हमने पाया है कि जब WST-1 ताजा बना दिया है और कोशिकाओं को धाराप्रवाह कर रहे हैं, अवशोषक में सबसे बड़ा परिवर्तन देखा है । पिछले P388 सेल लाइनों में किए गए अध्ययनों से पता चला है कि formazan की राशि का उत्पादन सकारात्मक सेल संख्या21के साथ संबद्ध । इसलिए, अधिक धाराप्रवाह कोशिकाओं तो WST-1 में कमी अधिक है । यह एक अच्छी तरह के लिए प्रोटीन की माइक्रोग्राम को सामान्य करने के द्वारा के लिए सही किया जा सकता.

एक इस परख के बारे में चेतावनी है कि यह मुख्य रूप से वैश्विक tPMET का आकलन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । हालांकि यह ascorbate समाप्ति के उदाहरण के रूप में tPMET, के कई रूपों की निगरानी में हेरफेर किया जा सकता है, और अधिक विशिष्ट परख अधिक उपयुक्त हो सकता है जब लक्ष्य tPMET के संदर्भ में माप की आवश्यकता नहीं है । फॉक्स उदाहरण के लिए, यदि सुपरऑक्साइड मुख्य ब्याज है, वहां अंय रास्ते की एक संख्या के लिए सुपरऑक्साइड, फ्लोरोसेंट अभेद्य जांच सहित जांच के उपयोग के रूप में निगरानी कर रहे हैं, aconitase, और nitroblue tetrazolium३७।

मौजूदा जांच DPIP, FeCN और ferricytochrome सी, वर्तमान नुकसान जैसे tPMET पर नजर रखने के लिए । उदाहरण के लिए, कम DPIP ए ओ और वतन के लिए एक सब्सट्रेट है, FeCN एक कम दाढ़ विलुप्त होने गुणांक है कि वास्तविक समय परख में अपनी उपयोगिता सीमा है, और cytochrome c महंगा है । इसके अतिरिक्त, इन जांचों के कुछ उच्च पृष्ठभूमि कम संवेदनशीलता के लिए अग्रणी उत्पादन कर सकते है जब अवशोषक३२में परिवर्तन को मापने । WST-1 ऐसे ए ओ और वतन के रूप में एंजाइमों के लिए एक सब्सट्रेट नहीं किया गया है दिखाया गया है । इसके अतिरिक्त, WST-1 एक उच्च दाढ़ विलुप्त होने गुणांक और एक कम पृष्ठभूमि प्रतिक्रिया है, एक अधिक संवेदनशील tPMET परख बनाने । आगे बढ़ते हुए, इस परख tPMET की प्रक्रिया को बेहतर समझने के लिए अवरोधकों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ उपयोग किया जा सकता है, एक दिया सेल लाइन में इलेक्ट्रॉन परिवहन के मार्ग का नक्शा, और कैसे एक कोशिका के redox वातावरण बनाए रखा है की बेहतर समझ के लिए सीसा ।

इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम निर्धारित है कि कोशिकाओं प्रयोग (~ ७०% धाराप्रवाह) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से परख रिएजेंट, विशेष रूप से WST-1 और पीएमएस, प्रत्येक परख के लिए ताजा बनाने के लिए तैयार कर रहे है शामिल हैं । यह भी महत्वपूर्ण है कोशिकाओं को धोने के लिए पहले परख रिएजेंट के अलावा । DMEM इस प्रोटोकॉल में उपयोग ascorbate शामिल नहीं है, हालांकि हम ascorbate के साथ अंतर मध्यम पूरक । उपलब्ध मीडिया की एक संख्या में ascorbate होते हैं । तथापि, कोशिकाओं को परख रिएजेंट के अलावा पहले धोया जाता है, जो ascorbate-मुक्त होते हैं, माध्यम से किसी भी अवशिष्ट ascorbate को दूर करते हैं. tPMET के एक भाग के रूप में आणविक समाप्ति के लिए कारण (है, ascorbate निर्यात), यह महत्वपूर्ण है के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रीडिंग तुरंत परख के अलावा एजेंट के बाद शुरू इतना के रूप में समाप्ति के पहले क्षणों को याद नहीं है । इसके अलावा, यह एक प्रयोग में प्रत्येक व्यक्ति के एजेंट के लिए पृष्ठभूमि कुओं को शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है । इस समाचार पत्र में वर्णित परख घटक अवशोषण में पृष्ठभूमि परिवर्तन के कारण नगण्य है । हालांकि, कुछ additives (उदा., phloretin) एक पर्याप्त पृष्ठभूमि प्रतिक्रिया को बढ़ावा दे सकते हैं । इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है कि पृष्ठभूमि से बाहर है जब डेटा को किसी भी मिल प्रभाव है कि रिएजेंट खुद का उत्पादन कर सकते है को खत्म करने का विश्लेषण कर रहे है घटाया है ।

संक्षेप में, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल tPMET का आकलन करने का एक साधन प्रदान करता है और निरंतर और प्रोटोकॉल है कि जब अलग सेल लाइनों के लिए परख लागू करने और/या विशिष्ट योगदानकर्ताओं का आकलन करने में लिया जाना चाहिए के पहलुओं की एक संख्या से पता चलता है ( ascorbate और सुपरऑक्साइड का उपयोग यहां) से tPMET ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम थॉमस बेल, Lyn Mattathil, मार्क Mannino, और Neej पटेल उनके तकनीकी समर्थन के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । यह काम संयुक्त राज्य अमेरिका सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा पुरस्कार R15DK102122 द्वारा राष्ट्रीय मधुमेह और पाचन और गुर्दे की बीमारी (NIDDK) के जोनाथन फिशर के लिए संस्थान से समर्थन किया गया था । पांडुलिपि सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि NIDDK या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C2C12 myoblasts American Type Culture Collection  CRL-1772
Dulbecco's modified eagle's medium - low glucose Sigma D6046
Fetal Plex animal serum complex Gemini Bio-Products  100-602
penicillin-streptomycin Sigma 516106
horse serum Gibco Technologies 16050-130
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma D8537
trypsin-EDTA Sigma T4049
15 cm culture dishes TPP 93150
96 well culture plates TPP 92096
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) Accela ChemBio  Inc SY016315
phenazine methosulfate  Sigma P9625
L-ascorbic acid Sigma A5960
ascorbate oxidase  Sigma A0157
superoxide dismutase  Sigma S5395
2,6-dichloroindophenol sodium salt  ICN Biomedicals 215011825
D-(+)-glucose Sigma G7528
HEPES sodium salt Sigma H3784
sodium chloride Sigma S7653
potassium chloride Fisher Scientific  BP366
magnesium sulfate heptahydrate Sigma M5921
calcium chloride dihydrate Sigma C7902
potassium phosphate Fisher Scientific  BP363
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Powerwave X-I spectrophotometer Biotek Insturments discontinued 
Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer Thermo Scientific 336001
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile MidSci 781602
Iron (II) chloride tetrahydrate Sigma 220299
Iron (II) sulfate heptahydrate Sigma 215422
hypoxanthine Sigma H9636
xanthine oxidase Sigma X4500
Excel Microsoft
R Studio Rstudio https://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4 Biotek Insturments discontinued 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).
  2. Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).
  3. Craig, T. A., Crane, F. L. Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells. Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).
  4. Mishra, R. K., Passow, H. Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells. J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).
  5. Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. Transplasma-membrane redox systems in growth and development. Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).
  6. Berridge, M. V., Tan, A. S. Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1. Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).
  7. Eccardt, A. M., et al. Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle. Antioxidants. 6 (4), 89 (2017).
  8. Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane. J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).
  9. Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells. J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).
  10. Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport. Biochemistry. 33, 11850-11857 (1994).
  11. Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).
  12. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. Multifunctional plasma membrane redox systems. Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).
  13. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells. FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).
  14. Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane. Biochem Biophys Res Commun. 234 (0), 79-81 (1997).
  15. Navarro, F., et al. Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes. Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).
  16. Herst, P. M., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines. Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).
  17. Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation. FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).
  18. Furukawa, S., et al. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).
  19. Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease. Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).
  20. Berridge, M. V., Tan, A. S. High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).
  21. Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).
  22. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
  23. Gurtoo, H. L., Johns, D. G. On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase. J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).
  24. Tan, A. S., Berridge, M. V. Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells. Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).
  25. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2013).
  26. Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1). Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).
  27. Higaki, Y., et al. Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).
  28. Zuagg, W. Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level. J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).
  29. Dayan, J., Dawson, C. R. Substrate specificity of ascorbate oxidase. Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).
  30. Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol. FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).
  31. Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts. Biochemica. 4, 15-20 (1996).
  32. Tan, A. S., Berridge, M. V. Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents. J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).
  33. Phillips, P. A., et al. Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway. Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).
  34. Altundag, E., et al. Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells. Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).
  35. Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase. Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).
  36. Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen. J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).
  37. Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases. Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).

Tags

जैव रसायन अंक १३५ tPMET WST-1 DPIP ascorbate सुपरऑक्साइड C2C12 myotubes स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक परख
C2C12 Myotubes द्वारा ट्रांस प्लाज्मा झिल्ली इलेक्ट्रॉन परिवहन को मापने
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kelly, S. C., Eccardt, A. M.,… More

Kelly, S. C., Eccardt, A. M., Fisher, J. S. Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes. J. Vis. Exp. (135), e57565, doi:10.3791/57565 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter