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Biochemistry

Trasporto dell'elettrone di miotubi C2C12 Trans-Plasma membrana di misura

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57565
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biology, Saint Louis University
* These authors contributed equally

Summary

L'obiettivo del presente protocollo è di monitorare spettrofotometricamente trans-plasma membrana elettrone trasporto utilizzando accettori extracellulari e di analizzare le interazioni enzimatiche che possono verificarsi con questi accettori extracellulari.

Abstract

Trans-plasma membrana electron transport (tPMET) svolge un ruolo nella protezione delle cellule dallo stress riduttivo intracellulare così come protezione da danni da ossidanti extracellulari. Questo processo di trasporto di elettroni da riducenti intracellulare agli ossidanti extracellulari non è ben definito. Qui vi presentiamo le analisi spettrofotometriche di miotubi C2C12 per monitorare tPMET utilizzando gli accettori extracellulari: sale di tetrazolio solubile in acqua-1 (WST-1) e 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP o DCIP). Attraverso la riduzione di questi accettori, siamo in grado di monitorare questo processo in un'analisi in tempo reale. Con l'aggiunta di enzimi come la superossido dismutasi (SOD) per l'analisi e l'ascorbato ossidasi (AO), possiamo determinare quale parte del tPMET è a causa della produzione di superossido o esportazione dell'ascorbato, rispettivamente. Mentre WST-1 è stato indicato per produrre risultati stabili con fondo basso, DPIP è stato in grado di essere ri-ossidato dopo l'aggiunta di AO e SOD, che è stata dimostrata con analisi spettrofotometriche. Questo metodo dimostra un'analisi spettrofotometrica in tempo reale, multi-pozzetto e veloce con vantaggi rispetto ad altri metodi utilizzati per il monitoraggio tPMET, come ferricianuro (FeCN) e ferricitocromo c riduzione.

Introduction

La capacità delle membrane plasmatiche purificate per ridurre accettori ha condotto alla vista che la membrana plasmatica ha un redox intrinseca capacità1. Precedentemente visto in funghi, piante e animali, tPMET è un processo comune a più organismi2,3,4,5. In particolare, questo processo è stato dimostrato in Saccharomyces cerevisiae, cellule di carota, eritrociti, linfociti, osteosarcoma, il melanoma, macrofagi, muscolo scheletrico e neutrofili2,3, 4 , 5 , 6 , 7. in un processo che trasporta gli elettroni attraverso la membrana plasmatica per ridurre extracellulari ossidanti, tPMET è coinvolto in molte funzioni cellulari tra cui: cella crescita5,8, cellula attuabilità9, Ferro da stiro metabolismo10,11,12,13e protezione da ossigeno reattivo specie12,14,15di segnalazione delle cellule. A causa del coinvolgimento di tPMET in molte funzioni cellulari, uno squilibrio di tPMET è stata supposta per contribuire allo sviluppo di alcune condizioni di salute gravi, tra cui cancro16, malattia cardiovascolare17e metabolica la sindrome18.

Ci sono diversi modi per monitorare il trasferimento di elettroni attraverso la membrana plasmatica, ma la tecnica più ampiamente usata è quello di valutare la riduzione di accettori extracellulari attraverso saggi colorimetrici. Accettori extracellulari comunemente utilizzati sono sali di tetrazolio, DPIP e FeCN ferricitocromo c19,20. Il sale di tetrazolio più comunemente usato è un noto sale seconda generazione come WST-119. Questo composto è più facile da utilizzare in saggi colorimetrici rispetto ai sali di tetrazolio di prima generazione a causa di due gruppi solfonato, che aumentano la sua acqua solubilità21. WST-1, in concomitanza con l'intermedio elettrone accettore 1-metossi-fenazina methosulfate (MPM), è ridotto in eventi di due trasferimento singolo elettrone. Questa riduzione cambia la forma ossidata debolmente colorato di WST-1 a un più intenso, giallo formazan20,22. WST-1 ha un coefficiente di estinzione molare alta di 37 x 103 M-1cm-1, portando a un dosaggio ad alta sensibilità21,22. DPIP viene anche utilizzato come un ricettore dell'elettrone extracellulare per monitorare tPMET. È stato dimostrato che DPIP può essere ridotto extracellularly di tPMET senza l'ausilio di intermedi elettroni accettori23,24. A causa della mancanza di accettori intermedi, DPIP può direttamente gli elettroni di pick-up dalla membrana del plasma, a differenza di WST-124. Simile a DPIP, FeCN ha dimostrato di essere ridotto extracellularly a ferrocianuro di tPMET senza l'ausilio di intermedi elettroni accettori19,24. A differenza di WST-1 e DPIP, FeCN ha un coefficiente di estinzione molare basso che conduce a un più basso dosaggio sensibilità9. Un altro accettore di elettroni extracellulare comunemente usate per monitorare tPMET è ferricitocromo c. simile a WST-1, ferricitocromo c riduzione aumenta con l'uso di accettore di elettroni intermedi, mPMS22. A differenza di WST-1 però, il metodo di ferricitocromo c è meno sensibile a causa di un'alta priorità bassa e un coefficiente di estinzione molare basso22.

Qui presentiamo un metodo per l'analisi in tempo reale di tPMET attraverso analisi spettrofotometriche. Il metodo utilizzato l'accettori extracellulari WST-1 e DPIP, dato che entrambi hanno un coefficiente di estinzione molare alta mentre essendo meno costoso rispetto agli altri comunemente usato accettori extracellulari quali ferricitocromo c. Abbiamo utilizzato fenazina methosulfate (PMS) invece di mPMS hanno una composizione chimica simile e PMS è molto meno costoso. mPMS è fotochimicamente stabile che è una caratteristica importante per un kit commerciale che ha bisogno di una lunga shelf life. Tuttavia, facciamo PMS fresco per ogni dosaggio, quindi stabilità non dovrebbe essere un problema. Presentiamo anche un metodo per valutare le possibili interazioni enzimatiche (Vedi Figura 1) tra il ricettore dell'elettrone extracellulare ed enzimi che possono essere utilizzati per caratterizzare ulteriormente il processo di tPMET. In particolare, gli enzimi AO e SOD può essere usato determinano quale parte del tPMET è dovuto al trasporto dell'ascorbato o rilascio extracellulare del superossido, due metodi comuni per gli elettroni essere trasportato attraverso la membrana plasmatica.

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Protocol

Nota: Vedere la Figura 1 per una descrizione schematica di passaggi chiave.

1. analisi di riduzione WST-1

  1. Crescere e differenziare cellule aderenti C2C12 con cella standard cultura procedure7 in una piastra a 96 pozzetti utilizzando righe A-F.
    1. Usare un mezzo di differenziazione consistente dell'Aquila per volta di Dulbecco Medium (DMEM) completati con 2% di siero equino, 100 U/mL di penicillina e 0,1 mg/mL di streptomicina. Incubare le cellule a 37 ° C con 5% CO2.
    2. Durante il monitoraggio di coinvolgimento di ascorbato in tPMET, supplemento media di differenziazione con l'acido ascorbico 100 µM. Consentire alle cellule di Incubare in media di differenziazione per ~ 24-48 h.
  2. Preparare soluzioni «stock» WST-1 e PMS.
    1. Per rendere uno stock di 10 mM di WST-1, sciogliere 0,033 g di WST-1 (Formula peso (FW): 651.34 g/mol) in 5 mL di fosfato tampone salino (PBS). Conservare a 4 ° C.
    2. Per rendere una scorta di 5 mM di PMS, sciogliere 0,0023 g di PMS (FW: 306.34 g/mol) in 1,5 mL di deionizzata H2O (diH2O). Conservare a-20 ° C e proteggere dalla luce.
  3. Aggiungi 0,0108 g di glucosio per soluzione salina tamponata con una concentrazione finale di 5 mM a 11,4 mL di PBS o HEPES (HBS; sale di sodio di 20 mM HEPES, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM MgSO4, 1mm CaCl2). µ L 480 di 10mm WST-1 per una concentrazione finale di 400 µM e 48 µ l di 5mm PMS per una concentrazione finale di 20 µM.
  4. Durante il monitoraggio di coinvolgimento di ascorbato in tPMET, è possibile dividere la soluzione in due aliquote di 6 mL. Ad un'aliquota, aggiungere 6 µ l di diH2O e l'altra aliquota aggiungere 6 µ l di AO 2 kU/mL per una concentrazione finale di 2 U/mL.
  5. Durante il monitoraggio di coinvolgimento di superossido in tPMET, è possibile dividere la soluzione in due aliquote di 6 mL. Ad un'aliquota, 55 µ l di tampone di4 KPO 0.1 M e l'altra aliquota aggiungere 55 µ l di SOD 6.5 kU/mL per una concentrazione finale di 60 U/mL.
  6. Lavare le cellule con PBS. Aspirare i media e aggiungere 150 µ l PBS. Poi aspirare il PBS.
    Nota: Il test è fatto con cellule placcate, allegate. Così, non esiste nessuna centrifugazione o uso della tripsina nel processo di lavaggio.
  7. Aggiungere 100 µ l di soluzione WST-1 (-) SOD o (-) AO a colonne 1-6 e aggiungere 100 µ l di soluzione WST-1 (+) SOD o (+) AO a colonne 7-12 la piastra a 96 pozzetti. Utilizzare righe G e H come sfondo controlli (vale a dire, per monitorare il cambiamento di assorbanza nel reagente solo nei pozzi senza cellule).
  8. Misurare i valori di assorbanza utilizzando lo spettrofotometro ogni 10 min per 1 h a 438 nm.
  9. Dopo la lettura, i media di aspirare e lavare ogni bene con 150 µ l di PBS. Poi aspirare il PBS.
  10. Calcolare la variazione di assorbanza di ciascun pozzetto sottraendo l'assorbanza iniziale per un pozzo dall'assorbanza in qualsiasi momento per bene. Correggere questo cambiamento per la variazione di assorbanza (se qualsiasi) osservata nei pozzetti sfondo (cioè, pozzetti con soluzione di saggio ma nessun cellule).
  11. Per l'analisi, normalizzare i dati di assorbanza per la misurazione di controllo 60 min o lavare i pozzetti con PBS o HBS e quindi eseguire un'analisi della proteina di bicinconinico acida (BCA).
  12. Aggiungere standard di albumina di siero bovino (BSA) 2 mg/mL (intervallo da 0,5-2 µ l per la curva standard, a seconda del grado di confluenza delle cellule) ai pozzetti vuoti (righe G e H), quindi aggiungere il reagente BCA in tutti i pozzetti.
  13. Quantificare i dati via nmol di WST-1 riduzione per µ g di proteina. Utilizzare 37 mM-1 cm-1 22 come il coefficiente di estinzione per ridotta WST-1 a 438 nm.

2. analisi di riduzione DPIP

  1. Crescere e differenziare le cellule aderenti C2C12 con la stessa procedura come passo 1.1.
  2. Preparare soluzione DPIP stock 10 mM come segue. Sciogliere 0,029 g di DPIP (FW: 290.08 g/mol) in 10 mL di diH2O. Confirm la concentrazione di DPIP misurando l'assorbanza a 600 nm con uno spettrofotometro. Utilizzare 1 mM-1 cm-1 23 come il coefficiente di estinzione per DPIP ridotta a 600 nm. Conservare a 4 ° C.
  3. Aggiungere 0,0108 g di glucosio 11,880 mL di PBS per una concentrazione finale di 5 mM. Aggiungere 120 µ l di 10 mM DPIP per una concentrazione finale di 100 µM.
  4. Durante il monitoraggio di coinvolgimento di ascorbato in tPMET, è possibile dividere la soluzione in due aliquote di 6 mL. Ad un'aliquota, aggiungere 6 µ l di diH2O e l'altra aliquota aggiungere 6 µ l di AO 2 kU/mL per una concentrazione finale di 2 U/mL.
  5. Durante il monitoraggio di coinvolgimento di superossido in tPMET, è possibile dividere la soluzione in due aliquote di 6 mL. Ad un'aliquota, 55 µ l di tampone di4 KPO 0.1 M e l'altra aliquota aggiungere 55 µ l di SOD 6.5 kU/mL per una concentrazione finale di 60 U/mL.
  6. I media di aspirare e lavare le cellule in 150 µ l di PBS. Aspirare il PBS e aggiungere 100 µ l di soluzione di DPIP (-) SOD o (-) AO a colonne 1-6 e aggiungere 100 µ l di soluzione DPIP (+) SOD o (+) AO a colonne 7-12 la piastra a 96 pozzetti. Utilizzare righe G e H volontà come sfondo controlli (vale a dire, per monitorare il cambiamento di assorbanza nel reagente solo nei pozzi senza cellule).
  7. Misurare l'assorbanza a 600 nm mediante spettrofotometro ogni 10 min per 1 h. quantificare la variazione di assorbanza relativo al controllo al min 60 simile procedura 1,9-1.13.

3. determinazione di se ridotta accettori sono substrati per AO o SOD

  1. 5,436 mL di PBS o HBS, aggiungere 240 µ l di 10 mM WST-1 per una concentrazione finale di 400 µM e 24 µ l di 5mm PMS per una concentrazione finale di 20 µM.
    1. Per DPIP, aggiungere 60 µ l di 10 mM DPIP, per una concentrazione finale di 100 µM, a 5,940 mL di PBS o HBS.
  2. Aggiungere 100 µ l di soluzione di ogni bene in una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto in assenza di cellule e misurare l'assorbanza a uno spettrofotometro a 438 nm, per WST-1, o 600 nm, per DPIP.
  3. Aggiungere 1 µ l di ascorbato di 10 mM per la metà dei pozzi per una concentrazione finale di 100 μM. Monitorare l'assorbanza finché non si stabilizza.
  4. Al momento di stabilizzazione, aggiungere 1 µ l di 200 U/mL AO per una concentrazione finale di 2 U/mL ad ogni pozzetto o aggiungere 1 µ l di 6 kU/mL SOD per una concentrazione finale di 60 U/mL a ciascun bene e monitorare l'assorbanza per 1 h.

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Representative Results

Le statistiche sono state effettuate con ANOVA con misure ripetute utilizzando RStudio software statistico25. Dimensioni del campione sono indicate nelle leggende figura.

Per monitorare tPMET, miotubi C2C12 sono stati utilizzati insieme accettori extracellulari, WST-1 e DPIP. AO è stato usato per determinare quale parte del WST-1 e DPIP riduzione era a causa del deflusso dell'ascorbato e SOD è stato utilizzato per determinare quale parte del WST-1 riduzione era dovuto rilascio extracellulare del superossido. Come illustrato nella Figura 2, miotubi C2C12 sono in grado di tPMET come si vede dalla riduzione del WST-1. Con l'aggiunta di AO, WST-1 riduzione è stata soppressa da ~ 30% che indica che circa il 30% di tPMET era dovuto l'esportazione dell'ascorbato (Figura 2A). Con l'aggiunta di zolla, WST-1 riduzione è stata soppressa da ~ 70%, indicando che circa il 70% di tPMET era dovuto rilascio extracellulare del superossido (Figura 2B). Quando DPIP è stato utilizzato come un ricettore dell'elettrone extracellulare con l'aggiunta di AO, è stata soppressa la riduzione DPIP oltre il 100% (Figura 3). Ciò ha sollevato domande riguardo alla validità di utilizzo DPIP con AO per valutare il contributo dell'ascorbato.

Per esaminare se ridotto WST-1 è un substrato per AO o SOD, WST-1 è stata ridotta con acido ascorbico. AO o SOD è stato aggiunto, e l'assorbanza è stata monitorata. Dopo 1 h, c'è stata alcuna variazione di assorbanza tra la forma ridotta del WST-1 senza AO o SOD e la forma ridotta del WST-1 con AO o SOD (Figura 4A, B). Di conseguenza, il ridotto WST-1 non è un substrato per questi enzimi, e l'uso di AO o SOD in combinazione con WST-1 è appropriato per la valutazione dei ruoli di ascorbato o superossido, rispettivamente.

Per determinare se ridotta DPIP è un substrato per AO o SOD, DPIP è stata ridotta con acido ascorbico. Dopo 20 min, AO è stato aggiunto, e l'assorbanza è stata monitorata. Ridotto DPIP è stato indicato per essere un substrato per AO, come si vede in Figura 5A, dove DPIP torna alla sua forma ossidata all'interno di 40 min. Quando è stato aggiunto SOD, DPIP è stato anche ri-ossidato (figura 5B). Di conseguenza, ridotto DPIP è un substrato per questi enzimi e non un accettore di elettroni extracellulare appropriato per essere utilizzato con questi enzimi.

Figure 1
Figura 1: una rappresentazione schematica dei passaggi chiave dei saggi di trasporto dell'elettrone e determinazione delle interazioni enzimatiche con l'accettori extracellulari. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: l'aggiunta di AO e SOD sopprime WST-1 riduzione di miotubi C2C12. TPMET (A) è stato analizzato per 60 min con 400 µM WST-1 e 20 µM PMS con l'aggiunta di 2 U/mL AO o diH2O (N = 18/gruppo). TPMET (B) è stato analizzato per 60 min con l'aggiunta di 60 U/mL SOD o 0,1 M KPO4 buffer (N = 36/gruppo). p≥ 0.05 al punto di tempo indicato. Barre di errore rappresentano l'errore standard della media e potrebbero essere troppo piccole per visualizzare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: l'aggiunta di AO sopprime la riduzione DPIP da miotubi C2C12. tPMET è stato analizzato per 60 min utilizzando 100 µM DPIP con o senza l'aggiunta di 2 U/mL AO (N = 36/gruppo). p≥ 0.05 al punto di tempo indicato. Barre di errore rappresentano l'errore standard della media e potrebbero essere troppo piccole per visualizzare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: ridotto WST-1 non è un substrato per AO o SOD. (A) WST-1 è stato ridotto con l'ascorbato. Dopo 45 min, AO è stato aggiunto, e l'assorbanza è stata monitorata per 1 h. È stata osservata alcuna variazione di assorbanza. (B) la procedura è lo stesso come sopra, tranne SOD è stato aggiunto dopo 45 min. È stata osservata alcuna variazione di assorbanza (N = 24/gruppo). Barre di errore rappresentano l'errore standard della media e potrebbero essere troppo piccole per visualizzare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: ridotta DPIP è un substrato per AO e SOD. (A) DPIP è stato ridotto con l'ascorbato. Dopo 20 min, AO è stato aggiunto, e l'assorbanza è stata monitorata. Entro 40 min, i campioni restituiti al loro originale capacità di assorbimento, che indica che la ridotta DPIP è un substrato per AO. (B) DPIP è stato ridotto con l'ascorbato. Dopo 20 min, SOD è stato aggiunto, e l'assorbanza è stata monitorata. Nel corso del tempo, il DPIP ridotto è stato ri-ossidato, che indica che ridotto DPIP è un substrato per SOD (N = 24/gruppo). Barre di errore rappresentano l'errore standard della media e potrebbero essere troppo piccole per visualizzare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: schematico raffigurante tPMET. In questo modello di tPMET, l'ascorbato (o un altro vettore di elettroni) esportati dalla cellula può ridurre PMS extracellulare. Inoltre, ossidasi di NADPH generano extracellulare del superossido, che può ridurre WST-1 direttamente o ridurlo indirettamente tramite riduzione della sindrome premestruale. Elettroni da altri donatori di plasma membrana possono anche ridurre la PMS, che può donare elettroni WST-1 o O2 con conseguente riduzione di WST-1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Abbiamo presentato due metodi per utilizzare extracellulare accettori, WST-1 e DPIP, nelle analisi spettrofotometriche per monitorare tPMET in miotubi C2C12. Con la crescita di linee cellulari nelle procedure standard di cultura e di un lettore di piastra spettrofotometro, è possibile monitorare tPMET con questi accettori in un'analisi semplice micropiastra. WST-1 riduzione è riproducibile dal pozzetto a altro all'interno di un test, ma non c'è variabilità giorno per giorno. Il quotidiano coefficiente di variazione (CV) che utilizzano PBS del buffer è 0,18 e il CV che utilizzano HBS come il buffer è di 0,23.

Dalla letteratura precedente utilizzando mPMS e WST-1, abbiamo modificato questo protocollo, in particolare, per l'utilizzo del PMS. Così, risoluzione dei problemi inclusi determinare le concentrazioni adeguate di PMS e WST-1 per l'utilizzo con i miotubi descritto. Inoltre abbiamo determinato che la temperatura (in una gamma di 23-37 ° C) non è un componente critico per il dosaggio, mentre scuotendo la piastra prima di ogni lettura di assorbanza è importante. Tuttavia, questi problemi dovrebbero essere studiati per altre linee cellulari a cui è applicato il dosaggio. I risultati per quanto riguarda la capacità di zolla e AO di ossidare direttamente ridotto WST-1 suggeriscono che lo screening di nuovi componenti di dosaggio per questa proprietà è un aspetto chiave della risoluzione dei problemi.

I nostri dati suggeriscono che il PMS dovrebbe essere utilizzato in combinazione con WST-1 al fine di suscitare riduzione ottimale WST-1. Abbiamo trovato che in un volume di 1 mL, ascorbato di 100 µM riduce 322 nmol di WST-1 al minuto in presenza di PMS, che è richiesto per riduzione diretta di WST-1 dall'ascorbato. In un volume di 1 mL, 2 U/mL di AO si ossida l'ascorbato ad un tasso di 4.400 nmol/s, o 800 volte più veloce rispetto alla riduzione di WST-1 dall'ascorbato. Chiaramente, l'attività enzimatica di AO è molto più veloce di riduzione diretta del PMS/WST-1 dall'ascorbato. Ci aspettiamo che lo stesso avrebbe seguito per superossido e SOD, anche se non abbiamo un sistema per misurare il tasso assoluto di WST-1 riduzione di superossido.

Per determinare se l'inclusione di PMS colpisce la riduzione di WST-1 da superossido, abbiamo utilizzato una xantina ossidasi (4,5 mU/mL) / superossido ipoxantina (0,1 mM) sistema di generazione come precedentemente descritto26,27. Inclusione di PMS approssimativamente raddoppia il tasso di riduzione WST-1 da questo sistema. Quindi, sembra che PMS media il trasferimento di elettroni da superossido a WST-1.

Per valutare ulteriormente il requisito di PMS per cellulare WST-1 riduzione, abbiamo analizzato la riduzione in presenza o assenza di PMS e WST-1 e ho trovato che PMS è necessario per cellulare WST-1 riduzione. Quando le cellule vengono incubate in un reagente test contenente PMS da solo (in assenza di WST-1), vi è un aumento di assorbanza a 438 nm. Ciò probabilmente riflette un accumulo della forma di semiquinone della sindrome premestruale (PMS-SQ) che ha una capacità di assorbimento di picco a 440 nm28. Accumulo di PMS-SQ suggerisce che PMS si riduce più velocemente di quanto può passare gli elettroni a O2 per la produzione di superossido. Pertanto, l'accumulo di PMS-SQ è coerenza con la riduzione lenta segnalata di O2 di PMS-SQ rispetto alla tariffa per completamente ridotto PMS28.

Abbiamo anche presentato un protocollo per determinare se gli accettori sono substrati per gli enzimi che possono essere utilizzati per monitorare tPMET. Controllando la riduzione dell'accettori extracellulari in uno spettrofotometro, seguita dall'aggiunta dell'enzima di interesse, è possibile determinare se il ricettore dell'elettrone è un substrato per questi enzimi. Attraverso questo metodo, abbiamo dimostrato che ridotta DPIP è un substrato per AO e SOD che indica che non è un accettore di elettroni adatto per il monitoraggio di esportazione del superossido e del deflusso dell'ascorbato.

La procedura per il test o meno dosaggio componenti quali SOD o AO creano artefatti è un miglioramento significativo rispetto ai metodi esistenti. Ad esempio, ridotta DPIP è un substrato per SOD, suggerendo che i dati pubblicati, ottenuti con l'uso di DPIP e SOD dovrebbero essere interpretati di conseguenza. I nostri risultati sostengono ricerche precedenti condotte da Dayan e Dawson in cui è stato monitorato l'assorbanza di leuco 2,6-dichloroindophenol dopo l'aggiunta di AO: DPIP è stato ossidato che indica che è un substrato per AO29. Tuttavia, i nostri risultati aggiungono contesto alla ricerca condotta da Tan e Berridge24, come pure Bellavite et al. 30, che ha valutato SOD per inibire riduzione DPIP. In uno studio condotto da Tan e Berridge confrontando gli accettori di WST-1, DPIP e FeCN in cellule HeLa, videro che la riduzione di alcune degli accettori è stata soppressa in presenza di SOD. La riduzione di WST-1, in combinato disposto con mPMS, è stata inibita ~ 80% in presenza di SOD mentre la riduzione di DPIP è stata inibita da 40%. La riduzione di FeCN, in combinazione con un accettore di elettroni intermedi alternativo, non è stata inibita in presenza di SOD24. Quando valutare la modalità di elettrone exchange tra NADPH ossidasi e DPIP o citocromo c, Bellavite et al. trovato che DPIP e citocromo c sono ridotti dalle ossidasi di NADPH e che questa riduzione è significativamente inibita da SOD30. Berridge e Tan hanno anche dimostrato che SOD può inibire WST-1 riduzione del 80% in linee di cellule del mouse di 32Dcl23, WEHI3B e J774 nonché linee cellulari umane di Jurkat, MALME3M e 143B6,31. Con le cellule primarie umane del neutrofilo, WST-1 riduzione è stata inibita 95% in presenza di SOD6,32.

I dati qui suggeriscono che è importante verificare che gli enzimi utilizzati per valutare il contributo specifico delle molecole esportati a tPMET non possono ri-ossida la forma riduttrice del ricettore dell'elettrone extracellulare. Abbiamo trovato che il cloruro ferroso (dati non mostrati) e solfato ferroso non erano solubile in PBS. In HBS e DMEM privo di rosso fenolo, essi sono stati rapidamente ossidati, dimostrando l'incompatibilità con HBS o DMEM come mezzi di analisi. Al contrario, AO e SOD non utilizzare ferrocianuro di potassio come substrato, suggerendo che è un accettore di elettroni extracellulare adatto se il suo coefficiente di estinzione basso non è un problema.

Uno dei principali limiti di questo test è che PMS/WST-1 e DPIP può essere ridotto da più donatori di elettroni, come NAD (P) H, ascorbato e flavonoidi come la quercetina e miricetina19,33,34. Tuttavia, questo può essere superato con l'aggiunta di enzimi (ad es., zolla, AO) o inibitori per determinare specifiche hanno contribuito a riduzione PMS/WST-1 o DPIP. Un'altra limitazione è che DPIP può agire come substrato per AO e SOD. Così, questi enzimi non dovrebbero essere utilizzati in combinazione con DPIP per monitorare tPMET. Un'ulteriore limitazione importante di questo studio è la capacità di PMS e altri cyclers redox per produrre superossido26,35,36. Questo è illustrato nella Figura 6. D'altra parte, PMS stesso non ha riferito alcun effetto diretto sul tPMET32. Inoltre, Tan e Berridge32 hanno dimostrato che l'inibitore della NADPH ossidasi (NOX), cloruro di diphenyleneiodinium (DPI), possa sopprimere la maggior parte della riduzione di WST-1, suggerendo che tPMET DPI-sensibile può essere una misura specifica del contributo di NOX per tPMET. Un'altra limitazione è che vediamo piccole variazioni di assorbanza quando utilizzando WST-1. Abbiamo trovato che quando WST-1 è fatta fresca e le cellule sono confluenti, la più grande variazione di assorbanza è visto. Precedenti studi condotti in linee di cellule P388 hanno dimostrato che la quantità di formazano prodotta positivamente correla con cella numero21. Di conseguenza, più confluenti le cellule sono quindi maggiore sarà la riduzione di WST-1. Questo può essere corretto per normalizzando a microgrammi per ciascun pozzetto.

Un avvertimento per quanto riguarda questo test è che esso è progettato principalmente per valutare tPMET globale. Anche se può essere manipolato per monitorare molteplici forme di tPMET, come l'esempio del deflusso dell'ascorbato, più specifici saggi potrebbero essere più appropriate quando l'obiettivo non richiede misure nel contesto del tPMET. Fox esempio, se il superossido è l'interesse principale, ci sono un numero di altre strade per monitorare superossido, come l'uso di sonde incluse sonde fluorescenti impermeabili e aconitasi nitroblue tetrazolium37.

Esistenti sonde per monitorare tPMET come DPIP, FeCN e ferricitocromo c, svantaggi presenti. Ad esempio, ridotta DPIP è un substrato per AO e SOD, FeCN ha un coefficiente di estinzione molare basso che limita la sua utilità nelle analisi in tempo reale, e del citocromo c è costoso. Inoltre, alcune di queste sonde in grado di produrre alta priorità bassa che conduce a bassa sensibilità quando si misura un cambiamento in assorbanza32. WST-1 ha dimostrato di non essere un substrato per enzimi quali AO e SOD. Inoltre, WST-1 ha un coefficiente di estinzione molare alta e una reazione di basso fondo, creazione di un test più sensibile di tPMET. Andando avanti, questo test può essere utilizzato con una vasta gamma di inibitori per meglio comprendere il processo di tPMET, mappare il percorso di trasporto dell'elettrone in una linea cellulare dato e conducono ad una migliore comprensione di come ambiente redox di una cella viene mantenuto.

Determinazione che le cellule sono pronte per la sperimentazione (~ 70% confluenti), nonché a rendere i reagenti, in particolare WST-1 e PMS, fresco per ogni dosaggio includono passaggi critici del presente protocollo. È anche fondamentale per lavare le cellule prima dell'aggiunta di reagenti. DMEM utilizzata nel presente protocollo non contiene l'ascorbato, anche se integriamo mezzo di differenziazione con l'ascorbato. Una serie di supporti disponibili contengono ascorbato. Tuttavia, le cellule vengono lavate prima dell'aggiunta dei reagenti, che sono privi di ascorbato, per rimuovere qualsiasi residuo ascorbato dal mezzo. Come una parte del tPMET è attribuibile ad efflusso molecolare (ad esempio, esportazione di ascorbato), è importante iniziare letture spettrofotometriche immediatamente dopo l'aggiunta del reagente di analisi per non perdere i momenti primi del deflusso. Inoltre, è fondamentale includere pozzi di sfondo per ciascun reagente individuali in un esperimento. I costituenti di analisi descritti in questa carta ha causato cambiamento trascurabile sfondo di assorbanza. Tuttavia, alcuni additivi (ad es., floretina) possono promuovere una reazione notevole sfondo. Quindi, è importante che lo sfondo viene sottratto fuori quando i dati sono analizzati per eliminare eventuali effetti confondenti che i reagenti si possono produrre.

In sintesi, il protocollo qui presentato fornisce un mezzo per valutare tPMET e suggerisce una serie di avvertimenti e aspetti del protocollo che devono essere presi in considerazione applicando l'analisi di diverse linee cellulari e/o valutare specifici contributori ( ascorbato e superossido usato qui) a tPMET.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino e Neej Patel per il loro supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato dal premio United States Public Health Service R15DK102122 dall'Istituto nazionale di diabete e digestivo e malattie renali (NIDDK) a Jonathan Fisher. Il contenuto del manoscritto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale il NIDDK o il National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C2C12 myoblasts American Type Culture Collection  CRL-1772
Dulbecco's modified eagle's medium - low glucose Sigma D6046
Fetal Plex animal serum complex Gemini Bio-Products  100-602
penicillin-streptomycin Sigma 516106
horse serum Gibco Technologies 16050-130
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma D8537
trypsin-EDTA Sigma T4049
15 cm culture dishes TPP 93150
96 well culture plates TPP 92096
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) Accela ChemBio  Inc SY016315
phenazine methosulfate  Sigma P9625
L-ascorbic acid Sigma A5960
ascorbate oxidase  Sigma A0157
superoxide dismutase  Sigma S5395
2,6-dichloroindophenol sodium salt  ICN Biomedicals 215011825
D-(+)-glucose Sigma G7528
HEPES sodium salt Sigma H3784
sodium chloride Sigma S7653
potassium chloride Fisher Scientific  BP366
magnesium sulfate heptahydrate Sigma M5921
calcium chloride dihydrate Sigma C7902
potassium phosphate Fisher Scientific  BP363
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Powerwave X-I spectrophotometer Biotek Insturments discontinued 
Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer Thermo Scientific 336001
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile MidSci 781602
Iron (II) chloride tetrahydrate Sigma 220299
Iron (II) sulfate heptahydrate Sigma 215422
hypoxanthine Sigma H9636
xanthine oxidase Sigma X4500
Excel Microsoft
R Studio Rstudio https://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4 Biotek Insturments discontinued 

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References

  1. Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).
  2. Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).
  3. Craig, T. A., Crane, F. L. Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells. Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).
  4. Mishra, R. K., Passow, H. Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells. J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).
  5. Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. Transplasma-membrane redox systems in growth and development. Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).
  6. Berridge, M. V., Tan, A. S. Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1. Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).
  7. Eccardt, A. M., et al. Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle. Antioxidants. 6 (4), 89 (2017).
  8. Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane. J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).
  9. Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells. J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).
  10. Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport. Biochemistry. 33, 11850-11857 (1994).
  11. Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).
  12. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. Multifunctional plasma membrane redox systems. Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).
  13. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells. FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).
  14. Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane. Biochem Biophys Res Commun. 234 (0), 79-81 (1997).
  15. Navarro, F., et al. Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes. Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).
  16. Herst, P. M., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines. Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).
  17. Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation. FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).
  18. Furukawa, S., et al. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).
  19. Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease. Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).
  20. Berridge, M. V., Tan, A. S. High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).
  21. Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).
  22. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
  23. Gurtoo, H. L., Johns, D. G. On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase. J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).
  24. Tan, A. S., Berridge, M. V. Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells. Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).
  25. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2013).
  26. Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1). Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).
  27. Higaki, Y., et al. Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).
  28. Zuagg, W. Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level. J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).
  29. Dayan, J., Dawson, C. R. Substrate specificity of ascorbate oxidase. Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).
  30. Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol. FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).
  31. Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts. Biochemica. 4, 15-20 (1996).
  32. Tan, A. S., Berridge, M. V. Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents. J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).
  33. Phillips, P. A., et al. Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway. Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).
  34. Altundag, E., et al. Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells. Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).
  35. Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase. Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).
  36. Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen. J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).
  37. Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases. Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).

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Kelly, S. C., Eccardt, A. M., Fisher, J. S. Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes. J. Vis. Exp. (135), e57565, doi:10.3791/57565 (2018).

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