Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Måle Trans-Plasma membran elektronet Transport av C2C12 Myotubes

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57565
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biology, Saint Louis University
* These authors contributed equally

Summary

Målet med denne protokollen er spektrofotometrisk overvåke trans-plasma membran elektronet transport utnytte ekstracellulære elektron acceptors og analysere enzymatisk interaksjoner som kan oppstå med disse ekstracellulære elektron acceptors.

Abstract

Trans-plasma membran elektronet transport (tPMET) spiller en rolle i beskyttelse av celler intracellulær reductive stress samt beskyttelse mot skade ved ekstracellulære oksidanter. Denne prosessen å transportere elektroner fra intracellulær reductants til ekstracellulære oksidanter er ikke godt definert. Her presenterer vi Spektrofotometri analyser av C2C12 myotubes å overvåke tPMET utnytte de ekstracellulære elektron acceptors: vannløselige tetrazolium salt-1 (WST-1) og 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP eller DCIP). Gjennom reduksjon av disse elektron acceptors er vi i stand til å overvåke denne prosessen i en sanntids analyse. Med tillegg av enzymer som ascorbate oxidase (AO) og superoxide dismutase (TORV) på råolje-terminaler, kan vi finne ut hvilken del av tPMET skyldes ascorbate eksport eller superoxide produksjon, henholdsvis. Mens WST-1 ble vist å produsere stabile resultater med lav bakgrunn, kunne DPIP være nytt oksidert etter AO og TORV, som ble demonstrert med Spektrofotometri analyse. Denne metoden viser en real-time, flere godt, rask Spektrofotometri analysen med fordeler over andre metoder brukes til å overvåke tPMET, som ferricyanide (Backward) og ferricytochrome c reduksjon.

Introduction

Av renset plasma membraner redusere muligheten elektron acceptors har ført til visningen at plasma membranen har en iboende redoks kapasitet1. Tidligere sett i sopp, planter og dyr, er tPMET en prosess som er felles for flere organismer2,3,4,5. Spesielt har denne prosessen blitt demonstrert i Saccharomyces cerevisiae, gulrot celler, erytrocytter, lymfocytter, osteosarcoma, melanom, makrofager, skjelettlidelser muskel og nøytrofile2,3, 4 , 5 , 6 , 7. i en prosess som transporterer elektroner i plasma membranen å redusere ekstracellulære oksidanter, tPMET er involvert i mange cellulære funksjoner inkludert: celle vekst5,8, celle levedyktighet9, jern metabolisme10, celle signalisering11,12,13, og beskyttelse fra reaktive oksygen arter12,14,15. På grunn av Tpmet's engasjement i mange cellulære funksjoner, en ubalanse i tPMET har blitt antatt bidra til utviklingen av noen alvorlige helsemessige forhold, inkludert kreft16, hjerte-og karsykdommer17, og metabolske syndrom18.

Det finnes flere måter å overvåke overføring av elektroner i plasma membranen, men den mest brukte metoden er å vurdere reduksjon av ekstracellulære elektron acceptors gjennom kolorimetrisk analyser. Brukte ekstracellulære elektron acceptors er tetrazolium salter, DPIP, FeCN og ferricytochrome c19,20. Den mest brukte tetrazolium saltet er en andregenerasjons salt kjent som WST-1-19. Denne forbindelsen er enklere å bruke i kolorimetrisk analyser sammenlignet med første generasjon tetrazolium salter på grunn av to sulfonate grupper, som øke sine vannløselighet21. WST-1, er i forbindelse med middels elektron acceptor 1-metoksy-phenazine methosulfate (mPMS), redusert i to én-elektron overføre hendelser. Denne reduksjonen endres svakt-farget oksidert form av WST-1 til en mer intens, gul formazan20,22. WST-1 har en høy molar utryddelse koeffisient av 37 x 103 M-1cm-1, fører til en høy analysen følsomhet21,22. DPIP benyttes også som en ekstracellulære elektron godkjenner å overvåke tPMET. Det har vist at DPIP reduseres extracellularly ved tPMET uten hjelp av mellomliggende elektron acceptors23,24. På grunn av manglende mellomliggende elektron acceptors, DPIP kan direkte pick-up elektroner fra plasma membranen, i motsetning til WST-1-24. Lik DPIP, FeCN har vist å være redusert extracellularly til ferrocyanide med tPMET uten hjelp av mellomliggende elektron acceptors19,24. I motsetning WST-1 og DPIP har FeCN en lav molar utryddelse koeffisient fører til en lavere analysen følsomhet9. En annen vanlig ekstracellulære elektron acceptor overvåke tPMET er ferricytochrome c. ligner WST-1, ferricytochrome c reduksjon øker med bruk av mellomliggende elektron acceptor, mPMS22. I motsetning WST-1 men er metoden ferricytochrome c mindre sensitive høy bakgrunn og en lav molar utryddelse koeffisienten22.

Her presenterer vi en metode for sanntids analyse av tPMET gjennom Spektrofotometri analyser. Metoden benyttes ekstracellulære elektron acceptors WST-1 og DPIP, som begge har en høy molar utryddelse koeffisient mens blir billigere sammenlignet med andre ofte brukte ekstracellulære elektron acceptors ferricytochrome c. Vi utnyttet phenazine methosulfate (PMS) i stedet for mPMS de har en lignende kjemisk makeup og PMS er langt billigere. mPMS er photochemically stabil som er et viktig karakteristisk for en kommersiell kit som trenger lang holdbarhet. Vi gjør imidlertid PMS fersk hver analysen, så stabilitet ikke bør være et problem. Vi presenterer også en metode for å vurdere mulig enzymatisk samspillet (se figur 1) mellom ekstracellulære elektron acceptor og enzymer som kan benyttes for å karakterisere videre prosessen med tPMET. Spesielt avgjøre enzymer AO og TORV hvilken del av tPMET er ascorbate transport eller ekstracellulær superoxide utgivelse, to vanlige metoder for elektroner transporteres over plasma membranen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Se figur 1 for en skjematisk oversikt over hovedtrinnene.

1. WST-1 reduksjon analysen

  1. Vokse og skille C2C12 tilhenger celler ved hjelp av standard celle kultur prosedyrer7 i en 96-brønns plate utnytte rader A-F.
    1. Bruk en differensiering medium bestående av Dulbeccos endret Eagle's Medium (DMEM) med 2% hest serum, 100 U/mL penicillin og 0,1 mg/mL streptomycin. Inkuber cellene på 37 ° C med 5% CO2.
    2. Når du overvåker ascorbate engasjement i tPMET, supplement differensiering media med 100 µM askorbinsyre. Tillate at celler å ruge på differensiering medier for ~ 24-48 h.
  2. Klargjør lager WST-1 og PMS løsninger.
    1. For å gjøre et 10 mM lager av WST-1, oppløse 0.033 g av WST-1 (formelen vekt (FW): 651.34 g/mol) i 5 mL av fosfat bufret saltvann (PBS). Butikken på 4 ° C.
    2. For å gjøre en 5 mM lager av PMS, oppløse 0.0023 g PMS (FW: 306.34 g/mol) i 1,5 mL av deionisert H2O (di2O). Lagre på 20 ° C og beskytte mot lyset.
  3. Legg til 0.0108 g av glukose for en siste konsentrasjon av 5 mM til 11.4 mL PBS eller HEPES bufret saltvann (HBS; 20 mM HEPES natrium salt, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 MgSO4, 1 mM CaCl2). Legge til 480 µL av 10 mM WST-1 for en siste konsentrasjon av 400 µM og 48 µL av 5 mM PMS for en siste konsentrasjon på 20 µM.
  4. Når du overvåker ascorbate engasjement i tPMET, dele løsningen i to 6 mL dele. Legge 6 µL av di2O en aliquot, og den andre aliquot legge til 6 µL av 2 kU/mL AO for en siste konsentrasjon av 2 U/mL.
  5. Når du overvåker superoxide engasjement i tPMET, dele løsningen i to 6 mL dele. En aliquot, legge til 55 µL 0.1 M KPO4 bufferen og den andre aliquot legge til 55 µL av 6,5 kU/mL TORV for en siste konsentrasjon av 60 U/mL.
  6. Vask cellene med PBS. Sug opp media og legge 150 µL PBS. Deretter Sug opp PBS.
    Merk: Analysen er gjort med forkrommet, tilknyttede celler. Dermed er det ingen sentrifugering eller bruk av trypsin i vaskeprosessen.
  7. Legge til 100 µL av WST-1-løsning (-) TORV eller (-) AO kolonner 1-6 og legge 100 µL av WST-1-løsning (+) TORV eller (+) AO kolonner 7-12 i 96-brønnen plate. Bruker radene G og H som bakgrunn kontroller (dvs.å overvåke endringer i absorbansen i reagensen alene i brønner uten celler).
  8. Måle absorbansen verdiene med spektrofotometer hvert 10 min 1t på 438 nm.
  9. Lesing, Sug opp media og vaskes hver med 150 µL av PBS. Deretter Sug opp PBS.
  10. Beregne endringen i absorbansen for hver brønn ved å trekke første absorbansen for et godt fra absorbansen til enhver tid for at godt. Rette opp denne endringen til endringen i absorbansen (hvis noen) observert i bakgrunn brønnene (dvs., brønner med analysen løsning men ingen celler).
  11. For analyse, normaliserer absorbansen dataene til 60 min kontroll målingen eller vask brønner med PBS eller HBS og deretter utføre en bicinchoninic syre (BCA) protein analysen.
  12. Legge til 2 mg/mL bovin serum albumin (BSA) standard (varierer fra 0,5-2 µL av standard kurve, avhengig av samløpet mellom cellene) tom fordelt (rader G og H), deretter legge BCA reagensen i alle brønnene.
  13. Kvantifisere dataene via nmol av WST-1 reduksjon per µg protein. Bruke 37 mM-1 cm-1 22 som utryddelse koeffisient for redusert WST-1 i 438 nm.

2. DPIP reduksjon analysen

  1. Vokse og skille C2C12 tilhenger celler med samme fremgangsmåte som trinn 1.1.
  2. Klargjør lager 10 mM DPIP løsning som følger. Oppløse 0.029 g DPIP (FW: 290.08 g/mol) i 10 mL di2O. Bekreft konsentrasjonen av DPIP ved å måle absorbans ved 600 nm med et spektrofotometer. Bruke 1 mM-1 cm-1 23 som utryddelse koeffisient for redusert DPIP på 600 nm. Butikken på 4 ° C.
  3. Legge til 0.0108 g av glukose 11.880 mL PBS for en siste konsentrasjon av 5 mM. Legge til 120 µL av 10 mM DPIP for en siste konsentrasjon av 100 µM.
  4. Når du overvåker ascorbate engasjement i tPMET, dele løsningen i to 6 mL dele. Legge 6 µL av di2O en aliquot, og den andre aliquot legge til 6 µL av 2 kU/mL AO for en siste konsentrasjon av 2 U/mL.
  5. Når du overvåker superoxide engasjement i tPMET, dele løsningen i to 6 mL dele. En aliquot, legge til 55 µL 0.1 M KPO4 bufferen og den andre aliquot legge til 55 µL av 6,5 kU/mL TORV for en siste konsentrasjon av 60 U/mL.
  6. Sug opp media og vask celler i 150 µL av PBS. Sug opp PBS og legge 100 µL DPIP løsning (-) TORV eller (-) AO kolonner 1-6 og legge 100 µL DPIP løsning (+) TORV eller (+) AO kolonner 7-12 i 96-brønnen plate. Bruke rader G og H vil som bakgrunn kontroller (dvs.å overvåke endringer i absorbansen i reagensen alene i brønner uten celler).
  7. Måle absorbansen 600 nm bruke spektrofotometer hvert 10 min for 1 h. kvantifisere endringen i absorbansen i forhold til kontrollen 60 minutter analog med skritt 1,9-1.13.

3. fastsettelse av om redusert elektron Acceptors er substrater for AO eller TORV

  1. 5.436 mL PBS eller HBS, legge 240 µL av 10 mM WST-1 for en siste konsentrasjon av 400 µM og 24 µL av 5 mM PMS for en siste konsentrasjon på 20 µM.
    1. For DPIP, legge til 60 µL av 10 mM DPIP, for en siste konsentrasjon av 100 µM, 5.940 mL PBS eller HBS.
  2. Legge til 100 µL løsning hver godt i 96-brønnen-bunnplaten i fravær av celler og måle absorbansen i et spektrofotometer på 438 nm, for WST-1, eller 600 nm, for DPIP.
  3. Legg 1 µL av 10 mM askorbat halvparten av brønnene for en siste konsentrasjon av 100 μM. Overvåke absorbansen før det stabiliserer.
  4. Ved stabilisering, tilsett 1 µL av 200 U/mL AO for en siste konsentrasjon av 2 U/mL hver brønn eller legge 1 µL av 6 kU/mL TORV for en siste konsentrasjon av 60 U/mL hver godt og overvåke absorbansen 1t.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Statistikk som ble utført med VARIANSANALYSE med gjentatte measures bruker RStudio statistisk programvare25. Utvalgene angis i figur legender.

For å overvåke tPMET, ble C2C12 myotubes brukt sammen med ekstracellulære elektron acceptors, WST-1 og DPIP. AO ble brukt til å avgjøre hvilken del av WST-1 og DPIP reduksjon var ascorbate middelklasseinnbyggere og TORV ble brukt til å avgjøre hvilken del av WST-1 reduksjonen skyldtes ekstracellulære superoxide utgivelsen. Som vist i figur 2, er C2C12 myotubes dugelig av tPMET sett av reduksjon av WST-1. Med tillegg av AO, ble WST-1 reduksjon undertrykt med ~ 30% som indikerer at ~ 30% av tPMET skyldtes eksport av askorbat (figur 2A). Med tillegg av TORV, ble WST-1 reduksjon undertrykket av ~ 70%, indikerer at ~ 70% av tPMET var ekstracellulære superoxide utgivelsen (figur 2B). Når DPIP ble benyttet som en ekstracellulære elektron godkjenner med tillegg av AO, DPIP reduksjon ble undertrykt over 100% (Figur 3). Dette løftet spørsmål om gyldigheten av å bruke DPIP med AO for å vurdere bidrag av askorbat.

For å se om redusert WST-1 er et medium for AO eller TORV, ble WST-1 redusert med askorbinsyre. AO eller TORV ble lagt, og absorbansen var overvåket. Etter 1 h var det ingen endring i absorbansen mellom redusert form av WST-1 uten AO eller TORV og redusert form av WST-1 med AO eller TORV (figur 4A, B). Derfor redusert WST-1 er ikke et substrat for disse enzymer, og bruk av AO eller TORV i forbindelse med WST-1 er aktuelle for vurdering av rollene av askorbat eller superoxide, henholdsvis.

For å avgjøre hvis redusert DPIP er et medium for AO eller TORV, ble DPIP redusert med askorbinsyre. Etter 20 min, AO ble lagt, og absorbansen var overvåket. Redusert DPIP viste seg å være et substrat for AO, som vist i figur 5A, der DPIP returnerer til sin oksidert form innen 40 min. Når TORV ble lagt, var DPIP også nytt oksidert (figur 5B). Derfor er redusert DPIP et medium for disse enzymer og ikke en passende ekstracellulære elektron godkjenner som skal benyttes med disse enzymer.

Figure 1
Figur 1: en skjematisk fremstilling av de viktigste trinnene av elektronet transport analyser og fastsettelse av enzymatisk samspill med de ekstracellulære elektron acceptors. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: AO og TORV undertrykker WST-1 reduksjon av C2C12 myotubes. (A) tPMET ble analysert for 60 min 400 µM WST-1 og 20 µM PMS med tillegg av 2 U/mL AO eller di2O (N = 18/gruppe). (B) tPMET ble analysert for 60 min med tillegg av 60 U/mL TORV eller 0.1 M KPO4 buffer (N = 36/gruppe). p≥ 0,05 på angitt tidspunktet. Feilfelt representerer standard feil av gjsnitt og kan være for liten til å visualisere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: tillegg av AO undertrykker DPIP reduksjon av C2C12 myotubes. tPMET ble analysert for 60 min bruker 100 µM DPIP med eller uten tilsetning av 2 U/mL AO (N = 36/gruppe). p≥ 0,05 på angitt tidspunktet. Feilfelt representerer standard feil av gjsnitt og kan være for liten til å visualisere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: redusert WST-1 er ikke et substrat for AO eller TORV. (A) WST-1 ble redusert med ascorbate. Etter 45 minutter, AO ble lagt, og absorbansen var overvåket 1t. Ingen endring i absorbansen ble observert. (B) fremgangsmåten er den samme som ovenfor, unntatt TORV ble lagt etter 45 minutter. Ingen endring i absorbansen ble observert (N = 24/gruppe). Feilfelt representerer standard feil av gjsnitt og kan være for liten til å visualisere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: redusert DPIP er et medium for AO og TORV. (A) DPIP ble redusert med ascorbate. Etter 20 min, AO ble lagt, og absorbansen var overvåket. Innen 40 min, prøvene tilbake til sine opprinnelige absorbansen, indikerer at redusert DPIP et substrat for AO. (B) DPIP ble redusert med ascorbate. Etter 20 min, TORV ble lagt, og absorbansen var overvåket. Over tid, den reduserte DPIP var re oksidert, indikerer at redusert DPIP er et medium for TORV (N = 24/gruppe). Feilfelt representerer standard feil av gjsnitt og kan være for liten til å visualisere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: skjematisk avbilder tPMET. I denne modellen av tPMET, kan ascorbate (eller en annen elektron bærer) eksportert av cellen redusere ekstracellulære PMS. I tillegg genererer NADPH oxidases ekstracellulære superoxide, som kan redusere WST-1 direkte eller redusere den indirekte via reduksjon av PMS. Elektroner fra andre plasma membranen givere kan også redusere PMS, som kan donere elektroner WST-1 eller O2 med påfølgende WST-1-reduksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har presentert to metoder for å utnytte ekstracellulære elektron acceptors, WST-1 og DPIP, i Spektrofotometri analyser å overvåke tPMET i C2C12 myotubes. Med veksten av linjer i standard kultur prosedyrer og en spektrofotometer plate leser er det mulig å overvåke tPMET med disse elektron acceptors i en enkel microplate analysen. WST-1 reduksjon er reproduserbare fra godt-å-brønnen i analysen, men det er daglige variasjon. Den daglige variasjonskoeffisienten (CV) utnytte PBS som bufferen er 0,18 og CV utnytte HBS bufferen er 0,23.

Fra forrige litteratur mPMS og WST-1, har vi endret denne protokollen, spesielt for bruk av PMS. Dermed feilsøking inkludert bestemme riktig konsentrasjonen av PMS og WST-1 for bruk med myotubes beskrevet. Vi har også bestemt at temperaturen (i en rekke 23-37 ° C) ikke er en kritisk komponent for analysen, mens risting platen før hver absorbansen lesning er viktig. Men skulle disse problemene bli undersøkt for andre linjer som analysen brukes. Resultatene om muligheten av TORV og AO å oksidere direkte redusert WST-1 foreslår at screening av nye analysen komponenter for denne egenskapen er et viktig aspekt av feilsøking.

Våre data tyder på at PMS skal benyttes i forbindelse med WST-1 for å lokke fram optimal WST-1-reduksjon. Vi fant at i en 1 mL volum, 100 µM ascorbate reduserer 322 nmol av WST-1 per minutt i nærvær av PMS, som kreves for direkte reduksjon av WST-1 av askorbat. I et 1 mL volum oxidizes 2 U/mL AO ascorbate med en hastighet på 4400 nmol/s eller 800 ganger raskere enn reduksjon av WST-1 av askorbat. Enzymatisk aktivitet av AO er åpenbart mye raskere enn direkte reduksjon av PMS/WST-1 av askorbat. Vi forventer at det samme ville følge superoxide og TORV, selv om vi ikke har et system for å måle absolutt frekvensen av WST-1 reduksjon av superoxide.

For å fastslå om inkludering av PMS berører reduksjon av WST-1 av superoxide, vi brukte en xantin oxidase (4,5 mU/mL) / hypoxanthine (0,1 mM) superoxide genererer systemet som tidligere beskrevet26,27. Inkludering av PMS dobler ca frekvensen av WST-1 reduksjon av dette systemet. Dermed ser det ut til at PMS formidler overføring av elektroner fra superoxide til WST-1.

For å ytterligere evaluere kravet til PMS mobilnettet WST-1 reduksjon, vi assayed reduksjon i tilstedeværelse eller fravær av PMS og WST-1, og fant at PMS kreves for mobilnettet WST-1-reduksjon. Når cellene er ruges i analysen reagens som inneholder PMS alene (i fravær av WST-1), det er en økning i absorbans ved 438 nm. Dette gjenspeiler sannsynligvis en opphopning av semiquinone form av PMS (PMS-SQ) som har en topp absorbansen på 440 nm28. Akkumulering av PMS-SQ antyder at PMS reduseres raskere enn den kan passere elektroner O2 å produsere superoxide. Dermed er akkumulering av PMS-SQ konsekvent med rapporterte langsom reduksjon av O2 av PMS-SQ sammenlignet med hastigheten for fullt redusert PMS28.

Vi har også presentert en protokoll for å avgjøre om elektron acceptors substrater for enzymer som kan brukes til å overvåke tPMET. Ved å overvåke reduksjon av de ekstracellulære elektron acceptors i et spektrofotometer etterfulgt av tillegg av enzymet rundt, er det mulig å avgjøre om elektron acceptor er et substrat for disse enzymene. Gjennom denne metoden, har vi vist at redusert DPIP er et medium for AO og TORV som indikerer at det ikke er en passende elektron godkjenner for overvåking ascorbate middelklasseinnbyggere og superoxide eksport.

Fremgangsmåten for å teste hvorvidt analysen komponenter som TORV eller AO skape gjenstander er en betydelig forbedring over eksisterende metoder. For eksempel er redusert DPIP et medium for TORV, antyder at publiserte data innhentet med bruk av DPIP og TORV tolkes tilsvarende. Våre funn støtter tidligere forskning utført av Dayan og Dawson der absorbansen av leuco 2,6-dichloroindophenol var overvåket etter tillegg av AO: DPIP var oksydert indikerer at det er et substrat AO29. Men legge våre funn sammenheng til forskning utført av Tan og Berridge24, samt Bellavite et al. 30, som utnyttet TORV å hemme DPIP reduksjon. I en studie utført av Tan og Berridge sammenligne elektron acceptors WST-1, DPIP og FeCN i HeLa celler, så de at reduksjon av noen av elektron acceptors ble undertrykt i nærvær av TORV. Reduksjon av WST-1, i forbindelse med mPMS, var hemmet ~ 80% i nærvær av TORV mens reduksjon av DPIP ble hemmet av 40%. Reduksjon av FeCN, sammen med en alternativ mellomliggende elektron godkjenner, var ikke hemmet i nærvær av TORV24. Når evaluere modus av elektron utveksling mellom NADPH oxidases og DPIP eller cytochrome c, Bellavite et al. funnet at DPIP og cytochrome c er redusert med NADPH oxidases og at denne reduksjonen er betydelig hemmet av TORV30. Berridge og Tan har også vist at TORV kan hemme WST-1 reduksjon av 80% i musen celler linjer med 32Dcl23, WEHI3B, og J774 samt humane cellelinjer Jurkat, MALME3M og 143B6,31. Med menneskelige primære nøytrofile celler var WST-1 reduksjon hemmet 95% i nærvær av TORV6,32.

Data her tyder på at det er viktig å kontrollere at enzymer brukes til å vurdere spesielle bidrag av eksporterte molekyler å tPMET re ikke oksidere redusert form av den ekstracellulære elektron acceptor. Vi fant at (data ikke vist) jernholdige klorid og jernvitriol ikke var oppløselig i PBS. HBS og fenol red-gratis DMEM, ble de raskt oksidert, demonstrere inkompatibilitet med HBS eller DMEM som analysen media. Derimot bruker AO og TORV ikke kalium ferrocyanide som et substrat antyder at det er en egnet ekstracellulære elektron acceptor hvis dens lav utryddelse koeffisient ikke er et problem.

En av de viktigste begrensningene for denne analysen er det PMS/WST-1 DPIP reduseres ved flere elektron givere, som NAD (P) H, ascorbate og flavonoider som quercetin og myricetin19,33,34. Men dette kan overvinnes med tillegg av enzymer (f.eks TORV, AO) eller hemmere å bestemme spesifikke bidragsytere til PMS/WST-1 eller DPIP reduksjon. En annen begrensning er at DPIP kan fungere som et substrat for AO og TORV. Dermed skal disse enzymene ikke benyttes i forbindelse med DPIP til å overvåke tPMET. En ekstra viktig begrensning av denne studien er muligheten for PMS og andre redoks cyclers å produsere superoxide26,35,36. Dette illustreres i figur 6. På den annen siden, PMS selv angivelig har ingen direkte innvirkning på tPMET32. I tillegg har Tan og Berridge32 vist at den NADPH (NOX) oksidase, diphenyleneiodinium chloride (PPT), kan undertrykke de fleste WST-1 reduksjon, noe som tyder på at PPT-sensitive tPMET kan være et tiltak av NOX bidrag til tPMET. En annen begrensning er at vi ser små endringer i absorbansen når utnytte WST-1. Vi har funnet at når WST-1 tilberedt fersk og cellene er confluent, den største endringen i absorbansen er sett. Tidligere studier utført i P388 linjer har vist at mengden av formazan produsert positivt samsvarer med celle nummer21. Derfor, jo mer confluent cellene er så jo større reduksjon i WST-1. Dette kan korrigeres for ved å normalisere til mikrogram protein for hver brønn.

En påminnelse om denne analysen er at den er hovedsakelig utformet å vurdere global tPMET. Selv om det kan manipuleres for å overvåke flere former for tPMET, som eksempel ascorbate middelklasseinnbyggere, kan mer spesifikke analyser være mer passende når målet ikke krever målinger i konteksten av tPMET. Fox eksempel, hvis superoxide er den største interessen, er det en rekke andre veier å dataskjerm superoxide, slik som bruk av prober inkludert fluorescerende ugjennomtrengelig sonder, aconitase og nitroblue tetrazolium37.

Eksisterende sonder overvåke tPMET som DPIP, FeCN og ferricytochrome c, finnes ulemper. For eksempel redusert DPIP er et medium for AO og TORV, FeCN har en lav molar utryddelse koeffisient som begrenser nytteverdien i sanntid analyser og cytochrome c er kostbar. I tillegg kan noen av disse sonder produsere høy bakgrunn fører til lav følsomhet ved måling av en endring i absorbansen32. WST-1 har vist seg å ikke være en substrat for enzymer som AO og TORV. I tillegg har WST-1 en høy molar utryddelse koeffisient og en lav bakgrunn reaksjon, skape en mer følsomme tPMET analysen. Fremover, kan denne analysen brukes med en rekke hemmere bedre forstå prosessen med tPMET, tilordne banen til elektronet transport i en gitt celle linje, og føre til bedre forståelse av hvordan en celle redoks miljø opprettholdes.

Avgjørende skritt i denne protokollen inkludere bestemme at cellene er klar for eksperimentering (~ 70% confluent), samt gjøre analysen reagenser, spesielt WST-1 og PMS, fersk hver analysen. Det er også viktig å vaske cellene før en analysen reagenser. DMEM benyttet i denne protokollen inneholder ikke ascorbate, selv om vi supplere differensiering medium med ascorbate. En rekke tilgjengelige medier inneholder ascorbate. Imidlertid er cellene vasket før en analysen reagenser, som ascorbate-fri, fjerne eventuelle gjenværende ascorbate fra mediet. Som en del av tPMET skyldes molekylær middelklasseinnbyggere (f.eks ascorbate eksport), er det viktig å starte Spektrofotometri opplesninger umiddelbart etter at analysen reagens for ikke å gå glipp av det første øyeblikk av middelklasseinnbyggere. Også er det viktig å inkludere bakgrunn brønner for hver individuelle reagens i et eksperiment. Analysen bestanddeler beskrevet i denne hvitboken forårsaket ubetydelig bakgrunn endring i absorbance. Men kan noen tilsetningsstoffer (f.eks phloretin) fremme en solid bakgrunn reaksjon. Derfor er det viktig at bakgrunnen blir trukket ut når dataene analyseres for å eliminere noen forvirrende effekter som reagensene seg kan produsere.

Oppsummert protokollen presenteres her er en vurdering av tPMET og foreslår en rekke advarsler og aspekter av protokollen som bør tas i betraktning når analysen ulike linjer og/eller vurdere bestemte bidragsytere ( ascorbate og superoxide her) til tPMET.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino og Neej Patel deres kundestøtte. Dette arbeidet ble støttet av USA Public Health Service award R15DK102122 fra National Institute Diabetes og fordøyelsesenzymer og nyre sykdommer (NIDDK) til Jonathan Fisher. Manuskriptet innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet av NIDDK eller National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C2C12 myoblasts American Type Culture Collection  CRL-1772
Dulbecco's modified eagle's medium - low glucose Sigma D6046
Fetal Plex animal serum complex Gemini Bio-Products  100-602
penicillin-streptomycin Sigma 516106
horse serum Gibco Technologies 16050-130
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma D8537
trypsin-EDTA Sigma T4049
15 cm culture dishes TPP 93150
96 well culture plates TPP 92096
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) Accela ChemBio  Inc SY016315
phenazine methosulfate  Sigma P9625
L-ascorbic acid Sigma A5960
ascorbate oxidase  Sigma A0157
superoxide dismutase  Sigma S5395
2,6-dichloroindophenol sodium salt  ICN Biomedicals 215011825
D-(+)-glucose Sigma G7528
HEPES sodium salt Sigma H3784
sodium chloride Sigma S7653
potassium chloride Fisher Scientific  BP366
magnesium sulfate heptahydrate Sigma M5921
calcium chloride dihydrate Sigma C7902
potassium phosphate Fisher Scientific  BP363
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Powerwave X-I spectrophotometer Biotek Insturments discontinued 
Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer Thermo Scientific 336001
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile MidSci 781602
Iron (II) chloride tetrahydrate Sigma 220299
Iron (II) sulfate heptahydrate Sigma 215422
hypoxanthine Sigma H9636
xanthine oxidase Sigma X4500
Excel Microsoft
R Studio Rstudio https://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4 Biotek Insturments discontinued 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).
  2. Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).
  3. Craig, T. A., Crane, F. L. Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells. Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).
  4. Mishra, R. K., Passow, H. Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells. J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).
  5. Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. Transplasma-membrane redox systems in growth and development. Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).
  6. Berridge, M. V., Tan, A. S. Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1. Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).
  7. Eccardt, A. M., et al. Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle. Antioxidants. 6 (4), 89 (2017).
  8. Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane. J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).
  9. Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells. J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).
  10. Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport. Biochemistry. 33, 11850-11857 (1994).
  11. Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).
  12. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. Multifunctional plasma membrane redox systems. Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).
  13. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells. FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).
  14. Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane. Biochem Biophys Res Commun. 234 (0), 79-81 (1997).
  15. Navarro, F., et al. Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes. Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).
  16. Herst, P. M., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines. Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).
  17. Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation. FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).
  18. Furukawa, S., et al. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).
  19. Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease. Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).
  20. Berridge, M. V., Tan, A. S. High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).
  21. Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).
  22. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
  23. Gurtoo, H. L., Johns, D. G. On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase. J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).
  24. Tan, A. S., Berridge, M. V. Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells. Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).
  25. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2013).
  26. Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1). Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).
  27. Higaki, Y., et al. Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).
  28. Zuagg, W. Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level. J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).
  29. Dayan, J., Dawson, C. R. Substrate specificity of ascorbate oxidase. Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).
  30. Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol. FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).
  31. Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts. Biochemica. 4, 15-20 (1996).
  32. Tan, A. S., Berridge, M. V. Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents. J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).
  33. Phillips, P. A., et al. Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway. Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).
  34. Altundag, E., et al. Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells. Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).
  35. Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase. Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).
  36. Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen. J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).
  37. Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases. Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).

Tags

Biokjemi problemet 135 tPMET WST-1 DPIP ascorbate superoxide C2C12 myotubes Spektrofotometri analysen
Måle Trans-Plasma membran elektronet Transport av C2C12 Myotubes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kelly, S. C., Eccardt, A. M.,… More

Kelly, S. C., Eccardt, A. M., Fisher, J. S. Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes. J. Vis. Exp. (135), e57565, doi:10.3791/57565 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter